Artykuł naukowy
Transkrypt
Artykuł naukowy
SPEKTROFOTOMETRIA UV-VIS W BADANIU AKTYWNOŚCI POCHODNYCH 1,3,4-TIADIAZOLI W STOSUNKU DO AChE I BuChE A. SKRZYPEK, J. MATYSIAK, A. NIEWIADOMY, Uniwersytet Przyrodniczy, Katedra Chemii, ul. Akademicka 15, 20-950 Lublin Abstrakt: Związki z grupy 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli posiadają szerokie spektrum działania biologicznego, uzależnione od rodzaju modyfikacji pierścienia heterocyklicznego. Znane są one głównie jako substancje o działaniu przeciwnowotworowym oraz antyproliferacyjnym w stosunku do szerokiej palety komórek ludzkich linii nowotworowych. W niniejszej pracy podjęto próbę określenia właściwości inhibicyjnych nowo zsyntezowanych pochodnych z tej grupy związków w stosunku do acetylocholinoesterazy (AChE) i butyrylocholinoesterazy (BuChE). Są to enzymy, który należą do klasy hydrolaz i są obecne w błonach presynaptycznych i postsynaptycznych układu cholinergicznego, w krwinkach czerwonych i w osoczu krwi. Zastosowano spektrofotometryczną metodę Ellmana, która w prosty sposób pozwala określić aktywność potencjalnych inhibitorów AChE oraz BuChE. Niektóre z badanych związków charakteryzują się inhibicją enzymu acetylocholinoesterazy przy stężeniach rzędu nM, mogą zatem zostać poddane dalszym badaniom w kierunku poszukiwania substancji o działaniu leczniczym w chorobie Alzheimera lub jako potencjalne insektycydy. Wprowadzenie: Choroba Alzheimera jest neurodegeneracyjnym schorzeniem układu nerwowego charakteryzującym się obecnością blaszek amyloidowych oraz zwyrodnienia włókienkowego w mózgu osób chorych, co w konsekwencji prowadzi do uszkodzenia neuronów układu cholinergicznego odpowiedzialnego za procesy uwagi i przywoływania śladów pamięciowych. Jest to najczęściej występująca postać otępienia, obejmująca 50 – 80% jego przypadków. Większość przeprowadzonych badań wskazuje na rozpowszechnienie się tej choroby w granicach 2 – 6 % populacji ogólnej osób powyżej 65 roku życia [1]. Z uwagi na stałe wydłużanie życia populacji należy oczekiwać, że jeśli nie zostaną opracowane metody zapobiegania lub leczenia tego schorzenia, liczba chorych może się podwoić a nawet potroić w ciągu najbliższych lat [2]. Leczenie objawowe w chorobie Alzheimera dotyczy wpływu na układy neuroprzekaźnikowe, a zwłaszcza na układ acetylocholinergiczny i zaliczane jest do tzw. strategii cholinergicznej. Istnieją różne metody zwiększania przekaźnictwa w układzie cholinergicznym takie jak: bezpośrednie podawanie acetylocholiny (ACh) czy też prekursorów (lecytyny) oraz działanie na receptory. Jednak tylko inhibitorom acetylocholinoesterazy udowodniono skuteczność przy stosunkowo niewielkich działaniach niepożądanych [3, 4]. Są one jedynymi lekami zaakceptowanymi przez Urząd ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) jako metoda leczenia choroby Alzheimera [5]. Dlatego też w terapii tej choroby istotną rolę odgrywają leki z grupy inhibitorów acetylocholinoesterazy (AChE), które hamują przez pewien czas rozwój zmian degeneracyjnych, niestety nie likwidują jej przyczyn. Leki te są przydatne we wczesnych stadiach choroby - przejściowo poprawiają pamięć i jakość życia osób dotkniętych chorobą Alzheimera. Nie wywierają natomiast istotnego wpływu na postęp schorzenia i nie hamują postępujących zmian neurodegeneracyjnych [6, 7]. Pierwszą substancją, którą zastosowano w leczeniu tej choroby była fizostygmina. Niestety niekorzystne parametry farmakokinetyczne oraz skutki uboczne w postaci silnych zaburzeń wegetatywnych spowodowały, że nie była ona stosowana na szerszą skalę. Jednak badania nad fizostygminą wykazały, że stymulacja neuroprzekaźnictwa ACh może wiązać się z przemijającą poprawą procesów pamięciowych oraz ogólnego stanu klinicznego chorych [8]. Innym lekiem jest takryna, niestety działa ona nieselektywnie, hamując zarówno enzymy w tkankach obwodowych, jak i w ośrodkowym układzie nerwowym. Substancja ta jest agonistą receptorów muskarynowych (M1 i M2) oraz przyśpiesza syntezę i uwalnianie ACh z magazynów. Ponadto blokuje kanały jonowe (Na+, K+, Ca2+) oraz hamuje uwalnianie głównego neuroprzekaźnika o działaniu inhibitującym w układzie nerwowym, tzw. GABA. Stosowanie takryny powoduje liczne objawy niepożądane takie jak: zwiększenie aktywności aminotransferaz, zmiany martwicze w biopsji wątroby, nudności. Zdecydowanie bezpieczniejszym lekiem jest donepezil, który nie działa hepatotoksycznie, a przy tym jego działanie lecznicze jest uznawane za zadowalające u większości pacjentów poddanych terapii [9, 10]. Rys. 1. Wzór strukturalny acetylocholiny. Wspomniany powyżej neuroprzekaźnik - acetylocholina (Rys. 1) pobudza część postsynaptyczną neuronu cholinergicznego. Prekursorem acetylocholiny jest cholina, która przenika z przestrzeni międzykomórkowej do wnętrza neuronów. Cholina ulega estryfikacji, tj. przyłączeniu reszty kwasu octowego do acetylocholiny przy udziale enzymu acetylotransferazy cholinowej. Powstała ACh jest uwalniana z zakończeń presynaptycznych do przestrzeni synaptycznej przez dopływające impulsy nerwowe, a część jej jest magazynowana w neuronach. Po wydzieleniu z zakończeń presynaptycznych acetylocholina oddziałuje na receptory znajdujące się w zakończeniach postsynaptycznych i jest bardzo szybko rozkładana przez enzymy tzw. cholinoesterazy – acetylocholinesterazę (AChE) i butyrylocholinesterazę (BuChE). AChE występuje w mózgu w neuronach, BuChE w komórkach glejowych, zwłaszcza w reaktywnym mikrogleju [11]. Zarówno AChE, jak i BuChE występują w płytkach starczych. W wyniku ubytku neuronów cholinoergicznych znacznie spada aktywność AChE, a ACh niszczona jest intensywnie przez zawartą w gleju i płytkach starczych BuChE, której aktywność wzrasta w miarę postępu choroby Alzheimera. Inhibitory cholinoesteraz dzięki blokowaniu tych enzymów, przyczyniają się do zwiększenia ilości ACh w synapsach cholinoergicznych, co poprawia neuroprzekaźnictwo. Omawiane inhibitory można podzielić ze względu na mechanizm ich działania na trzy grupy: inhibitory odwracalne (np. takryna, donepezil), pseudonieodwracalne (np. fizostygmina) i nieodwracalne (np. metrifonat). Inhibitory nieodwracalnie i pseudonieodwracalne nazywane są także acylującymi, ponieważ acylują enzym, działając w ten sam sposób co substrat. Różnice dotyczą jedynie prędkości deacylacji. Mogą być one bardzo powolne, w przypadku inhibitorów pseudonieodwracalnych, bądź nawet równe zeru - dla nieodwracalnych. Natomiast inhibitory odwracalne tworzą jedynie addytywny kompleks, w konsekwencji nie dając produktów reakcji. W rezultacie prędkość reakcji hydrolizy ulega spowolnieniu jako efekt konkurencji między inhibitorem a substratem o centrum katalityczne enzymu [12]. Badając i analizując przebieg reakcji enzymatycznych Leonor Michaelis i Maud Menten sformułowali teorię działania enzymów i opisali ich kinetykę. Zgodnie z tą teorią enzym (E) tworzy z substratem (S) kompleks enzym-substrat (ES), a następnie może z powrotem dysocjować w reakcji odwrotnej na enzym i substrat lub przekształcać się w produkt (P) i wolny enzym (Schemat 1). Mechanizm łączenia się enzymu z substratem ma charakter indukowanego dopasowania, opierającego się na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu lub odpowiedniej grupy substratów i przekształceniu ich w produkty. W kompleksie ES cząsteczka enzymu wymusza optymalne dla reakcji ułożenie cząsteczek substratów w przestrzeni. W trakcie tworzenia kompleksu również w cząsteczce enzymu następują zmiany budowy przestrzennej [12]. E+S k1 k2 ES k3 E+P gdzie: k1, k 2, k3 – stałe szybkości reakcji. Schemat 1. Reakcja katalizowana enzymatycznie zaproponowana przez Michaelisa i Menten’a Jeżeli stężenie substratu jest niewielkie, to tylko niektóre cząsteczki enzymu tworzą kompleks z substratem i reakcja przebiega z szybkością V0 opisaną równaniem (1). Natomiast przy wysokich stężeniach substratu praktycznie wszystkie cząsteczki enzymu połączone są z substratem i reakcja biegnie z szybkością maksymalną (Vmax). Tę zależność ujmuje równanie Michaelisa - Menten’a, którego wykres jest hiperbolą (Rys. 2): V0 = V max ×[S] K m + [S] (1) gdzie: Vmax – szybkość maksymalna reakcji osiągana w warunkach całkowitego wysycenia enzymu substratem, [S] – stężenie substratu, V0 – szybkość początkowa reakcji, Km – stała Michaelisa – Menten’a. Rys. 2. Zależność między stężeniem substratu a szybkością reakcji enzymatycznej. Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia kompleksu (ES) oraz szybkości jego powstawania i rozpadu. Miarą stabilności kompleksu (ES) jest stała Michaelisa – Menten’a (Km) (równanie (2)). Km = k 2 + k3 k1 (2) gdzie: Km - stała Michaelisa – Menten’a, k1- stała szybkości tworzenia kompleksu ES, k2- stała szybkości rozpadu kompleksu ES w kierunku uwolnienia substratu, k3- stała szybkości rozpadu kompleksu ES z wytworzeniem produktu. Stała Km nie zależy od stężenia enzymu. Jej wartość równa jest takiemu stężeniu substratu, przy którym początkowa szybkość reakcji (V0) stanowi połowę szybkości maksymalnej (Vmax) i najczęściej mieści się w granicach 10-1 – 10-7 mol/dm3. Parametry Vmax i Km charakteryzują aktywność metaboliczną enzymów. Wartość Km odzwierciedla taką ilość substratu, w którym połowa miejsc aktywnych w cząsteczkach enzymu jest zajęta. Pozwala to uzyskać informację, jakie stężenie substratu jest konieczne do osiągnięcia znaczącego przyśpieszenia reakcji [13]. Stwierdzono ponadto, że jeśli stała szybkości (k2) rozpadu kompleksu (ES) do substratu i wolnego enzymu jest znacznie wyższa od stałej rozpadu tego kompleksu do produktu i enzymu (k3), to wówczas wartość Km jest miarą siły wiązania substratu przez enzym. Można ogólnie wnioskować, że wysoka wartość stałej Km wskazuje na słabe powinowactwo enzymu do substratu. Aby dokładnie wyznaczyć wartość Km oraz Vmax należy oprzeć się na równaniu Lineweavera-Burka (równanie (3)), które jest odwrotnością zależności Michaelisa – Menten’ a, a jej wykresem jest linia prosta (Rys. 3). 1 Km [ I] 1 1 = (1 + ) + v Vmax K i [S] Vmax gdzie: v- szybkość reakcji, (3) Km- stała Michaelisa – Menten’a, Vmax – maksymalna szybkość reakcji, [I]– stężenie inhibitora, Ki – stała dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor, [S] – stężenie substratu. W celu doświadczalnego wyznaczenia Km należy wykonać serię pomiarów, w których początkową szybkość reakcji wyznacza się stosując różne stężenia substratu, ale zachowując stałe stężenie enzymu. Aktywność katalityczna enzymu może zostać zmniejszona poprzez przyłączenie się cząsteczek inhibitora. Typ inhibicji dla substancji badanej określa się przeprowadzając reakcje enzymatyczne przy rożnych stężeniach substratu oraz inhibitora. Na początku wyznacza się wartości Km i Vmax, a następnie uzyskane dane przedstawia się graficznie na wykresie. Rys. 3. Wykres zależności 1/v od 1/[S] zwany wykresem Lineweavera-Burka. Interpretacja typu inhibicji enzymatycznej pozwala określić kinetykę badanej reakcji oraz specyficzność danego enzymu i budowę jego centrum aktywnego. Wyróżnia się następujące rodzaje inhibicji: inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) inhibicja