Mikromacierze Fenotypowe PM 1
Transkrypt
Mikromacierze Fenotypowe PM 1
PRZEŁOMOWA TECHNOLOGIA MIKROMACIERZY FENOTYPOWYCH PM Mikromacierze fenotypowe PM (Biolog Phenotype MicroArrays PMs) stanowią trzecią kluczową technikę analizy ekspresji genów, obok mikromacierzy DNA i proteomiki. (Rys. 1). Dokładnie tak jak mikromacierze DNA i proteomika, umożliwiające jednoczesne analizy tysięcy genów lub białek, mikromacierze fenotypowe PM Biolog, umożliwiają ilościowe analizy tysięcy fenotypów komórkowych jednocześnie. Rys.1 DNA RNA AFFYMETRIX, 1993 ANALIZY MOLEKULARNE BIAŁKO O’FARREL, 1975 FENOTYP BIOLOG, 2000 ANALIZY KOMÓRKOWE Mikromacierze DNA i proteomika pozwalają naukowcom na badanie genów lub białek analogicznie regulowanych, których wzór zmian koreluje z czymś istotnym np., stanem chorobowym. Jednakże, nie daje to całkowitej pewności, czy ma to istotne znaczenie dla komórki. Mikromacierze fenotypowe są technologią wspomagającą, zapewniającą niezbędną informację na poziomie komórkowym oraz tworząc pełen profil komórkowy, który może być wykorzystany do identyfikacji funkcji genów, opracowywaniu celów leków, usprawnieniu walidacji, optymalizacji, badań toksykologicznych. Po dokonaniu zmiany genetycznej czy ekspozycji na działanie określonego leku, mikromacierze fenotypowe PM pozwalają znaleźć korelację pomiędzy profilem ekspresji różnych genów, wybranych genów a procesami fizjologicznymi, zmianami anatomicznymi czy fenotypem. Badacz może bezpośrednio analizować odpowiedź komórkową na dokonaną zmianę, otrzymując właściwą ocenę efektu zmian genetycznych w komórkach, wpływu czynników środowiskowych, chemicznych, leków i wielu innych elementów. ZASADA DZIAŁANIA MIKROMACIERZY FENOTYPOWYCH PM Technologia mikromacierzy fenotypowych Phenotype Microarrays należy do przełomowych platform technologicznych. Jest to zintegrowany system, składający się z systemu profili komórkowych, specjalistycznego oprzyrządowania oraz unikatowego oprogramowania bioinformatycznego do przeszukiwania wysokoprzepustowego komórek (high-throughpout screening HTS). Technologia oraz proces testowy przedstawiony jest na rys.2. Producent zestawów PM, firma Biolog, wstępnie skonfigurował szeroki zakres testów fenotypowych w zestawach macierzy. Każde naczyńko macierzy jest przeznaczone do badania innego fenotypu. Inokulując wystandaryzowaną zawiesinę komórek do naczyniek mikromacierzy, analizujemy jednocześnie tysiące fenotypów. Po inokulacji mikromacierz poddawana jest inkubacji (zazwyczaj 24-godzinnej). 011a/2012 Rys.2 Naniesienie komórek 2a.Wzór PM 2b.Omnilog PM System 2c.Wynik kinetyczny PM 2d.Porównanie Rys.3 Zestawy PM w oparciu o opatentowaną przez Biolog wyjątkową technologię chemii Redox wykorzystują w roli uniwersalnego informatora proces oddychania komórkowego. Jeżeli fenotyp jest „pozytywny”, komórki w naczyńku aktywnie oddychają, redukując obecny tam barwnik tetrazolium i tworząc intensywne zabarwienie (rys.2a, rys.3). Jeżeli jest słabo „pozytywny” lub „negatywny”, oddychanie spada lub jest całkowicie zatrzymane, a utworzony kolor jest bardzo słaby lub brak jest zabarwienia. Zestawy redox zapewniają amplifikację i kwantyfikację obu fenotypów. Inkubacja i zapis danych fenotypowych przeprowadzana jest przez urządzenie Omnilog® (rys.2b), które przechwytuje cyfrowy obraz z mikromacierzy PM kilkakrotnie