cobas EGFR Mutation Test v2

Transkrypt

Please ignore the layout!!!
cobas® EGFR Mutation Test v2
Do stosowania w diagnostyce in vitro
cobas® DNA Sample Preparation Kit 24 Tests
P/N: 05985536190
cobas® cfDNA Sample Preparation Kit 24 Tests
P/N: 07247737190
P/N: 07248563190
24 Tests
SPIS TREŚCI
®
cobas EGFR Mutation Test v2: Zastosowanie ................................................................................................................. 5
Podsumowanie oraz opis testu ........................................................................................................................................... 5
Informacje podstawowe ....................................................................................................................... 5
Zasady procedury ................................................................................................................................ 7
Przygotowanie próbek ................................................................................................................ 7
Amplifikacja PCR ........................................................................................................................ 7
CZĘŚĆ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI ........................................................................................................ 9
Przygotowanie próbek .......................................................................................................................................................... 9
Materiały i odczynniki ......................................................................................................................................................... 10
Dostarczane materiały i odczynniki.................................................................................................... 10
Przechowywanie i użytkowanie odczynników .................................................................................... 12
Wymagane materiały dodatkowe ....................................................................................................... 13
Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane ....................................................... 14
Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania .......................................................................................... 14
Ostrzeżenia i środki ostrożności ........................................................................................................ 14
Dobra praktyka laboratoryjna ............................................................................................................. 14
Zanieczyszczenie ............................................................................................................................... 15
Integralność ........................................................................................................................................ 15
Utylizacja ............................................................................................................................................ 15
Rozlanie płynów i czyszczenie ........................................................................................................... 16
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek ................................................................................ 16
Pobieranie próbek ..................................................................................................................... 16
Przechowywanie i trwałość próbek podczas transportu ........................................................... 16
Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej .................................................................. 17
Procedura testowa .............................................................................................................................................................. 17
Wykonywanie oznaczenia .................................................................................................................. 17
Instrukcja użytkowania .............................................................................................................. 18
Procedura izolacji DNA ............................................................................................................. 20
Ocena ilościowa stężenia DNA ................................................................................................. 22
Amplifikacja i detekcja............................................................................................................... 22
Konfigurowanie aparatu ............................................................................................................ 23
Konfiguracja zlecenia testu ....................................................................................................... 23
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki .................. 25
Rozcieńczenie próbki ................................................................................................................ 26
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
2
Konfiguracja reakcji................................................................................................................... 26
Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2) ................ 26
Przygotowanie płytki ................................................................................................................. 27
Rozpoczęcie reakcji PCR ......................................................................................................... 28
Wyniki ................................................................................................................................................................................... 29
Interpretacja wyników......................................................................................................................... 29
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami ................................................................................... 29
Kontrola jakości i ważność wyników .................................................................................................. 30
Kontrola mutacji ........................................................................................................................ 30
Kontrola ujemna ........................................................................................................................ 30
Ograniczenia metody ......................................................................................................................... 30
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych ........................................................................................................... 32
Czułość analityczna — granica próby ślepej ..................................................................................... 32
Granica wykrywalności przy użyciu mieszanek próbek FFPET ........................................................ 32
Minimalna zawartość tkanki guza ...................................................................................................... 34
Swoistość — mikroorganizmy i homologi EGFR ............................................................................... 35
Mikroorganizmy związane z płucami ........................................................................................ 35
Plazmidy homologów EGFR ..................................................................................................... 35
Substancje wpływające na wynik testu .............................................................................................. 35
Tkanka martwicza .............................................................................................................................. 36
Powtarzalność .................................................................................................................................... 36
Odtwarzalność przygotowywania próbek .......................................................................................... 36
Ocena klinicznej skuteczności testu ................................................................................................................................. 36
Badanie odtwarzalności klinicznej ..................................................................................................... 36
Korelacja z metodą referencyjną wykorzystującą próbki fazy III z badania EURTAC ....................... 37
Dane dotyczące wyniku klinicznego .................................................................................................. 39
CZĘŚĆ B: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI OSOCZA..................................................................................................... 41
Przygotowanie próbek ........................................................................................................................................................ 41
Materiały i odczynniki ......................................................................................................................................................... 42
Dostarczane materiały i odczynniki.................................................................................................... 42
Przechowywanie i użytkowanie odczynników .................................................................................... 45
Wymagane materiały dodatkowe ....................................................................................................... 45
Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane ....................................................... 46
Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania .......................................................................................... 46
Ostrzeżenia i środki ostrożności ........................................................................................................ 46
Dobra praktyka laboratoryjna ............................................................................................................. 46
Zanieczyszczenie ............................................................................................................................... 47
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
3
Integralność ........................................................................................................................................ 47
Utylizacja ............................................................................................................................................ 47
Rozlanie płynów i czyszczenie ........................................................................................................... 48
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek ................................................................................ 48
Pobieranie próbek i praca z próbkami ...................................................................................... 48
Transport, przechowywanie i stabilność próbek ....................................................................... 48
Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej .................................................................. 49
Procedura testowa .............................................................................................................................................................. 50
Wykonywanie oznaczenia .................................................................................................................. 50
Instrukcja użytkowania .............................................................................................................. 50
Amplifikacja i detekcja............................................................................................................... 53
Konfiguracja reakcji................................................................................................................... 55
Przygotowanie płytki ................................................................................................................. 56
Rozpoczęcie reakcji PCR ......................................................................................................... 57
Wyniki ................................................................................................................................................................................... 58
Interpretacja wyników......................................................................................................................... 58
Wskaźnik półilościowy (SQI) ..................................................................................................... 58
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami .......................................................................... 59
Kontrola jakości i ważność wyników .................................................................................................. 59
Kontrola mutacji ........................................................................................................................ 59
Kontrola ujemna ........................................................................................................................ 59
Ograniczenia metody ......................................................................................................................... 59
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych ........................................................................................................... 60
Granica wykrywalności przy użyciu DNA linii komórkowych ............................................................. 61
Korelacja z MiSeq przy użyciu klinicznych próbek osocza K2 EDTA ................................................ 61
Liniowość ........................................................................................................................................... 62
Powtarzalność .................................................................................................................................... 65
Dodatkowe informacje ........................................................................................................................................................ 66
Oznaczenia ........................................................................................................................................ 66
Wytwórca i dystrybutorzy ................................................................................................................... 67
Znaki towarowe i patenty ................................................................................................................... 67
Copyright ............................................................................................................................................ 67
Piśmiennictwo .................................................................................................................................... 68
Wersja dokumentu ............................................................................................................................. 69
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
4
cobas® EGFR Mutation Test v2: Zastosowanie
Test cobas® EGFR Mutation Test v2 jest oparty na reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym,
przeznaczony do jakościowej detekcji i identyfikacji mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu kodującego
receptor naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptor, EGFR) w DNA pochodzącym
z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek tkanki (ang. formalin-fixed paraffin-embedded
tissue, FFPET) nowotworowej lub osocza od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (ang. non-small
cell lung cancer, NSCLC). Test jest także przeznaczony jako pomoc w doborze pacjentów z NSCLC do terapii
inhibitorem kinazy tyrozynowej (ang. tyrosine kinase inhibitor, TKI) EGFR.
Test cobas® EGFR Mutation Test v2 do stosowania z osoczem jest także wskazany do półilościowego
oznaczania mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. genu EGFR z pobranych serii próbek osocza ludzkiego i jako
pomoc w leczeniu pacjentów z rakiem NSCLC.
Próbki FFPET są przetwarzane przy użyciu zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit, a próbki osocza są
przetwarzane przy użyciu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 i
analizator cobas z 480 są stosowane razem do automatycznej amplifikacji i detekcji.
Podsumowanie oraz opis testu
Informacje podstawowe
Uaktywnienie się mutacji genu kodującego EGFR następuje głównie w przypadku NSCLC i skutkuje
konstytutywną aktywacją białka EGFR, które wykazuje aktywność kinazy, przyczyniając się tym samym do
rozwoju procesu onkogennego.1 Częstość występowania tych mutacji w niewyselekcjonowanych przypadkach
NSCLC wynosi około 10–30%2, 3. Jednak mutacje te występują częściej (choć nie wyłącznie) u
niepalących/palących rzadko pacjentek pochodzenia azjatyckiego, u których w badaniach histopatologicznych
wykrywa się gruczolakoraka4.
Najczęstsze mutacje EGFR w NSCLC obejmują różne delecje w eksonie 19. i mutację substytucji L858R w
eksonie 21.; mutacje te łącznie stanowią około 85% mutacji EGFR obserwowanych w NSCLC.5 Test cobas®
EGFR Mutation v2 (cobas® EGFR Test) to test reakcji PCR zachodzącej w czasie rzeczywistym opracowany
do wykrywania mutacji substytucji G719X w eksonie 18., mutacji delecji w eksonie 19., mutacji substytucji
T790M i S768I w eksonie 20., mutacji insercji w eksonie 20. oraz mutacji substytucji L858R i L861Q w eksonie
21.
Tabela 1 wymienia mutacje EGFR wykrywane za pomocą testu cobas® EGFR.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
5
Tabela 1
®
Test cobas EGFR jest przeznaczony do detekcji następujących mutacji
Ekson
Grupa mutacji EGFR
Ekson 18.
G719X
Ekson 19.
Ex19Del
S768I
T790M
Ekson 20.
Ex20Ins
Ekson 21.
L858R
L861Q
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
Sekwencja kwasu
nukleinowego genu
kodującego EGFR
2156G>C
2155G>A
2155G>T
Identyfikator
6
COSMIC
2240_2251del12
6210
2239_2247del9
6218
2238_2255del18
6220
2235_2249del15
6223
2236_2250del15
6225
2239_2253del15
6254
2239_2256del18
6255
2237_2254del18
12367
2240_2254del15
12369
2240_2257del18
12370
6239
6252
6253
2239_2248TTAAGAGAAG>C
12382
2239_2251>C
12383
2237_2255>T
12384
2235_2255>AAT
12385
2237_2252>T
12386
2239_2258>CA
12387
2239_2256>CAA
12403
2237_2253>TTGCT
12416
2238_2252>GCA
12419
2238_2248>GC
12422
2237_2251del15
12678
2236_2253del18
12728
2235_2248>AATTC
13550
2235_2252>AAT
13551
2235_2251>AATTC
13552
2253_2276del24
13556
2237_2257>TCT
18427
2238_2252del15
23571
2233_2247del15
26038
2303G>T
2369C>T
2307_2308ins9GCCAGCGTG
2319_2320insCAC
2310_2311insGGT
2311_2312ins9GCGTGGACA
2309_2310AC>CCAGCGTGGAT
2573T>G
2573_2574TG>GT
2582T>A
6241
6240
12376
12377
12378
13428
13558
6224
12429
6213
6
Zasady procedury
Test cobas® EGFR jest oparty na dwóch głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu
pozyskania DNA z próbek FFPET oraz (2) amplifikacji PCR i detekcji docelowego DNA z użyciem
komplementarnych par primerów oraz znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych.
Test cobas® EGFR jest przeznaczony do detekcji następujących mutacji:
·
·
·
·
Ekson 18.: G719X (G719A, G719C i G719S)
Ekson 19.: delecje i mutacje złożone
Ekson 20.: S768I, T790M i insercje
Ekson 21.: L858R i L861Q
Detekcję mutacji uzyskuje się w toku analizy PCR za pomocą analizatora cobas z 480. Do każdego przebiegu
testowego włącza się kontrolę mutacji oraz kontrolę ujemną w celu potwierdzenia ważności przebiegu.
Przygotowanie próbek
Zestawy cobas® DNA Sample Preparation Kit oraz cobas® cfDNA Sample Preparation Kit to zestawy do
ręcznego przygotowywania próbek na podstawie wiązania kwasu nukleinowego do włókien szklanych.
Proteaza i chaotropowy bufor do lizy/wiążący uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA przed
DNazami. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym
mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W
trakcie wirowania DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie
jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania.
Zaadsorbowane kwasy nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Następnie docelowy
DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i
detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test v2.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
W teście cobas® EGFR wykorzystuje się primery określające specyficzne sekwencje par zasad każdej z
mutacji docelowych. W przypadku mutacji substytucji G719X w eksonie 18. docelowe są sekwencje liczące od
104 do 106 par zasad; w przypadku mutacji delecji w eksonie 19. docelowe są sekwencje liczące od 125 do
141 par zasad; w przypadku mutacji substytucji S768I w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 133 pary
zasad; w przypadku mutacji substytucji T790M w eksonie 20. docelowa jest sekwencja licząca 118 par zasad;
w przypadku mutacji insercji w eksonie 20. docelowe są sekwencje liczące od 125 do 143 par zasad; w
przypadku mutacji substytucji L858R w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licząca 138 par zasad; w
przypadku mutacji substytucji L861Q w eksonie 21. docelowa jest sekwencja licząca 129 par zasad.
Amplifikacja zachodzi jedynie w regionach genu kodującego EGFR między primerami; całość genu kodującego
EGFR nie ulega amplifikacji.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Do amplifikacji sekwencji docelowej wykorzystuje się polimerazę DNA Z05-AS1 pochodzącą ze szczepów
Thermus. Mieszanina PCR jest najpierw podgrzewana w celu denaturacji genomowego DNA oraz odsłonięcia
sekwencji docelowych primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne
hybrydyzują z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA Z05 w obecności kationu dwuwartościowego
metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dNTP) wydłuża każdy przyłączony w wyniku hybrydyzacji
primer i w ten sposób następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając
dwuniciowej kopii DNA, zawierającej regiony genu kodującego EGFR z docelowymi sekwencjami par zasad.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
7
Proces ten powtarza się wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu)
ulega podwojeniu.
Zautomatyzowana detekcja mutacji w czasie rzeczywistym
Test cobas® EGFR wykorzystuje technologię PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). W tej reakcji
każda swoista dla sekwencji docelowej sonda oligonukleotydowa jest znakowana barwnikiem
fluorescencyjnym, służącym jako reporter, a także cząsteczką pełniącą funkcję wygaszacza absorbującego
(wygaszającego) emisje fluorescencyjne pochodzące z barwnika reporterowego w nienaruszonej sondzie. W
trakcie każdego cyklu amplifikacji sonda komplementarna do sekwencji jednoniciowego DNA w amplikonie
wiąże się z nią, a następnie ulega rozszczepieniu pod wpływem polimerazy DNA Z05-AS1, wykazującej
aktywność nukleazy w kierunku od końca 5' do końca 3' łańcucha. Po oddzieleniu się barwnika reporterowego
od wygaszacza wskutek aktywności nukleazy można zmierzyć promieniowanie fluorescencyjne o
charakterystycznej długości fali po wzbudzeniu barwnika reporterowego odpowiednim widmem światła. Do
znakowania mutacji docelowych dla tego testu użyto czterech różnych barwników reporterowych. Produkty
amplifikacji docelowych siedmiu sekwencji wchodzących w skład genu kodującego EGFR są wykrywane
niezależnie w toku trzech reakcji przez pomiar fluorescencji o czterech charakterystycznych długościach fal w
wydzielonych kanałach optycznych.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki jest osiągana w teście cobas® EGFR dzięki
użyciu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trifosforanu dezoksyurydyny (dUTP).7 Enzym AmpErase
rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę, ale nie DNA zawierającego
tymidynę. Dezoksyurydyna nie wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna
w amplikonie wskutek użycia dUTP zamiast trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z trójfosforanów
nukleotydów w odczynnikach Master Mix; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę.
Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase
przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase zawarty w odczynnikach Master Mix katalizuje rozkład
DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha
dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym przy wartościach pH
oznaczających środowisko zasadowe łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się
dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w
temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on
amplikonu docelowego. Wykazano, że test cobas® EGFR inaktywuje zmutowany amplikon EGFR zawierający
dezoksyurydynę.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
8
CZĘŚĆ A: Do stosowania z próbkami tkanek
®
W PRZYPADKU PRÓBEK TKANKI NALEŻY POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z
INSTRUKCJAMI W CZĘŚCI A.
W PRZYPADKU PRÓBEK OSOCZA NALEŻY POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z
INSTRUKCJAMI W CZĘŚCI B.
CZĘŚĆ A: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI TKANKI
Próbki FFPET są przetwarzane w celu izolowania genomowego DNA przy użyciu zestawu cobas® DNA
Sample Preparation Kit, manualnego przygotowywania próbek opartego na podstawie wiązania kwasu
nukleinowego do włókien szklanych. Pozbawiony parafiny skrawek próbki FFPET o grubości 5 mikronów
zostaje poddany lizie przez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do
lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony genomowy DNA przed DNazami. W dalszej
kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i
przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania
genomowy DNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak
sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania.
Zaadsorbowane kwasy nukleinowe są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Ilość genomowego
DNA określa się spektrofotometrycznie i dostosowuje do ustalonego stężenia dodawanego do mieszaniny do
amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje detekcji w analizatorze cobas z 480 z
użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem cobas® EGFR Mutation Test
v2.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
9
®
Materiały i odczynniki
Dostarczane materiały i odczynniki
Zestaw/kasety
®
cobas DNA Sample
Preparation Kit
24 testów
(P/N: 05985536190)
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
a
Ilość na test
Symbol bezpieczeństwa i ostrzeżenie
DNA TLB
(DNA Bufor do lizy tkanek)
(P/N: 05517613001)
Bufor Tris-HCl
Chlorek potasu
0,04% EDTA
0,1% Triton X-100
0,09% azydku sodu
1 x 10 ml
PK
(Proteinaza K)
(P/N: 05860695102)
Proteinaza K, liofilizowana
1 x 100 mg
Niebezpieczeństwo
H302 + H332: Działa szkodliwie po
połknięciu i w następstwie wdychania.
H315: Działa drażniąco na skórę.
H317: Może powodować reakcję
alergiczną skóry.
H318: Powoduje poważne uszkodzenie
oczu.
H334: Może powodować objawy alergii
lub astmy lub trudności w oddychaniu w
następstwie wdychania.
H335: Może powodować podrażnienie
dróg oddechowych.
P261: Unikać wdychania
pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej
cieczy.
P280: Stosować rękawice
ochronne/ochronę oczu/ochronę twarzy.
P284: Stosować indywidualne środki
ochrony dróg oddechowych.
P305 + P351 + P338 + P310: W
PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU:
Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut.
Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i
można je łatwo usunąć. Nadal płukać.
Natychmiast skontaktować się z
OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem.
P342 + P311: W przypadku wystąpienia
objawów ze strony układu oddechowego:
Skontaktować się z OŚRODKIEM
ZATRUĆ lub lekarzem.
P362 + P364: Zanieczyszczoną odzież
zdjąć i wyprać przed ponownym użyciem.
Elementy i składniki odczynników
DNA PBB
(DNA Bufor wiążący parafinę)
(P/N: 05517621001)
Bufor Tris-HCl
49,6% chlorowodorku guanidyny
0,05% mocznika
17,3% Triton X-100
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
(P/N: 05517656001)
Bufor Tris-HCl
64% chlorowodorku guanidyny
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
(P/N: 05517664001)
Bufor Tris-HCl
Chlorek sodu
DNA EB
(DNA bufor do elucji)
(P/N: 05517630001)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
1 x 10 ml
1 x 25 ml
1 x 12,5 ml
1 x 6 ml
FT
(Probówki z filtrem i z zatyczkami)
(P/N: 05089506102)
1 x 25 sztuk
CT
(Probówki zbiorcze)
(P/N: 05880513001)
3 x 25 sztuk
10
®
Zestaw/kasety
®
cobas EGFR
Mutation Test v2
24 testów
(P/N: 07248563190)
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
Ilość na test
EGFR MMX-1
(EGFR Master Mix 1)
(P/N 06471366001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
3,13% dimetylosulfotlenku
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
< 0,01% polimerazy DNA Z05-AS1
(bakteryjnej)
< 0,01% enzymu AmpErase (uracyloN-glikozylazy) (bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
< 0,01% primerów sensownych i
antysensownych EGFR
< 0,01% sond EGFR znakowanych
barwnikiem fluorescencyjnym
EGFR MMX-2
(EGFR Master Mix 2)
(P/N 06471382001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
(bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
antysensownych EGFR
EGFR MMX-3 v2
(EGFR Master Mix 3)
(P/N 07248610001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
(bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
antysensownych EGFR
a
Nie dotyczy
Nie dotyczy
Nie dotyczy
11
®
Zestaw/kasety
®
cobas EGFR
Mutation Test v2
24 testów
(P/N: 07248563190)
a
MGAC
(Octan magnezu)
(P/N 05854326001)
Octan magnezu
0,09% azydku sodu
EGFR MC
(EGFR Kontrola mutacji)
(P/N 06471455001)
Bufor Tris
EDTA
Poli-rA RNA (syntetyczny)
0,05% azydku sodu
< 0,1% plazmidowego DNA
(bakteryjnego) zawierającego
sekwencje eksonów: 18., 19., 20. i
21. genu kodującego EGFR
< 0,1% naturalnie występującego
DNA genu kodującego EGFR (z
hodowli komórkowej)
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
(P/N 05854474001)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
Ilość na test
a
Nie dotyczy
6 x 0,2 ml
Nie dotyczy
6 x 0,1 ml
Nie dotyczy
2 x 3,5 ml
Oznakowanie bezpieczeństwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE.
Przechowywanie i użytkowanie odczynników
Odczynnik
®
cobas DNA Sample Preparation Kit*
®
cobas EGFR Mutation Test v2**
Temperatura
przechowywania
Czas przechowywania
od 15°C do 30°C
Po otwarciu zachowują stabilność do 8-krotnego
użycia w ciągu 90 dni lub do podanej daty
ważności, w zależności od tego, który termin
wypada wcześniej.
od 2°C do 8°C
Po otwarciu zachowują stabilność do 4-krotnego
użycia w ciągu 90 dni lub do podanej daty
ważności, w zależności od tego, który termin
wypada wcześniej.
Uwaga: Nie wolno zamrażać odczynników z wyjątkiem odczynnika PK.
* Po dodaniu jałowej wody wolnej od nukleaz do odczynnika PK, niezużyty, rozpuszczony odczynnik PK należy
przechowywać w porcjach o równych objętościach po 450 µl w temperaturze -20°C. Po rozpuszczeniu odczynnik PK trzeba
zużyć w ciągu 90 dni albo do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej. Po dodaniu etanolu
bezwodnego odczynniki WB I i WB II należy przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C. Wymienione roztwory
robocze zachowują stabilność przez 90 dni albo do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej.
** Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie
odczynnika MGAC do EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2) należy chronić przed długotrwałą
ekspozycją na światło. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do
8°C. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika MMX w ciągu 1 godziny od jego
przygotowania. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i
kontrolnych do roboczego odczynnika MMX.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
12
®
Wymagane materiały dodatkowe
Materiały
P/N
Ksylen (ACS, ≥ 98,5% ksylenów)
Dowolny dostawca
Etanol bezwodny (200 proof, do biologii molekularnej)
Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat.
BP2818-500 albo odpowiednik
Izopropanol (ACS, >99,5%)
Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A4511 albo odpowiednik
Jałowa woda wolna od nukleazy (do biologii molekularnej)
Applied Biosystems (Ambion) AM9937 lub GE
TM
Healthcare Hyclone SH3053801 albo odpowiednik
Wybielacz
Dowolny dostawca
70% etanol
Dowolny dostawca
Jałowe, jednorazowe, serologiczne pipety 5 i 25 ml
Dowolny dostawca
®
Płytki z mikrodołkami systemu cobas 4800 (płytki AD) i film
Roche 05232724001
do zaklejania
®
Aplikator filmu do zaklejania systemu cobas 4800
®
(dostarczany wraz z instalacją systemu cobas 4800)
Roche 04900383001
Pipetory regulowane* (mogące pipetować 5–1000 µl)
Dowolny dostawca
Wolne od DNaz końcówki z osłoną aerozolową lub dodatnim
Dowolny dostawca
wypieraniem.
TM
Pipet-Aid *
Drummond 4-000-100 albo odpowiednik
Mikrowirówka laboratoryjna* (umożliwiająca wirowanie przy
20 000 x g)
Eppendorf 5430 lub 5430R albo odpowiednik
Dwa suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie
probówek do mikrowirówki do temperatury 56°C i 90°C*
Dowolny dostawca
TM
Probówki do mikrowirówki Safe-Lock (jałowe o pojemności
Eppendorf 022363204 albo odpowiednik
1,5 ml, wolne od RNaz/DNaz, o czystości do PCR)
Statywy do probówek do mikrowirówki
Dowolny dostawca
Spektrofotometr do pomiaru stężenia DNA*
Dowolny dostawca
Mieszadło wibracyjne*
Dowolny dostawca
Rękawiczki jednorazowe, bezpudrowe
Dowolny dostawca
Kalibrowane termometry do suchego bloku grzejnego*
Dowolny dostawca
Łaźnia wodna*, umożliwiająca utrzymywanie temperatury
37°C
Dowolny dostawca
Skalpel z jednostronnym ostrzem lub podobne narzędzie
Dowolny dostawca
Całe wyposażenie powinno być konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta.
W celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących materiałów sprzedawanych oddzielnie prosimy o kontakt z
miejscowym przedstawicielstwem firmy Roche.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
13
®
Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane
Wymagane urządzenia i oprogramowanie, lecz niedostarczane
Analizator cobas z 480
®
Jednostka sterująca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemu w wersji 2.1 lub nowszej
Pakiet oprogramowania EGFR Tissue Analysis Package Software w wersji 1.0 lub nowszy
Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB
Drukarka (np. HP P2055d)
Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Podobnie jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe
znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
·
Do stosowania wyłącznie w diagnostyce in vitro.
·
Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym
przedstawicielstwie firmy Roche.
·
Niniejszy test jest przeznaczony do badania próbek FFPET NSCLC. Z próbkami należy obchodzić się
tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone
w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories8 oraz w dokumencie M29-A4
CLSI.9
·
Odczynniki DNA PBB i DNA TLB zawierają Triton X-100, środek drażniący błony śluzowe. Należy
unikać kontaktu tych odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi.
·
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny i podczas używania go należy korzystać z wyciągu
chroniącego przed chemikaliami. Należy go wyrzucać wraz z odpadami chemicznymi zgodnie z
przepisami lokalnymi, stanowymi i federalnymi.
·
Zaleca się używanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipetorów wolnych od DNaz.
Dobra praktyka laboratoryjna
·
Nie należy pipetować za pomocą ust.
·
Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium.
·
Po pracy z próbkami i zestawami odczynników należy dokładnie umyć ręce.
·
Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą,
oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wystąpienia należy natychmiast
spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie działania lecznicze, może dojść do
oparzeń. W razie rozlania przed wytarciem należy rozcieńczyć wodą.
·
Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze świeżo przygotowanym
roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcieńczyć domowy
wybielacz w stosunku 1:10). Następnie należy przetrzeć powierzchnię 70% etanolem.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
14
®
Uwaga: Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj
zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10
daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
Zanieczyszczenie
·
W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie rękawic i ich zmiana pomiędzy pracą z
próbkami i odczynnikami testu cobas® EGFR. Podczas pracy z próbkami należy unikać
zanieczyszczenia rękawiczek.
·
Rękawiczki należy często zmieniać, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia.
·
Rękawiczki należy zmieniać przed opuszczeniem obszarów izolacji DNA lub w przypadku podejrzenia
kontaktu z roztworami lub próbką.
·
Należy unikać mikrobiologicznego i przez rybonukleazy zanieczyszczenia odczynników.
·
Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i
detekcji. Materiały i urządzenia powinny być przeznaczone do każdego z działań; nie mogą być
stosowane w innych działaniach lub przenoszone pomiędzy obszarami. Na przykład pipetory i
materiały przeznaczone do izolacji DNA nie mogą być stosowane do przygotowywania odczynników
do amplifikacji i detekcji.
·
Zdecydowanie zaleca się, aby przebieg pracy w laboratorium był jednokierunkowy i polegał na
zakończeniu jednej czynności przed przejściem do kolejnej. Na przykład izolację DNA należy
zakończyć przed rozpoczęciem amplifikacji i detekcji. Izolacja DNA powinna być prowadzona w
obszarze oddzielonym od amplifikacji i detekcji. Aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnika roboczego
Master Mix próbkami DNA, obszar roboczy amplifikacji i detekcji powinien być dokładnie oczyszczony
przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix.
Integralność
·
Nie wolno używać zestawów po upływie daty ważności.
·
Nie należy zlewać odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii.
·
Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności.
·
Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie
wykorzystywać ponownie.
·
Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta.
Utylizacja
·
Odczynniki DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2, EGFR MC i
DNA SD zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory
zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody,
aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
·
Należy wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
15
®
Rozlanie płynów i czyszczenie
·
Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany
bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i
wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy
używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu.
·
Jeśli do rozlania płynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas® 4800, należy postępować zgodnie z
instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podręczniku systemu — system cobas® 4800 w celu
przeprowadzenia czyszczenia.
·
Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza).
Czyszczenie analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w
Podręczniku użytkownika systemu cobas® 4800.
·
Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka
zanieczyszczenia analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga:
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Pobieranie próbek
Próbki NSCLC FFPET zostały zatwierdzone do wykorzystania w teście cobas® EGFR.
Przechowywanie i trwałość próbek podczas transportu
Próbki FFPET NSCLC można transportować w temperaturze od 15°C do 30°C. Próbki FFPET muszą być
transportowane zgodnie z krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu
czynników chorobotwórczych10.
Stabilność próbek FFPET przechowywanych w temperaturze od 15°C do 30°C potwierdzono przez okres do
12 miesięcy od daty pobrania. Skrawki o grubości pięciu mikronów, osadzone na szkiełkach, można
przechowywać w temperaturze od 15°C do 30°C do 60 dni.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
16
®
Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej
Próbki przetworzone (ekstrahowany DNA) są stabilne dla:
Temperatura
przechowywania
ekstrahowanego DNA
Od -15°C do -25°C
Od 2°C do 8°C
Od 15°C do 30°C
Czas przechowywania
Do 3 cykli rozmrażania
przez 60 dni
Do 14 dni
Do 1 dnia
Ekstrahowany DNA powinien być używany w zalecanych okresach przechowywania lub przed upływem daty
ważności zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit użytego do ekstrahowania DNA, w zależności od
tego, co nastąpi wcześniej.
Procedura testowa
Wykonywanie oznaczenia
Ryc. 1
®
®
Przebieg pracy z testem cobas EGFR Mutation Test v2 i zestawem cobas DNA Sample Preparation Kit
1
Uruchomienie systemu.
2
Wykonanie czynności konserwacyjnych w odniesieniu do aparatu.
3
Wyjęcie próbek i odczynników z miejsca przechowywania.
4
Pozbawienie próbek parafiny.
5
Przeprowadzenie izolacji DNA.
6
Wymycie DNA.
7
Utworzenie harmonogramu pracy i wydrukowanie układu płytki.
8
Przygotowanie odczynników do amplifikacji.
9
Umieszczenie odczynników do amplifikacji na płytce z mikrodołkami.
10
Umieszczenie próbki na płytce z mikrodołkami.
11
Uszczelnienie płytki z mikrodołkami.
12
Umieszczenie płytki z mikrodołkami w analizatorze cobas z 480.
13
Rozpoczęcie przebiegu.
14
Przeanalizowanie wyników.
15
W przypadku korzystania z systemu LIS: przesłanie wyników do systemu LIS.
16
Wyjęcie płytki z analizatora.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
17
®
Instrukcja użytkowania
Uwaga:
Do badania za pomocą testu cobas® EGFR można używać wyłącznie skrawków próbki
FFPET NSCLC o grubości 5 mikronów, zawierających co najmniej 10% tkanki guza z danego
obszaru. Każdą próbkę zawierającą mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru należy po
pozbawieniu jej parafiny przeciąć makroskopowo.
Uwaga:
Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w
Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
Uwaga:
Suche bloki grzejne, umożliwiające ogrzewanie probówek do mikrowirówki Safe-LockTM,
należy włączyć i nastawić na temperaturę 56°C i 90°C.
Wielkość przebiegu
Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w każdej płytce z 96
mikrodołkami. Przy przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki trzeba będzie
użyć wielu zestawów testu cobas® EGFR.
Test cobas® EGFR zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3
próbki (plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw.
Przygotowanie odczynników
Przed użyciem zestawu po raz pierwszy przygotować odczynniki robocze zgodnie z informacją poniżej. Do
dozowania wody użyć pipety serologicznej 5 ml. Do dozowania etanolu użyć pipet serologicznych 25 ml. Jeśli
proteinaza K została już rozpuszczona i zamrożona, rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika,
wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego.
Odczynniki
Rozpuszczenie / Przygotowanie
Proteinaza K
(PK)
Rozpuścić proteinazę K (PK) przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody niezawierającej
nukleazy (o stopniu czystości odpowiednim do PCR) za pomocą jałowej, jednorazowej
pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać zawartość, odwracając fiolkę do góry
dnem od 5 do 10 razy. Przenieść porcję 450 µl rozpuszczonej PK do probówek do
TM
mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20°C
przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi
wcześniej. Jeśli proteinaza K została już rozpuszczona i zamrożona, przed
pozbawieniem próbek parafiny rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika,
wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu
testowego (każda próbka wymaga 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK).
Bufor do wymywania I
(WB I)
Przygotować roboczy odczynnik WB I dodając 15 ml alkoholu bezwodnego do butelki
WB I. Wymieszać odwracając butelkę od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano
etanol, i wpisać datę. Przechowywać odczynnik WB I w temperaturze od 15°C do 30°C
przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi
wcześniej.
Bufor do wymywania II
(WB II)
Przygotować roboczy odczynnik WB II przez dodanie do butelki z odczynnikiem WB II 50
ml etanolu bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do góry dnem od 5
do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano etanol, i wpisać datę. Przechowywać
odczynnik WB II w temperaturze od 15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty
ważności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze od 15°C do 30°C powinny być klarowne. Jeżeli w
którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrzać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37°C aż do
rozpuszczenia się osadu. Nie wolno używać odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
18
®
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach
Uwaga:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek
parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział
Ostrzeżenia i środki ostrożności.
Uwaga:
Jeżeli próbka zawiera poniżej 10% tkanki guza z danego obszaru, skrawek należy
przeciąć makroskopowo.
1. Włożyć szkiełko z osadzonym skrawkiem FFPET o grubości 5 mikronów do pojemnika zawierającego
ksylen w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki; pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut.
2. Przenieść szkiełko do pojemnika z etanolem bezwodnym w ilości wystarczającej do przykrycia tkanki;
pozostawić do nasiąknięcia przez 5 minut.
3. Wyjąć szkiełko z etanolu i odczekać, aż skrawek całkowicie wyschnie na powietrzu (od 5 do 10 minut).
4. Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy przeciąć ją makroskopowo.
5. Oznakować jedną probówkę do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemności 1,5 ml na każdą próbkę
informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie próbki.
6. Dodać 180 µl odczynnika DNA TLB do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemności 1,5 ml.
7. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM zawierającej
odczynnik DNA TLB.
8. Zeskrobać tkankę ze szkiełka do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM. Zanurzyć tkankę w mieszaninie
odczynników DNA TLB/PK.
9. Kontynuować postępowanie od punktu 1 procedury izolacji DNA.
Pozbawienie parafiny skrawków FFPET nieosadzonych na szkiełkach
Uwaga:
Ksylen to niebezpieczny związek chemiczny. Wszystkie etapy pozbawiania próbek
parafiny należy wykonywać pod wyciągiem chroniącym przed chemikaliami. Patrz rozdział
Ostrzeżenia i środki ostrożności.
Uwaga:
Jeśli próbka zawiera mniej niż 10% tkanki guza z danego obszaru, należy osadzić skrawek
na szkiełku w celu makroskopowego przecięcia, a następnie postępować zgodnie z procedurą
omówioną w rozdziale „Pozbawienie parafiny skrawków FFPET osadzonych na szkiełkach”.
1. Włożyć jeden skrawek FFPET o grubości 5 mikronów do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM o
pojemności 1,5 ml oznakowanej informacjami umożliwiającymi zidentyfikowanie każdej próbki.
2. Dodać 500 µl ksylenu do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM, zawierającej skrawek FFPET.
3. Mieszać dokładnie na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
4. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
5. Dodać 500 µl etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
6. Odstawić probówkę na 5 minut w temperaturze od 15°C do 30°C.
7. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez
uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
8. Dodać 1 ml etanolu bezwodnego i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
9. Wirować z przyspieszeniem od 16 000 x g do 20 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant bez
uszkodzenia peletki. Wyrzucić supernatant do odpadów chemicznych.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
19
®
10. Jeśli peletka unosi się w pozostałym supernatancie, ponownie wirować przez 1 minutę z przyspieszeniem
od 16 000 x g do 20 000 x g. Usunąć pozostały supernatant.
11. Suszyć peletkę tkanki przez 10 minut w bloku grzejnym o temperaturze 56°C w otwartej probówce.
12. Przed przejściem do następnego etapu należy upewnić się, że etanol został całkowicie odparowany i
peletka jest sucha.
13. W razie potrzeby suche peletki można przechowywać do 24 godzin w temperaturze od 2°C do 8°C.
14. Wytworzyć z peletki tkanki ponownie zawiesinę w 180 µl odczynnika DNA bufor do lizy tkanek (DNA TLB).
15. Dodać 70 µl rozpuszczonego odczynnika PK.
16. Kontynuować postępowanie od punktu 1 procedury izolacji DNA.
Procedura izolacji DNA
Uwaga:
Jednocześnie z próbką(-ami) należy przeprowadzić przetwarzanie kontroli ujemnej.
Przygotować kontrolę ujemną przez połączenie 180 µl odczynnika DNA Bufor do lizy tkanek
(DNA TLB) i 70 µl roztworu odczynnika PK w probówce do mikrowirówki Safe-LockTM o
pojemności 1,5 ml, oznakowanej napisem NEG. Przetwarzanie kontroli ujemnej powinno
przebiegać według takiej samej procedury, jak przetwarzanie próbek.
1. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund probówki zawierające mieszaninę próbka/DNA
TLB/PK i mieszaninę kontroli ujemnej (NEG).
Uwaga:
Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
2. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 56°C i inkubować przez 60 minut.
3. Mieszać probówki na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund.
Uwaga:
Tkanka musi być całkowicie zanurzona w mieszaninie DNA TLB/PK.