niekompetycyjna (niewspółzawodnicząca) inhibicja akompetycyjna inhibicja mieszana Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca) występuje wtedy, gdy inhibitor łączy się z wolną formą enzymu w taki sposób, że enzym nie może związać się już z substratem. Oznacza to, że inhibitor i substrat wykluczają się nawzajem, najczęściej z powodu współzawodnictwa o to samo miejsce w enzymie. Inhibitor kompetycyjny może być pochodną substratu, alternatywnym substratem lub produktem reakcji. Zdarzają się przykłady inhibicji kompetycyjnej powodowanej przez substancje, które strukturalnie nie są podobne do substratów, jest to tzw. inhibicja zwrotna. W takim przypadku inhibitor zostaje połączony z enzymem w miejscu innym niż centrum aktywne. Powoduje to zmiany konformacji enzymu (w trzecio- lub czwartorzędowej jego strukturze) i przez to zniekształcone zostaje miejsce lokowania się substratu uniemożliwiając jego związanie. Inhibitor kompetycyjny nie zmienia wartości Vmax, rośnie natomiast wyznaczona dla takiego układu wartość Km co świadczy, że powinowactwo substratu do enzymu maleje. Inhibicja niekompetycyjna (niewspółzawodnicząca) - w tym przypadku zarówno użyty inhibitor, jak i substrat nie oddziałują na siebie, ponieważ wiążą się odwracalnie, losowo i niezależnie w różnych miejscach. Uniemożliwia to przyjęcie przez enzym odpowiedniej konformacji, wymaganej do jego aktywności katalitycznej, co powoduje zmniejszenie się maksymalnej szybkości reakcji enzymatycznej (Vmax). Cząsteczki enzymu pozostające w środowisku reakcyjnym wykazują niezmienione powinowactwo do substratu (Km pozostaje bez zmian) [14-17]. W inhibicji akompetycyjnej inhibitor wiąże się odwracalnie z kompleksem (ES), tworząc nieaktywny kompleks (ESI). Inhibitor nie wiąże się do wolnego enzymu. Ten rodzaj inhibicji rzadko występuje w układach z jednym substratem, natomiast powszechnie w reakcjach wielosubstratowych. Inhibitor akompetycyjny obniża Vmax i Km o ten sam współczynnik, co w rezultacie daje wykres dwóch linii (kontrolnej bez inhibitora i drugiej po dodatku inhibitora) równoległych względem siebie. Inhibicja mieszana – jeżeli inhibitor może wiązać się zarówno z wolnym enzymem, jak i z kompleksem enzym-substrat to wówczas wykres Lineweavera-Burka dla różnych stężeń inhibitora nie przedstawia prostych równoległych, ani przecinających się na osi rzędnych [18]. Stosowane w leczeniu choroby Alzheimera substancje powodują wiele działań niepożądanych, m.in. zaburzenia żołądkowo-jelitowe, mają niską biodostępność lub słabą przenikalność przez barierę krew-mózg. W związku z tym poszukuje się nowych, bezpieczniejszych oraz skuteczniejszych środków leczniczych. Celem tej pracy jest próba oceny właściwości inhibicyjnych nowo zsyntezowanych pochodnych 1,3,4 – tiadiazoli w stosunku do acetylocholinoesterazy i butyrylocholinoesterazy. Część eksperymentalna: Synteza pochodnych 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli: Poddane badaniu w stosunku do AChE i BuChE związki zostały otrzymane w reakcji sulfinylo-bis((2,4-dihydroksyfenylo)metanotionu [19] z hydrazydami (Rys. 4), gdzie po utworzeniu liniowego produktu – tioaryloilowej pochodnej i przegrupowaniu tautomerycznym następował proces intramolekularnej addycji. W efekcie końcowym eliminacja cząsteczki wody prowadziła do utworzenia pierścienia 1,3,4-tiadiazolu [20]. Pierścień 1,3,4–tiadiazolu jest połączony z ugrupowaniem 2,4-dihydroksyfenylowym, które zapewnia zwilżalność związków wodą oraz utrzymuje równowagę hydrofilowohydrofobową - jeden z koniecznych warunków bioaktywności związków. Prawdopodobnie decyduje też o stosunkowo niskiej toksyczności substancji. OH S S OH O S HO O + H2N NH C OH R CH3OH S HO ∆, 2-3 h R N N OH Rys. 4. Schemat syntezy 4-(1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-dioli Zsyntezowano w ten sposób ponad 50 różnych połączeń, które poddane były badaniom enzymatycznym na modelu in vitro. Poniżej (Rys. 5) przedstawiono 4 przykładowe struktury chemiczne dla związków o działaniu inhibicyjnym wobec AChE. OH OH HO HO S N S CH3 N N CF3 N 2 1 OH OH Cl Cl HO HO S S Cl N N N 4 3 H3CO N H H O H N H N O C N H H O H3CO Donepezil Neostygmina Rys. 5. Struktury chemiczne zsyntezowanych związków oraz substancji referencyjnych neostygminy i donepezilu. Strukturę wszystkich połączeń potwierdzono za pomocą metod spektroskopowych. Widma 1H NMR i 13C NMR zarejestrowano w DMSO–d6 aparatem Varian Mercury 400 lub Bruker DRX 500. Widma oscylacyjne – na spektrofotometrze Perkin – Elmer FT–IR 1725X przy użyciu pastylki z KBr w zakresie 600 – 4000 cm-1. Widma ze spektroskopii masowej (EI–MS, 70eV) rejestrowano przy użyciu aparatu AMD-604. Natomiast analizę elementarną (C, H, N) wykonano używając aparatu Perkin - Elmer 2400. W celu określenia aktywności AChE i BuChE pomiaru absorbancji dokonano na spektrofotometrze Varian Cary 50 - Bio z przystawką termostatującą PCB - 150. Oznaczenia aktywności AChE i BuChE: Aktywność inhibicyjną otrzymanych związków w stosunku do AChE i BuChE określono metodą spektrometryczną wykorzystując metodykę opisaną przez Ellmana [21]. Analizowany spektrofotometrycznie roztwór zawierał: 1 ml (0,1 mol/dm-3, pH = 8,0) buforu fosforanowego, 50 µl barwnika DTNB (0,01 mol/dm-3), 50 µl jodku acetylotiocholiny (ATChI) (lub jodku butyrylotiocholiny (BuTChI)), 10 µl enzymu AChE (lub BuChE) oraz 50 µl testowanego związku. Sporządzono siedem różnych stężeń (w zakresie 10-3 ÷ 10-9 mol/dm-3) badanych połączeń. Roztwory enzymów zostały przygotowane przez rozpuszczenie 2 U/ml w 2 ml buforu fosforanowego. Wszystkie odczynniki pochodziły z firmy Sigma –Aldrich (Steinheim, Germany). Badany roztwór termostatowano w kuwecie przez 10 minut w temperaturze 37 ± 0,2 0C. Hydroliza acetylotiocholiny (butyrylotiocholiny) wywołała zmianę barwy, którą śledzono ilościowo, mierząc absorbancję przy długości fali 412 nm przez 1 minutę. Jako odnośnika użyto 0,1 M roztworu buforu fosforanowego o pH = 8,0. Związkami referencyjnymi były stosowane w medycynie inhibitory AChE i BuChE, których struktury chemiczne przedstawiono na rysunku 5. Wszystkie związki zostały zanalizowane w trzech seriach pomiarów, a następnie wyznaczono dla nich wartości IC50. Jest to takie stężenie substancji będącej potencjalnym inhibitorem, przy którym inhibicja osiąga wartość 50%. W tym celu za pomocą programu GraFit 4.09 sporządzono wykresy zależności % inhibicji związku w zależności od logarytmu ze stężenia potencjalnego inhibitora (log Cm) [22]. Wyniki wartości IC50 w stosunku do AChE i BuChE dla badanych połączeń oraz związków wzorcowych przedstawiono w tabeli 1. Badanie kinetyki reakcji i określanie typu inhibicji: Następnym etapem badań było określenie typu inhibicji dla wybranych połączeń W tym celu na początku sporządzono wykres zależność absorbancji (A) od różnych stężeń jodku acetylotiocholiny (A = f ([S])), gdzie [S] – stężenie ATChI. Jeżeli przyjmiemy, że w zakresie niskich stężeń substratu wartość zmierzonej absorbancji jest równoważna z ilością powstałego produktu w czasie, to wtedy szybkość danej reakcji jest równa wartości tej absorbancji. Wartość szybkości reakcji (V) otrzymano więc z przekształcenia równania A = f ([S]). Z przekształcenia hiperbolicznego wykresu Michaelisa - Menten’a otrzymano prostoliniowe wykresy Lineweavera-Burka, czyli zależność odwrotności szybkości reakcji (1/V) w stosunku do odwrotności stężenia substratu (1/[S]). Na rysunkach 6 i 7 przedstawiono przykładowe wykresy, dzięki którym określono typ inhibicji odpowiednio dla związków nr 1 i 2. Wyniki: Analiza widm opisywanych związków: Związek nr 1: 4-(5-(3-metylofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol Analiza elementarna dla C15H12N2O2S (284,06): obliczono: C, 63,36; H, 4,25; N, 9,85; znaleziono: C, 63,42; H, 4,23; N, 9,89; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,14 (s, 1H, HO-C(3)), 10,10 (s, 1H, HOC(1)), 8,08 (d, J = 8,73 Hz, 1H, H-C(5), 7,83 (m, 2H, H-C(2’,4’), 7,45 (t, J = 7,55 Hz, 1H, H-C(5’)), 7,36 (m, 1H, H-C(6’)), 6,53 (d, J = 2,18 Hz, 1H, H-C(2)), 6,48 (dd, J = 8,74 i 2,36 Hz, 1H, H-C(6)), 2,41 (s, 3H, CH3); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 166,2, 162,6, 161,3, 156,3, 138,8, 131,3, 130,1, 129,2, 128,9, 127,7, 124,4, 108,4, 108,3, 102,3; IR (KBr, cm-1): 3138 (OH), 1632 (C=N), 1598, 1528, 1471, 1443, 1318 (C=C), 1281, 1262, 1214, 1175 (C-O), 1141, 1041 (N=C-S-C=N), 986, 966, 877, 846, 778 (H-Ar), 684, 665 (C-S-C), 596, 522; EI-MS (m/z, %): 284 (M+, 100), 168 (4), 167 (38), 153 (6), 150 (3), 149 (15), 142 (4), 135 (13), 119 (5), 118 (4), 117 (5), 116 (4), 107 (5), 91 (9), 80 (3), 65 (4). Związek nr 2: 4-(5-(4-trifluorometylofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol Analiza elementarna dla C15H9F3N2O2S (338,30): obliczono: C, 53,25; H, 2,68; N, 8,28; znaleziono: C, 53,30; H, 2,65; N, 8,30; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,20 (s, 1H, HO-C(3)), 10,11 (s, 1H, HOC(1)), 9,23 (d, J = 8,11 Hz, 2H, H-C(3’,5’)), 8,10 (d, J = 8,69 Hz, 1H, H-C(5)), 7,90 (d, J = 8,32 Hz, 2H, H-C(2’,6’)), 6,54 (d, J = 2,30 Hz, 1H, H-C(2)), 6,46 (dd, J = 8,70 i 2,31 Hz, 1H, H-C(6)); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,1, 163,4, 161,6, 156,5, 134,0, 129,0, 128,9, 128,0, 125,1 (CF3), 126,3, 126,2, 125,0, 108,4, 108,2, 102,3; IR (KBr, cm-1): 3452, 3202 (OH), 1631 (C=N), 1600, 1523, 1473 (C=C), 1413, 1320 (CF3), 1235, 1170 (C-O), 1141 (CAR-CF3), 1115, 1067 (N=C-S-C=N), 1012, 996, 985, 964, 843, 829, 799, 671 (C-S-C); EI-MS (m/z, %): 338 (M+, 100), 319 (9), 309 (4), 203 (20), 189 (14), 171 (4), 169 (4), 167 (47), 153 (13), 152 (6), 145 (12), 139 (8), 135 (15), 121 (7), 119 (9), 112 (5), 108 (7), 107 (14), 106 (5), 95 (7), 80 (90), 69 (11), 51 (8), 39 (11). Związek nr 3: 4-(5-(2-chlorofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol Analiza elementarna dla C14H9ClN2O2S (304,75): obliczono: C, 55,18; H, 2,98; N, 9,19; znaleziono: C, 55,06; H, 2,99; N, 9,21; 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,17 (s, 1H, HO-C(3)), 10,14 (szeroki sygnał, 1H, HO-C(1)), 8,17 (m, 1H, H-C(3’)), 8,14 (d, J = 8,70 Hz, 1H, H-C(5)), 7,69 (m, 1H, H-C(6’)), 7,55 (m, 2H, H-C(4’,5’)), 6,56 (d, J = 2,32 Hz, 1H, H-C(2)), 6,51 (dd, J = 8,70 i 2,33 Hz, 1H, H-C(6)); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,2, 161,8, 161,4, 156,4, 131,8, 131,3, 130,9, 130,6, 129,0, 128,9, 127,8, 108,4, 108,1, 102,4; IR (KBr, cm-1): 3186 (OH), 1629 (C=N), 1598 (C=C), 1522 (C=C), 1473 (C=C), 1417, 1314, 1230, 1183 (C-O), 1068 (N=C-S-C=N), 1042, 995, 982, 965, 845 (H-Ar), 798, 757, 733, 714, 681 (C-S-C), 648, 632; EI-MS (m/z, %): 304 (M+, 100), 171 (6), 169 (19), 168 (7), 167 (78), 157 (8), 156 (5), 155 (24), 153 (12), 140 (4), 139 (10), 138 (8), 137 (14), 136 (3), 135 (18), 134 (10), 125 (5), 111 (15), 108 (10), 107 (19), 106 (8), 102 (13), 97 (8), 95 (5), 90 (4), 84 (5), 80 (13), 79 (7), 76 (6), 75 (15), 69 (17), 66 (5), 65 (7), 63 (11), 62 (6), 58 (2), 53 (6), 52 (24), 51 (18), 50 (10), 45 (7), 39 (22), 38 (5). Związek nr 4: 4-(5-(2,4-dichlorofenylo)-1,3,4-tiadiazol-2-ilo)benzeno-1,3-diol Analiza elementarna dla C14H8Cl2N2O2S (339,20): obliczono: C, 49,57; H, 2,38; N, 8,26; znaleziono: C, C, 49,66; H, 2,36; N, 8,23; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 11,21 (s, 1H, HO-C(3)), 10,15 (s, 1H, HOC(1)), 8,22 (dd, J = 8,56 i 0,28 Hz, 1H, H-C(5’)), 8,14 (d, J = 8,71 Hz, 1H, H-C(5)), 7,89 (dd, J = 2,11 i 0,27 Hz, 1H, H-C(3’)), 7,65 (dd, J = 8,57 i 2,11 Hz, 1H, H-C(6’)), 6,54 (d, J = 2,20 Hz, 1H, H-C(2)), 6,41 (dd, J = 8,71 i 2,29 Hz, 1H, H-C(6)); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ: 164,3, 161,5, 160,0, 156,4, 135,6, 132,2, 132,0, 130,0, 128,9, 128,4, 128,1, 108,5, 108,1, 102,3; IR (KBr, cm-1): 3400, 3196 (OH), 1630 (C=N), 1595 (C=C), 1524 (C=C), 1478 (C=C), 1411, 1341, 1315, 1246, 1246, 1177 (C-O), 1142, 1110 (C-Cl), 1067 (N=C-S-C=N), 994, 966, 947, 815 (H-Ar), 745, 684, 668 (C-S-C), 648, 614; EI-MS (m/z, %): 338 (M+, 100), 205 (7), 203 (10), 191 (5), 189 (7), 171 (5), 169 (6), 168 (7), 167 (65), 153 (8), 135 (8), 119 (6), 107 (7), 80 (4), 69 (5), 52 (6), 39 (4). Widma 1H-NMR otrzymanych związków zawierają charakterystyczne zakresy przesunięć chemicznych protonów dla zakresu 0-15 ppm względem DMSO w zakresie 11,21÷11,14 ppm i 10,15÷10,10 ppm odpowiednio dla C(3)–OH i C(1)–OH w pierścieniu rezorcynolowym. W widmach 13C NMR obserwuje się sygnały w zakresie 166-160 ppm, które są charakterystyczne dla atomów węgla pierścienia 1,3,4-tiadiazolu. Natomiast na widmach oscylacyjnych (IR) pojawiają się charakterystyczne pasma przy częstotliwościach: 3550 – 3510 cm-1 (OH), 1650 – 1610 cm-1 (C=N), 1050 – 1010 cm-1 (N=C-S-C=N). Na widmach ze spektroskopii masowej zaobserwowano obecność pików jonów molekularnych M+ oraz inne charakterystyczne fragmentacje dla układu 1,3,4-tiadiazolu. Analiza aktywności enzymatycznej badanych połączeń: Aktywność inhibicyjna dla nowo zsyntezowanych związków w stosunku do AChE i BuChE została wyznaczona poprzez określenie IC50. Uzyskane wartości dla obu enzymów przedstawiono w tabeli 1. Analizując wartości IC50 otrzymane w stosunku do acetylocholinoesterazy można zauważyć, że dwa związki (1 i 2) wykazują inhibicję na poziomie nM, czyli przy takich wartościach stężeń, które przy obecnym poziomie wiedzy klasyfikują je do dalszych badań w tym kierunku. Dla związków 3 i 4 stężenie przy którym aktywność enzymu zmniejsza się o połowę kształtuje się w zakresie µM. Natomiast aktywność wobec BuChE jest na poziomie mikromoli dla wszystkich połączeń poza związkiem 4, w którym wartość IC50 jest większa niż 500 µM. W zbadanych układach zarówno efekty elektronowe, jak i steryczne wpływają na aktywność inhibitującą w stosunku do analizowanych enzymów. Tabela 1. Wartości IC50 w stosunku do AChE I BuChE badanych związków i wzorców. Nr związku AChE IC50 ± SD [µM] BuChE IC50 ± SD [µM] 1 0,16 ± 0,01 17,02 ± 0,40 2 0,09 ± 0,004 26,49 ± 1,22 3 1,55 ± 0,02 196,24 ± 7,00 4 128,42 ± 7,13 > 500 neostygmina 0,05 ± 0,006 0,07 ± 0,009 donepezil 0,02 ± 0,008 7,52 ± 0,2 Związek 2 (IC50=0,09 µM) posiada najlepszą aktywność inhibicyjną w stosunku do AChE zbliżoną do związku referencyjnego – neostygminy (IC50=0,05 µM). Może to sugerować względnie dobre dopasowanie cząsteczek analizowanego związku w centrum katalitycznym enzymu. Związki 3 i 4 posiadające atomy chloru odpowiednio w pozycji 2 oraz 2 i 4 pierścienia fenylowego znacznie różnią się aktywnością. Związek 3 wykazał zdecydowanie lepszą właściwość inhibicyjną (IC50=1,55 µM) w stosunku do acetylocholinoesterazy. Widać również wyraźną różnicę w wartościach IC50 dla BuChE. Związek z dwoma atomami chloru wykazuje zdecydowanie gorszą aktywność inhibicyjną wobec butyrylocholinoesterazy. Natomiast związek 1 wykazuje dobrą aktywność hamującą zarówno BuChE i AChE. Analiza wykresu Lineweavera-Burka dla związku 1 (Rys. 6) wskazuje na mieszany typ inhibicji acetylocholinoesterazy. Natomiast związek 2 (Rys. 7) zachowuje się jak inhibitor niekompetycyjny, ponieważ na wykresie wartość Km jest stała, natomiast zmienia się Vmax w zależności od obecności i ilości badanego związku. 1 brak inhibitora 0,12 µM 0,17 µM V-1 min/ ∆A 30 25 20 15 10 5 0 -12 -8 -4 -5 0 4 8 12 [S]-1 mM-1 Rys. 6. Wykres Lineweavera-Burka przedstawiający mieszany typ inhibicji dla związku nr 1. 2 brak inhibitora 0,10 µM 0,14 µM V-1 min/ ∆A 25 20 15 10 5 0 -12 -8 -4 -5 0 4 8 12 [S]-1 mM-1 Rys. 7. Wykres Lineweavera-Burka przedstawiający niekompetycyjny typ inhibicji dla związku nr 2. Ponieważ u osób chorych na Alzheimera aktywność butyrylocholinoesterazy rośnie, natomiast aktywność acetylocholinoesterazy pozostaje niezmieniona lub ulega obniżeniu, dlatego prawdopodobnie obydwa enzymy biorą udział w regulacji poziomu acetylocholiny i stanowią właściwe cele dla terapii deficytu cholinergicznego. Wyniki badań z użyciem substancji o zwiększonej selektywności wobec butyrylocholinesterazy (cymseryna, MF-8622) i inhibitorów cholinoesterazy, takich jak riwastygmina, które działają zarówno na AChE, jak i na BuChE, wskazują na potencjalne korzyści terapeutyczne z hamowania obydwu enzymów. Tworzenie substancji, które są swoistymi inhibitorami butyrylocholinoesterazy i dalsze stosowanie inhibitorów cholinoesteraz, które oprócz AChE hamują także BuChE, powinno doprowadzić do poprawy wyników leczenia tej choroby [23]. Wnioski: Otrzymano nowe związki z grupy 1,3,4–tiadiazoli o potencjalnym działaniu biologicznym. Badania spektroskopowe potwierdziły budowę połączeń oraz przypuszczalny mechanizm reakcji. Przeprowadzone badania in vitro wykazały, że połączenia z tej grupy związków posiadają właściwości inhibicyjne w stosunku do acetylocholinoesterazy oraz butyrylocholinoesterazy. Dlatego mogą być poddane kolejnym etapom badań nad poszukiwaniem skutecznego leku na chorobę Alzheimera. Literatura: 1. D. K. Lahiri, Curr. Drug Targets, 42 (2003) 97. 2. P. D. Meek, E.K. McKeitan, G.T. Schumock, Pharmacotherapy, 18 (1998) 68. 3. S. Ball, Chemia szarych komórek. Neurochemia i toksykologia ośrodkowego układu nerwowego. (2003) Medyk, Warszawa. 4. R. Magierski, I. Kłoszewska, T. Sobów, Aktualna Neurologia, 3 (2004) 171. 5. J. L. Cummings, G. Cole, Alzheimer Disease, JAMA, 287 (2002) 2335. 6. M. R. Roberson, L.E. Harrell, Brain Res. Rev., 25 (1997) 50. 7. E. Giacobini, Pharmacol. Res., 64 (2004) 433. 8. R. J. Harvey, S. Eagger, Rev. Contemp. Pharmacother., 6 (1995) 335. 9. H. Sugimoto, H. Ogura, J. Pharmacol. 89 (2002) 7. 10. S. Gauthier, H. Feldman, Curr. Med. Res. Opin., 18 (2002) 347. 11. T. Crook, Th Psychopharmacol. Bull., 12 (1992) 347. 12. A.G. Marangoni. How do enzymes work? In: Enzyme kinetics – a modern approach.(2003) Wiley Interscience, Hoboken, New Jersey. 13. J. Kączkowski, Podstawy biochemii. (1999) WNT, Warszawa. 14. D. K. Granner, R.K. Murray, V.W. Rodwell, Biochemia Harpera. (2010) PZWL, Warszawa. 15. J. Witwicki, W. Ardelt, Elementy enzymologii. (1989) PWN, Warszawa. 16. B. Baraniak, Enzymologia w zarysie. (2011), Wyd. Czelej Sp. z o.o. 17. J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemia (2009) PWN, Warszawa. 18. K. Pigoń, Z. Ruziewicz, Chemia fizyczna: Podstawy fenomenologiczne. (2005) PWN, Warszawa. 19. A. Niewiadomy, J. Matysiak, G. Mącik – Niewiadomy, (1999) P – 330263. 20. J. Matysiak, J. Heterocyclic. Chem., 43 (2006) 55. 21. G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, Biochem. Pharmacol., 7 (1961) 88. 22. R. J. Leatherbarrow, Stains, U.K: Erithacus Software Ltd, (1999). 23. R. Bullock, A. Cameron, Curr. Med. Res. Opin., 18 (2002) 258.