w ciągu każdej godziny i przechowuje dane ilościowe, dotyczące zmiany zabarwienia, w programie komputerowym. Dane komputerowe, mogą być przez badaczy wykreślane w postaci kinetycznych wykresów. Omnilog® monitoruje jednocześnie tysiące fenotypów, w ciągu 24-godzinnej pracy może być generowane do 450.000 punktów pomiarowych. Dla porównania fenotypów dwóch linii komórkowych, jeden jest zapisywany jako czerwona, drugi jako zielona ścieżka (rys.2c). W celu wykrycia różnic, wykresy są na siebie nakładane. Obszary pokrywające się (np. bez zmian) są zaznaczane kolorem żółtym, natomiast różnice wyróżnione są na czerwono lub zielono (rys.2d, rys.4,5) Rys.4 Rys.5 Mikromacierze fenotypowe PM mogą monitorować większość znanych funkcji komórkowych: • • • • • • • Strukturę powierzchni komórki i funkcje transportu komórkowego Katabolizm węgla, azotu, fosforu i siarki Biosyntezę mikromolekuł Syntezę i czynności makromolekuł i struktur komórkowych Oddychanie komórkowe Stres komórkowy i odbudowę komórek Inne właściwości komórkowe Ważniejsze zastosowania mikromacierzy fenotypowych fenotypowych PM: 1. Badania linii komórkowych eksponowanych na działanie leków i czynników chemicznych: a. Tworzenie nowych leków b. Badania toksykologiczne 2. Badania linii komórkowych po zmianach genetycznych a. Określenie funkcji genów (genomika funkcjonalna) b. Poszukiwanie genów kodujących c. Optymalizacja linii komórkowych d. Testowanie stabilności fenotypowej kultur komórkowych 3. Bezpośrednie badania linii komórkowych a. Optymalizacja warunków hodowli linii komórkowych b. Optymalizacja warunków sporulacji i kiełkowania c. Optymalizacja produkcji wtórnych metabolitów takich jak antybiotyki d. Poszukiwanie użytecznych enzymów aktywnych e. Inne badania oparte na liniach komórkowych MIKROMACIERZE FENOTYPOWE KOMÓREK SSAKÓW PMM Zestawy do fenotypowania metabolizmu komórek ssaków w oparciu o prostą 3-etapową procedurę, umożliwiają analizę kinetyki energii oraz różnicowanie przepływu i przemian energii (głównie NADH) w setkach szlaków metabolicznych jednocześnie. Zestawy PMM są to 96-cio dołkowe płytki opłaszczone metabolicznymi substratami i efektorami. Płytki PMM Biolog, mogą być odczytywane przy użyciu każdego standardowego czytnika mikropłytek. Wykonanie badania jest bardzo wygodne i nieabsorbujące, a wyniki zapewniają wysoką powtarzalność. W połączeniu z szybkim definiowaniem preferencji substancji metabolicznych dla różnych typów komórek i generowaniem współczynników zmienności energii, zestawy są doskonałym narzędziem, umożliwiającym ocenę zmian aktywności metabolicznej w odpowiedzi na zmianę stężenia jonów, hormonów, leków przeciwnowotworowych.. Najnowszy zestaw Mitochondrial assay umożliwia ocenę reakcji mitochondrii na wiele podstawowych substancji odżywczych. Wszystkie zestawy PMM wspólnie pozwalają ocenić, jak różne substancje odżywcze/substraty metaboliczne (różne źródła energii) i środowisko komórki mogą wpływać na zmiany mechanizmów sygnalizacji receptorów jądrowych. Uzyskany wynik badań zestawami Biolog, może być wykorzystany do badania, potwierdzenia czy modyfikowania roboczej hipotezy. Do badań mogą być użyte wszystkie typy komórek ssaków (komórki macierzyste, komórki pierwotne, komórki nowotworowe , komórki unieśmiertelnione i in.) pochodzące z dowolnego źródła. Zestawy mogą dostarczyć