4. Umieścić probówki w suchym bloku grzejnym o temperaturze 90°C i inkubować przez 60 minut.
Uwaga:
Podczas inkubacji należy przygotować wymaganą liczbę probówek z filtrem (FT) z
zawiasowymi zatyczkami, umieszczając każdą FT na probówce zbiorczej (CT) i oznakowując
zatyczkę każdej FT odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
Uwaga:
Na każdą próbkę będą potrzebne: 1 FT, 3 CT i 1 probówka do elucji (probówka do
mikrowirówki Safe-LockTM o pojemności 1,5 ml).
Uwaga:
Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do
mikrowirówki o pojemności 1,5 ml) odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę lub
kontrolę.
5. Pozostawić probówki do schłodzenia do temperatury od 15°C do 30°C. Po schłodzeniu odwirować
pulsacyjnie, aby zgromadzić płyn z zatyczek.
6. Dodać do każdej probówki po 200 µl odczynnika DNA PBB i wymieszać zawartość przez trzykrotne
pobranie mieszaniny pipetą i jej wypuszczenie.
7. Inkubować probówki w temperaturze od 15°C do 30°C przez 10 minut.
8. Dodać do każdej probówki 100 µl izopropanolu i 3 razy wymieszać lizat przez nabieranie pipetą i
wypuszczanie.
9. Przenieść każdy lizat do właściwie oznakowanej jednostki FT/CT.
10. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę.
11. Umieścić każdą probówkę FT na nowej probówce CT. Wyrzucić zawartość ze starej probówki CT do
odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usunąć zużytą probówkę CT.
12. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej probówki FT.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
20
®
Uwaga:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w rozdziale „Przygotowanie
odczynników”.
14. Wyrzucić zawartość każdej probówki CT do odpadów chemicznych. Umieścić probówkę FT z powrotem
na tej samej probówce CT.
15. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej probówki FT.
Uwaga:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w rozdziale „Przygotowanie
odczynników”.
18. Wirować jednostki FT/CT z przyspieszeniem od 16 000 do 20 000 x g przez 1 minutę, aby osuszyć
membrany filtrów.
19. Umieścić każdą FT w probówce do elucji (probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml), oznakowanej
uprzednio informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę. Wyrzucić zawartość ze zużytej probówki CT
do odpadów chemicznych i w odpowiedni sposób usunąć zużytą probówkę CT.
20. Dodać po 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany każdej probówki FT bez dotykania membrany
probówki FT.
21. Inkubować probówkę FT z probówką do elucji w temperaturze od 15°C do 30°C przez 5 minut.
22. Wirować probówkę FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat
do probówki do elucji. Usunąć w odpowiedni sposób zużytą probówkę FT.
23. Zamknąć zatyczkę na probówce do elucji. Probówka do elucji zawiera roztwór podstawowy DNA. Przejść
do punktu 1 w rozdziale Ocena ilościowa stężenia DNA.
Uwaga:
Pomiar stężenia DNA należy przeprowadzać natychmiast po zakończeniu procedury
izolacji DNA i przed odłożeniem materiału do przechowywania.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
21
®
Ocena ilościowa stężenia DNA
1. Wymieszać każdy roztwór podstawowy DNA na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
2. Przeprowadzić ocenę ilościową stężenia DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z protokołem
postępowania, podanym przez producenta urządzenia. Do wyzerowania urządzenia użyć odczynnika DNA
EB. Należy obliczyć średnią z dwóch zgodnych odczytów. Wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w
granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA > 20,0 ng/µl. W przypadku odczytów
stężenia DNA < 20,0 ng/µl wyniki dwóch pomiarów powinny mieścić się w granicach ± 2 ng/µl. Jeżeli
wyniki dwóch pomiarów nie mieszczą się w granicach ± 10% każdego z nich przy odczytach stężenia DNA
> 20,0 ng/µl lub w granicach ± 2 ng/µl przy odczytach stężenia DNA < 20,0 ng/µl, należy uzyskać
dodatkowe 2 odczyty, aby wymogi badania zostały spełnione. Wówczas należy obliczyć średnią z dwóch
nowych wyników pomiarów.
Uwaga:
Nie ma potrzeby wykonywania pomiarów w przypadku roztworu podstawowego DNA,
pochodzącego z przetworzonej kontroli ujemnej (NEG CT).
3. Stężenie roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbek, musi być > 2 ng/µl, aby można było
wykonać test cobas® EGFR. Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej amplifikacji/detekcji z użyciem w
każdej amplifikacji/detekcji 25 µl rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl (co daje
ogółem 50 ng DNA).
Uwaga:
Aby można było przeprowadzić test cobas® EGFR Mutation, każdy roztwór podstawowy
DNA musi mieć minimalne stężenie 2 ng/µl. Jeżeli stężenie roztworu podstawowego DNA jest <
2 ng/µl, należy powtórzyć procedury: pozbawiania próbek parafiny, izolacji DNA i oceny
ilościowej stężenia DNA z użyciem dwóch skrawków FFPET tej próbki o grubości 5 µm. W
przypadku próbek osadzonych na szkiełkach po pozbawieniu ich parafiny należy połączyć
tkankę z obu skrawków w jednej probówce, zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK i
przeprowadzić izolację oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. W
przypadku próbek nieosadzonych na szkiełkach należy połączyć oba skrawki w jednej
probówce i zanurzyć tkankę w odczynnikach DNA TLB + PK, po czym przeprowadzić izolację
oraz ocenę ilościową stężenia DNA w sposób opisany powyżej. Jeżeli stężenie roztworu
podstawowego DNA nadal jest < 2 ng/µl, należy zwrócić się do ośrodka klinicznego,
zlecającego wykonanie badania, o przysłanie kolejnej próbki FFPET.
Uwaga:
Przetwarzane próbki (wyizolowane DNA) są stabilne maksymalnie przez 24 godziny w
temperaturze od 15°C do 30°C, maksymalnie przez 14 dni w temperaturze od 2°C do 8°C,
maksymalnie przez 60 dni w temperaturze od -15°C do -25°C lub po przejściu 3 cykli zamrażania
i rozmrażania przy przechowywaniu w temperaturze od -15°C do -25°C. Ekstrahowane DNA
powinno zostać poddane amplifikacji podczas okresu przechowywania zalecanego w danych
warunkach lub przed upłynięciem daty ważności zestawu cobas® DNA Sample Preparation Kit
użytego do wyizolowania DNA w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
Amplifikacja i detekcja
Uwaga:
Aby zapobiec zanieczyszczeniu roboczego odczynnika MMX
próbkami DNA, należy przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od
obszaru wykonywania izolacji DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie
oczyścić obszar roboczy amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia należy
dokładnie przetrzeć wszystkie powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5%
roztworem podchlorynu sodu, a następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu płynny
wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o
stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór
podchlorynu sodu.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
22
®
Konfigurowanie aparatu
Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji
obsługi analizatora cobas z 480.
Konfiguracja zlecenia testu
Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu EGFR zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora
cobas® 4800 System cobas z 480 oraz podręczniku operatora oprogramowania cobas® EGFR Mutation Test
v2.
Wygenerować mapę płytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli do przebiegu. Kontrola mutacji jest
umieszczona w pozycjach A01–A03 płytki. Kontrola ujemna jest umieszczona w pozycjach B01–B03 płytki.
Następnie rozcieńczone próbki są dodawane w zestawach po 3 kolumny począwszy od C01–C03 do H09–
H12 jak przedstawia to Ryc. 2.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
23
®
Ryc. 2
Rząd/k
olumna
®
Układ płytki dla testu cobas EGFR Mutation Test v2
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
A
MC
MMX 1
MC
MMX 2
MC
MMX 3
v2
S7
MMX 1
S7
MMX 2
S7
MMX 3
v2
S15
MMX 1
S15
MMX 2
S15
MMX 3
v2
S23
MMX 1
S23
MMX 2
S23
MMX 3
v2
B
NEG
MMX 1
NEG
MMX 2
S8
MMX 1
S8
MMX 2
S8
MMX 3
v2
S16
MMX 1
S16
MMX 2
S24
MMX 2
S24
MMX 3
v2
S1
MMX 1
S1
MMX 2
S9
MMX 1
S9
MMX 2
S9
MMX 3
v2
S17
MMX 1
S17
MMX 2
S16
MMX 3
v2
S17
MMX 3
v2
S24
MMX 1
C
NEG
MMX 3
v2
S1
MMX 3
v2
S25
MMX 1
S25
MMX 2
S25
MMX 3
v2
D
S2
MMX 1
S2
MMX 2
S2
MMX 3
v2
S10
MMX 1
S10
MMX 2
S10
MMX 3
v2
S18
MMX 1
S18
MMX 2
S18
MMX 3
v2
S26
MMX 1
S26
MMX 2
S26
MMX 3
v2
E
S3
MMX 1
S3
MMX 2
S3
MMX 3
v2
S11
MMX 1
S11
MMX 2
S11
MMX 3
v2
S19
MMX 1
S19
MMX 2
S19
MMX 3
v2
S27
MMX 1
S27
MMX 2
S27
MMX 3
v2
F
S4
MMX 1
S4
MMX 2
S4
MMX 3
v2
S12
MMX 1
S12
MMX 2
S12
MMX 3
v2
S20
MMX 1
S20
MMX 2
S20
MMX 3
v2
S28
MMX 1
S28
MMX 2
S28
MMX 3
v2
G
S5
MMX 1
S5
MMX 2
S13
MMX 1
S13
MMX 2
S21
MMX 2
S29
MMX 2
S6
MMX 2
S14
MMX 1
S14
MMX 2
S22
MMX 1
S22
MMX 2
S21
MMX 3
v2
S22
MMX 3
v2
S29
MMX 1
S6
MMX 1
S13
MMX 3
v2
S14
MMX 3
v2
S21
MMX 1
H
S5
MMX 3
v2
S6
MMX 3
v2
S30
MMX 1
S30
MMX 2
S29
MMX 3
v2
S30
MMX 3
v2
Gdzie: MC = kontrola mutacji, NEG = kontrola ujemna, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi Master Mix 1, 2 lub 3 v2.
Uwaga:
Każda próbka musi rozciągać się przez trzy kolejne kolumny w jednym rzędzie, aby
możliwe było utworzenie wyniku.
Uwaga:
Odczynnik roboczy Master Mix 1 musi być umieszczony w kolumnie 01, 04, 07 i 10 na
płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 2 musi być umieszczony w kolumnie 02, 05, 08 i 11 na
płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 3 v2 musi być umieszczony w kolumnie 03, 06, 09 i 12 na
płytce.
Uwaga:
Na jednej płytce można umieścić do 30 próbek. Jeżeli do przetworzenia wszystkich
próbek na płytce potrzebny jest więcej niż jeden zestaw odczynnika, wszystkie zestawy muszą
pochodzić z tej samej serii.
4. Włączyć analizator cobas z 480. Zanim będzie można rozpocząć przebieg, instrument będzie przez kilka
minut rozgrzewał się.
5. Włączyć jednostkę sterującą. Jednostka sterująca automatycznie zaloguje się do systemu Windows.
6. Kliknąć dwukrotnie ikonę oprogramowania cobas® 4800 i zalogować się, aby przeprowadzić przebieg
używając określonego identyfikatora użytkownika laboratorium i hasła.
7. Kliknąć w menu ikonę „New Run”.
8. Zostanie wyświetlone okno wyskakujące „Select Test”. Wybrać „EGFR Tissue Test” i kliknąć przycisk
„OK”.
9. Po wyświetleniu ekranu „Work Place” wpisać lub zeskanować kod kreskowy MWP w polu „Microwell Plate
ID”. Zeskanować w odpowiednich polach kody kreskowe identyfikatora zestawu do izolacji DNA oraz
identyfikator zestawu cobas® EGFR Mutation Test Reagent. W polu „Sample” wprowadzić „24” dla
pierwszego i „6” dla drugiego zestawu (jeżeli planowany jest przebieg dla pełnej płytki 30 próbek). Jeżeli
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
24
®
planowany jest przebieg dla mniej niż 24 próbek, należy wprowadzić odpowiednią liczbę w pole próbki w
pierwszym wierszu.
10. Pole „Sample ID” jest wypełniane automatycznie w pozycjach kontroli. Wpisać lub zeskanować unikatowy
identyfikator próbki dla każdej próbki w kolumnie „Sample ID”.
11. Po zakończeniu wprowadzania identyfikatorów próbek wybrać przycisk „Save” znajdujący się w lewym
dolnym rogu ekranu.
12. Zapisać plik pod domyślną nazwą przypisaną przez oprogramowanie.
13. Wygenerować układ płytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli w serii klikając przycisk Print i
wybierając File -> Print w oknie Preview. Zawsze wypełniać płytkę kolumnami zaczynając od EGFR MC w
pozycjach A01–A03 i EGFR NEG w pozycjach B01–B03. Mapować próbki zaczynając od pozycji C01–
C03 i kontynuować w dół do H01–H03, następnie przechodzić do pozycji A04–A06 w dół do H04–H06, aż
zostaną zmapowane wszystkie próbki (Ryc. 2.)
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z próbki
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń od 2 ng/µl do 36 ng/µl
Uwaga:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio
przed amplifikacją i detekcją.
Uwaga:
Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości
rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl, wynoszącej ogółem 75 µl (po
25 µl na każdą z trzech reakcji) (ogółem 150 ng DNA).
1. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) roztworu podstawowego DNA:
ilość µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ stężenie roztworu podstawowego DNA
[ng/µl]
2. Obliczyć dla każdej próbki potrzebną objętość (µl) rozcieńczalnika próbki DNA (DNA SD):
ilość µl odczynnika DNA SD = 90 µl – ilość µl roztworu podstawowego DNA
Przykład:
stężenie roztworu podstawowego DNA = 6,5 ng/µl
1. Liczba µl roztworu podstawowego DNA = (90 µl x 2 ng/µl) ÷ 6,5 ng/µl = 27,7 µl
2. Ilość µl odczynnika DNA SD = (90 µl – 27,7 µl) = 62,3 µl
Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA w przypadku stężeń > 36 ng/µl
Uwaga:
Roztwory podstawowe DNA, pochodzące z próbek, należy rozcieńczać bezpośrednio
przed amplifikacją i detekcją.
Uwaga:
Każdą próbkę poddaje się trzykrotnej amplifikacji/detekcji, co wymaga objętości
rozcieńczonego roztworu podstawowego DNA o stężeniu 2 ng/µl, wynoszącej ogółem 75 µl (po
25 µl na każdą z trzech reakcji) (ogółem 150 ng DNA).
1. W przypadku stężeń roztworu podstawowego DNA > 36 ng/µl do obliczania ilości odczynnika DNA
Rozcieńczalnik próbki (DNA SD), wymaganej do przygotowania co najmniej 90 µl rozcieńczonego
roztworu podstawowego DNA, należy użyć zamieszczonego poniżej wzoru. Ma to na celu zapewnienie, że
do badania każdej próbki zostanie użyta objętość co najmniej 5 µl roztworu podstawowego DNA.
2. Obliczyć dla każdej próbki objętość (µl) odczynnika DNA SD, potrzebną do rozcieńczenia 5 µl roztworu
podstawowego DNA do stężenia 2 ng/µl:
Wymagana obj. DNA SD w µl = [(5 µl roztworu podstawowego DNA x stężenie roztworu
podstawowego DNA w ng/µl) / 2 ng/µl] – 5 µl
Przykład:
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
25
®
Stężenie roztworu podstawowego DNA = 100 ng/µl
1. Wymagana obj. DNA SD w µl = ((5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl) – 5 µl = 245 µl
2. Użyć obliczonej objętości odczynnika DNA SD do rozcieńczenia 5 µl roztworu podstawowego
DNA.
Rozcieńczenie próbki
1. Przygotować stosowną liczbę probówek do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemności 1,5 ml na
rozcieńczenia DNA, oznakowując je odpowiednimi informacjami identyfikującymi próbkę.
2. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu, przenieść pipetą obliczone
objętości odczynnika DNA SD do odpowiednio oznakowanych probówek. Przenieść pipetą 45 µL
odczynnika DNA SD do probówki do mikrowirówki Safe-LockTM oznakowanej napisem NEG.
3. Mieszać każdy roztwór podstawowy DNA i kontrolę ujemną na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10 sekund.
4. Używając pipetora z końcówką zabezpieczoną przed powstawaniem aerozolu (nowa końcówka do
przenoszenia każdej próbki), delikatnie przenieść pipetą obliczoną objętość każdego roztworu
podstawowego DNA do odpowiedniej probówki zawierającej odczynnik DNA SD. Przenieść pipetą 45 µl
kontroli ujemnej (wyizolowanego eluatu) do probówki z napisem NEG.
5. Zamknąć probówki zatyczkami i mieszać zawartość każdej z nich na mieszadle wibracyjnym od 5 do 10
sekund.
6. Zmienić rękawiczki.
Konfiguracja reakcji
Przygotowanie roboczych odczynników Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2)
Uwaga:
Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX
są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło.
Uwaga:
Ze względu na lepkość odczynników EGFR MIX oraz roboczego odczynnika MMX
przenoszenie pipetą należy wykonywać powoli, aby zagwarantować podanie z końcówki całej
objętości mieszaniny.
Uwaga:
Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 i EGFR MMX-3 v2 mogą przybierać zabarwienie
jasnoniebieskie lub zbliżone do purpury. Nie wpływa to na działanie odczynnika.
Przygotować w oddzielnych probówkach do mikrowirówki Safe-LockTM o pojemności 1,5 ml trzy większe
porcje odczynników potrzebnych do sporządzenia roboczych odczynników MMX: jedną odczynnika EGFR
MMX-1, jedną odczynnika EGFR MMX-2 i jedną odczynnika EGFR MMX-3 v2.
1. Obliczyć objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 wymaganą do
sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX według następującego wzoru:
Wymagana objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 = (liczba próbek
+ 2 kontrole +1) x 20 µl
2. Obliczyć objętość odczynnika MGAC, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych
MMX, według następującego wzoru:
Wymagana objętość odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 5 µl
Posługując się Tabela 2 określić objętość każdego odczynnika, potrzebną do przygotowania roboczego
odczynnika MMX, na podstawie liczby próbek włączonych do przebiegu testowego.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
26
®
Tabela 2
Objętości odczynników, potrzebne do sporządzenia roboczego odczynnika MMX-1, roboczego odczynnika MMX-2
i roboczego odczynnika MMX-3 v2
Liczba próbek*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
MMX
20 µl
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
MGAC
5 µl
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
Całkowita obj.
każdego roboczego
odczynnika MMX (µl)
* Objętości odpowiadające liczbie próbek obliczono na podstawie sumy: liczba próbek + 2 kontrole + 1
3. Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek z odczynnikami EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 i MGAC
z miejsca, w którym były przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C. Przed użyciem każdego
odczynnika mieszać go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie
probówki. Oznakować jałową probówkę do mikrowirówki, przeznaczoną na roboczy odczynnik MMX-1,
roboczy odczynnik MMX-2 i roboczy odczynnik MMX-3 v2.
4. Dodać obliczoną objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 do
odpowiedniej probówki przeznaczonej na roboczy odczynnik MMX.
5. Dodać obliczoną objętość odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX.
6. Mieszać zawartość probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewnić dostateczne
wymieszanie odczynnika.
Uwaga:
Próbki i kontrole należy dodać do płytki z mikrodołkami (płytki AD) w ciągu 1 godziny od
przygotowania roboczych odczynników MMX.
Uwaga:
Należy używać wyłącznie płytki z mikrodołkami (płytki AD) systemu cobas® 4800 oraz
odpowiedniego filmu do zaklejania.
Przygotowanie płytki
1. Przenieść pipetą 25 µl roboczego odczynnika MMX do każdego dołka reakcyjnego płytki z mikrodołkami
(płytki AD), potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopuścić do tego, aby końcówka
pipetora dotknęła płytki poza obrębem dołka.
· Dodać roboczego odczynnika MMX-1 (zawierającego odczynnik EGFR MMX-1) do dołków płytki z
mikrodołkami (płytki AD) w kolumnach 01, 04, 07 i 10, zgodnie z potrzebą.
· Dodać roboczego odczynnika MMX-3 v2 (zawierającego odczynnik EGFR MMX-3 v2) do dołków
płytki z mikrodołkami (płytki AD) w kolumnach 03, 06, 09 i 12, zgodnie z potrzebą.
2. Przenieść pipetą 25 µl odczynnika EGFR MC do dołków A01, A02 i A03 płytki z mikrodołkami (płytki AD);
dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w
obrębie danego dołka.
3. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść pipetą 25 µl odczynnika NEG do dołków B01, B02 i B03
płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z
powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka.
Uwaga:
Każdy przebieg testowy musi zawierać kontrolę dodatnią (odczynnik EGFR MC) w
dołkach A01, A02 i A03 oraz kontrolę ujemną (odczynnik NEG) w dołkach B01, B02 i B03; w
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
27
®
przeciwnym razie przebieg testowy zostanie odrzucony jako nieważny przez analizator cobas z
480.
Uwaga:
Należy zmieniać rękawice zgodnie z potrzebami, aby chronić próbki przed wzajemnym
zanieczyszczeniem zawartym w nich materiałem oraz chronić probówki do reakcji PCR przed
zanieczyszczeniem na ich zewnętrznych powierzchniach.
4. Używając nowych końcówek pipetora do każdej rozcieńczonej próbki DNA, dodać 25 µl pierwszej próbki
DNA do dołków: C01, C02 i C03 płytki z mikrodołkami (płytki AD); używając nowej końcówki do dodawania
próbki DNA do każdego dołka; dokładnie wymieszać zawartość każdego dołka, aspirując pipetą zawartość
i podając ją z powrotem, przynajmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. Powtórzyć tę procedurę z
rozcieńczonym roztworem DNA z kolejnych próbek (dołki: D01, D02 i D03). Postępować według szablonu
przedstawionego na ryc. 2, dopóki rozcieńczone roztwory DNA ze wszystkich próbek nie zostaną
umieszczone na płytce z mikrodołkami (płytce AD). Upewnić się, że cały płyn zebrał się na dnie dołków.
5. Przykryć płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) filmem do zaklejania (dostarczonym wraz z płytkami). Użyć
aplikatora filmu uszczelniającego do szczelnego przytwierdzenia filmu do płytki z mikrodołkami (płytki AD).
6. Przed rozpoczęciem reakcji PCR potwierdzić, że cały płyn zebrał się na dnie każdego z dołków.
Uwaga:
Amplifikacja i detekcja powinny rozpocząć się w ciągu 1 godziny od dodania
rozcieńczonego roztworu DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX.
Rozpoczęcie reakcji PCR
Szczegółowe wskazówki dotyczące etapów przebiegu pracy przy wykonywaniu badań genu kodującego
EGFR zamieszczono w Podręczniku użytkownika testu cobas® EGFR.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
28
®
Wyniki
Interpretacja wyników
Cały cykl pracy i walidację próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800.
Uwaga:
Uwaga:
Ważny przebieg testowy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki
badania próbek.
W przypadku ważnego przebiegu wyniki badania próbek interpretuje się w sposób, który przedstawia Tabela
3.
Tabela 3
®
Wynik interpretacji testu cobas EGFR
Wynik testu
Wynik badania mutacji
Interpretacja
Ex19Del
S768I
L858R
Mutation
Detected
T790M
L861Q
Wykryto mutację w określonym regionie docelowym
genu kodującego EGFR.
G719X
Ex20Ins
(może być obecna większa liczba
mutacji niż jedna)
No Mutation
Nie dotyczy
Detected (NMD)*
Invalid
Failed
Nie wykryto mutacji w regionach docelowych genu
kodującego EGFR.
Nie dotyczy
Wynik badania próbki jest nieważny. Powtórzyć test
próbek z nieważnymi wynikami, postępując zgodnie z
instrukcją przedstawioną poniżej w rozdziale Ponowny
test próbek z nieważnymi wynikami.
Nie dotyczy
Przebieg testowy nie powiódł się wskutek awarii
sprzętu lub oprogramowania. Skontaktować się z
miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
* Wynik „No Mutation Detected” nie wyklucza obecności mutacji w regionach docelowych genu kodującego EGFR,
ponieważ wyniki zależą od procentu zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralności próbki, braku inhibitorów i
wystarczającej do wykrycia ilości DNA.
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami
1. Powtórzyć rozcieńczanie roztworu podstawowego DNA z próbki, która dała wynik nieważny,
rozpoczynając od procedur: Obliczanie rozcieńczenia roztworu podstawowego DNA, pochodzącego z
próbki i Rozcieńczanie próbki w rozdziale Amplifikacja i detekcja.
2. Po rozcieńczeniu roztworu podstawowego DNA do stężenia 2 ng/µl, co opisano w rozdziale
„Rozcieńczanie próbki”, kontynuować wykonywanie czynności opisanych w rozdziale „Przygotowanie
odczynników roboczych Master Mix (odczynników roboczych MMX)” oraz pozostałych czynności
należących do procedury amplifikacji i detekcji.
Uwaga:
Jeżeli po ponownym przeprowadzeniu testu wynik badania próbki nadal jest nieważny
lub jeśli nie było dostatecznej ilości roztworu podstawowego DNA do przygotowania kolejnego
rozcieńczenia zgodnie z opisem w punkcie A rozdziału Ponowny test próbek z nieważnymi
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
29
®
wynikami, należy powtórzyć całą procedurę testu dla tej próbki od etapu pozbawienia parafiny i
izolacji DNA, używając nowego skrawka FFPET guza o grubości 5 mikronów.
Kontrola jakości i ważność wyników
Każdy przebieg testowy, liczący do 30 próbek, zawiera jeden zestaw kontroli mutacji do testu cobas® EGFR
(EGFR MC) (dołki A01, A02 i A03) i kontroli ujemnej (NEG) (dołki B01, B02 i B03) odczynników roboczych
MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2. Przebieg jest ważny, jeżeli ważne są: kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR
MC) i kontrola ujemna (NEG). Jeżeli kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) lub kontrola ujemna (NEG)
jest nieważna, cały przebieg wymaga powtórzenia. Należy wówczas przygotować świeże rozcieńczenie
roztworu podstawowego DNA, wyizolowanego uprzednio z próbki, aby skonfigurować nową płytkę z
mikrodołkami (płytkę AD) wraz z kontrolami w celu przeprowadzenia amplifikacji i detekcji.
Kontrola mutacji
Wynik kontroli mutacji do testu EGFR (EGFR MC) musi nosić określenie „Valid”. Jeżeli wyniki oznaczenia
EGFR MC stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
Kontrola ujemna
Wynik kontroli ujemnej (NEG) musi nosić określenie „Valid”. Jeżeli wyniki oznaczenia NEG stale są nieważne,
należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Ograniczenia metody
1. Do badań należy używać wyłącznie określonych rodzajów próbek. Test cobas® EGFR Mutation Test v2
został zatwierdzony wyłącznie do badania próbek NSCLC FFPET guza.
2. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 został zatwierdzony do użytku wyłącznie z zestawem cobas® DNA
Sample Preparation Kit (Roche P/N: 05985536190).
3. Detekcja mutacji zależy od liczby kopii obecnych w próbce, na którą wpływać może integralność próbki,
ilość wyizolowanego DNA i obecność substancji zakłócających detekcję.
4. Wiarygodność wyników zależy od dostatecznego utrwalenia próbki, jej transportu, przechowywania i
przetwarzania. Należy przestrzegać procedur opisanych w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania
testu oraz w Podręczniku użytkownika cobas® EGFR Test.
5. Wpływ innych możliwych zmiennych, takich jak te związane z utrwaleniem próbki, nie został zbadany.
6. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® EGFR Test enzymu AmpErase umożliwia selektywną
amplifikację docelowego DNA; jednak dla uniknięcia zanieczyszczenia odczynników konieczne jest
stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w
niniejszej ulotce dołączonej do opakowania testu.
7. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu
cobas® 4800.
8. Do użycia z tym produktem został zatwierdzony wyłącznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie
wolno używać żadnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym.
9. Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
30
®
10. Mutacje w obrębie regionów genomowego DNA tworzącego gen kodujący EGFR, z którymi wiążą się
primery i/lub sondy używane w teście cobas® EGFR Test, chociaż rzadkie, mogą spowodować
niewykrycie obecności mutacji w eksonach 18., 19., 20., 21. (wyniki „No Mutation Detected”).
11. Test cobas® EGFR wykazuje reaktywność krzyżową (wyniki „Mutation Detected”) z mutacją L747S w
eksonie 19., rzadką mutacją nabytą, która może odpowiadać za oporność na leczenie TKI11.
12. Test cobas® EGFR został zatwierdzony do zastosowania w każdym dołku reakcyjnym DNA w ilości 50 ng.
Nie zaleca się stosowania początkowych ilości DNA na poziomie niższym niż 50 ng w każdym dołku
reakcyjnym.
13. Test cobas® EGFR jest testem jakościowym. Test nie jest przeznaczony do ilościowych pomiarów
odsetka mutacji.
14. Próbki NSCLC FFPET zawierające zdegradowany DNA mogą wpływać na zdolność testu do wykrycia
mutacji w genie EGFR.
15. Próbki z wynikami oznaczonymi jako „No Mutation Detected” mogą zawierać mutacje w genie EGFR
niewykrywane przez to oznaczenie.
16. Test cobas® EGFR wykrywa mutacje EGFR u pacjentów z przerzutami NSCLC, których guzy mają
substytucje eksonu 18. (G719X), delecje eksonu 19., insercje i substytucje eksonu 20. (T790M, S768I)
oraz substytucje eksonu 21. (L858R, L861Q), ale nie jakiekolwiek inne mutacje EGFR.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
31
®
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych
Uwaga:
Poniższe opisy badań zawierają dane zbiorcze przeprowadzone z wersjami v1 oraz v2
testu cobas® EGFR.
W przypadku niżej opisanych badań nieklinicznych, odsetek guza był oceniany przy zastosowaniu badania
patologicznego. Do wybrania próbek do badań zastosowano dwukierunkowe sekwencjonowanie metodą
Sangera oraz sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Odsetek mutacji w próbce NSCLC FFPET określano
metodą NGS.
Czułość analityczna — granica próby ślepej
W celu oceny wydajności testu cobas® EGFR przy braku szablonu i zapewnieniu, że próbka ślepa nie
generuje sygnału analitycznego, który może wskazywać na niskie stężenie mutacji, oceniano próbki bez
szablonu i próbki NSCLC FFPET EGFR typu dzikiego. Wykorzystując analizę zaleconą w wytycznych EP17A2E CLSI12, granicę próby ślepej określono jako zero dla wszystkich klas mutacji.
Granica wykrywalności przy użyciu mieszanek próbek FFPET
Trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji delecji eksonu 19., cztery izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji
L858R, dwa izolaty DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji L858R i T790M, dwa izolaty DNA
próbki FFPET dla mutacji G719A, jeden izolat DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji T790M i
G719A, jeden izolat DNA próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji G719C i S768I, jeden izolat DNA
próbki FFPET podwójnego mutanta dla mutacji S768I i G719S, trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji
insercji eksonu 20. i trzy izolaty DNA próbki FFPET dla mutacji L861Q wymieszano z izolatami próbki FFPET
EGFR typu dzikiego w celu uzyskania mieszanin z próbkami celującymi w poziom mutacji 10, 5,0, 2,5 oraz
1,25%, co określono metodą sekwencjonowania nowej generacji (NGS), która jest zatwierdzona do
stosowania w wykrywaniu mutacji EGFR w eksonach 18., 19., 20. i 21. Dla każdej mieszaniny próbek
przygotowano seryjne rozcieńczenia i przetworzono osiem powtórzeń każdego elementu panelu z
wykorzystaniem każdej z trzech serii zestawów cobas® EGFR Test (n=24/element panelu). Granicę czułości
każdej próbki określono na podstawie najmniejszej ilości DNA, która dała odsetek wyników „Mutation
Detected”, dotyczących mutacji docelowej genu kodującego EGFR, wynoszący co najmniej 95%; wyniki
przedstawia Tabela 4.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
32
®
Tabela 4
®
Granica wykrywalności testu cobas EGFR przy użyciu mieszanek próbek FFPET
Ekson
genu
kodującego
EGFR
Grupa mutacji
EGFR
18
G719X
19
Delecja w
eksonie 19.
T790M
20
S768I
Insercja w
eksonie 20.
L858R
+
P
21
L861Q
Sekwencja kwasu
nukleinowego genu
kodującego EGFR
Odsetek mutacji w
elemencie panelu
konieczny do
uzyskania odsetka
≥95% wyników
„Mutation Detected”
przy początkowym
poziomie DNA w
ilości 50 ng w
każdym dołku
reakcyjnym (n = 24
powtórzenia)
Identyfikator
6
COSMIC
2155 G>T
2155 G>A
2156 G>C
2156 G>C
2235_2249del15
2236_2250del15
2238_2252del15
2239_2248>C
2240_2254del15
2240_2257del18
2237_2253>TTGCT*
2237_2255>T*
2239_2256del18*
2238_2252del15*
2239_2257>GT*
2369 C>T
2369 C>T
2369 C>T
2303 G>T
2303 G>T
2307_2308insGCCAGCGTG
2310_2311insGGT
2319_2320insCAC
2573 T>G
2573 T>G
2573 T>G
2573 T>G
2573 T>G
2582T>A
2582T>A
2582T>A
5,6
3,2
4,7
2,5
1,4
2,5
#
2,4
2,2
7,2
13,4**
6,32
4,08
4,74
#
5,45
6,02
2,4
3,0
2,0
2,4
1,3
6,8
1,3
2,1
4,0
4,2
4,3
4,3
5,3
2,1
2,2
3,4
6253
6252
6239
6239
6223
6225
23571
12382
12369
12370
12416
12384
6255
23571
Nie stwierdzono
6240
6240
6240
6241
6241
12376
12378
12377
6224
6224
6224
6224
6224
6213
6213
6213
* Dla tych niedominujących delecji w eksonie 19. występujących w kohorcie badania EURTAC przebadano
jedynie pojedynczy poziom sekwencji docelowych zawierających około 5% mutacji. Mieszaniny próbek DNA
zostały przebadane w 3 ośrodkach biorących udział w badaniu.
®
** Granica wykrywalności testu cobas EGFR dla tej mutacji jest większa niż 10% poziom mutacji z
zastosowaniem standardowej początkowej ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
# Przebadano dwie niezależne próbki dla delecji w eksonie 19. (2238_2252del15).
+ Przebadano pięć niezależnych próbek dla mutacji L858R.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
33
®
Wyniki tego badania wskazują, że test cobas® EGFR umożliwia wykrywanie mutacji w eksonach 18., 19., 20. i
21. genu kodującego EGFR przy poziomie mutacji o wartości co najmniej 5% z zastosowaniem standardowej
początkowej ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Minimalna zawartość tkanki guza
Przebadano łącznie 66 niezależnych próbek z mutacjami genu EGFR (tj. 35 próbek mutantów delecji w
eksonie 19. i 31 próbek mutantów L858R w eksonie 21.) o zawartości tkanki guza mieszczącej się w
przedziale 25–99% w celu określenia minimalnej zawartości tkanki guza wymaganej do wykrycia mutacji w
genie EGFR w próbkach NSCLC. W żadnej z przebadanych próbek nie stwierdzono jednoczesnego
występowania delecji w eksonie 19. i mutacji L858R w eksonie 21. Każdą próbkę przebadano bez wykonania
przecięcia makroskopowego (w stanie niezmienionym) oraz po przecięciu makroskopowym. Obserwowane
wartości CtR dla próbek niezmienionych i poddanych przecięciu makroskopowemu przeanalizowano z
użyciem regresji Deminga oraz wykresu Blanda-Altmana (różnice w funkcji wartości średniej). Wyniki
potwierdzają zasadność stosowania próbek z zawartością tkanki guza przekraczającą 25% bez przecięcia
makroskopowego.
Dodatkowe 10 próbek NSCLC EGFR typu dzikiego (zawartość tkanki guza 1–90%) i 10 próbek mutantów
EGFR (zawartość tkanki guza 8–95%) testowano w celu określenia, czy makroskopowe przecięcie tkanki
guza NSCLC poprawia wykrywalność testu cobas® EGFR. Każdą próbkę przebadano bez wykonania
przecięcia makroskopowego (w stanie niezmienionym) oraz po przecięciu makroskopowym. Wszystkie wyniki
po makroskopowym rozcięciu były zgodne z wynikami bez makroskopowego rozcięcia i oczekiwane wyniki
mutacji oraz typu dzikiego obserwowano dla wszystkich 20 próbek.
W badaniu fazy III EURTAC dotyczącym stosowania erlotynibu w porównaniu z chemioterapią opartą na
cisplatynie próbki NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza poniżej 10% zostały przecięte makroskopowo
przed analizą mutacji w genie EGFR. Podgrupa próbek przebadanych przesiewowo w badaniu EURTAC
została oceniona pod kątem statusu mutacji w genie EGFR z użyciem testu cobas® EGFR oraz
sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Tabela 5 i Tabela 6 zawierają próbki NSCLC z ważnymi
sparowanymi wynikami mutacji eksonu 19. lub L858R EGFR połączonymi z testem cobas® EGFR oraz
sekwencjonowaniem NGS. Podczas korzystania z sekwencjonowania NGS jako metody referencyjnej wyniki
wykazały, że w przypadku próbek NSCLC FFPET po przecięciu makroskopowym z zawartością tkanek guza
poniżej 10% uzyskano porównywalną dokładność analityczną jak w przypadku próbek NSCLC FFPET
nieprzeciętych makroskopowo.
Razem te badania potwierdzają, że przed przeprowadzeniem testu cobas® EGFR wymagane jest przecięcie
makroskopowe w przypadku próbek NSCLC FFPET o zawartości tkanki guza poniżej 10%.
Tabela 5
®
Skuteczność testu cobas EGFR w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza ≤10% (przeciętych
makroskopowo)
Miara zgodności
Procent zgodności (N)
95% CI
Zgodność procentowa wyników dodatnich (PPA)
97,2% (35/36)
85,8–99,5%
Zgodność procentowa wyników ujemnych (NPA)
94,5% (52/55)
85,1–98,1%
Procentowa zgodność ogółem (OPA)
95,6% (87/91)
89,2–98,3%
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
34
®
Tabela 6
®
Skuteczność testu cobas EGFR w przypadku próbek NSCLC FFPET z zawartością tkanki guza >10%
(nieprzeciętych makroskopowo)
Miara zgodności
95% CI
93,0% (107/115)
86,9%, 96,4%
98,5% (199/202)
95,7%, 99,5%
96,5% (306/317)
93,9%, 98,1%
Swoistość — mikroorganizmy i homologi EGFR
Swoistość testu cobas® EGFR była oceniana przez badanie mikroorganizmów związanych z płucami oraz
plazmidów homologów EGFR tj. plazmidów zawierających sekwencje dla każdego obszaru genetycznego
HER2, HER3 i HER4 analogowego do sekwencji eksonów 18., 19., 20. i 21. EGFR amplifikowanych za
pomocą testu cobas® EGFR.
Mikroorganizmy związane z płucami
Stwierdzono, że jednostki tworzące kolonie Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae w ilości 4 x
105 CFU nie wykazują reaktywności krzyżowej ani nie zakłócają działania testu cobas® EGFR po dodaniu
podczas etapu lizy tkanki do próbek zawierających naturalnie występujące sekwencje genu kodującego
EGFR.
Plazmidy homologów EGFR
Wykazano, że powiązane strukturalnie sekwencje analogowe białka receptora naskórkowego o aktywności
kinazy tyrozynowej (EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4) nie reagują krzyżowo w teście cobas® EGFR w
przypadku dodania przed procedurą amplifikacji/detekcji do roztworu podstawowego wyizolowanego DNA
potencjalnej sekwencji reagującej krzyżowo w liczbie kopii genomowych równoważnej 50 ng na reakcję PCR.
Uwzględniono warunki kontrolne bez dodatku DNA plazmidowego. Wyniki wykazały, że obserwowane
mutacje dla wszystkich 20 przebadanych próbek FFPET były zgodne z oczekiwanymi mutacjami określonymi
w drodze sekwencjonowania zarówno w obecności, jak i przy braku dodanego DNA plazmidowego genu HER.
Dodatkowo pod kątem reaktywności krzyżowej przebadano mutację L747S w eksonie 19. genu EGFR. Wyniki
wykazały, że test cobas® EGFR reaguje krzyżowo z mutacją L747S w eksonie 19. genu EGFR.
Substancje wpływające na wynik testu
Wykazano, że triglicerydy (37 mM, granica podwyższonego stężenia zalecana przez CLSI13) i hemoglobina (2
mg/ml, granica podwyższonego stężenia zalecana przez CLSI13) nie zakłócają działania testu cobas® EGFR
w przypadku dodania potencjalnej substancji zakłócającej podczas procedury przygotowania próbki na etapie
lizy.
Wykazano, że leki albuterol (Ventolin), ipratropium (Atrovent), flutykazon (Flonase), ceftazydym (Fortaz),
Imipenem-cylastyna (Primaxin), Piperacillin-tazobaktam, Cilastin (cylastatyna sodu), Betadine oraz lidokaina
nie zakłócają działania testu cobas® EGFR w przypadku dodania podczas procedury przygotowania próbki na
etapie lizy.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
35
®
Tkanka martwicza
Wykazano, że próbki FFPET NSCLC z zawartością tkanki martwiczej do 60% w przypadku próbek mutanta
EGFR oraz do 85% w przypadku próbek typu dzikiego nie zakłócają rozpoznań wyników przy użyciu testu
cobas® EGFR.
Powtarzalność
Powtarzalność testu cobas® EGFR oceniano przy użyciu sześciu próbek FFPET obejmujących: dwie próbki
EGFR typu dzikiego; cztery próbki mutantów EGFR, po jednej delecji w eksonie 19., S768I i G719X, T790M i
L858R oraz insercji w eksonie 20. Próbki te badało dwukrotnie dwóch operatorów, używając dwóch różnych
serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ciągu czterech dni. Łącznie oceniano 32 powtórzenia
na próbkę. Odsetek prawidłowych rozpoznań testu cobas® EGFR wyniósł 96,9% (186/192).
Powtarzalność testu cobas® EGFR oceniano także w drugim badaniu wykorzystującym cztery próbki FFPET
obejmujące: jedną próbkę EGFR typu dzikiego; trzy próbki mutantów FFPET EGFR po jednej spośród
następujących mutacji: L861Q, G719X i insercja w eksonie 20. Próbki badało dwukrotnie dwóch operatorów,
używając dwóch różnych serii odczynników i dwóch analizatorów cobas z 480 w ciągu wielu dni. Test cobas®
EGFR miał dokładność prawidłowych rozpoznań 99,2% (127/128) dla wszystkich kombinacji powtórzeń
próbek, operatorów, serii odczynników i instrumentów.
Odtwarzalność przygotowywania próbek
Odtwarzalność działania zestawu do przygotowywania próbek cobas® DNA Sample Preparation Kit
przebadano z użyciem skrawków uzyskanych z trzech bloków z próbkami FFPET — jednego zawierającego
delecję w eksonie 19., jednego z mutacją L858R oraz jednego z sekwencją występującą naturalnie. Każdą
próbkę badano w dwóch powtórzeniach w każdym ośrodku każdego dnia. Skrawki danej próbki zostały
poddane randomizacji i przebadane w ciągu sześciu dni w trzech ośrodkach przez jednego operatora w
każdym ośrodku, z użyciem jednego analizatora cobas z 480 w każdym ośrodku, trzech serii zestawu cobas®
DNA Sample Preparation Kit oraz jednej serii testu cobas® EGFR. Każdego dnia każdy operator prowadził
izolację i analizę DNA pochodzącego z dwóch skrawków NSCLC FFPET w przypadku każdej próbki z
użyciem testu cobas® EGFR. W ciągu sześciu dni prowadzenia testów dla wszystkich próbek uzyskano
ważne i prawidłowe wyniki. Dla połączenia wszystkich próbek i operatorów odsetek prawidłowych rozpoznań
testu cobas® EGFR wyniósł 100% (108/108).
Ocena klinicznej skuteczności testu
Badanie odtwarzalności klinicznej
Przeprowadzono badanie zewnętrzne w celu oceny odtwarzalności testu cobas® EGFR z udziałem
3 zewnętrznych ośrodków badawczych (2 operatorów na ośrodek) i użyciem 3 serii odczynników przez
5 niekolejnych dni badania z 13-elementowym panelem próbek DNA uzyskanych ze skrawków FFPET próbek
NSCLC z naturalnie występującą sekwencją (ang. wild type, WT) oraz obarczonych mutacją (ang. mutant
type, MT). Ten panel obejmował mutację L858R w eksonie 21. oraz pięć różnych mutacji w eksonie 19. w
postaci delecji. Na 92 cykle pracy 90 (97,8%) było prawidłowych. Ogółem dla każdego z 13 członów panelu w
90 ważnych cyklach pracy wykonano 2340 testów; wszystkie wyniki testu były ważne. Nie stwierdzono
wyników „No Mutation Detected” w 180 ważnych testach dla elementów panelu WT, co skutkowało 100%
zgodnością. W przypadku 10 spośród 12 elementów panelu MT uzyskano zgodność rzędu 100%. Dla
elementu EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji panelu zgodność wyniosła 62,8% (67 ze 180 wyników testu
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
36
®
stanowiły wyniki „Mutation Not Detected”). Dla elementu EX19_2240_2257del18 — 10% mutacji panelu
zgodność wyniosła 99,4% (1 ze 180 wyników testu był wynikiem „Mutation Not Detected”). Wyniki według
ogólnej zgodności przedstawia Tabela 7. Współczynnik zmienności (CV) wyniósł <6% w przypadku
wszystkich elementów panelu mutacji. W przypadku każdego elementu panelu wartość CV wyniosła <3,5%.
Dla kontroli zewnętrznej ogólna wartość CV wyniosła <1,3%. Wartość procentowa CV wyniosła <0,5% między
seriami i <1,2% w ramach serii.
Tabela 7
®
Ogólne oszacowania zgodności według elementów panelu w badaniu odtwarzalności testu cobas EGFR
Liczba ważnych
testów
Zgodność (n)
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_ 2235_2249del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_ 2235_2249del15 — <10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2236_2250del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2236_2250del15 — <10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2239_2248>C — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2239_2248>C — <10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2254del15 — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2254del15 — <10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX19_2240_2257del18 — 5% mutacji
180
113
62,8 (55,3; 69,9)*
EX19_2240_2257del18 — <10% mutacji
180
179
99,4 (96,9; 100,0)*
EX21_ 2573T>G=L858R — 5% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
EX21_ 2573T>G=L858R — <10% mutacji
180
180
100 (98,0; 100,0)
Człon panelu
Naturalnie występująca
% zgodności
a
(95% CI)
P
Uwaga: Wyniki uznawano za zgodne, gdy dla elementu panelu mutacji uzyskano ważny wynik „Mutation Detected”
lub gdy dla elementu panelu sekwencji występujących naturalnie uzyskano ważny wynik „Mutation Not Detected”.
a
95% CI = 95% przedział ufności na podstawie dokładnej metody dwumianowej.
®
* Czułość analityczna testu cobas EGFR w przypadku detekcji tej mutacji jest większa niż 10% z zastosowaniem
standardowej początkowej ilości 50 ng w każdym dołku reakcyjnym.
Korelacja z metodą referencyjną wykorzystującą próbki fazy III z badania
EURTAC
Skuteczność kliniczna testu cobas® EGFR była oceniana przez porównanie go z dwoma metodami
referencyjnymi — 2x dwukierunkowym sekwencjonowaniem metodą Sangera oraz ilościowym
sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS) — wykorzystując 487 utrwalonych w formalinie i zatopionych w
parafinie próbek guza płuca od pacjentów z zaawansowanym NSCLC, których badano przesiewowo w fazie 3.
badania EURTAC erlotynibu w porównaniu z chemioterapią opartą na cisplatynie14, 15. Charakterystyka
kliniczna i demograficzna pacjentów, których próbki były dostępne do tego badania retrospektywnego były
porównywalne z kwalifikującymi się w innym przypadku pacjentami (557), których próbki nie były dostępne do
ponownego badania.
W ramach badania EURTAC badaniu przesiewowemu z użyciem skojarzenia testów opracowanych
laboratoryjnie, określanych wspólnie mianem oznaczenia badania klinicznego (ang. clinical trial assay, CTA)
poddano łącznie 1276 pacjentów. Po wykluczeniu pacjentów niespełniających kryteriów badania oraz bez
wyników oznaczenia CTA do badania potencjalnie kwalifikowało się 1044 pacjentów. W grupie
1044 pacjentów kwalifikujących się do badania próbki 225 z nich uzyskały dodatni wynik dla mutacji w
oznaczeniu CTA, próbki 792 pacjentów dały wynik naturalnie występującej sekwencji w badaniu CTA, a
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
37
®
27 próbek miało niejednoznaczny wynik w badaniu CTA. W przypadku 487 spośród 1044 pacjentów
potencjalnie kwalifikujących się do badania dostępne były próbki do przeprowadzenia ponownego badania z
użyciem testu cobas® EGFR.
Wszystkie 487 próbek przebadano metodą ślepej próby z użyciem testu cobas® EGFR oraz
sekwencjonowania metodą Sangera. Spośród nich w przypadku 406 próbek uzyskano ważne wyniki w teście
cobas® EGFR i sekwencjonowaniu metodą Sangera, 38 próbek dało wynik nieważny w teście cobas® EGFR i
sekwencjonowaniu metodą Sangera, a w przypadku 38 i 5 próbek uzyskano nieważne wyniki odpowiednio
tylko w sekwencjonowaniu metodą Sangera oraz tylko w teście cobas® EGFR. Spośród 487 próbek
dostępnych do ponownego badania z użyciem testu cobas® EGFR 444 próbki dały ważny wynik w teście
cobas® EGFR i zostały również przebadane z użyciem sekwencjonowania NGS. Spośród nich uzyskano
36 nieważnych wyników w drodze sekwencjonowania NGS; z tego powodu 408 próbek uzyskało ważne wyniki
w teście cobas® EGFR i sekwencjonowaniu NGS. Dokładność analityczna testu cobas® EGFR w porównaniu
z każdą metodą referencyjną została oceniona poprzez oszacowanie odsetka zgodności wyników dodatnich
(ang. positive percentage agreement, PPA), odsetka zgodności wyników ujemnych (ang. negative percentage
agreement, NPA) oraz procentowej zgodności ogółem (ang. overall percentage agreement, OPA), a także
odpowiednich 95% przedziałów ufności dla mutacji w postaci delecji w eksonie 19. i L858R łącznie.
W kohorcie badania EURTAC test cobas® EGFR umożliwił wykrycie następujących mutacji w eksonie 19.
genu EGFR (Tabela 8).
Tabela 8
®
Mutacje wykrywane w kohorcie EURTAC w teście cobas EGFR
Ekson
6
Mutacja
Zmiana aminokwasu
COSMIC ID
2234_2251>AAT
K745_T751>K
Nie stwierdzono
2236_2244del9
E746_R748>E
Nie stwierdzono
2236_2252>AT
E746_T751>I
26680
2236_2263>GAAGCAT
E746_A755>E
Nie stwierdzono
2237_2251>AAC
E746_751T>E
Nie stwierdzono
2239_2253>CAA
L747_T751>Q
51527
2237_2257>TCT
E746_P753>VS
18427
2239_2251>C
L747_T751>P
12383
P
19
W analizie zgodności uwzględniono łącznie 406 próbek z ważnymi wynikami testu cobas® EGFR i
sekwencjonowania metodą Sangera. PPA między testem cobas® EGFR i sekwencjonowaniem metodą
Sangera wynosiła 96,6% (95% CI: od 91,5% do 98,7%), a NPA wynosiła 88,3% (95% CI: od 84,1% do 91,5%)
podczas detekcji delecji w eksonie 19. i mutacji L858R łącznie tak jak to przedstawia Tabela 9. Wartość OPA
wyniosła 90,6% z dolną granicą 95% przedziału ufności przekraczającą 87%.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
38
®
Tabela 9
®
Porównanie testu cobas EGFR z sekwencjonowaniem metodą Sangera w celu wykrywania mutacji delecji w
eksonie 19. oraz L858R EGFR
Miara zgodności
95% CI
96,6% (112/116)
91,5%, 98,7%
88,3% (256/290)
84,1%, 91,5%
90,6% (368/406)
87,4%, 93,1%
W analizie zgodności uwzględniono łącznie 408 próbek z ważnymi wynikami testu cobas® EGFR i
sekwencjonowania metodą NGS. Po porównaniu pomiędzy łącznymi wynikami testu cobas® EGFR i
sekwencjonowania NGS w przypadku detekcji delecji w eksonie 19. i mutacji punktowej L858R wartości PPA
oraz NPA wyniosły odpowiednio 94,0% (95% CI: od 89,1% do 96,8%) i 97,7% (95% CI: od 95,0% do 98,9%)
jak przedstawia to Tabela 10. Wartość OPA wyniosła 96,3% z dolną granicą 95% przedziału ufności
wynoszącą 94,0%.
®
Tabela 10 Porównanie testu cobas EGFR z sekwencjonowaniem metodą NGS w celu wykrywania mutacji delecji w eksonie
19. oraz L858R EGFR łącznie
Miara zgodności
95% CI
94,0% (142/151)
89,1%, 96,8%
97,7% (251/257)
95,0%, 98,9%
96,3% (393/408)
94,0%, 97,8%
Dane dotyczące wyniku klinicznego
EURTAC
Badanie EURTAC to wieloośrodkowe, randomizowane badanie III fazy, prowadzone metodą otwartej próby w
celu porównania stosowania produktu leczniczego Tarceva® (erlotynib) ze standardową chemioterapią
dwulekową związkami platyny jako leczenia pierwszego rzutu u pacjentów z zaawansowanym NSCLC, u
których nie stosowano chemioterapii i którzy są obarczeni mutacjami w postaci delecji w eksonie 19. lub
substytucji w eksonie 21. (L858R) genu EGFR ocenionych z użyciem oznaczenia badania klinicznego (CTA).
Badanie było sponsorowane przez hiszpański zespół badań nad rakiem płuca (Spanish Lung Cancer Group,
SLCG). Do udziału w badaniu zakwalifikowano łącznie 174 pacjentów. Wyniki badania wykazały, że w
przypadku pacjentów otrzymujących produkt leczniczy Tarceva® stwierdzono statystycznie istotną różnicę w
długości okresu przeżycia bez progresji choroby (PFS) (mediana wartości PFS 10,4 miesiąca w por. z
5,1 miesiąca) w porównaniu z pacjentami leczonymi chemioterapią ze współczynnikiem hazardu wynoszącym
0,34 (p <0,0001, 95% CI [0,23; 0,49]). Odsetek odpowiedzi na leczenie w przypadku grupy pacjentów
otrzymujących produkt leczniczy Tarceva® był wyższy niż u pacjentów leczonych z użyciem chemioterapii
(odpowiednio 65,1% i 16,1%). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w całkowitym czasie przeżycia (ang.
overall survival, OS) w obu grupach, gdyż 76% pacjentów otrzymujących standardową chemioterapię
przeniesiono do grupy leczonej z użyciem produktu leczniczego Tarceva®.
Spośród 174 pacjentów włączonych do udziału w badaniu EURTAC 134 przypadki (77% populacji badanej, w
tym 69 pacjentów z grupy otrzymującej erlotynib oraz 65 pacjentów z grupy leczonej z użyciem chemioterapii)
były dostępne do ponownego badania i zostały przebadane retrospektywnie z użyciem testu cobas® EGFR.
Spośród 134 przypadków przebadanych ponownie z użyciem testu cobas® EGFR dla 116 pacjentów
(59 pacjentów z grupy otrzymującej erlotynib oraz 57 pacjentów z grupy leczonej z użyciem chemioterapii)
uzyskano wynik „Mutation Detected” w teście cobas® EGFR. Analiza podgrupy 116 pacjentów wykazała, że
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
39
®
osoby leczone z użyciem produktu leczniczego Tarceva® cechowało istotne wydłużenie czasu PFS (mediana
wartości PFS 10,4 miesiąca w porównaniu z 5,4 miesiąca) i mniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia
zdarzenia progresji choroby lub zgonu (HR = 0,34; 95% CI [0,21; 0,54], p <0,0001) niż w przypadku pacjentów
leczonych z użyciem chemioterapii (Ryc. 3). Częstość odpowiedzi na leczenie w grupie leczonej produktem
leczniczym Tarceva® była większa w porównaniu z grupą otrzymującą chemioterapię (odpowiednio 59,3% i
14,0%). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w wartości OS pomiędzy dwiema grupami. Obserwowana
korzyść kliniczna w podgrupie pacjentów przebadanych z użyciem testu cobas® EGFR była porównywalna ze
stwierdzoną w całej populacji badania (Tabela 11).
Przeprowadzono dodatkową analizę skuteczności w celu uwzględnienia pacjentów, dla których uzyskano
dodatni wynik w teście cobas® EGFR i ujemny lub nieważny wynik w oznaczeniu CTA. Dane uzyskane w
najgorszym scenariuszu (przy założeniu współczynnika hazardu wynoszącego 1 dla pacjentów z dodatnim
wynikiem w teście cobas® EGFR i ujemnym wynikiem oznaczenia CTA) wykazały współczynnik hazardu
wynoszący 0,42 (95% CI [0,26; 0,57]).
Wykres Kaplana-Meiera dla wartości PFS według metody leczenia w przypadku pacjentów z mutacją wykrytą w
®
teście cobas EGFR Test (ocena badacza)
HR: 0,34
P <0,0001
Prawdopodobieństwo
przeżycia
Ryc. 3
Erlotynib (n = 59)
Mediana: 10,4 miesiąca
Chemioterapia (n = 57)
Mediana: 5,4 miesiąca
Miesiące od zakończenia leczenia
®
Tabela 11 Korzyści kliniczne w przypadku pacjentów przebadanych z użyciem testu cobas EGFR są porównywalne z
obserwowanymi w populacji badania EURTAC
Populacja dodatnia w teście cobas
Parametr
®
EURTAC
P
n = 116
n = 173*
Chemioterapia
Erlotynib
Chemioterapia
Erlotynib
n = 57
n = 59
n = 87
n = 86
5,4
10,4
5,1
10,4
PFS
Mediana (miesiące)
Współczynnik hazardu
0,34
0,34
95% przedział ufności
współczynnika hazardu
[0,21; 0,54]
[0,23; 0,49]
<0,0001
<0,0001
Wartość P (test log rank)
*Uwaga: Jeden pacjent wycofał zgodę po zakończeniu badania EURTAC, co skutkowało zestawem danych o wielkości n = 173.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
40
CZĘŚĆ B: Do stosowania z próbkami osocza
®
CZĘŚĆ B: DO STOSOWANIA Z PRÓBKAMI OSOCZA
Próbki osocza są przetwarzane w celu izolowania krążącego bezkomórkowego DNA (ang. cell-free DNA,
cfDNA) przy użyciu zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit, ogólnego manualnego przygotowywania
próbek opartego na wiązaniu kwasu nukleinowego do włókien szklanych. Dwa mililitry (ml) osocza są
przetwarzane za pomocą proteazy i chaotropowego buforu wiążącego, który chroni cfDNA przed DNazami. W
dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano wiązania, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę
wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie
wirowania cfDNA ulega związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak
sole, białka i inne zanieczyszczenia, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowane kwasy nukleinowe
są przemywane i poddane elucji roztworem wodnym. Następnie docelowy DNA amplifikuje się i poddaje
detekcji w analizatorze cobas z 480 z użyciem odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z
zestawem cobas® EGFR Mutation Test v2.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
41
®
Materiały i odczynniki
Dostarczane materiały i odczynniki
Zestaw/kasety
PK
(Proteinaza K)
(P/N: 05860695102)
Proteinaza K, liofilizowana
DNA PBB
b
(DNA Bufor wiążący parafinę )
(P/N: 05517621001)
Bufor Tris-HCl
49,6% chlorowodorku guanidyny
0,05% mocznika
17,3% Triton X-100
WB I
(DNA Bufor płuczący I)
(P/N: 05517656001)
Bufor Tris-HCl
64% chlorowodorku guanidyny
WB II
(DNA Bufor płuczący II)
(P/N:
05517664001)
®
cobas cfDNA Sample Bufor Tris-HCl
Preparation Kit
Chlorek sodu
DNA EB
24 testów
(DNA bufor do elucji)
(P/N: 07247737190)
(P/N: 05517630001)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
HPEA FT
(Moduł jednostki przedłużającej o
wysokiej czystości)
(P/N: 07323204102)
Probówki z filtrem i z zatyczkami
CT
(Probówki zbiorcze)
(P/N: 05880513001)
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
Ilość na
test
Symbol bezpieczeństwa i
a
ostrzeżenie
2 x 100 mg
8 x 10 ml
1 x 25 ml
1 x 12,5 ml
1 x 6 ml
5 x 5 sztuk
3 x 25
sztuk
Niebezpieczeństwo
H302 + H332: Działa
szkodliwie po
połknięciu i w następstwie
wdychania.
H315: Działa drażniąco na skórę.
H317: Może powodować reakcję
alergiczną skóry.
H318: Powoduje poważne
uszkodzenie oczu.
H334: Może powodować objawy
alergii lub astmy lub trudności w
oddychaniu w następstwie
wdychania.
H335: Może powodować
podrażnienie dróg oddechowych.
P261: Unikać wdychania
pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej
cieczy.
P280: Stosować rękawice
ochronne/ochronę oczu/ochronę
twarzy.
P284: Stosować indywidualne środki
ochrony dróg oddechowych.
P305 + P351 + P338 + P310: W
PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO
OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez
kilka minut. Wyjąć soczewki
kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo
usunąć. Nadal płukać.
Natychmiast skontaktować się z
OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem.
P342 + P311: W przypadku
wystąpienia objawów ze strony
układu oddechowego: Skontaktować
się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub
lekarzem.
P362 + P364: Zanieczyszczoną
odzież zdjąć i wyprać przed
ponownym użyciem.
42
®
Zestaw/kasety
®
Zestaw cobas EGFR
Mutation Test v2
24 testów
(P/N: 07248563190)
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
Ilość na test
EGFR MMX-1
(EGFR Master Mix 1)
(P/N: 06471366001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
(bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
antysensownych EGFR
EGFR MMX-2
(EGFR Master Mix 2)
(P/N: 06471382001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
(bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
antysensownych EGFR
EGFR MMX-3 v2
(EGFR Master Mix 3)
(P/N: 07248601001)
Bufor Tris
Chlorek potasu
Glicerol
EDTA
Tween 20
0,09% azydku sodu
2 x 0,48 ml
< 0,10% dNTP
(bakteryjnej)
< 0,01% aptameru
antysensownych EGFR
a
ostrzeżenie
Nie dotyczy
Nie dotyczy
Nie dotyczy
43
®
Zestaw/kasety
Ilość na test
a
ostrzeżenie
Nie dotyczy
MGAC
(Octan magnezu)
(P/N: 05854326001)
Octan magnezu
0,09% azydku sodu
6 x 0,2 ml
Nie dotyczy
EGFR MC
(EGFR Kontrola mutacji)
®
Zestaw cobas EGFR
Mutation Test v2
24 testów
(P/N: 07248563190)
(P/N: 06471455001)
Bufor Tris
EDTA
Poli-rA RNA (syntetyczny)
0,05% azydku sodu
< 0,1% plazmidowego DNA
(bakteryjnego) zawierającego
sekwencje eksonów: 18., 19., 20. i
21. genu kodującego EGFR
< 0,1% naturalnie występującego
DNA genu kodującego EGFR (z
hodowli komórkowej)
6 x 0,1 ml
Nie dotyczy
DNA SD
(DNA Rozcieńczalnik próbki)
(P/N: 05854474001)
Bufor Tris-HCl
0,09% azydku sodu
2 x 3,5 ml
a
Oznakowanie bezpieczeństwa produktu jest zasadniczo zgodne z wytycznymi GHS UE.
b
Bufor wiążący parafinę jest stosowany do próbek osocza.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
44
®
Przechowywanie i użytkowanie odczynników
Temperatura
przechowywania
Czas przechowywania
®
od 15°C do 30°C
Po otwarciu i rozpuszczeniu odczynnik PK jest stabilny
przez maksymalnie 30 dni lub do upływu daty ważności, w
zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Po otwarciu i
rozpuszczeniu pozostałe odczynniki zestawu cfDNA Sample
Preparation Kit są stabilne przez maksymalnie 90 dni lub do
upływu daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi
wcześniej.
®
od 2°C do 8°C
Po otwarciu odczynnika, zestaw zachowuje stabilność do 4krotnego użycia w ciągu 90 dni lub do podanej daty ważności,
w zależności od tego, który termin wypada wcześniej.
Odczynnik
cobas cfDNA Sample Preparation Kit
cobas EGFR Mutation Test v2*
Uwaga: Nie wolno zamrażać odczynników z wyjątkiem odczynnika PK.
*Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX (przygotowany przez dodanie
odczynnika MGAC do EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2) należy chronić przed długotrwałą ekspozycją na
światło. Roboczy odczynnik MMX trzeba przechowywać w zaciemnionym miejscu w temperaturze od 2°C do 8°C.
Przygotowane próbki i kontrole należy dodać do roboczego odczynnika MMX w ciągu 1 godziny od jego przygotowania.
Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 1 godziny od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do
roboczego odczynnika MMX.
Wymagane materiały dodatkowe
Materiały
P/N
Etanol bezwodny (200 proof, do biologii molekularnej)
Sigma, nr kat. E7023 lub Fisher Scientific, nr kat. BP2818500 albo odpowiednik
Izopropanol (ACS, >99,5%)
Sigma, nr kat. 190764 lub Fisher Scientific, nr kat. A451-1
albo odpowiednik
Jałowa woda wolna od nukleazy (do biologii molekularnej)
Applied Biosystems (Ambion) AM9937 lub GE Healthcare
TM
Hyclone SH3053801 albo odpowiednik
Wybielacz
Dowolny dostawca
70% etanol
Dowolny dostawca
Jałowe, jednorazowe, serologiczne pipety 5 i 25 ml
Dowolny dostawca
®
Płytki z mikrodołkami systemu cobas 4800 (płytki AD) i
film do zaklejania
Roche 05232724001
®
Aplikator filmu do zaklejania systemu cobas 4800
®
(dostarczany wraz z instalacją systemu cobas 4800)
Roche 04900383001
Pipetory regulowane* (mogące pipetować 5–1000 µl)
Dowolny dostawca
Wolne od DNaz końcówki z osłoną aerozolową lub
wyrzutnikiem
Dowolny dostawca
TM
Pipet-Aid *
Drummond 4-000-100 albo odpowiednik
Wirówka laboratoryjna* (umożliwiająca wirowanie przy
6000 x g dla probówek stożkowych o pojemności 50 ml)
Eppendorf model 5810 albo odpowiednik
Mikrowirówka laboratoryjna* (umożliwiająca wirowanie przy
Eppendorf 5430 lub 5430R albo odpowiednik
20 000 x g)
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
45
®
Materiały
P/N
Jałowe plastikowe probówki stożkowe o pojemności 15 ml
Dowolny dostawca
Probówki do mikrowirówek (wolne od RNaz/DNaz, 1,5 ml/o Life Technologies AM12400 lub Eppendorf 022364120 albo
czystości do PCR)
odpowiednik
Statywy na wirówki stożkowe i do mikrowirówki
Dowolny dostawca
Mieszadło wibracyjne*
Dowolny dostawca
Rękawiczki jednorazowe bezpudrowe
Dowolny dostawca
* Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane zgodnie z instrukcjami producenta.
Urządzenia i oprogramowanie wymagane, lecz niedostarczane
Wymagane urządzenia i oprogramowanie, lecz niedostarczane
Analizator cobas z 480
®
Jednostka sterująca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemu w wersji 2.1 lub nowszej
Pakiet oprogramowania EGFR Plasma Analysis Package Software w wersji 1.0 lub nowszy
Zewnętrzny czytnik kodów kreskowych, podłączany do portu USB
Drukarka (np. HP P2055d)
Wymagania dotyczące środków ostrożności i użytkowania
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Podobnie jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe
znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
·
Do stosowania wyłącznie w diagnostyce in vitro.
·
Karty charakterystyki (Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym
przedstawicielstwie firmy Roche.
·
Z wszystkimi próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne
procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories8 oraz CLSI Document M29-A49.
·
Odczynnik DNA PBB zawiera Triton X-100, środek drażniący błony śluzowe. Należy unikać kontaktu
tych odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi.
·
Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet niezawierających DNazy.
Dobra praktyka laboratoryjna
·
Nie należy pipetować za pomocą ust.
·
Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
46
®
·
Po pracy z próbkami i zestawami odczynników należy dokładnie umyć ręce.
·
Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą,
oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, miejsce jego wystąpienia należy natychmiast
spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie działania lecznicze, może dojść
do oparzeń. W razie rozlania przed wytarciem należy rozcieńczyć wodą.
·
Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze świeżo przygotowanym
roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej (rozcieńczyć domowy
wybielacz w stosunku 1:10). Następnie należy przetrzeć powierzchnię 70% etanolem.
Uwaga: Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do zastosowań domowych zazwyczaj
zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku
1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
Zanieczyszczenie
·
W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie rękawic i ich zmiana pomiędzy pracą
z próbkami i odczynnikami testu cobas® EGFR. Podczas pracy z próbkami należy unikać
zanieczyszczenia rękawiczek.
·
Rękawiczki należy często zmieniać, aby ograniczyć możliwość zanieczyszczenia.
·
Rękawiczki należy zmieniać przed opuszczeniem obszarów izolacji DNA lub w przypadku
podejrzenia kontaktu z roztworami lub próbką.
·
Należy unikać mikrobiologicznego i przez rybonukleazy zanieczyszczenia odczynników.
·
Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy amplifikacji i
detekcji. Materiały i urządzenia powinny być przeznaczone do każdego z działań; nie mogą być
stosowane w innych działaniach lub przenoszone pomiędzy obszarami. Na przykład pipetory i
materiały przeznaczone do izolacji DNA nie mogą być stosowane do przygotowywania odczynników
do amplifikacji i detekcji.
·
Zdecydowanie zaleca się, aby przebieg pracy w laboratorium był jednokierunkowy i polegał na
zakończeniu jednej czynności przed przejściem do kolejnej. Na przykład izolację DNA należy
zakończyć przed rozpoczęciem amplifikacji i detekcji. Izolacja DNA powinna być prowadzona w
obszarze oddzielonym od amplifikacji i detekcji. Aby uniknąć zanieczyszczenia odczynnika roboczego
Master Mix próbkami DNA, obszar roboczy amplifikacji i detekcji powinien być dokładnie oczyszczony
przed przygotowaniem odczynnika roboczego Master Mix.
Integralność
·
Nie wolno używać zestawów po upływie daty ważności.
·
Nie należy zlewać odczynników pochodzących z różnych zestawów lub serii.
·
Nie wolno używać przedmiotów jednorazowego użytku po upływie daty ważności.
·
Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie
wykorzystywać ponownie.
·
Całe wyposażenie powinno być odpowiednio konserwowane, zgodnie z instrukcjami producenta.
Utylizacja
·
Odczynniki DNA EB, MGAC, EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2, EGFR MC i DNA SD
zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
47
®
wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory
zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody,
aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
·
Należy wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Rozlanie płynów i czyszczenie
·
Odczynniki DNA PBB i WB I zawierają chlorowodorek guanidyny. Jeśli płyn zawierający wspomniany
bufor ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i
wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy
używać najpierw detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5% roztworu podchlorynu sodu.
·
Jeśli do rozlania płynu dojdzie na powierzchni aparatu cobas® 4800, należy postępować zgodnie z
instrukcjami zamieszczonymi w odpowiednim Podręczniku systemu — system cobas® 4800 w celu
przeprowadzenia czyszczenia.
·
Do czyszczenia analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (wybielacza).
Czyszczenie analizatora cobas z 480 należy przeprowadzać zgodnie z procedurami opisanymi w
Podręczniku użytkownika systemu cobas® 4800.
·
Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury mające na celu zmniejszenie ryzyka
zanieczyszczenia analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga:
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Pobieranie próbek i praca z próbkami
Zestaw cobas® cfDNA Sample Preparation Kit został opracowany do stosowania z próbkami osocza
pobranego na K2-EDTA.
Osocze powinno być oddzielane od krwi w ciągu 4 godzin od pobrania i przechowywane do momentu badania
w temperaturze ≤-70°C.
Transport, przechowywanie i stabilność próbek
Próbki osocza mogą być transportowane w stanie zamrożenia. Próbki osocza muszą być transportowane
zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi, dotyczącymi transportu czynników
etiologicznych.10
Temperatura
przechowywania próbek
osocza
≤-70°C
Od 2°C do 8°C
Czas przechowywania
Do 12 miesięcy
Do 3 dni
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
48
®
Przechowywanie i stabilność próbki przetworzonej
Próbka przetworzona (ekstrahowany DNA) jest stabilna dla:
Temperatura
przechowywania
ekstrahowanego DNA
Od -15°C do -25°C
Od 2°C do 8°C
Od 15°C do 30°C
Czas przechowywania
Do 1 cyklu rozmrażania
przez 60 dni
Do 7 dni
Do 1 dnia
Ekstrahowany DNA powinien być używany w zalecanych okresach przechowywania lub przed upływem daty
ważności zestawu cobas® cfDNA Sample Preparation Kit użytego do ekstrahowania DNA, w zależności od
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
49
®
Procedura testowa
Wykonywanie oznaczenia
Ryc. 4
®
®
Przebieg pracy z testem cobas EGFR Mutation Test v2 i zestawem cobas cfDNA Sample Preparation Kit
1
Uruchomienie systemu.
2
Wykonanie czynności konserwacyjnych w odniesieniu do aparatu.
3
Wyjęcie próbek i odczynników z miejsca przechowywania.
4
Przygotowanie próbek do wiązania na kolumnie
5
Przeprowadzenie izolacji DNA.
6
Wymycie DNA.
7
Utworzenie harmonogramu pracy i wydrukowanie układu płytki.
8
Przygotowanie odczynników do amplifikacji.
9
Umieszczenie odczynników do amplifikacji na płytce z mikrodołkami.
10
Umieszczenie próbki na płytce z mikrodołkami.
11
Uszczelnienie płytki z mikrodołkami.
12
Umieszczenie płytki z mikrodołkami w analizatorze cobas z 480.
13
Rozpoczęcie przebiegu.
14
Przeanalizowanie wyników.
15
W przypadku korzystania z systemu LIS: przesłanie wyników do systemu LIS.
16
Wyjęcie płytki z analizatora.
Instrukcja użytkowania
Uwaga:
Z zestawem cobas® EGFR należy stosować wyłącznie próbki osocza pobranego na K2
EDTA.
Uwaga:
Szczegółowe wskazówki dotyczące obsługi analizatora cobas z 480 zamieszczono w
Instrukcji obsługi analizatora cobas z 480.
Wielkość przebiegu
Pojedynczy przebieg testowy może obejmować od 1 do 30 próbek (plus kontrole) w każdej płytce z 96
mikrodołkami. Przy przeprowadzaniu przebiegu testowego obejmującego więcej niż 24 próbki trzeba będzie
użyć wielu zestawów testu cobas® EGFR.
Zestaw cobas® EGFR zawiera ilość odczynników wystarczającą do wykonania 8 przebiegów testowych po 3
próbki (plus kontrole), czyli maksymalnie na 24 próbki na zestaw.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
50
®
Przygotowanie i przechowywanie odczynników
Przed użyciem zestawu po raz pierwszy przygotować odczynniki robocze zgodnie z tabelą poniżej. Do
dozowania wody użyć pipety serologicznej 5 ml. Do dozowania etanolu użyć pipet serologicznych 25 ml. Jeśli
proteinaza K została już rozpuszczona i zamrożona, rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika,
wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego przebiegu testowego.
Odczynniki
Proteinaza K
(PK)
Rozpuszczenie / Przygotowanie
Rozpuścić proteinazę PK przez dodanie do fiolki 4,5 ml jałowej wody za pomocą
jałowej, jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Wymieszać
zawartość, odwracając fiolkę do góry dnem od 5 do 10 razy. Przenieść porcję 1,1
ml rozpuszczonej PK do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i
przechowywać w temperaturze -20°C przez maksymalnie 30 dni lub do daty
ważności, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Jeśli PK została już
rozpuszczona i zamrożona, rozmrozić liczbę równych objętości odczynnika,
wystarczającą do przetworzenia liczby próbek przeznaczonych do danego
przebiegu testowego (każda próbka wymaga 250 µl rozpuszczonego odczynnika
PK).
Bufor do wymywania I
(WB I)
Przygotować roboczy odczynnik WB I dodając 15 ml alkoholu bezwodnego do
butelki WB I. Wymieszać odwracając butelkę od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce,
że dodano etanol, i wpisać datę. Przechowywać odczynnik WB I w temperaturze od
15°C do 30°C przez maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od
Bufor do wymywania II
(WB II)
Przygotować roboczy odczynnik WB II przez dodanie do butelki z odczynnikiem
WB II 50 ml etanolu bezwodnego. Wymieszać zawartość, odwracając butelkę do
góry dnem od 5 do 10 razy. Zapisać na butelce, że dodano etanol, i wpisać datę.
Przechowywać odczynnik WB II w temperaturze od 15°C do 30°C przez
maksymalnie 90 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi
wcześniej.
Wszystkie roztwory przechowywane w temperaturze od 15°C do 30°C powinny być klarowne. Jeżeli w
którymkolwiek odczynniku obecny jest osad, ogrzać roztwór do temperatury 37°C aż do rozpuszczenia się
osadu. Nie wolno używać odczynnika do czasu rozpuszczenia się całego osadu.
Procedura izolacji DNA
1. Opisać probówkę stożkową o pojemności 15 ml dla każdej próbki osocza i kontroli ujemnej. Jałowa woda
może służyć jako kontrola ujemna i może być przetwarzana w taki sam sposób jak próbki.
2. Zamieszać w mieszadle wibracyjnym, a następnie przenieść 2 ml każdej próbki osocza lub kontroli ujemnej
(woda jałowa) do oddzielnej probówki o pojemności 15 ml.
Uwaga:
Do przetwarzania próbki za pomocą zestawu
przynajmniej 2 ml osocza.
cobas® cfDNA Sample Preparation Kit potrzebne są
3. Dodać 250 µl PK do każdej probówki.
4. Dodać 2 ml odczynnika DNA PBB do każdej probówki.
5. Wymieszać probówki z próbką zawierające odczynniki DNA PBB/PK odwracając je od 3 do 5 razy.
6. Inkubować każdą probówkę w temperaturze pokojowej (od 15°C do 30°C) przez 30 minut.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
51
®
Uwaga:
Podczas inkubacji przygotować wymaganą liczbę probówek filtrujących HPEA FT opisując
każdą probówkę filtrującą HPEA FT odpowiednimi danymi na korku każdej probówki filtrującej
HPEA FT.
Uwaga:
Na każdą próbkę będzie potrzebna jedna probówka filtrująca FT HPEA, trzy probówki do
pobierania (CT) i jedna probówka do elucji (probówka do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml).
Uwaga:
Podczas inkubacji należy oznakować wymaganą liczbę probówek do elucji (probówek do
mikrowirówki o pojemności 1,5 ml) informacjami identyfikującymi próbkę lub kontrolę.
7. Dodać 500 µl izopropanolu i wymieszać lizat odwracając od 3 do 5 razy.
8. Przenieść całość lizatu do właściwie oznakowanej probówki filtrującej HPEA FT.
9. Używając wirówki laboratoryjnej, odwirować probówkę filtrującą HPEA FT przy 4000 x g przez 5 minut.
10. Po odwirowaniu wyjąć probówkę filtrującą HPEA FT ze stożkowej probówki do pobierania o pojemności 50
ml. Umieścić probówkę filtrującą HPEA FT na probówce CT. Zdjąć większy zacisk blokujący odkręcając i
odciągając go z zespołu.
11. Zdjąć mniejszy zacisk blokujący spod korka probówki filtrującej (FT) popychając go do góry, aż uszczelka
będzie pęknięta po obu stronach korkach, a następnie odciągając go z zespołu.
12. Zdjąć probówkę filtrującą HPEA z probówki FT pochylając przedłużenie z dala od strony korka probówki
FT.
13. Wyrzucić zawartość ze starej probówki filtrującej HPEA FT do odpadów chemicznych i w odpowiedni
sposób usunąć zużytą jednostkę.
14. Opisać odpowiednio korek filtra.
15. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB I do każdej probówki FT.
Uwaga:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB I opisano w tabeli w rozdziale „Przygotowanie
odczynników”.
16. Do pozostałej części protokołu użyć mikrowirówki laboratoryjnej.
17. Odwirować jednostki FT/CT przy 8000 x g przez 1 minutę.
18. Umieścić każdą probówkę FT na nowej probówce CT. Wyrzucić zawartość z każdej probówki CT do
odpadów chemicznych i odpowiednio zutylizować starą probówkę CT.
19. Dodać 500 µl roboczego odczynnika WB II do każdej probówki FT.
Uwaga:
Przygotowanie roboczego odczynnika WB II opisano w tabeli w rozdziale „Przygotowanie
odczynników”.
21. Odwirować jednostki FT/CT przy 8000 x g przez 1 minutę.
23. Odwirować jednostki FT/CT przy 16 000 x g do 20 000 x g przez 1 minutę, aby osuszyć membranę filtra.
24. Umieścić probówkę FT na probówce do elucji (wolnej od RNaz/DNazy probówce do mikrowirówki o
pojemności 1,5 ml) oznakowanej uprzednio informacjami identyfikującymi próbkę. Wyrzucić zawartość z
każdej probówki CT do odpadów chemicznych i odpowiednio utylizować starą probówkę CT.
25. Dodać 100 µl odczynnika DNA EB na środek membrany probówki FT bez dotykania membrany probówki
FT.
26. Inkubować każdą probówkę do elucji FT w temperaturze pokojowej (od 15°C do 30°C) przez 5 minut.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
52
®
27. Wirować probówkę FT z probówką do elucji z przyspieszeniem 8000 x g przez 1 minutę, aby zebrać eluat
do probówki do elucji (uprzednio oznakowanej wolnej od RNaz/DNaz probówki do mikrowirówki o
pojemności 1,5 ml). Eluat stanowi roztwór podstawowy DNA. Eluat należy przed użyciem zamieszać w
mieszadle wibracyjnym.
28. Odrzucić probówkę FT. Zamknąć zatyczki na probówkach do elucji.
29. Roztwór podstawowy DNA jest gotowy do testów PCR po zamieszaniu w mieszadle wibracyjnym.
Przechowywać roztwór podstawowy DNA zgodnie z instrukcjami w części Transport, przechowywanie i
stabilność próbek.
Amplifikacja i detekcja
Uwaga:
Aby zapobiec zanieczyszczeniu roboczego odczynnika MMX próbkami DNA, należy
przeprowadzać amplifikację i detekcję w miejscu oddzielonym od obszaru wykonywania izolacji
DNA. Przed przygotowaniem roboczego MMX należy dokładnie oczyścić obszar roboczy
amplifikacji i detekcji. W celu właściwego oczyszczenia należy dokładnie przetrzeć wszystkie
powierzchnie, włącznie ze statywami i pipetorami, 0,5% roztworem podchlorynu sodu, a
następnie 70% roztworem etanolu. Dostępny w handlu płynny wybielacz przeznaczony do
zastosowań domowych zazwyczaj zawiera podchloryn sodu o stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie
domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
Szczegółowe wskazówki dotyczące konfigurowania analizatora cobas z 480 zamieszczono w Instrukcji obsługi
analizatora cobas z 480.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
53
®
Konfiguracja zlecenia testu
Szczegółowe instrukcje dotyczące etapów przebiegu EGFR zamieszczono w Instrukcji obsługi analizatora
cobas® 4800 System cobas z 480 oraz podręczniku operatora oprogramowania cobas® EGFR Mutation Test
v2.
Wygenerować mapę płytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli do przebiegu. Kontrola mutacji jest
umieszczona w pozycjach A01–A03 płytki. Kontrola ujemna jest umieszczona w pozycjach B01–B03 płytki.
Następnie rozcieńczone próbki są dodawane w zestawach po 3 kolumny począwszy od C01–C03 do H09–H12
jak przedstawia to Ryc. 5.
Ryc. 5
®
Układ płytki dla testu cobas EGFR Mutation Test v2
Rząd/kolumna
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
A
MC
MMX 1
MC
MMX 2
MC
MMX 3
v2
S7
MMX 1
S7
MMX 2
S7
MMX 3
v2
S15
MMX 1
S15
MMX 2
S15
MMX 3
v2
S23
MMX 1
S23
MMX 2
S23
MMX 3
v2
B
NEG
MMX 1
NEG
MMX 2
S8
MMX 1
S8
MMX 2
S16
MMX 2
S24
MMX 2
S1
MMX 2
S9
MMX 1
S9
MMX 2
S17
MMX 1
S17
MMX 2
S16
MMX 3
v2
S17
MMX 3
v2
S24
MMX 1
S1
MMX 1
S8
MMX 3
v2
S9
MMX 3
v2
S16
MMX 1
C
NEG
MMX 3
v2
S1
MMX 3
v2
S25
MMX 1
S25
MMX 2
S24
MMX 3
v2
S25
MMX 3
v2
D
S2
MMX 1
S2
MMX 2
S2
MMX 3
v2
S10
MMX 1
S10
MMX 2
S10
MMX 3
v2
S18
MMX 1
S18
MMX 2
S18
MMX 3
v2
S26
MMX 1
S26
MMX 2
S26
MMX 3
v2
E
S3
MMX 1
S3
MMX 2
S11
MMX 1
S11
MMX 2
S11
MMX 3
v2
S19
MMX 1
S19
MMX 2
S27
MMX 2
S27
MMX 3
v2
S4
MMX 1
S4
MMX 2
S12
MMX 1
S12
MMX 2
S12
MMX 3
v2
S20
MMX 1
S20
MMX 2
S19
MMX 3
v2
S20
MMX 3
v2
S27
MMX 1
F
S3
MMX 3
v2
S4
MMX 3
v2
S28
MMX 1
S28
MMX 2
S28
MMX 3
v2
G
S5
MMX 1
S5
MMX 2
S13
MMX 1
S13
MMX 2
S21
MMX 2
S29
MMX 2
S6
MMX 2
S14
MMX 1
S14
MMX 2
S22
MMX 1
S22
MMX 2
S21
MMX 3
v2
S22
MMX 3
v2
S29
MMX 1
S6
MMX 1
S13
MMX 3
v2
S14
MMX 3
v2
S21
MMX 1
H
S5
MMX 3
v2
S6
MMX 3
v2
S30
MMX 1
S30
MMX 2
S29
MMX 3
v2
S30
MMX 3
v2
Gdzie: MC = kontrola mutacji, NEG = kontrola ujemna, S# = identyfikator próbki, a MMX-# odpowiada odczynnikowi Master Mix 1, 2 lub 3 v2.
Uwaga:
Każda próbka musi rozciągać się przez trzy kolejne kolumny w jednym rzędzie, aby
możliwe było utworzenie wyniku.
Uwaga:
Odczynnik roboczy Master Mix 1 musi być umieszczony w kolumnie 01, 04, 07 i 10 na
płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 2 musi być umieszczony w kolumnie 02, 05, 08 i 11 na
płytce. Odczynnik roboczy Master Mix 3 v2 musi być umieszczony w kolumnie 03, 06, 09 i 12 na
płytce.
Uwaga:
Na jednej płytce można umieścić do 30 próbek. Jeżeli do przetworzenia wszystkich
próbek na płytce potrzebny jest więcej niż jeden zestaw odczynnika, wszystkie zestawy muszą
pochodzić z tej samej serii.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
54
®
1. Włączyć analizator cobas z 480. Zanim będzie można rozpocząć przebieg, instrument będzie przez kilka
minut rozgrzewał się.
2. Włączyć jednostkę sterującą. Jednostka sterująca automatycznie zaloguje się do systemu Windows.
3. Kliknąć dwukrotnie ikonę oprogramowania cobas® 4800 i zalogować się, aby przeprowadzić przebieg
używając określonego identyfikatora użytkownika laboratorium i hasła.
4. Kliknąć w menu ikonę „New Run”.
5. Zostanie wyświetlone okno wyskakujące „Select Test”. Wybrać „EGFR Plasma Test” i kliknąć przycisk
„OK”.
6. Po wyświetleniu ekranu „Work Place” wpisać lub zeskanować kod kreskowy MWP w polu „Microwell Plate
ID”. Zeskanować w odpowiednich polach kody kreskowe identyfikatora zestawu do izolacji DNA oraz
identyfikator zestawu cobas® EGFR Mutation Test Reagent. W polu „Sample” wprowadzić „24” dla
pierwszego i „6” dla drugiego zestawu (jeżeli planowany jest przebieg dla pełnej płytki 30 próbek). Jeżeli
planowany jest przebieg dla mniej niż 24 próbek, należy wprowadzić odpowiednią liczbę w pole próbki w
pierwszym wierszu.
7. Pole „Sample ID” jest wypełniane automatycznie w pozycjach kontroli. Wpisać lub zeskanować unikatowy
identyfikator próbki dla każdej próbki w kolumnie „Sample ID”.
8. Po zakończeniu wprowadzania identyfikatorów próbek wybrać przycisk „Save” znajdujący się w lewym
dolnym rogu ekranu.
9. Zapisać plik pod domyślną nazwą przypisaną przez oprogramowanie.
10. Wygenerować układ płytki z pozycjami wszystkich próbek i kontroli w serii klikając przycisk Print i
wybierając File -> Print w oknie Preview. Zawsze wypełniać płytkę kolumnami zaczynając od EGFR MC w
pozycjach A01–A03 i NEG w pozycjach B01–B03. Mapować próbki zaczynając od pozycji C01–C03 i
kontynuować w dół do H01–H03, następnie przejść do pozycji A04–A06 w dół do H04–H06, aż zostaną
zmapowane wszystkie próbki (Ryc. 2).
Konfiguracja reakcji
Przygotowanie roboczego odczynnika Master Mix (MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2)
Uwaga:
Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 oraz roboczy odczynnik MMX
są wrażliwe na światło i należy je chronić przed długotrwałą ekspozycją na światło.
Uwaga:
Ze względu na lepkość odczynników EGFR MIX oraz roboczego odczynnika MMX
przenoszenie pipetą należy wykonywać powoli, aby zagwarantować podanie z końcówki całej
objętości mieszaniny.
Uwaga:
Odczynniki EGFR MMX-1, EGFR MMX-2 i EGFR MMX-3 v2 mogą przybierać zabarwienie
jasnoniebieskie lub zbliżone do purpury. Nie wpływa to na działanie odczynnika.
Przygotować w oddzielnych probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml trzy większe porcje
odczynników potrzebnych do sporządzenia roboczych odczynników MMX: jedną odczynnika EGFR MMX-1,
jedną odczynnika EGFR MMX-2 i jedną odczynnika EGFR MMX-3 v2.
1.
Obliczyć objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 wymaganą do
sporządzenia każdego z odczynników roboczych MMX według następującego wzoru:
Wymagana objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 = (liczba próbek
+ 2 kontrole +1) x 20 µl
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
55
®
2. Obliczyć objętość odczynnika MGAC, wymaganą do sporządzenia każdego z odczynników roboczych
MMX, według następującego wzoru:
Wymagana objętość odczynnika MGAC = (liczba próbek + 2 kontrole +1) x 5 µl
Posługując się Tabela 12 określić objętość każdego odczynnika, potrzebną do przygotowania roboczego
odczynnika MMX, na podstawie liczby próbek włączonych do przebiegu testowego.
Tabela 12 Objętości odczynników, potrzebne do sporządzenia roboczego odczynnika MMX-1, roboczego odczynnika MMX-2 i
roboczego odczynnika MMX-3 v2
Liczba próbek*
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
MMX
20 µl
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
MGAC
5 µl
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
Całkowita obj.
każdego roboczego
odczynnika MMX (µl)
* Objętości odpowiadające liczbie próbek obliczono na podstawie sumy: liczba próbek + 2 kontrole + 1
3. Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek z odczynnikami EGFR MMX-1, EGFR MMX-2, EGFR MMX-3 v2 i MGAC z
miejsca, w którym były przechowywane w temperaturze od 2°C do 8°C. Przed użyciem każdego
odczynnika mieszać go przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym, po czym zgromadzić płyn na dnie
probówki. Oznakować jałową probówkę do mikrowirówki, przeznaczoną na roboczy odczynnik MMX-1,
roboczy odczynnik MMX-2 i roboczy odczynnik MMX-3 v2.
4. Dodać obliczoną objętość odczynnika EGFR MMX-1 lub EGFR MMX-2 lub EGFR MMX-3 v2 do
odpowiedniej probówki przeznaczonej na roboczy odczynnik MMX.
5. Dodać obliczoną objętość odczynnika MGAC do probówek przeznaczonych na robocze odczynniki MMX.
6. Mieszać zawartość probówek na mieszadle wibracyjnym od 3 do 5 sekund, aby zapewnić dostateczne
wymieszanie odczynnika.
Uwaga:
Próbki i kontrole należy dodać do płytki z mikrodołkami (płytki AD) w ciągu 1 godziny od
przygotowania roboczych odczynników MMX.
Uwaga:
Należy używać wyłącznie płytki z mikrodołkami (płytki AD) systemu cobas® 4800 oraz
odpowiedniego filmu do zaklejania.
Przygotowanie płytki
1. Przenieść pipetą 25 µl roboczego odczynnika MMX do każdego dołka reakcyjnego płytki z mikrodołkami
(płytki AD), potrzebnego do przeprowadzenia przebiegu testowego. Nie dopuścić do tego, aby końcówka
pipetora dotknęła płytki poza obrębem dołka.
· Dodać roboczego odczynnika MMX-3 v2 (zawierającego odczynnik EGFR MMX-3 v2) do dołków
płytki z mikrodołkami (płytki AD) w kolumnach 03, 06, 09 i 12, zgodnie z potrzebą.
2. Przenieść pipetą 25 µl odczynnika EGFR MC do dołków A01, A02 i A03 płytki z mikrodołkami (płytki AD);
dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z powrotem, co najmniej dwukrotnie w
obrębie danego dołka.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
56
®
3. Używając nowej końcówki pipetora, przenieść pipetą 25 µl odczynnika NEG do dołków B01, B02 i B03
płytki z mikrodołkami (płytki AD); dokładnie wymieszać, aspirując pipetą zawartość i podając ją z
powrotem, co najmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka.
Uwaga:
Każdy przebieg testowy musi zawierać kontrolę dodatnią (odczynnik EGFR MC) w
dołkach A01, A02 i A03 oraz kontrolę ujemną (odczynnik NEG) w dołkach B01, B02 i B03; w
przeciwnym razie przebieg testowy zostanie odrzucony jako nieważny przez analizator cobas z
480.
Uwaga:
Należy zmieniać rękawice zgodnie z potrzebami, aby chronić próbki przed wzajemnym
zanieczyszczeniem zawartym w nich materiałem oraz chronić probówki do reakcji PCR przed
zanieczyszczeniem na ich zewnętrznych powierzchniach.
4. Używając nowych końcówek pipetora do każdej próbki DNA, dodać 25 µl pierwszej próbki DNA do dołków:
C01, C02 i C03 płytki z mikrodołkami (płytki AD); używając nowej końcówki do dodawania próbki DNA do
każdego dołka; dokładnie wymieszać zawartość każdego dołka, aspirując pipetą zawartość i podając ją z
powrotem, przynajmniej dwukrotnie w obrębie danego dołka. Powtórzyć tę procedurę z roztworem DNA z
kolejnych próbek (dołki: D01, D02 i D03). Postępować według szablonu przedstawionego na ryc. 2, dopóki
roztwory DNA ze wszystkich próbek nie zostaną umieszczone na płytce z mikrodołkami (płytce AD).
Upewnić się, że cały płyn zebrał się na dnie dołków.
5. Przykryć płytkę z mikrodołkami (płytkę AD) filmem do zaklejania (dostarczonym wraz z płytkami). Użyć
aplikatora filmu uszczelniającego do szczelnego przytwierdzenia filmu do płytki z mikrodołkami (płytki AD).
6. Przed rozpoczęciem reakcji PCR potwierdzić, że cały płyn zebrał się na dnie każdego z dołków.
Uwaga:
Amplifikacja i detekcja powinny rozpocząć się w ciągu 1 godziny od dodania
rozcieńczonego roztworu DNA z pierwszej próbki do roboczego odczynnika MMX.
Rozpoczęcie reakcji PCR
Szczegółowe wskazówki dotyczące etapów przebiegu pracy przy wykonywaniu badań genu kodującego EGFR
zamieszczono w Podręczniku użytkownika testu cobas® EGFR.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
57
®
Wyniki
Interpretacja wyników
Uwaga:
Cały cykl pracy i walidację próbek przeprowadza oprogramowanie cobas® 4800.
Uwaga:
Ważny przebieg testowy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki badania
próbek.
W przypadku ważnego przebiegu wyniki badania próbek interpretuje się w sposób, który przedstawia Tabela
13.
®
Tabela 13 Wynik interpretacji testu cobas EGFR
Wynik testu
Mutation
Detected
Wynik badania mutacji
Ex19Del
Ex19Del: SQI
S768I
S768I: SQI
L858R
L858R: SQI
T790M
T790M: SQI
L861Q
L861Q: SQI
G719X
G719X: SQI
Ex20Ins
Ex20Ins: SQI
(może być obecna większa
liczba mutacji niż jedna)
(może być obecna większa
liczba mutacji niż jedna)
No Mutation
Detected
Nie dotyczy
(NMD)*
Invalid
Failed
Wynik wskaźnika
półilościowego (SQI)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
Interpretacja
Wykryto mutację w określonym
regionie docelowym genu
kodującego EGFR.
Nie dotyczy
Nie wykryto mutacji w regionach
docelowych genu kodującego
EGFR.
Nie dotyczy
Wynik badania próbki jest nieważny.
Powtórzyć test próbek z nieważnymi
wynikami, postępując zgodnie z
instrukcją przedstawioną poniżej w
rozdziale Ponowny test próbek z
nieważnymi wynikami.
Nie dotyczy
Przebieg testowy nie powiódł się
wskutek awarii sprzętu lub
oprogramowania. Skontaktować się
z miejscowym biurem firmy Roche w
celu uzyskania pomocy technicznej.
* Wynik „No Mutation Detected” nie wyklucza obecności mutacji w regionach docelowych genu kodującego EGFR,
ponieważ wyniki zależą od stężenia zmutowanych sekwencji, dostatecznej integralności próbki, braku inhibitorów i
wystarczającej do wykrycia ilości DNA.
Wskaźnik półilościowy (SQI)
SQI to półilościowa miara ilości cfDNA w próbce, której można użyć do pomiaru różnic w obciążeniu mutacją w
czasie. Wzrost wartości SQI wskazuje na wzrost ilości odpowiedniej mutacji docelowej w danej próbce,
natomiast zmniejszenie wartości SQI wskazuje na spadek całkowitej ilości odpowiedniej mutacji docelowej w
danej próbce.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
58
®
Ponowny test próbek z nieważnymi wynikami
1. Jeżeli przebieg jest nieważny, będzie niewystarczająca ilość ekstrahowanego DNA dla każdej próbki, aby
powtórzyć amplifikację i detekcję. Powtórzyć całą procedurę testu dla wszystkich próbek zaczynając od
izolacji DNA.
2. Jeżeli przebieg jest ważny, ale próbka jest nieważna, będzie niewystarczająca ilość ekstrahowanego DNA
dla każdej próbki, aby powtórzyć amplifikację i detekcję. Powtórzyć całą procedurę testu dla próbki
nieważnej zaczynając od izolacji DNA.
Kontrola jakości i ważność wyników
Każdy przebieg testowy, liczący do 30 próbek, zawiera jeden zestaw kontroli mutacji do testu cobas® EGFR
(EGFR MC) (dołki A01, A02 i A03) i kontroli ujemnej (NEG) (dołki B01, B02 i B03) odczynników roboczych
MMX-1, MMX-2 i MMX-3 v2. Przebieg jest ważny, jeżeli ważne są: kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC)
i kontrola ujemna (NEG). Jeżeli kontrola mutacji do testu EGFR (EGFR MC) lub kontrola ujemna (NEG) jest
nieważna, cały przebieg wymaga powtórzenia.
Kontrola mutacji
Wynik kontroli mutacji do testu EGFR (EGFR MC) musi nosić określenie „Valid”. Jeżeli wyniki oznaczenia
EGFR MC stale są nieważne, należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania
pomocy technicznej.
Kontrola ujemna
Wynik kontroli ujemnej (NEG) musi nosić określenie „Valid”. Jeżeli wyniki oznaczenia NEG stale są nieważne,
należy skontaktować się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Ograniczenia metody
1. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 został zweryfikowany z próbkami osocza pobranego na K2 EDTA.
2. Skuteczność testu cobas® EGFR Mutation Test v2 była weryfikowana przy użyciu zestawu cobas® cfDNA
Sample Preparation Kit (Roche P/N: 07247737190) z próbkami osocza K2 EDTA.
3. Detekcja mutacji zależy od liczby kopii obecnych w próbce, na którą wpływać może integralność próbki,
ilość wyizolowanego DNA i obecność substancji zakłócających detekcję.
4. Wiarygodność wyników zależy od dostatecznego transportu, przechowywania i przetwarzania. Należy
przestrzegać procedur opisanych w niniejszej instrukcji użytkowania oraz w Podręczniku użytkownika testu
cobas® EGFR.
5. Dodanie do odczynnika Master Mix testu cobas® EGFR Mutation Test v2 enzymu AmpErase umożliwia
selektywną amplifikację docelowego DNA; jednak dla uniknięcia zanieczyszczenia odczynników konieczne
jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w
niniejszej instrukcji użytkowania.
6. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu
cobas® 4800.
7. Do użycia z tym produktem został zatwierdzony wyłącznie analizator cobas z 480. Z tym produktem nie
wolno używać żadnego innego termocyklera z systemem optycznym do detekcji w czasie rzeczywistym.
8. Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik
przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia ilościowych różnic
występujących pomiędzy nimi.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
59
®
9. Mutacje w obrębie regionów genomowego DNA tworzącego gen kodujący EGFR, z którymi wiążą się
primery i/lub sondy używane w teście cobas® EGFR, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie
obecności mutacji w eksonach 18., 19., 20. i 21. (wyniki „Mutation Not Detected”).
10. Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych.
11. Badane próbki poza zakresem liniowym oznaczenia mogą generować wyniki fałszywe.
12. Test cobas® EGFR Mutation Test v2 został zatwierdzony do zastosowania 25 µl roztworu podstawowego
DNA na dołek reakcyjny. Nie zaleca się stosowania początkowych objętości roztworu podstawowego DNA
w ilości mniejszej niż 25 µl w każdym dołku reakcyjnym.
13. Opisana wyżej procedura musi być przestrzegana, aby wykrywać ≥100 kopii DNA mutanta na ml osocza
K2 EDTA w przypadku mutacji EGFR w Tabela 1.
14. Próbki z wynikami oznaczonymi jako „No Mutation Detected” mogą zawierać mutacje w genie EGFR
niewykrywane przez to oznaczenie.
15. Należy rozważyć, czy wynik „No Mutation Detected” dla osocza należy powtórzyć, czy potwierdzić przez
badania tkanki.
16. Test cobas® EGFR wykazuje reaktywność krzyżową (wyniki „Mutation Detected”) z mutacją L747S w
eksonie 19., rzadką mutacją nabytą, która może odpowiadać za oporność na leczenie TKI11.
Ocena skuteczności w badaniach nieklinicznych
Następujące dane mają wykazywać skuteczność analityczną testu cobas® EGFR.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
60
®
Granica wykrywalności przy użyciu DNA linii komórkowych
DNA linii komórkowych zawierający każdą z siedmiu klas mutacji wykrywanych przez test dodano do osocza
K2 EDTA od zdrowego dawcy, które jest EGFR typu dzikiego. Przygotowano seryjne rozcieńczenia i zbadano
24 powtórzenia każdego elementu panelu z użyciem każdej z trzech serii zestawów cobas® EGFR.
Granicę wykrywalności określono dla każdej z siedmiu klas mutacji wykrywanych przez test badając najniższe
stężenia DNA, które dawały wynik EGFR „Mutation Detected” z częstością przynajmniej 95% dla badanej
mutacji. Wyniki przedstawia Tabela 14.
®
Tabela 14 Granica wykrywalności testu cobas EGFR przy użyciu osocza K2 EDTA
2156G>C
Granica
wykrywalności
niezmienionego* DNA
(kopii/ml)
100
Granica
wykrywalności
roztartego** DNA
(kopii/ml)
100
Ex19Del
2235_2249del15
25
75
20
S768I
2303G>T
20
25
20
T790M
2369C>T
25
100
20
Ex20Ins
80
25
21
L858R
2573T>G
10
100
21
L861Q
2582T>A
30
30
Ekson
genu
kodującego
EGFR
18
Mutacja
genu
kodującego
EGFR
G719A
19
Sekwencja docelowego
kwasu nukleinowego
Różnice w obserwowanej granicy wykrywalności wynikały z różnic DNA tła.
*Niezmieniony DNA linii komórkowej miał tło DNA typu dzikiego wynoszące około 1000 kopii/ml.
**DNA linii komórkowych roztarty mechaniczne na fragmenty o średniej wielkości 200 pz miał tło DNA typu
dzikiego wynoszące około 10 000 kopii/ml.
Wyniki tego badania wskazują, że test cobas® EGFR umożliwia wykrywanie mutacji w eksonach 18., 19., 20. i
21. genu kodującego EGFR przy ≤ 100 kopiach DNA mutanta na ml osocza z zastosowaniem standardowej
początkowej objętości 25 µl podstawowego roztworu DNA na dołek reakcyjny.
Korelacja z MiSeq przy użyciu klinicznych próbek osocza K2 EDTA
W celu oceny zdolności testu do prawidłowej identyfikacji mutacji EGFR w osoczu, przeprowadzono badanie
porównawcze 74 próbek osocza K2 EDTA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (ang. NonSmall Cell Lung Cancer, NSCLC) wykorzystując test cobas® EGFR oraz platformę do sekwencjonowania
Illumina MiSeq (MiSeq) (Tabela 15).
®
Tabela 15 Test cobas EGFR Mutation Test v2 w porównaniu z sekwencjonowaniem MiSeq
Miara zgodności
Procent zgodności (n)
95% CI
Zgodność procentowa wyników dodatnich
(PPA)
80,0% (28/35)
70,3–83,7%
Zgodność procentowa wyników ujemnych
(NPA)
94,9% (37/39)
83,1–98,6%
87,8% (65/74)
81,2–90,7%
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
61
®
Liniowość
Badanie liniowości testu cobas® EGFR przeprowadzono z serią rozcieńczeń przynajmniej 8 elementów panelu
obejmujących zakres liniowości dominującej mutacji w każdej klasie mutacji EGFR zgłaszanych przez test.
Elementy panelu zostały przygotowane przez rozcieńczenie DNA linii komórkowych zawierających każdą z
dominujących mutacji ze zdrowym osoczem K2 EDTA, które jest typem dzikim dla EGFR. Ocenę
przeprowadzono według wytycznych EP06-AE CLSI 16. Zbadano dziesięć powtórzeń na element panelu każdej z
2 serii dla stężeń do 1,0E+04 kopii/ml (łącznie 20 powtórzeń na poziom). Powyżej 1,0E+04 kopii/ml badano
jedno powtórzenie na serię.
Dla każdej klasy mutacji testu cobas® EGFR zakres liniowości wskazuje Tabela 16 i odpowiednie wykresy dla
jednej serii przedstawiają Ryc. 6 do Ryc. 12.
®
Tabela 16 Zakres liniowości testu cobas EGFR przy użyciu osocza K2 EDTA
Ekson genu
kodującego
EGFR
18
Mutacja genu
kodującego
EGFR
G719A
19
Delecja w
eksonie 19.
20
S768I
2303G>T
10 — 1E+05
20
T790M
2369C>T
50 — 1E+05
20
Insercja w
eksonie 20.
10 — 1E+05
21
L858R
2573T>G
10 — 1E+05
21
L861Q
2582T>A
10 — 1E+05
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
kwasu nukleinowego
Zakres liniowości (kopie/ml)
2156 G>C
50 — 1E+04
2235_2249del15
10 — 1E+05
62
®
Ryc. 6
Liniowość DNA mutanta w osoczu K2 EDTA:
DNA linii komórkowej G719A
Ryc. 7
DNA linii komórkowej Ex19 Del
Log miana (kp/ml)
Log miana (kp/ml)
SQI = -0,987 + 2,986 * Log kopii na ml
2
R = 0,968
SQI = 7,042 + 3,507 * Log kopii na ml
2
R = 0,981
Ryc. 8
Ryc. 9
DNA linii komórkowej S768I
Log miana (kp/ml)
2
R = 0,912
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
DNA linii komórkowej T790M
Log miana (kp/ml)
2
R = 0,973
63
®
Ryc. 10
DNA linii komórkowej Ex20Ins
Log miana (kp/ml)
2
R = 0,990
Ryc. 12
Ryc. 11
DNA linii komórkowej L858R
Log miana (kp/ml)
2
R = 0,933
DNA linii komórkowej L861Q
Log miana (kp/ml)
2
R = 0,980
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
64
®
Powtarzalność
Powtarzalność testu cobas® EGFR oceniono wykorzystując rozcieńczenia DNA linii komórkowej mutanta
EGFR rozcieńczonego w próbkach osocza K2 EDTA. Dominująca mutacja w każdej klasie zgłaszanej przez
test była jednocześnie rozcieńczana i oceniana przy 3x granicy wykrywalności odpowiedniej mutacji (w
kopiach/ml), 1,0E+03 kopii/ml i 5,0E+04 kopii/ml. Dodatkowo badano jedną próbkę typu dzikiego. Każdą z
czterech próbek badało dwukrotnie dwóch operatorów używając dwóch różnych serii odczynników i dwóch
analizatorów cobas z 480 w ciągu 4 dni. Odsetek prawidłowych rozpoznań testu cobas® EGFR wyniósł 99,2%
(381/384).
Tabela 17 Wymienia średni SQI oraz odchylenie standardowe SQI z badania powtarzalności.
Tabela 17 Średni SQI oraz odchylenie standardowe SQI z badania powtarzalności
Ekson genu
kodującego
EGFR
Mutacja genu
kodującego
EGFR
18
19
G719A
Ex19Del
20
S768I
20
20
T790M
Ex20Ins
21
21
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
L858R
L861Q
kwasu nukleinowego
2156G>C
2235_2249del15
2303G>T
2369C>T
2573T>G
2582T>A
Stężenie
(kopie/ml)
Średnie
SQI
Odchylenie
standardowe
SQI (n=32)
3,00E+02
4,53
0,41
1,00E+03
6,86
0,38
5,00E+04
11,81
0,67
7,50E+01
13,42
0,46
1,00E+03
16,85
0,42
5,00E+04
22,31
0,55
6,00E+01
5,99
0,45
1,00E+03
8,49
0,43
5,00E+04
14,13
0,43
7,50E+01
9,00
1,03
1,00E+03
13,28
0,43
5,00E+04
19,52
0,57
2,40E+02
4,92
0,43
1,00E+03
6,77
0,40
5,00E+04
12,61
0,60
1,20E+02
9,81
0,47
1,00E+03
12,91
0,28
5,00E+04
17,21
0,81
4,50E+01
3,58
0,73
1,00E+03
7,91
0,45
5,00E+04
10,06
0,60
65
®
Dodatkowe informacje
Oznaczenia
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się następujące oznaczenia.
Tabela 18 Oznaczenia stosowane na etykietach produktów diagnostycznych PCR firmy Roche
Oprogramowanie pomocnicze
Wyrób do diagnostyki in vitro
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Dolna granica przypisanego zakresu
Arkusz kodów kreskowych
Wytwórca
Kod partii
Przechowywać z dala od światła
Zagrożenie biologiczne
Zawartość wystarczająca na <n> testów
Numer katalogowy
Przestrzegać zakresu temperatury
Sprawdź w instrukcji obsługi
Plik definicji testów
Zawartość zestawu
Górna granica przypisanego zakresu
Dystrybucja
Termin ważności
Wyłącznie do oceny działania w
badaniach IVD
Numer pozycji handlu globalnego
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE dotyczącej
diagnostycznych urządzeń medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
66
®
Wytwórca i dystrybutorzy
Tabela 19 Wytwórca i dystrybutorzy
Wyprodukowano w Stanach Zjednoczonych
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics
9115 Hague Road
Indianapolis, IN 46250-0457 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800-526-1247)
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos
Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Znaki towarowe i patenty
Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents
Copyright
©2015 Roche Molecular Systems, Inc.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
67
®
Piśmiennictwo
1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer.
Nat Rev Cancer. 2007;7:169-181.
2. Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer.
Nat Rev Cancer. 2010;10:760-774.
3. Zhou C, Wu Y-L, Chen G, et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre,
open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 2011;12:735-742.
Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, et al. Clinical outcomes in non-small-cell lung cancer patients with
EGFR mutations: pooled analysis. J Cell Mol Med. 2010;14:51-69.
American Cancer Society. Cancer Facts and Figures, 2012.
http://www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/cancerfactsfigures2012.
Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51.
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic.
Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in
polymerase chain reactions. Gene. 1990; 93:125-128.
Chosewood LC, Wilson DE. Biosafety and microbiological and biomedical laboratories-Fifth Edition. US
Department of Health and Human Services Publication. (CDC). 2009;21-1112.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of laboratory workers from occupationally
acquired infections. Approved Guideline-Fourth Edition. CLSI Document M29-A4: Wayne, PA;CLSI, 2014.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition. 2011.
11. Costa DB, Nguyen KS, Cho BC, Sequist LV, Jackman DM, Riely GJ, Yeap BY, Halmos B, Kim JH, Jänne
PA, Huberman MS, Pao W, Tenen DG, Kobayashi S. Effects of erlotinib in EGFR mutated non-small cell
lung cancers with resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 2008;14(21):7060-7067.
12. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of Detection Capability for Clinical
Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline - Second Edition. CLSI Document EP17-A2E:
Wayne, PA; CLSI, Jun 2012.
13. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference testing in clinical chemistry; Approved
Guideline–Second Edition. CLSI Document EP7-A2E Appendix D:Wayne, PA; CLSI, 2005.
®
14. Tarceva (erlotinib) Package Insert.
15. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with
advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label,
randomised phase 3 trial. The Lancet Oncology. 2012;13 v3:239-246.
16. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Evaluation of the linearity of quantitative measurement
procedures: A statistical approach; Approved Guideline. CLSI Document EP06-AE: Wayne, PA; CLSI, Apr
2003.
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
68
®
Wersja dokumentu
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 1.0
08/2015
07340761001-01PL
Doc. Rev. 1.0
Pierwsza publikacja.
69

cobas EGFR Mutation Test v2

Transkrypt

Podobne dokumenty

Innowacyjne wdrażanie standardów postępowania medycznego

Jak pobrać materiał genetyczny do testu DNA

Analiza DNA - praktyka - Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

manipulacje i mutacje DNA

Andrzej Kasprzak