Nr wniosku: 178764, nr raportu: 19635. Kierownik (z rap.): prof. dr

Nr wniosku: 178764, nr raportu: 19635. Kierownik (z rap.): prof. dr hab. Andrzej Witkowski
W 2012 roku zespół uzyskał z NCN w ramach programu „Maestro” grant zatytułowany „Zespoły okrzemkowe
(Bacillariophyta) morskiej strefy litoralnej w wymiarze regionalnym i globalnym w świetle analizy morfologicznej oraz
genetycznej. Implikacje filogenetyczne, biogeograficzne oraz taksonomiczne”. Uzyskane środki pozwoliły na znaczącą
rozbudowę hodowli, zakup mikroskopów, zestawu do ekstrakcji DNA, reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz
elektroforezy i dokumentacji żeli.
Badania realizowane w oparciu o hodowlę obejmowały strefę litoralną wszystkich oceanów, włącznie z Arktyką i
Antarktyką. Jednak najbardziej intensywne prace były prowadzone na wybrzeżach RPA i Namibii, Morza Śródziemnego
oraz Oceanu Indyjskiego i zachodniego Pacyfiku. W trakcie ekspedycji badawczych (np. Madagaskar, Afryka
Południowa, Namibia, Arabia Saudyjska, Morze Żółte, Portugalia, Azory, Morze Bałtyckie) równocześnie z poborem
prób (zazwyczaj był to piasek lub mułek z dna, często mieszanina piasku i mikroorganizmów zeskrobana z powierzchni
skał, fragmenty makroglonów lub próby planktonu) dokonywane były pomiary podstawowych parametrów
środowiskowych.
Z prób dostarczonych do laboratorium część materiału traktowano pożywką hodowlaną f/2 i przenoszono do szalek
Petriego w celu wzbogacenia w taksony będące przedmiotem zainteresowania. Po pewnym czasie, kiedy liczebność
pożądanych taksonów była odpowiednia do izolacji, pojedyncze komórki takich okrzemek wyciągano z próby, a
następnie wyizolowane komórki oczyszczono z zanieczyszczeń i ewentualnych domieszek innych taksonów i
przenoszono do nowej szalki. Z chwilą kiedy wiadome było, że w szalce występuje czysta kultura reprezentująca jeden
gatunek, szczep taki został włączony do kolekcji. Rozmiary izolowanych okrzemek wahają się od 1-2 do ok. 50-100 µm.
Każdy ze szczepów poddany został rutynowo dokumentacji fotograficznej (żywe komórki, oczyszczone komórki w
mikroskopie świetlnym i elektronowym). Kolejnym etapem badań nad wyizolowanymi okrzemkami była ekstrakcja i
amplifikacja DNA. Do tego celu wykorzystywano gotowy zestaw do ekstrakcji DNA. Geny z jądra komórkowego oraz z
chloroplastów były poddawane amplifikacji. Produkty PCR były wysyłane do Pracowni Sekwencjonowania DNA i
Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie i poddawane sekwencjonowaniu
metodą Sangera. Na podstawie wyników uzyskanych z sekwencjonowania opracowywane zostały drzewa filogenetyczne
danej grupy okrzemek. W opublikowanych pracach przyjęliśmy metodę najwyższego prawdopodobieństwa (Maximum
Likelihood, ML) jako najlepsze pod względem statystycznym przybliżenie dla konstrukcji drzew filogenetycznych (np. Li
i in. 2015, Witkowski i in. 2016).
W hodowli morskich okrzemek bentosowych ze strefy litoralnej wyizolowanych zostało ok. 1600 szczepów ze
wszystkich oceanów. Informacja na temat taksonów oraz ich pochodzenia geograficznego dostępna jest na stronie
http://geocentrum.usz.edu.pl/zaklad-paleooceanologii/.
Zgromadzone w hodowli taksony okrzemek oraz dotyczące ich metadane stały się podstawą do zainicjowania badań
metagenomicznych. Badania metagenomiczne, w przeciwieństwie do barkodingu i metabarkodingu, obejmują dane
środowiskowe dla poszczególnych taksonów, dokumentację morfologiczną (dane strukturalne i ultrastrukturalne na
najwyższym możliwym poziomie), dane cytologiczne oraz markery molekularne. Markery molekularne wykorzystywane
są do tworzenia łączonych (konkatenowanych) drzew filogenetycznych mających na celu określenie pozycji
filogentycznej badanych taksonów oraz ich przynależności taksonomicznej. W ten sposób powstała baza referencyjna,
która będzie w przyszłości służyć identyfikacji taksonów okrzemek bentosowych z morskiej strefy litoralnej, a w
odniesieniu do sporej grupy taksonów już jest dostępna. Część danych odnośnie markerów molekularnych została już
opublikowana (Li i in. 2015, 2016, Witkowski i in. 2016, Dąbek i in. w druku), i są dostępne w GenBanku
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Ogółem nasza baza danych wykorzystywana w badaniach metagenomicznych i
posiadających pełne, wyżej wymienione informacje, liczy w tej chwili ok. 1000 szczepów.
W opublikowanych już kilku pracach bazujących głównie na własnych szczepach udało się nam udokumentować
nowe rodzaje i gatunki. Podejmujemy badania na poziomie dużych jednostek taksonomicznych, głównie o randze rodzin.
Wyniki naszych badań z zastosowaniem tradycyjnych metod analizy morfologicznej i metod biologii molekularnej rzuciły
nowe światło i uporządkowały wiedzę na temat kilku rodzin okrzemek, m.in. Plagiogrammaceae, Cymatosiraceae oraz
Fragilariaceae. Ważnym odkryciem naukowym było wykazanie przez nasz zespół, że pewne cechy – typ rafy (szczeliny)
kanałowej u okrzemek – powstawały w wyniku odrębnych procesów ewolucyjnych i mimo podobieństwa w obrębie
określonych rodzin czy rzędów, wyewoluowały one niezależnie od siebie i są przykładem homoplazji. W kontekście
zmian środowiskowych w strefie litoralnej mórz i oceanów wywołanych zmianami klimatycznymi, nasze badania mają
fundamentalne znaczenie dla określenia istniejącej bioróżnorodności morskich bentosowych zespołów okrzemkowych. Z
jednej strony dokumentujemy istniejącą bioróżnorodność, przechowujemy materiał genetyczny na przyszłość, z drugiej
zaś, udostępniając sekwencje współczesnych taksonów umożliwiamy badania nad bioróżnorodnością zespołów
okrzemkowych w przeszłości. Jest to możliwe dzięki coraz częściej prowadzonym badaniom osadów morskich z
wykorzystaniem zdeponowanego w nich DNA.