danych metabolicznych nawet dla 500 komórek w naczyńku w ciągu zaledwie 3-4 godzin. W ofercie Biolog dostępne są następujące zestawy PMM Biolog : • Carbon Energy and Nitrogen Substrate Metabolism Profiling (4 płytki X 96 dołków, w których znajduje się 367 metabolicznych substratów, substratów jeden substrat w jednym dołku, każdy dołek na płytce jest powiązany z innym szlakiem metabolicznym. Użyte substraty to: węglowodany, alkohole, kwasy tłuszczowe, ketony, kwasy karboksylowe, aminokwasy). • Ion and Hormones - Metabolism Response Profiling (1 płytka X 96 dołków, na których znajdują się 22 zróżnicowane Jony/kofaktory i 3 płytki X 96 dołków - 45 różnych hormonów) hormonów • Mitochondrial Metabolism Assay (1 płytka X 96 dołków, na której znajduje się 8 mitochondrialnych i niemitochondrialnych substratów do rozpoznawania zróżnicowanych stanów aktywności mitochondrialnej, przy jednoczesnym oznaczaniu charakteru i stopnia użytej ścieżki pozamitochondrialnej) • Chemosensitivity Metabolism Profiling (4 płytki X 96 dołków z 92 chemicznymi lekami przeciwnowotworowymi) przeciwnowotworowymi Więcej informacji znajduje się na stronie www.biolog.com/PMM lub www.biolog.com OMNIL OMNILOG ILOG PM SYSTEMS Wszystkie systemy OmniLog PM zawierają OmniLog reader/inkubator, komputer, OmniLog PM Software, instrukcję użytkowania, elektroniczny pipetor, turbidymetr MIKROMACIERZE FENOTYPOWE DO BADAŃ KOMÓREK MIKROORGA MIKROORGANIZMÓW PM Nazwa PM1 96 Carbon utilization assays PM2 96 Carbon utilization assays PM3 96 Nitrogen utilization assays PM4 96 Phosphorus - Sulfur utilization assays PM5 96 Biosynthetic pathway/nutrient stimulation PM6 96 Nitrogen utilization assays PM7 96 Nitrogen utilization assays PM8 96 Nitrogen utilization assays PM9 96 Osmotic/Ionic response assays PM10 96 pH response assays PM11 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM12 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM13 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM14 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM15 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM16 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM17 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM18 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM19 96 Bacterial chemical sensitivity assays PM20 96 Bacterial chemical sensitivity assays Wielkość opak. Nr kat. 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 12111 12112 12121 12131 12141 12181 12182 12183 12161 12162 12211 12212 12213 12214 12215 12216 12217 12218 12219 12220 MIKROMACIERZE MIKROMACIERZE FENOTYPOWE PMM DO BADAŃ KOMÓREK SSAKÓW PM-M1 Metabolite utilization assays 1 płytka 13101 PM-M2 Metabolite utilization assays PM-M3 Metabolite utilization assays PM-M4 Metabolite utilization assays PM-M5 Cation / Anion sensitivity assays PM-M6 Hormone/Metabolic effector assays PM-M7 Hormone/Metabolic effector assays PM-M8 Hormone/Metabolic effector assays PM-M11 Chemosensitivity assays PM-M12 Chemosensitivity assays PM-M13 Chemosensitivity assays PM-M14 Chemosensitivity assays PM-M Tox 1 Biolog Redox Dye Mix MA (6X), 20 ml Biolog Redox Dye Mix MB (6X), 20 ml 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 płytka 1 butelka 1 butelka 13102 13103 13104 13105 13106 13107 13108 13111 13112 13113 13114 14101 74351 74352 Dystrybutor: