autoreferat (PL) - Instytut Chemii Fizycznej PAN

Transkrypt

Agnieszka Michota-Kamińska, Wniosek habilitacyjny
Dr Agnieszka Michota-Kamińska
Instytut Chemii Fizycznej, Polska Akademia Nauk, Warszawa
AUTOREFERAT
Modyfikowane nanostruktury plazmoniczne do analiz spektroskopowych wybranych
związków i układów biologicznych istotnych w diagnostyce medycznej.
Załącznik 2
DO WNIOSKU O PRZEPROWADZENIE POSTĘPOWANIA HABILITACYJNEGO
Warszawa 2016
1
Spis treści
1. DANE OSOBOWE ............................................................................................................ 3
2. OMÓWIENIE BADAŃ STANOWIĄCYCH PODSTAWĘ DOROBKU
HABILITACYJNEGO ............................................................................................................... 4
2.1. Lista publikacji wybranych jako przedmiot habilitacji ................................................... 4
2.2. Wprowadzenie ................................................................................................................. 6
2.3. Cel naukowy prac wchodzących w skład rozprawy habilitacyjnej. .............................. 10
2.4. Prezentacja najważniejszych wyników ......................................................................... 11
2.5. Podsumowanie .............................................................................................................. 36
2.6. Przyszłe plany badawcze. .............................................................................................. 39
3. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO – BADAWCZYCH ....... 40
3.1. Przebieg pracy naukowej. ............................................................................................. 40
3.2. Wykaz patentów i zgłoszeń patentowych. .................................................................... 45
3.4. Nagrody i wyróżnienia .................................................................................................. 49
3.5. Podsumowanie dorobku naukowego ............................................................................. 49
4. DZIAŁALNOŚĆ DYDAKTYCZNA .............................................................................. 49
5. WSPÓŁPRACA KRAJOWA I MIĘDZYNARODOWA ................................................ 51
6. POPULARYZACJA NAUKI .......................................................................................... 51
6.1. Organizowanie konferencji. .......................................................................................... 52
6.2. Udział w konferencjach krajowych i międzynarodowych ............................................ 52
7. PROJEKTY BADAWCZE .............................................................................................. 56
Podziękowania
2
1. DANE OSOBOWE
IMIĘ I NAZWISKO
Agnieszka Michota-Kamińska
WYKSZTAŁCENIE
1999 – magister chemii, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Pracownia Oddziaływań
Międzymolekularnych, Praca magisterska pt. „Badania spektroskopowe kompleksów
donorowo-akceptorowych: Co(hemiporfirazyna) i Co(salofeny) z TCNQ”
2004 – doktor chemii, Uniwersytet Warszawski, Wydział Chemii, Pracownia Oddziaływań
Międzymolekularnych, Praca doktorska pt. „Wpływ oddziaływań międzymolekularnych na
strukturę monowarstw dwufunkcyjnych tioli zaadsorbowanych na podłożach Ag i Au”.
PRZEBIEG PRACY ZAWODOWEJ
2000 – 2004 – doktorantka, Wydział Chemii, UW, Warszawa, Polska.
2005 – 2007 – adiunkt, Wydział Chemii, UW, Warszawa, Polska.
2007 – 2008 – post-doc, School of Chemical Science, Dublin City University, Irlandia.
2008 – adiunkt, Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie, Polska.
3
2. OMÓWIENIE BADAŃ STANOWIĄCYCH PODSTAWĘ DOROBKU
HABILITACYJNEGO
TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO
„Modyfikowane nanostruktury plazmoniczne do spektroskopowych analiz wybranych
związków i układów biologicznych istotnych w diagnostyce medycznej”.
2.1.
Lista publikacji wybranych jako przedmiot habilitacji
H1. A. Kamińska*, E. Witkowska, K. Winkler, I. Dzięcielewski, J. L. Weyher, J. Waluk
„Detection of Hepatitis B virus antigen from human blood: SERS immunoassay in a
microfluidic system“, Biosensors and Bioelectronics 66, 461–467 (2015). IF=6.409, liczba
cytowań: 1
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 65%. Jestem autorem pomysłu wykorzystania
techniki SERS do detekcji antygenów wirusa HPV, wykonałam pomiary spektroskopowe,
opracowałam wyniki, napisałam manuskrypt, korespondowałam z edytorem, przygotowałam
odpowiedzi dla recenzentów.
H2. A. Kamińska*, A. A. Kowalska, D. Snigurenko, E. Guziewicz, J. Lewiński, J. Waluk,
„ZnO oxide films for ultrasensitive, rapid, and label-free detection of neopterin by surfaceenhanced Raman spectroscopy”, Analyst 140, 5090-5098 (2015). IF=4.107, liczba cytowań:
0
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 75%. Jestem autorem pomysłu sprawdzenia
możliwości analizy i detekcji immuno-markerów (takich jak neopteryna) techniką SERS,
wykonałam pomiary spektroskopowe, opracowałam wyniki, napisałam manuskrypt,
korespondowałam z edytorem, przygotowałam odpowiedzi dla recenzentów.
H3. A. Kamińska*, E. Witkowska, A. Kowalska, A. Skoczyńska, I. Gawryszewska, E.
Guziewicz, D. Snigurenko, J. Waluk, „Highly efficient SERS-based detection of cerebrospinal
fluid neopterin as a diagnostic marker of bacterial infection” Anal. Bioanal. Chem., DOI
10.1007/s00216-016-9535-7, (2016). IF=3.436, liczba cytowań: 0
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 65%. Jestem autorem pomysłu opracowania
metody detekcji neopteryny w próbkach klinicznych z określoną infekcją bakteryjną,
wykonałam pomiary spektroskopowe, opracowałam wyniki, napisałam manuskrypt,
korespondowałam z edytorem, przygotowałam odpowiedzi dla recenzentów.
4
H4. A. Kamińska*, E. Witkowska, A. Kowalska, A. Skoczyńska, P. Ronkiewicz, T.
Szymborski, J. Waluk „Rapid detection and identification of bacterial meningitis pathogens
in ex vivo clinical samples by SERS method and principal component analysis”, Anal.
Methods, DOI: 10.1039/C6AY01018K,(2016). IF=1.821, liczba cytowań: 0
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 70%. Jestem autorem pomysłu opracowania
metody detekcji i identyfikacji bakterii powodujących infekcję bakteryjną analizowaną w
pracy H3 pod kątem oznaczania neopteryny, wykonałam wszystkie pomiary spektroskopowe,
opracowałam wyniki, napisałam manuskrypt, korespondowałam z edytorem, przygotowałam
H5. A. Kamińska*, A. Kowalska, E.Witkowska, P. Albrycht, J. Waluk, „The ABO blood
groups antigen-antibody interactions studied by SERS spectroscopy: towards the blood group
typing”, Analytical Methods 8, 1461-1463 (2016). IF=1.821, liczba cytowań:0
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 80%. Jestem współautorem pomysłu
wykorzystania techniki SERS do badań oddziaływań antygen – przeciwciało głównych grup
krwi. Zaprojektowałam badania i wykonałam ich większość, opracowałam wyniki, napisałam
manuskrypt, korespondowałam z edytorem, współuczestniczyłam w przygotowaniu
H6. A. Sivanesan, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, Ł. Dziewit, A. Kamińska*, J. Waluk,
„Nanostructured Silver-Gold Bimetallic SERS Substrate for Selective Identification of
Bacteria in Human Blood”, Analyst 139, 1037-43 (2014). IF=4.107, liczba cytowań: 17
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 50%. Jestem współautorem opracowanych
nanostruktur metalicznych i opracowanej metody detekcji bakterii. Uczestniczyłam w
pomiarach i analizach spektroskopowych oraz w pisaniu manuskryptu i odpowiedzi dla
recenzentów.
H7. T. Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk, A. Kamińska*, „Electrospun
polymer mat as a SERS platform for immobilization and detection of bacteria from fluids”,
Analyst, 139, 5061-5064 (2014). IF= 4.107, liczba cytowań: 2
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 70%. Jestem współautorem pomysłu
opracowanych nanostruktur metalicznych, które zapewniają jednoczesne wzmocnienie sygnał
u SERS, ale także filtrację i immobilizację komórek bakteryjnych z płynów. Wykonałam
pomiary SERS, uczestniczyłam w analizie danych, pisaniu manuskryptu, korespondowałam z
edytorem i przygotowałam odpowiedzi dla recenzentów.
5
H8. A. Kamińska, O. Inya-Agha, R. J. Forster and T. E. Keyes, „Chemically bound gold
nanoparticle arrays on silicon: assembly, properties and SERS study of protein interactions”,
Phys. Chem. Chem. Phys, 10, 4172- 4175 (2008). IF = 4.493, liczba cytowań: 40
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 60%. Zaprojektowałam badania, wykonałam
wszystkie eksperymenty, napisałam manuskrypt. Uczestniczyłam w przygotowaniu
H9. A. Kamińska, R. J. Forster and T. E. Keyes, „The impact of adsorption of bovine
pancreatic trypsin inhibitor on CTAB-protected gold nanoparticle arrays: a Raman
spectroscopic comparison with solution denaturation”, Journal of Raman Spectroscopy, 41,
130-1334 (2009). IF = 2.671; liczba cytowań: 4
Mój wkład w realizację tej pracy oceniam na 70%. Jestem autorem pomysłu badań,
wykonałam
wszystkie
eksperymenty,
napisałam
manuskrypt.
Uczestniczyłam
w
przygotowaniu odpowiedzi dla recenzentów.
Podsumowanie cyklu publikacji wchodzących w skład rozprawy habilitacyjnej według Web
of Science (Thomson Reuters) na dzień 21 kwietnia:
Sumaryczny IF: 31.216
Liczba cytowań : 64
Liczba cytowań bez autocytowań: 56
2.2.
Wprowadzenie
Technika powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (ang. – surface
enhanced Raman spectroscopy; SERS) w chwili obecnej jest dynamicznie rozwijającą się
metodą coraz szerzej stosowaną w badaniach biomedycznych i analitycznych.
Zjawisko SERS zostało zaobserwowane w 1974 roku przez Fleishamana1i polega na
wzmocnieniu sygnału nieelastycznie rozproszonego światła dla molekuł znajdujących sie w
pobliżu schropowaconej metalicznej powierzchni złota, srebra czy miedzi lub ich nanoczastek
(chociaż lista metali, dla których zaobserwowano także wzmocnienie rozproszenia
ramanowskiego jest znacznie bogatsza2). Powstało tak wiele ujęć teoretycznych zjawiska
SERS, że pojawiły się trudności z ich klasyfikacją. Do dziś nie istnieje jedna uniwersalna
1
M. Fleischmann, P. Hendra, A. McQuillan, Chem. Phys. Lett. 26, 163 (1974).
(a) H.Seki, J. Electron Spectrosc. 39, 289 (1983); (b) P. A. Lund, D. E. Tevault, R. R. Smardzewski,
J. Phys. Chem. 88, 1731 (1984).
2
6
teoria tłumacząca wszystkie obserwowane efekty. Powszechnie jednak wśród badaczy panuje
zgoda, że na efekt SERS składają się dwa zasadnicze mechanizmy wzmocnienia:
elektromagnetyczny i efekt oddziaływań bliskiego zasięgu nazywany często efektem
przeniesienia ładunku (ang. charge-transfer, (CT). Jedna z najczęściej stosowanych teorii do
opisu mechanizmu elektromagnetycznego to teoria rezonansu plazmonów powierzchniowych
(SPR, ang. surface plazmon resonance), która zakłada, że lokalne pola elektryczne wokół
molekuł przy powierzchni metalu są wzmacniane w wyniku wzbudzenia zlokalizowanych
powierzchniowych plazmonów, prowadząc do intensywnego rozpraszania ramanowskiego 3.
Na molekułę, oświetloną promieniowaniem, znajdującą sie przy powierzchni metalu
oddziałuje promieniowanie n-krotnie wzmocnione. Promieniowanie rozproszone ulega w
obecności
nanostruktur
metalicznych
dodatkowemu
n’-krotnemu
wzmocnieniu
a
intensywność światła rozproszonego wzrasta |n n’|2-krotnie. Do wytłumaczenia mechanizmu
CT stosuje się co najmniej trzy zasadnicze podejścia: tunelowanie elektronu lub dziury
pomiędzy metalem a molekułą w zjawisku indukowanego fotonem przeniesienia ładunku
(ang. photon driven charge transfer, PDCT)
z uwzględnieniem czynnika tzw. „miejsc
aktywnych” (defekty w sieci krystalicznej na powierzchni metalu lub adatomy) 4, modulacje
rezonansu plazmonowego przez przeniesienie ładunku5 oraz najpowszechniej stosowany opis
oparty na teorii Albrechta rezonansowego rozproszenia Ramana6. W przypadku molekuł
zaadsorbowanych chemicznie na podłożu metalicznym, możliwe są przejścia elektronowe
typu CT (charge transfer) pomiędzy poziomem Fermiego metalu i poziomem LUMO (lowest
unoccupied molecular orbital) molekuły, bądź też pomiędzy HOMO (highest occupied
molecular
orbital)
i
poziomem
Fermiego
metalu.
Gdy
energia
wzbudzającego
promieniowania odpowiada energii tych przejść tj. jest z nimi w rezonansie, wówczas zgodnie
z mechanizmem rezonansu (drugorzędowy czasowo-zależny rachunek zaburzeń), następuje
wzmocnienie pasm ramanowskich. Zastosowanie tylko jednej teorii do opisu zjawiska SERS
nie tłumaczy wszystkich obserwowanych eksperymentalnie efektów. Zdecydowanie lepszy
opis omawianego zjawiska można uzyskać stosując kombinacje różnych modeli. W efekcie
opisanych wyżej złożonych mechanizmów, w zjawisku SERS dochodzi do wzmocnienia
3
K. Kneipp, M. Moskovits, Surface-Enhanced Raman Scattering. Physics
and Applications; Springer-Verlag: Berlin Heidelberg, 2006.
4
D. Guzanosm D. I rish, G. Atkinson, Langmuir, 6, 1102 (1990).
5
J. Kirtley, S. Jha, T. Tsang, Solid State Commun. 35, 509, 1980.
6
R. Aroca, Surface enhanced vibrational spectroscopy; Wiley, 2006; Part 4. Chemical Effects and the
SERS Spectrum.
7
sygnału ramanowskiego rzędu 103 – 1014, co daje możliwość obserwacji pojedynczych
molekuł7.
Tak duża czułość detekcji w połączeniu z wysoką selektywnością otwiera przed
spektroskopią SERS szeroki wachlarz aplikacji. Otrzymane w wyniku pomiaru SERS pasma
oscylacyjne dają możliwość uzyskania informacji o strukturze badanego związku. W
spektroskopii
Ramana
każdy
związek
daje
charakterystyczne
dla
siebie
widmo
spektroskopowe (ang. fingerprint).
Technika SERS jest przykładowo używana w badaniach nad inhibitorami korozji8,
polimerami9, do detekcji i charakteryzacji barwników w obiektach archeologicznych i
dziełach sztuki10, w analizie śladowej np. do określania zanieczyszczeń wody11, w medycynie
sądowej czy w detekcji zagrożeń bioterrorystycznych12. Coraz częściej jej potencjał jest
wykorzystywany w badaniach medycznych i analitycznych i wydaje się, iż obecnie jest to
jeden z dominujących obszarów aplikacyjnych techniki SERS. Przykładowo, analizie SERS
poddawane
są
nukleotydy,
elementy
składowe
kwasów
nukleinowych
a
także
neurotransmitery, fotosyntetyczne membrany i cytochromy, a nawet pojedyncze żywe
komórki13. Prowadzone są także pomiary glukozy in vivo i obserwacje oddziaływania leków z
białkami14. Wszystkie te badania, a szczególnie aplikacje biomedyczne muszą bazować na
silnych i powtarzalnych sygnałach SERS. Chociaż wielkość sygnału SERS zależy od szeregu
czynników takich jak właściwości elektryczne metalu, odległość molekuły od powierzchni i
jej orientacja na powierzchni, częstość, natężenie i kąt padania promieniowania
wzbudzającego15 to morfologia powierzchni wzmacniającej tj. rozmiar i geometria ułożenia
molekuł tworzących powierzchnię jest kluczowym parametrem decydującym o czułości i
powtarzalności rejestrowanych widm. Rozwój nanotechnologii zaowocował w ostatnich
latach tworzeniem różnorodnych powierzchni do pomiarów SERS. Podłoże SERS-owskie jest
to struktura dowolnego typu, która podtrzymuje rezonans plazmonowy, dając przez to
odpowiednie wzmocnienie sygnału ramanowskiego. Jak już zostało nadmienione, szeroko
7
[a] K. Kneipp, Y. Wang, H. Kneipp, I. Itzkan, R. R. Dasari, M. S. Feld, Phys. Rev. Lett., 76, 2444
(1996),; [b] S. Nie, S. R. Emory, Science, 275, 1102, (1997) [c] K. Kneipp, Y. Wang, H. Kneipp, L. T.
Perelman, I. Itzkan, R. R. Dasari, M. S. Feld, Phys. Rev. Lett. 78, 1667 (1997).
8
W. H. Durnie, R. De Marco, A. Jefferson, B. J. Kinsella, Surf. Interface Anal., 35, 536 (2003).
9
F. J. Boerio, P. P Hong, H. W. Tsai, J. T Young., Surface and Interface Analysis 17(7):448 (1991).
10
V. A. Whitney, F. Casadio, R. P. Van Duyne, Appl Spectrosc.,61, 9 (2007).
11
M. Wang, B. De Vivo, W. Lu, M. Muniz-Miranda, Appl Spectrosc., 68, 784 (2014).
12
Rigaku Raman Technologies: http://www.rigakuraman.com/applications/chemical-verification/
13
A. Downes A. Elfick, Sensors, 10,1 871 (2010).
14
S. Siddhanta, Ch. Narayana, Nanomater Nanotechnol., 2, 1 (2012).
15
S. B. Chaney, S Shanmukh, R. A Dluhy, Y. P Zhao, Applied Physics Letters, 87, 031908 (2005).
8
stosowanymi materiałami do produkcji podłóż są złoto, srebro i miedź z racji swoich
właściwości optycznych. Podłoża SERS-owskie najogólniej można podzielić na: (i)
nanocząstki metali rozmieszczone chaotycznie lub tworzące uporządkowane dwu- lub
trójwymiarowe struktury i (ii) powierzchnie o odpowiedniej morfologii. Znanych jest wiele
metod otrzymywania nanocząstek począwszy od kontrolowanej redukcje soli odpowiedniego
metalu16 (koloidy) poprzez elektroosadzanie z użyciem woltamperometrii cyklicznej17,
kontrolowaną samoorganizację nanoczastek na granicy faz ciecz-ciecz czy fragmentację
indukowaną laserowo, które dające możliwość uzyskiwania nanocząstek (lub agregatów) o
wymaganych wielkościach i kształtach.
Lista technik wykorzystywanych do projektowania aktywnych SERS-owsko
powierzchni jest również bogata. Wysoce uporządkowane struktury o wielkości rzędu kilku
nanometrów można uzyskać techniką elektrolitografii
18
i DPN (dip-pen nanolithography)19.
Dobre wyniki daje naparowywanie nanostruktur metalicznych na podłoża o odpowiedniej
morfologii uzyskane dzięki technikom CVD (ang. Chemical Vapor Deposition) –
chemicznego osadzania z fazy pary, w tym ALD (ang. Atomic Layer Deposition) – osadzania
warstw atomowych20. Mimo dużej ilości używanych technik i możliwości jakie niesie rozwój
nanotechnologii nadal jednak pozostaje problematyczne tworzenie powierzchni spełniających
jednocześnie wszystkie wymagania stawiane podłożom do zastosowań biomedycznych, jak:
wysoka czułość, powtarzalność i stabilność rejestrowanych sygnałów ramanowskich.
Brak takich powierzchni ogranicza technikę SERS w zastosowaniach aplikacyjnych.
W swojej pracy naukowej, już od kilku lat pracuję nad otrzymywaniem aktywnych
SERS-owsko podłoży do analiz biomedycznych. Wyniki tych badań są przedmiotem co
najmniej 25 publikacji, 10 patentów, w tym 6 międzynarodowych i 5 zgłoszeń patentowych.
Obejmują one metody wytwarzania, analizy podłoży i ich aplikacyjnych zastosowań.
Prezentują między innymi możliwości wykorzystania techniki SERS do detekcji mutacji
genu BCR-ABL (na nowatorskich podłożach bazujących na GaN pokrytym złotem)
odpowiedzialnych za występowanie przewlekłej białaczki21, wybranych neurotransmiterów
16
R. Aroca, Surface enhanced vibrational spectroscopy; Part 4. Chemical Effects and the SERS
Spectrum. Wiley, 2006.
17
M. Siek, A. Kamińska, A. Kelm, T. Rolinski, R. Holyst, M. Opallo and J. Niedziolka-Jönsson,
Electrochimica Acta, 89, 284 (2013).
18
B. Sharma R. R Frontiera, A. I Henry, E Ringe, R. P Van Duyne, Materials today, 15, 16 (2012).
19
M. Green, M. Garcia-Parajo, F. Khaleque, R. Murray, Appl. Phys. Lett., 62, 264 (1993).
20
A. Kamińska. A. A. Kowalska, D. Snigurenko, E. Guziewicz, J. Lewiński, J. Waluk, Analyst;140,
5090 (2015).
21
A. Kamińska, A. Sivanesan, E. Witkowska, J. Gołąb, M. Winiarska, D. Nowis, I. Dzięcielewski, J.
L. Weyher and J. Waluk, J. Chem. Chem. Eng.,7, 972 (2013).
9
takich jak dopamina, cholina, epinefryna na specjalnie zaprojektowanych aktywnych
podłożach z wykorzystaniem elektroosadzania nanocząstek Au metodą woltamperometrii
cyklicznej22. Wiele z tych prac powstało we współpracy ze środowiskiem biologów i lekarzy.
W niniejszej rozprawie habilitacyjnej przedstawiam dziewięć oryginalnych publikacji.
Prace
te
są
ze
sobą
związane
za
sprawą
aktywnych
podłoży SERS-owskich
wykorzystywanych do uzyskania przedstawionych w nich wyników, ale także ze względu na
zastosowanie i/lub znaczenie w badaniach biomedycznych i analitycznych. Przedstawiony
cykl publikacji jest poświęcony nanostrukturom metalicznym, które podtrzymując rezonans
plazmonowy, dają silne sygnały SERS umożliwiając badania wybranych markerów i
patogenów istotnych jednostek chorobowych. W moich badaniach starałam się pokazać
kluczowe parametry do uzyskania dobrze funkcjonującego podłoża do badań molekularnych
za pomocą powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana i jaki potencjał badawczy i
aplikacyjny niesie ze sobą ta technika.
2.3.
Cel naukowy prac wchodzących w skład rozprawy habilitacyjnej.
Zasadniczym celem badawczym było zaprojektowanie i otrzymanie modyfikowanych
nanostruktur metalicznych do analizy spektroskopowej (SERS):
1) patogenów – wybranych, wirusów i bakterii,
2) markera infekcji bakteryjnych i chorób immunologicznych – neopteryny,
3) antygenów głównych grup krwi typu ABO i ich przeciwciał.
Ta analiza została podjęta by zrealizować specyficzne i bardziej szczegółowe cele
badawcze dla każdego „układu biologicznego” analizowanego w ramach projektu, tj:
opracowanie:
- sensora (immuno-testu) do detekcji antygenów HBsAg wirusa HBV wywołującego
przewlekłe zapalenie wątroby typu B, [H1],
- metody bezpośredniej detekcji i analizy ilościowej neopteryny w płynach
ustrojowych, w tym w próbkach klinicznych, [H2], [H3], [H4],
- metody identyfikacji głównych grup krwi ABO, [H5]
- metod detekcji bakterii z osocza krwi, moczu i płynu mózgowo-rdzeniowego, [H6],
[H7]
M. Siek, A. Kamińska, A. Kelm, T. Rolinski, R. Holyst, M. Opallo and J. Niedziolka-Jönsson,
Electrochimica Acta, 89, 284 (2013).
22
10
Powyższe cele mogły być zrealizowane dzięki zaprojektowaniu aktywnych SERS-owsko
powierzchni dających powtarzalne i stabilne w czasie widma o dużym współczynniku
wzmocnienia sygnału bazujących na:
- nanocząstkach Au immobilizowanych na chemicznie modyfikowanym krzemie,
[H8], [H9]
- matach polimerowych pokrytych stopem Au/Ag, [H4 ],[H7],
- nanostrukturach ZnO otrzymanych metodą osadzania warstw atomowych (ALD)
pokrytych Au, [H1], [H3].
Prezentacja najważniejszych wyników
2.4.
H1. A. Kamińska*, E. Witkowska, K. Winkler, I. Dzięcielewski, J. L. Weyher, J. Waluk
„Detection of Hepatitis B virus antigen from human blood: SERS immunoassay in a
microfluidic system“, Biosensors and Bioelectronics 66,461–467 (2015).
Praca przedstawia immuno-test do detekcji antygenów HBsAg wirusa HBV
wywołującego zapalenie wątroby typu B bazujący na zjawisku SERS. Wykorzystano w nim:
(1) nowatorskie podłoża oparte na GaN pokrytym stopem Au-Ag (podłoża te są tematem
trzech prac nie ujętych w cyklu habilitacyjnym23,24, i trzech patentów międzynarodowych
których jestem współautorem); (2) odpowiednio zaprojektowaną tzw. immuno sondę tj.
„Raman reporter” bazujący na fuksynie, molekule, która daje silne sygnały SERS, a jej grupy
funkcyjne
mają
możliwość
wiązania
przeciwciał
i
nanostruktur
Au;
(3)
układ
mikrofluidyczny z wbudowanych aktywnym SERS-owsko podłożem, w którym przebiegają
reakcje immunologiczne i rejestracja sygnałów SERS. Rysunek 1 przedstawia ideowy
schemat immuno-testu i kolejne etapy (reakcje) w nim przebiegające.
(a) J. L. Weyher, I. Dzięcielewski, A. Kamińska, G. Nowak, R. Hołyst, Applied Physics Letters,112,
114327 (2012); (b) A. Kamińska, J. L. Weyher; J. Waluk, S. Gawinkowski, R. Holyst, “SERS Active
Surface Based on Au-Coated Porous GaN”, AIP Conference Proceedings, 1267, 954-955 (2010).
24
11
Rysunek 1. Kolejne etapy immuno–testu bazującego na zjawisku SERS. (A) przygotowanie
aktywnego SERS-owsko podłoża (GaN pokryty Ag-Au) z warstwą tiolową 6-amino 1heksanotiolu, do której przyłączone zostały przeciwciała wirusa HBV. (B) schemat tworzenia
„immuno sondy” tj. nadstruktury Au, do których poprzez warstwę kwasu
merkaptobursztynowego przyłączona została fuksyna (Raman reporter) i przeciwciała wirusa
HBV. (D) schematyczna ilustracja układu mikrofluidycznego zintegrowanego z aktywnym
podłożem SERS-owskim; DA-obszar detekcji sygnałów SERS (komora z wbudowanym
podłożem GaN/Ag-Au).
Opierając się na powyższym schemacie i zaplanowanych reakcjach wykazano
możliwość detekcji antygenów HBsAg w osoczu i plaźmie ludzkiej krwi. Na podstawie
opracowanych krzywych kalibracyjnych (zależność pomiędzy stężeniem antygenu w płynie
ustrojowym a intensywnością pasma diagnostycznego fuksyny, rysunek 2) możliwe było
oznaczenie ilościowe zawartości antygenów w badanych próbkach. Wyznaczony limit
detekcji wynosił 0.01 IU/ml i jest niższy (lepszy) w porównaniu z limitami detekcji jakie
oferują immuno-testy oparte na klasycznych technikach ELISA, mieszczącymi się w zakresie
12
od 0.03 do 0.65 IU/ml, co wskazuje na ogromy potencjał diagnostyczny zaproponowanego
immunoSERS-testu.
B
A
Rysunek. 2. (A)Widma SERS rejestrowane dla wzrastającego stężenia antygenu w surowicy
krwi: (a) 0.0; (b) 0.00125; (c) 0.0125; (d) 0.125; (e) 0.625; (f) 2.5; (g) 12.0 and (h) 250
IU/mL. Każde z widm jest uśrednione z sześciu pomiarów. (B) Zależność między
intensywnością pasma diagnostycznego o częstości 1178 cm-1 w funkcji stężenia antygenu w
zakresie od 0 do 500 IU/Ml i od 0 do 60 IU/mL (insert).
Dodatkowo w pracy przebadano wpływ aktywnego SERS-owsko podłoża
bazującego na GaN/Ag-Au adoptując strategię opisanej metody na podłoża nieaktywne
SERS-owsko (krzem modyfikowany 3-aminopropyl-3-metoksysilanem). Limit detekcji
antygenów HBsAg na podłożach nieaktywnych był znacznie wyższy i wynosił 0.625 IU/ml,
co potwierdza zasadność stosowania opracowanych nanostruktur wzmacniających sygnał
ramanowski, zarówno podłoża GaN/Ag-Au jak i nanostruktur Au związanych z „Raman
reporterem”. Podłoża z azotku galu, były otrzymywane zgodnie z procedurą opisaną w
artykule „Highly reproducible, stable and multiply regenerated surface-enhanced Raman
scattering for biomedical applications”25 we współpracy z Instytutem Wysokich Ciśnień
PAN. Stosowano powłoki GaN (na szafirze), otrzymywane metodą MOCVD (ang. Metal
A. Kamińska, I. Dzięcielewski, J. L. Weyher, J. Waluk, S. Gawinkowski, V. Sashuk, M. Fiałkowski,
M. Sawicka, T. Suski, S. Porowski, R. Hołyst, J. Mat. Chem., 21, 8662 (2011).
25
13
Organic Chemical Vapour Deposition czyli chemiczne osadzanie warstw na powierzchni,
przy zastosowaniu związków metaloorganicznych będących w fazie gazowej), które następnie
poddawano procesowi fototrawienia w roztworze wodnym KOH i K2S2O8 a w ostatnim etapie
napylano stopem Au-Ag (1:1), (rysunek 3 prezentuje morfologię uzyskanych struktur).
Dobierając parametry fototrawienia i napylania opracowane zostały nanostruktury, które
dawały najsilniejsze wzmocnienia sygnałów ramanowskich zarówno dla analitów testowych
takich jak kwas p-merkaptobenzoesoewy jak i układów biologicznych takich jak krew i jej
składniki, przeciwciała, antygeny. Analiza własności spektroskopowych uzyskanych
nanostruktur obejmowała: (1) wyznaczanie współczynników wzmocnienia, (2) określenie
powtarzalności rejestrowanych sygnałów (opracowano liczbową ocenę korelacji między
widmami (seriami danych), która wykorzystuje współczynniki korelacji liniowej Pearsona,
zastosowane do drugiej pochodnej funkcji reprezentującej widmo SERS, (3) określenie
stabilności morfologicznej podłoży w czasie, co z kolei przekłada się na stabilność
rejestrowanych widm. Należy podkreślić, że zoptymalizowane nanostruktury bazujące na
GaN mają szczególnie wysoką powtarzalność rejestrowanych sygnałów, co jest jednym z
najistotniejszych parametrów w ilościowych analizach, a gwarantuje je unikatowa właściwość
omawianych podłoży. W procesie rozwinięcia warst GaN fototrawieniu nie ulegają jedynie
GaN z dyslokacjami dając w efekcie wąsy GaN o precyzyjnie zdefiniowanej (w 99 %)
średnicy, np.70 nm. Tak powtarzalna morfologia zapewnia wysoką powtarzalność
rejestrowanych sygnałów. Wyliczony średni współczynnik korelacji Pearsona dla widm
kwasu p-merkaptobenzoesoewego wynosi 0,92 a dla porównania dla podłoży SERS
bazujących na koloidach Ag wynosi 0.73.
Rysunek 3. Obraz SEM aktywnego SERS-owsko podłoża bazującego na GaN/Ag-Au.
14
W pracy wykazano również immunologiczną specyficzność opracowanego testu,
stosując do opisanego protokołu detekcji niespecyficzne antygeny w stosunku do badanych
przeciwciał wirusa HBV. Ponadto, przebadano powtarzalność zaproponowanej metody
detekcji antygenów HBsAg i obliczono, że średnie odchylenie standardowe opracowanej
metody wynosi mniej niż 10 %, co jest porównywalne z wynikiem uzyskiwanym dla
konwencjonalnych metod typu ELISA.
Podsumowując, przedstawione w pracy H1 badania rozwiązały wiele problemów
związanych ze stosowanymi do tej pory immuno-testami26 bazującymi głównie na strategii z
użyciem tzw. „zewnętrznych Raman reporterów” gdzie immuno- sondę stanowiły
nanostruktury metaliczne, na których współadsorbowano przeciwciała i molekuły „Raman
reprtera”. Zastosowana w opisywanej pracy metodologia przyczyniła się do rozwiązania
dotychczasowych problemów związanych z niespecyficzną adsorpcją przeciwciał na
nanostrukturach, co przekłada się na możliwość rozwoju multipleksowych oznaczeń
przeciwiał/antygenów, a także ograniczyła problemy z agregacją nanastruktur i podniosła
czułość immuno-sond.
Dodatkowo, połączenie techniki SERS z mikrofluidyką pozwoliło na precyzyjne
dostarczenie odpowiednich analitów o określonych stężeniach, kontrolę poszczególnych
reakcji i, co najbardziej istotne, dało możliwość rejestracji sygnałów SERS z jednego punktu
na podłożu co ograniczyło fluktuacje sygnałów SERS wynikające z niepowtarzalności
morfologicznej podłoża wzmacniającego sygnał.
H2. A. Kamińska*, A. A. Kowalska, D. Snigurenko, E. Guziewicz, J. Lewiński, J. Waluk,
„ZnO oxide films for ultrasensitive, rapid, and label-free detection of neopterin by surfaceenhanced Raman spectroscopy” Analyst 140, 5090-5098 (2015).
Przedstawione w pracy H1 aktywne SERS-owsko podłoża bazujące na warstwach GaN
wykazują wszystkie cechy spektralne niezbędne do analiz ramanowskich, tak jakościowych i
ilościowych, zarówno standardowych analitów jak i złożonych układów biologicznych.
Dużym ograniczeniem ich szerokiego potencjalnego zastosowania w analizach medycznych
jest koszt ich wytwarzania (warstwy GaN na SiC o odpowiedniej gęstości dyslokacji
zapewnia tylko Instytut Fraunhofera w Niemczech), dlatego też poszukuje się nanostruktur,
26
(a) C. Y. Song, Z. Y. Wang, R. H., Zhang, J. Yang, X. B Tan, Y. P. Cui, Biosens. Bioelectron., 25,
826 (2009).
(b) K. J. Yoon, H. K. Seo, H. Hwang, D. J. Pyo, I. Y. Eom, J. H. Hahn, Y. M. Jung, Bull. Korean
Chem. Soc., 31, 1215 (2010).
15
zapewniających rezonans plazmonowy i silne wzmocnienia sygnałów ramanowskich,
możliwych do uzyskania powszechnymi i/lub tańszymi procedurami i metodami.
W pracy H2 przedstawiłam aktywne SERS-owsko podłoża bazujące na warstwach
ZnO na krzemie otrzymanych metodą ALD – osadzania warstw atomowych i napylonych
złotem techniką rozpylania magnetronowego. Tlenek cynku jako półprzewodnik: (1) cechuje
się wysokim współczynnikiem załamania światła27, który jako optyczna właściwość metalu
wpływająca
na
mechanizm
elektromagnetyczny,
zwiększa
wzmocnienie
sygnału
rozproszenia; (2) zwiększa transfer ładunku między metalem a analitem, potęgując tym
samym efekt wzmocnienia28; (3) posiada właściwości fotokatalityczne, które pozwalają przy
pomocy promieniowania UV zdegradować analit i w efekcie wyczyścić podłoże, a następnie
wykorzystać je ponownie do pomiarów 29.
Dostępna literatura zawiera zaledwie kilka doniesień o podłożach wykorzystujących
ZnO do wytwarzania podłoży SERS a ich aktywność SERS-owska została wykazana jedynie
dla podstawowych analitów takich jak barwnik rodamina 6G30.
Wykorzystując wspomnianą wyżej metodę ALD, w omawianej pracy, tlenek cynku na
płytkach krzemowych otrzymano w reakcji podwójnej wymiany:
Zn(C2H5)2 + H2O  ZnO + 2 C2H6
Właściwości spektralne podłoży Si/ZnO/Au optymalizowano poprzez dobór odpowiednich
parametrów prowadzenia procesu ALD, tj. temperatury, grubości warstwy ZnO (liczba cykli
ALD) oraz grubości napylanej warstwy Au. Rysunek 4 prezentuje obraz SEM uzyskanych
struktur przy zastosowaniu 10 000 cykli ALD (1.4 µm) i napyleniu około 60 nm Au.
Uzyskane nanostrukury są również przedmiotem zgłoszenia patentowego, którego jestem
współautorem: „A method for preparing a platform for testing of chemicals via surfaceenhanced Raman spectroscopy (SERS) and platform obtained by this metod”, 2013, P406026.
27
H. Qi, D. Alexon, O. Glembocki, S. Prokes, Nanotechnology, 21, 085705 (2010).
L. Yang, W. Ruan, X. Jiang, J. R. Lombardi, J. Phys. Chem. C, 113, 117 (2009)
29
G. Sinha, L. E. Depero, I. Alessandri, Applied Materials and Interfaces, 3, 2557 (2011).
30
(a) L. M. Chen, L. B. Luo, Z. H. Chen, M. L. Zhang, J. A. Zapien, C. S. Lee and S. T. Lee, J. Phys.
Chem. C, 114, 93 (2010); (b) L. Sun, D. Zhao, Z. Zhang, B. Li, D. Shen, Journal of Material
Chemistry, 21, 9674 (2011); (c) A. E. Kandjani, M. Mohammadtaheri, A. Thakkar, S. K. Bhargava, V.
Bansal, J. Colloid. and Interface Science, 436, 251 (2014).
28
16
Rysunek 4. Zdjęcia SEM struktury podłoży Si/ZnO/Au zarejestrowane przy różnych
powiększeniach. Stosowano następujące warunki procesu ALD: temperatura – 100ºC, czas
przedmuchiwania gazem obojętnym – 2s, ilość cykli – 10.000 i parametry napylania warstwy
Au: grubość napylonego Au - 60nm).
Przeprowadzono analizę uzyskanych podłoży pod kątem spełniania podstawowych wymagań
stawianych podłożom do analiz spektroskopowych, takich jak czułość, stabilność oraz
powtarzalność rejestrowanych sygnałów. Obliczono współczynniki wzmocnienia dla warstw
ZnO o różnej grubości przy stałej grubości warstwy napylanego Au i zebrano w Tabeli 1.
Chropowatość (ang. root
Grubość warstwy ZnO
mean
square
(RMS)
Współczynnik
roughness), RMS/nm
wzmocnienia (ang. EF/)
630 nm
24
3.3 x 102
1 m
38.5
1.4 x 106
1.4 m
68
4.2 x 107
Tabela 1. Współczynniki wzmocnienia obliczone dla kwasu p-merkaptobenzoesowego
zaadsorbowanego z wodnych roztworów na podłożach Si/ZnO/ Au o różnych grubościach
warst ZnO przy ustalonej grubości warstwy Au (60 nm).
Najwyższy współczynnik wzmocnienia, EF=4.2107 uzyskano dla warstwy ZnO o
grubości 1.4 m i te podłoża były wykorzystywane do dalszych badań. Analizę
powtarzalności rejestrowanych sygnałów badanego kwasu p-MBA przeprowadzono zarówno
w obrębie jednego podłoża, jak i pomiędzy różnymi podłożami otrzymanymi w niezależnych
17
procedurach (rysunek 5A). Wykazano również wysoką stabilność uzyskanych nanostruktur
metalicznych w czasie. Stabilność podłoża SERS określa zakres jej praktycznego
zastosowania w analizie chemicznej i biologicznej. Jak przedstawiono na rysunku 5B
intensywność wybranego pasma o częstości 1079 cm-1 maleje jedynie o około 3% w
przypadku podłoża przechowanego przez trzy miesiące w warunkach atmosferycznych. Tak
wysoka czułość, stabilność i powtarzalność opracowanych podłoży umożliwia prowadzenie
ilościowych badań SERS licznych biomolekuł i zwiększa zastosowalność w realnych
badaniach analitycznych i biomedycznych.
B
A
Rysunek 5. (A) Widma SERS p-MBA wykonane w losowo wybranych miejscach na podłożu
Si/ZnO/Au; (B) Widmo SERS p-MBA wykonane na świeżo przygotowanym podłożu
Si/ZnO/Au (niebieski spektrogram) oraz na podłożu, którego powierzchnia wystawiona była
na działanie powietrza przez 3 miesiące (czarny spektrogram).
Wykorzystując opracowane nanostruktury, po raz pierwszy pokazałam możliwość
zastosowania techniki SERS do detekcji neopteryny w roztworach buforowych i w
osoczu krwi ludzkiej.
Neopteryna to pirazolopirymidyna syntetyzowana z trójfosforanu guanozyny w ludzkich
monocytach i makrofagach po stymulacji przez interferon gamma (IFN-) - pochodzący z
aktywowanych antygenem limfocytów T31. Jest ona utworzona przez GTP cyklohydrolazę I,
31
C. Huber, J. R. Batchelor, D. Fuchs, A. Hausen, A. Lang, D. Niederwieser, Journal of Experimental
Medicine, 160, 310 (1984).
18
która przekształca się w 7,8-GTP trójfosforan dwuhydroneopteryny, który w następnym
etapie jest metabolizowany do neopteryny. Podwyższony poziom neopteryny wskazuje na
zmieniony stan aktywacji komórek układu odpornościowego i świadczy o różnych chorobach,
takich jak choroby autoimmunologiczne i infekcje wirusowe32 (wirus zapalenia wątroby typu
A, B i C, cytomegalia, odra, różyczka, grypa), zakażenia bakteryjne 33, choroby układu
sercowo-naczyniowego34. Może wskazywać także na odrzucenie przeszczepu i niektóre
nowotwory35. Wyższe poziomy neopteryny obserwowano również w schorzeniach
związanych
z
reumatoidalnym
zapaleniem
stawów36
czy
zaburzeniach
neuropsychiatrycznych37. Do tej pory opracowano kilka procedur analitycznych do
wyznaczania poziomu neopteryny w płynach fizjologicznych wykorzystujących głównie
wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC)38 i testy immunoenzymatyczne
(ELISA)39. Jednak obie te metody są czasochłonne i kosztowne; wymagają one również
skomplikowanych urządzeń technicznych i wysoko wykwalifikowanych pracowników.
Rysunek 6 przedstawia normalne widmo Ramana (wstawka) i widma SERS neopteryny
zaadsorbowanej na podłożu Si/ZnO/Au z roztworów buforowych o różnych stężeniach.
32
(a) G. Werner-Felmayer , et al., Cancer Res., 50, 2863 (1990; (b) D. Fuchs, et al., Immunol Today,
9, 150 (1988); (c) D. Fuchs, et al., Crit Rev Clin Lab Sci., 29, 307 (1992); (d) C. S. Dukes, et al., J.
Leuk. Biol., 56, 650 (1994).
33
J. Frick, W. Aulitzky, D. Fuchs, A. Hausen, H. Joos, G. Reibnegger, H. D. Wachter , Lung, 162, 337
(1984).
34
X. Garcia-Moll, D. Cole, E. Zouridakis, J. Kaski, Heart, 83, 346 (2000).
35
C. Murr, A. Bergant, M. Widschwendter, K, Heim, H. Schröcksnadel , D.C. Fuchs, et al., Clinical
Chemistry, 45, 1998 (1999).
36
W. Kullich, Clin. Rheumatol., 12, 387 (1993).
37
S. Zeuzem, S. V. Feinman, J. Rasenack, E.J. Heathcote, M. Y. Lai, E. Gane, J. O'Grady, J. Reichen,
M. Diago, A. Lin, J. Hoffman, M. J. Brunda, N. Engl. J. Med., 343, 1666 (2000).
38
E. R. Werner, A. Bichler, G. Daxenbichler, Clinical Chemistry, 33, 62 (1987).
39
M. Barak, D. Merzbach, N. M. Gruener, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 50, 705 (1990).
19
Rysunek 6. Widma SERS zarejestrowane dla neopteryny zaadsorbowanej na podłożach
Si/ZnO/Au z roztworów buforowych o stężeniach: (a) 3.0; (b) 5.0; (c) 7.0; (d) 10.0; (e) 20.0;
(f) 45.0; and (g) 150.0 nmol/L. Insert przedstawia normalne widmo Ramana neopteryny w
postaci proszku.
Bazując na wykonanej analizie spektroskopowej zarejestrowanych widm neopteryny,
wybrano najsilniejsze pasmo diagnostyczne (w obszarze pozbawionym silnych pasm od
składników osocza krwi) i wykorzystano je do opracowania krzywej kalibracyjnej, na
podstawie której wyznaczono limit detekcji neopteryny w osoczu. Przy czym należy
podkreślić, iż na tym etapie badań neopteryna była „sztucznie” dodawana do osocza krwi.
Dodatkowo te same próbki były analizowane pod kątem stężenia neopteryny z
wykorzystaniem komercyjnych testów ELISA.
20
B
A
Rysunek 7. (A) Widmo SERS plazmy krwi (a) i widma SERS plazmy krwi zarejestrowane
dla wzrastającego stężenia neopteryny: (b) 5.0; (c) 7.0; (d) 10.0; (e) 50.0, i (f) 150.0 nmol/L.
(B) Zależność stosunku intensywności pasm 695/1005 cm-1 od stężenia neopteryny w plaźmie
krwi w zakresach stężeń 0 to 250 nmol/L i 0 to 30 nmol/L (wstawka).
W pracy wyznaczono limit detekcji neopterinu w osoczu krwi ludzkiej wynoszący 1.4
nmol/L, co odzwierciedla kliniczne limity detekcji określone technikami ELISA i mieszczące
się w zakresie 0.7 do 2.2 nmol/L. Uzyskane wyniki wskazują na potencjał techniki SERS w
detekcji neopteryny w złożonych płynach ustrojowych oraz na możliwość rozwoju nowej
metody monitorowania chorób, związanych szczególnie z zaburzeniami układu
immunologicznego oraz infekcjami bakteryjnymi.
H3. A. Kamińska*, E. Witkowska, A. Kowalska, A. Skoczyńska, I. Gawryszewska, E.
Guziewicz, D. Snigurenko, J. Waluk, „Highly efficient SERS-based detection of cerebrospinal
fluid neopterin as a diagnostic immune-marker of bacterial meningitidis”, Anal. Bioanal.
Chem., DOI 10.1007/s00216-016-9535-7, (2016).
W pracy przedstawiono kontynuację badań neopteryny w próbkach klinicznych płynu
mózgowo-rdzeniowego pochodzących od pacjentów, u których zdiagnozowano zapalenie
opon mózgowych wywołane przez bakterie Neisseria meningitidis i zdrowych pacjentów
(nie zakażonych tymi bakteriami). Badania prowadzono we współpracy z Narodowym
Instytutem Leków w Warszawie.
W badaniach wykorzystano opisane w poprzednim artykule podłoża SERS-owskie
bazujące na warstwach ZnO, ale także nowatorskie nanostruktury oparte na
komercyjnych matach polimerowych pokrytych złotem.
21
W pracy po raz pierwszy przeprowadzono analizę spektroskopową płynu
mózgowo-rdzeniowego zdrowych pacjentów i z infekcją bakteryjną, również pod kątem
analizy pasm pochodzących od neopteryny (rysunek 8).
A)
B)
Rysunek 8. (A) Porównanie widm SERS płynu mózgowo-rdzeniowego pochodzącego od
zdrowych pacjentów (b) i zakażonych bakteriami Neisseria meningitidis (a). Wstawka
przedstawia widmo SERS neopteryny zaadsorbowanej na podłożu Si/ZnO/Au z 35.0 nmol/L
roztworu buforowego. Graficzna prezentacja zależności między: (B) pierwszą główną
składową PC1 (83 % całkowitych zmian) a drugą składową PC2 (9 % całkowitych zmian) i
(C) pierwszą główną składową PC1 (83 % całkowitych zmian) do trzeciej głównej składowej
PC3 (4 %). (D) zależność wartości głównych składowych PC (wagi) od zmiennych (liczb
falowych ).
Do analizy uzyskanych danych spektralnych (widma mają dużo pasm, a pasma
diagnostyczne dla neopteryny w tak złożonych układach biologicznych nie są silne i mogą
być trudne do analizy empirycznej) wykorzystano numeryczne metody chemometryczne
22
bazujące między innymi na analizie głównych składowych (PCA). Uzyskane zależności
pomiędzy wartościami głównych składowych PC (wagi) od zmiennych (liczb falowych )
obrazują wkład poszczególnych zmiennych w rozróżnieniu analizowanego zbioru danych
(rysunek 8C).
Wykazano, że najważniejsze pasmo diagnostyczne w analizowanym zbiorze próbek
płynu mózgowo-rdzeniowego to pasmo o częstości 695 cm-1 charakterystyczne dla
neopteryny, co zgadza się z analizą empiryczną i może posłużyć do rozróżnienia próbek
kontrolnych (od zdrowych pacjentów) od próbek zainfekowanych z 98% specyficznością i
95% czułością.
Wykorzystując wiedzę i doświadczenie, zdobyte przy ilościowym wyznaczaniu
neopteryny podczas badań opisanych w poprzedniej publikacji, wyznaczono limity detekcji
neopteryny w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów zdrowych i z infekcją bakteryjną
(Tabela 2).
nmol/L
SERS
(nowa metoda)
ELISA
(metoda referencyjna)
Próbka kontrolna
3.8  0.7
4.0  1.3
Próbka z Neisseria meningitidis
30.0 4.1
36.0  5.2
Tabela 2. Stężenia neopteryny w płynie mózgowo-rdzeniowym wyznaczone metodą analizy
SERS i klasycznymi testami ELISA.
Wyniki te jasno wskazują, że neopteryna może być używana jako marker w
diagnostyce meningokokowego zapalenia opon mózgowych i w przyszłości posłużyć do
monitorowania tego zakażenia.
Ponadto, w omawianej pracy wykazano, że oprócz analizy ilościowej neopteryny w
płynie mózgowo-rdzeniowym możliwa jest również detekcja i identyfikacja bakterii Neisseria
meningitidis. Zaprojektowane podłoża spełniają istotne cechy, bez których do tej pory
identyfikacja bakterii w złożonych układach biologicznych była bardzo trudna lub
wręcz niemożliwa. Podłoża te nie tylko wzmacniają sygnał ramanowski bakterii ale służą
jednocześnie do filtracji bakterii ze złożonych układów biologicznych i ich zagęszczenia
(immobilizacji) na małym obszarze podłoża, co znacznie ułatwia rejestracje widm SERS.
23
H4. A. Kamińska*, A. Kowalska, E. Witkowska, A. Skoczyńska, P. Ronkiewicz, T.
Szymborski, J. Waluk, „Rapid detection and identification of bacterial meningitis pathogens
in ex vivo clinical samples by SERS method and principal component analysis”. Anal.
Methods, DOI: 10.1039/C6AY01018K,(2016).
Meningokokowe zapalenie opon mózgowych może być wywołane nie tylko przez
bakterie z rodzaju Neisseria meningitidis (opisane w pracy H3) ale także przez
Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae. Są to trzy podstawowe i najczęstsze
gatunki bakterii wywołujące tę infekcję40. Kontynuując badania opisane w pracy H3, do
detekcji tych bakterii opracowano i zoptymalizowano nanostruktury wzmacniające sygnały
SERS, bazujące na membranach z poliwęglanu o dwóch rozmiarach porów (0.3 µm i 3.0
µm) dobranych pod kątem wielkości analizowanych komórek bakteryjnych. Membrany po
napyleniu stopem Au-Ag (1:1) umieszczone zostały w holderach filtrów strzykawkowych,
połączone ze strzykawką z której badany analit dozowany był za pomocą pompy (rysunek 9).
A) Zestaw to filtracji płynu mózgowo-rdzeniowego.
B) membrana z
poliwęglanu
napylona Au-Ag
(podłoże SERSowskie)
Rysunek 9. (A) Zdjęcie zestawu do filtracji klinicznych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego
i (B) obraz SEM zastosowanego podłoża SERS.
W prezentowanej pracy, po raz pierwszy pokazano możliwość detekcji Neisseria
meningitidis Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae z płynu mózgowordzeniowego bezpośrednio, bez użycia znaczników. Przeprowadzono analizę SERS tych
trzech gatunków bakterii i przypisano pasma odpowiednim drganiom. Widma SERS
bakterii uzyskane z próbek klinicznych prezentuje rysunek 10A.
40
C. E. Corless, M. Guiver, R. Borrow, V. Edwards-Jones, A. J. Fox, E. B. Kaczmarski, J. Clin.
Microbiol., 39 1553 (2001).
24
A
B
Rysunek 10. (A) Widma SERS próbki kontrolnej płynu mózgowo-rdzeniowego (a) i próbek
zakażonych odpowiednio bakteriami: (b) S. pneumoniae; (c) N. meningitidis i (d) H.
influenzae uzyskane według metody opisanej powyżej (rysunek 9). (B) Graficzna prezentacja
wyników analizy PCA ilustrująca porównanie pomiędzy próbkami kontrolnymi i zakażonymi.
W pracy wykazano, że połączenie techniki SERS z metodami chemometrycznymi
(analiza głównych składowych; ang. PCA) daje możliwość rozwijania algorytmów
diagnostycznych mających na celu poprawę: (i) rozróżnienia testowanych bakterii oraz (ii)
zróżnicowania między próbkami kontrolnymi i zakażonymi bakteriami. Wyniki uzyskane z
analizy PCA są graficznie zaprezentowane na rysunku 10B i pokazują wyraźne skupiska
punktów odpowiadające próbkom kontrolnym i zakażonym, w obrębie których możliwe jest
dodatkowo rozróżnienie pomiędzy poszczególnymi gatunkami bakterii.
W omawianej pracy przeanalizowałam stężenie neopteryny w próbkach płynu
mózgowo-rdzeniowego zdrowych pacjentów i zakażonych trzema badanymi bakteriami. .
Bazując na metodzie detekcji neopteryny opisanej w pracy H3 wyznaczono jej stężenia i
porównano z metodą referencyjną (tabela 3).Wszystkie próbki były dodatkowo analizowane
niezależnie testami ELISA w celu wyznaczenia zawartości neopteryny i porównania
uzyskanych wyników z wynikami otrzymanymi metodą SERS.
Wykazano, że jednoznacznie na podstawie poziomu neopteryny w płynie mózgowordzeniowym można odróżnić próbki pacjentów zdrowych od zakażonych bakteriami,
natomiast trudno na podstawie wyznaczonego stężenia neopteryny odróżnić od siebie
poszczególne gatunki bakterii.
25
nmol/L
Kontrolna próbka
SERS
(nowa metoda)
3.8  0.7
ELISA
(metoda referencyjna)
4.0  1.3
Próbka z N. meningitidis
30.0 4.1
36.0  5.2
Próbka z S. pneumoniae
38.0 4.8
45.0  6.6
32 4.5
40.0  5.8
Próbka z H. influenzae
Tabela 3. Stężenia neopteryny w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów zainfekowanych
trzema bakteriami N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae i zdrowych, wyznaczone
metodą analizy SERS i klasycznymi testami ELISA (metoda referencyjna).
H5. A. Kamińska*, A. Kowalska, E. Witkowska, P. Albrycht, J. Waluk, „The ABO blood
groups antigen-antibody interactions studied by SERS spectroscopy: towards the blood group
typing”, Analytical Methods, 2016
W omawianej pracy wykazałam możliwość wykorzystania techniki SERS do
bezpośredniej analizy oddziaływań antygen-przeciwciało. Oddziaływania tego typu i
możliwość ich detekcji, ale przy użyciu znaczników tzw. „Raman reporterów”
zaprezentowałam w pracy H1. Wówczas, przy detekcji antygenów wirusa HBV w stężeniach
nanomolowych, zastosowanie znacznika było zasadne ponieważ
znacząco zwiększyło
czułość analizy. Zasadniczym celem postawionym w tej pracy było zrozumienie istoty
oddziaływań pomiędzy antygenami głównych grup krwi AB0 a ich przeciwciałami
znajdującymi się w surowicy krwi. Dlatego też kwestia wysokiej czułości detekcji nie była w
tych badaniach kluczowa i zastosowano technikę bezpośredniej analizy SERS.
Należy podkreślić, że obecnie metody wykorzystywane do badania swoistych
oddziaływań
antygen-przeciwciało
grup
krwi
bazują
głównie
na
technikach
immunochemicznych, które polegają na obserwacji procesów aglutynacji i posiadają swoje
ograniczenia dotyczące tak istotnych parametrów jak czułość i selektywność oznaczenia. Z
przeglądu literatury wynika również, że omawiana praca jest jak dotąd pierwszą pracą,
która pokazuje wykorzystanie spektroskopii SERS do badań oddziaływań antygenów
głównych grup krwi AB0 a ich przeciwciałami i drugą pracą naukową, która podejmuje ten
trudny a zarazem niezwykle interesujący temat badań w aspekcie identyfikacji grup krwi.
Badania prowadzono na zoptymalizowanych strukturach plazmonicznych, będących
tematem zgłoszenia patentowego: „The method of uniform coating of the silver surface by
26
electrochemically roughened gold layer with a highly developed surface and the platform for
measuring the surface-enhanced Raman effect” 2013, P-402089, E. Witkowska, S.
Arumugam, A. Kamińska, W. Adamkiewicz, J. Waluk. Własności spektroskopowe tych
hybrydowych podłoży (Ag-Au) przeanalizowałam pod kątem wzmocnienia sygnału
ramanowskiego (wyznaczono współczynniki wzmocnienia), stabilności i powtarzalności
rejestrowanych sygnałów i będę jeszcze omawiać w kolejnej pracy w prezentowanym cyklu
prac habilitacyjnych. Ich morfologię prezentuje rysunek 11B.
W pracy wykazano wpływ czasu trwania aglutynacji, pH i siły jonowej użytych
roztworów do ustalenia optymalnych warunków do tworzenia się określonych kompleksów
pomiędzy antygenami głównych grup krwi i ich przeciwciałami z surowicy krwi.
Siła aglutynacji (tworzenia kompleksów antygen – przeciwciało) zależy między
innymi od aktywności przeciwciał, co wykazano opracowując procedurę przygotowania
„mieszaniny” krwinek czerwonych o znanych: antygenie i przeciwciałach A lub B z
surowicy krwi. Wykonano serie odpowiednich rozcieńczeń przeciwciał A i B (1:8, 1:256,
1:512 i 1:1024), które mieszano z krwinkami czerwonymi w stosunku 1:1. Na podstawie
analizy spektroskopowej wybrano najbardziej optymalne rozcieńczenia przeciwciał A i B,
które wskazywały jednoznacznie na tworzenie się kompleksu antygen-przeciwciało. Rysunek
11A przedstawia przykład widm sersowskich kompleksów krwinek czerwonych o znanym
antygenie (grupa krwi B) z przeciwciałem anty B. Najbardziej dominujące pasma pochodzące
od drgań kompleksu antygen-przeciwciało zaznaczono gwiazdkami na rysunku 11A
(rozcieńczenie 1:256, które stosowano do dalszych analiz). Wnioski wysunięto na podstawie
dokonanej analizy spektroskopowej i porównań widm erytrocytów, przeciwciał i ich
mieszanin. Wykazano też, iż nawet bez zauważalnego „naocznie” procesu aglutynacji,
proponowana w niniejszej pracy metoda badań, w oparciu o technikę SERS, może dostarczyć
informacji o tworzących się kompleksach antygen-przeciwciało.
27
B)
A)
Rysunek 11. (A) Widma SERS erytrocytów krwi grupy B z przeciwciałami antyB o różnym
stężeniu przeciwciał (roztwory erytrocytów i przeciwciał zmieszano w stosunku 1:1). (B)
Obrazy SEM, przy różnych powiększeniach, hybrydowych podłoży Ag-Au stosowanych w
badaniach.
Ponadto, w pracy wykazano że analiza danych spektroskopowych z wykorzystaniem
metod numerycznych, pozwala na określenie pasm diagnostycznych i jednoznaczne
rozróżnienie, a w dalszym etapie klasyfikowanie i kategoryzowanie widm ramanowskich.
Ostatecznie pokazano możliwość wykorzystania spektroskopii SERS do identyfikacji
głównych grup krwi. Rysunek 12A przedstawia graficzne wyniki uzyskane z analizy
głównych składowych ilustrujące rozróżnienie punków (widm) należących do czterech grup
krwi z dokładnością 96%. Tak precyzyjne rozróżnienie możliwe było dzięki odpowiedniej
optymalizacji podłoży wzmacniających, która gwarantowało wysoką powtarzalność
rejestrowanych sygnałów ramanowskich, co prezentuje rysunek 12B.
Przeprowadzono również walidację opracowanego modelu PCA wprowadzając
dodatkową „zewnętrzną” próbkę o znanej grupie krwi, która po numerycznej analizie została
prawidłowo przypisana do odpowiedniego klasteru punktów, pokazując potencjał
aplikacyjny zaproponowanych badań.
28
A
A przeciwciało
B przeciwciało
B)
A przeciwciało
B przeciwciało
Współczynniki korelacji
A)
O
B
Intensity / a.u.
Raman
Intensywność
C)
800
1000
1200
1400
1600
-1
-1
Przesunięcie
ramanowskie
Raman
Shift / cm (cm )
Rysunek 12. (A) Graficzna prezentacja zależności pomiędzy wynikami PC-1 i PC-2
uzyskanymi z analizy PCA zespołu danych zawierających widma przeciwciała Azmieszanego z erytrocytami czterech głównych grup krwi układu AB0 (próbki krwi
pochodziły od 4 pacjentów a do analizy użyto 80 widm SERS). (B) Współczynniki korelacji
(liczone na podstawie średnich współczynników korelacji Pearsona) widm SERS czterech
grup krwi A, 0, AB, B z przeciwciałami A i B (w proporcjach i stężeniach zgodnych z
opracowaną w pracy procedurą). (C) Przykładowe widma erytrocytów uzyskanych z krwi o
grupie B rejestrowane z 20 różnych punków na tym samym podłożu wzmacniającym.
H6. A. Sivanesan, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, Ł. Dziewit, A. Kamińska*, J. Waluk,
„Nanostructured Silver-Gold Bimetallic SERS Substrate for Selective Identification of
Bacteria in Human Blood”, Analyst 139, 1037-43 (2014).
Hybrydowe nanostruktury Ag-Au użyte do analiz przedstawionych w pracy H5 były
modyfikowane antybiotykami i zastosowane do detekcji bakterii z krwi z wykorzystaniem
techniki SERS. Podłoża modyfikowano wankomycyną, która działa bakteriobójczo na
większość bakterii Gram-dodatnich i ceftazydymem, szczególnie aktywnym w stosunku do
bakterii Gram-ujemnych.
W pracy wykazano, że intensywność sygnałów ramanowskich analizowanych
bakterii: Escherichia coli, Salmonella enterica, Staphylococcus epidermidis i Bacillus
29
megaterium wzrasta od 4 do 5 razy w porównaniu z ich sygnałami rejestrowanymi z podłoży
niemodyfikowanych (próbka z bakteriami bezpośrednio umieszczana na podłożu), co
prezentuje poniższy rysunek 13A.
B)
A)
Rysunek 13. (A) Przykładowe widma SERS (a) E. coli, (b) S. enterica, rejestrowane
bezpośrednio z hybrydowych podłoży Ag-Au. Widma oznaczone jako a*-b* odnoszą się do
powyższych bakterii na podłożach modyfikowanych wankomycyną. (B) Obrazy SEM bakterii
(a) E. coli, (b) S. enterica, (c) S. epidermidis, and (d) B. megaterium na modyfikowanych
antybiotykiem podłożach Ag-Au.
Wykazano również, że zmodyfikowane wankomycyną podłoża Ag-Au mogą być
wykorzystywane do wychwytywania (detekcji) bakterii z zakażonej krwi ludzkiej.
Wyniki badań pokazały przede wszystkim, że jedną z podstawowych trudności w
rejestracji widm bakterii, nawet jeżeli mamy podłoże SERS-owskie gwarantujące bardzo
dobre własności spektralne rejestrowanych widm, jest immobilizacja bakterii na podłożu.
Zastosowana metoda modyfikacji podłoży antybiotykami w znaczącym stopniu ten problem
rozwiązuje, ale posiada też ograniczenia, jak chociażby wybór takich antybiotyków, które nie
dają same silnych obrazów spektralnych, co utrudniałoby lub też uniemożliwiło identyfikację
pasm charakterystycznych dla analizowanych bakterii. Dlatego też, poszukiwałam
nanostruktur metalicznych, które podtrzymywałyby rezonans plazmonowy i dawały silne
sygnały SERS, ale też jednocześnie pozwalały na immobilizację bakterii. Układy biologiczne,
które nie posiadają grup wiążących z dużym powinowactwem do podłoży Ag i Au i/lub tak
jak mikroorganizmy, np. bakterie przemieszczają się po podłożu, stwarzają tym samym duże
30
problemy w rejestracji widm SERS. Takie nowatorskie podłoża dedykowane rejestracji widm
bakterii prezentuje kolejna praca H7.
H7. T. Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk, A. Kamińska*, „Electrospun
polymer mat as a SERS platform for immobilization and detection of bacteria from fluids “,
Analyst, 139, 5061-5064 (2014).
Omawiana praca prezentuje podłoża do analiz sersowskich bazujące na pokrytych Au
matach polimerowych uzyskiwanych metodą elektroprzędzenia (maty są też dostępne
komercyjnie), które jednocześnie wzmacniają sygnał ramanowski i umożliwiają filtrację i
immobilizację bakterii z płynów ustrojowych (moczu, krwi), wody itp., szczególnie gdy ich
stężenie jest niskie.
W pracy przeanalizowano cztery rodzaje mat polimerowych wykonanych z: poli
(fluorku winylu) (PVDF), poli (L-laktydu) (PLLA) i nylonu. Wybrane materiały różniły się
między sobą gęstością, ułożeniem i rozmiarem włókien polimerowych. Oczywiście należy
podkreślić, że wymienione parametry mat są istotne ze względu na możliwość filtracji
pożądanych składników badanych analitów (o określonej wielkości), natomiast morfologia
napylonych włókien odpowiada za wielkości wzmocnień sygnału SERS. Wszystkie maty
przeanalizowano pod kątem ich własności wzmacniających zarówno dla analitu
podstawowego
–
kwasu
p-merkaptobenzoesowego
(wyznaczono
współczynniki
wzmocnienia, przeanalizowano powtarzalność rejestrowanych sygnałów) jak i wybranych
bakterii - Escherichia coli. Oprócz analizy własności spektralnych uzyskanych nanostruktur
przeanalizowano również ich wydajność do immobilizacji i filtracji komórek bakteryjnych.
Wykazano, że widma rejestrowane na matach PLLA, o strukturze zaprezentowanej na
rysunku 16, wykazywały najlepsze własności spektralne i były one używane do detekcji i
identyfikacji bakterii Escherichia coli and Staphylococcus aureus z krwi, moczu, wody itp.
Poniższy rysunek 14 prezentuje schemat zestawu (pompa próżniowa, lejek z
wbudowanym podłożem SERS-wskim), obraz SEM podłoża SERS-owskiego (maty PLLA z
bakteriami S. aureus ) i przykładowe widma SERS dwóch gatunków bakterii analizowanych
w prezentowanej pracy. W pracy przedstawiono także analizę spektroskopową widm SERS
bakterii E. coli and S. aureus i obserwowanym pasmom przypisano drgania odpowiednim
składnikom komórek bakteryjnych.
Podłoża dedykowane badaniom komórek bakteryjnych są również tematem zgłoszenia
patentowego: „The platform for testing chemicals and microorganisms via Surface Enhanced
Raman Spectroscopy and method of preparation of the platform” 2014, P-409210, T.
Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk, A. Michota – Kamińska.
31
A)
B)
C)
Rysunek 14. (A) Zdjęcie i schemat zestawu używanego do detekcji bakterii. (B) Obraz SEM
maty PLLA pokrytej 90 nm Au z komórkami bakteryjnymi Staphylococcus aureus. (C)
Przykładowe widma SERS analizowanych bakterii E. coli i S. aureus zarejestrowane na
prezentowanym podłożu.
H8. A. Kamińska, O. Inya-Agha, R. J. Forster, T. E. Keyes, „Protein compatible Metal
Nanoparticle Arrays for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy”, Chem. Chem. Phys, 10,
4172- 4175 (2008); IF = 4.49
Prace H8 i H9 to pierwsze z moich publikacji, które wpisują się w nurt badań nad
modyfikowanymi nanostrukturami plazmonicznymi do analizy układów biologicznych
techniką SERS. Praca H8 opisuje wysoce powtarzalny i łatwy sposób tworzenia
uporządkowanych dwuwymiarowych struktur bazujących na modyfikowanych bromekem
cetylotrimetyloamoniowym (CTAB) 50 nm nanocząstkach Au immobilizowanych na
waflach krzemowych (rysunek 15). Podłoża krzemowe były chemicznie modyfikowane
32
silanami (3-(aminopropyl)-3-metoksysilan) do których wykorzystując karbodiimidy jako
odczynniki
kondensujące
(1-etylo-3-[3-(dimetyloamino)
propylo]karbodiimid,
EDC)
chemicznie przyłączono długi tiol (kwas 11-merkaptoundekanowy, MUA), którego grupy –
SH wiązały nanocząsteczki Au z warstwą CTAB.
(A)
(C)
(B)
Rysunek 15. (A) Schematyczne przedstawienie etapów syntezy CTAB-Au/Si podłoży. (B)
Przykładowy obraz AFM uzyskanych struktur. (C) Widma (a) SERS białka BPTI na podłożu
CTAB-Au/Si, (b) normalne widmo Raman 45µmol roztworu BPTI e buforze, (c) SERS białka
BPTI na elektrochemicznie schropowaconym podłożu Au (bez warstwy protekcyjnej).
Morfologie uzyskanych struktur scharakteryzowano technikami AFM i SEM a analizy
ramanowskie pokazały ich własności spektralne. W pracy wykazano, że CTAB-Au/Si
podłoża są fizycznie i kompozycyjnie stabilne przed okres do 80 dni, co kontrastuje mocno
ze strukturami Au bez warstw protekcyjnych. Warstwy CTAB chronią powierzchnię
nanocząstek Au przed adsorpcją zanieczyszczeń z powietrza a chemiczne immobilizacja
nanocząstek Au na podłożu Si efektywnie blokuje rekonstrukcje powierzchni w nanoskali.
33
Zbadano także wpływ temperatury na stabilność nanocząstek Au z warstwą
protekcyjną CTAB w zakresie od 20 do 100 ºC. Wykazano, że w temperaturze powyżej 50 ºC
następują nieodwracalne zmiany w strukturze dwuwarstwy CTAB a w temperaturze powyżej
90 ºC zmiany konformacyjne w warstwie wiążącej Au do podłoża Si powodują agregację
nanocząstek Au. Wpływ temperatury na stabilność otrzymanych struktur jest szczególnie
istotny w aspekcie ich wykorzystania do dalszych badań, między innymi, dotyczących analizy
procesów denaturacji wybranych protein techniką SERS (praca H9).
W pracy wykazano, że dwu-warstwa protekcyjna CTAB na nanocząstach Au
zapewnia biomimetyczne środowisko dla badanych analitów i jednocześnie umożliwia
separację nanocząstek Au na odległościach około 10 nm, co przekłada się na wzrost
wzmocnienia sygnałów ramanowskich badanych analitów.
W niniejszej pracy przeanalizowano oddziaływania aminokwasu fenyloalaniny i
białka – inhibitora trypsyny z trzustki bydlęcej (znane jako białko BPTI) z otrzymanymi
nanostrukturami CTAB-Au/Si. Analiza widm SERS fenyloalaniny wykazała, że aminokwas
ten nie ma bezpośredniego kontaktu z powierzchnią złota (dane literaturowe wskazywały
dotąd na udział grup karboksylowych w oddziaływaniu z powierzchnią Au41) a jedynie
penetruje warstwy CTAB dając współczynniki wzmocnienia 2.6 x 104. Elektrostatyczne
oddziaływania białek z powierzchnią metalu (bez warstw protekcyjnych) prowadzi do
preferencyjnej adsorpcji na powierzchni ich pozytywnie naładowanych domen prowadząc do
zaburzenia/zniszczenia ich natywnej struktury i utraty funkcji biologicznych białek.
Zaproponowano eksperymenty sprawdzające dwie możliwe hipotezy oddziaływań BPTI z
CTAB-Au nanostrukturami: (1) silne elektrostatyczne oddziaływanie naładowanych reszt
aminokwasowych białka BPTI z warstwą pasywującą CTAB, (2) wypieranie molekuł CTAB i
zastępowanie ich przez białko BPTI. Przeprowadzona analiza danych spektralnych, a głównie
obszaru drgań S-S nie wskazuje na jego bezpośrednie wiązanie z powierzchnią Au.
Wykazano, że zaprojektowane podłoża pozwalają na analizę struktury drugorzędowej białek,
co jest znacznie ograniczone lub niemożliwe w przypadku nanostruktur Au bez warstw
protekcyjnych.
41
E. Podstawka, Y. Ozaki, L. M. Proniewicz, Appl Spectrosc., 59, 1516 (2005).
34
H9. A. Kamińska, R. J. Forster, T. E. Keyes, „The impact of adsorption of bovine pancreatic
trypsin inhibitor on CTAB-protected gold nanoparticle arrays: a Raman spectroscopic
comparison with solution denaturation”, Journal of Raman Spectroscopy, 41, 130-1334
(2009); IF = 2.67
Wykorzystując zalety opracowanych nanostruktur (publikacja H8), które okazały się
szczególnie istotne przy badaniach białek, w niniejszej pracy kontynuowano analizę
modelowego białka BPTI w aspekcie strukturalnych konsekwencji wynikających z jego
adsorpcji na podłożu CTAB-Au/Si.
Dowiedziono (na podstawie analizy drgań z obszaru odpowiadającego pasmom
amidowym I i II rzędowym), że adsorpcja BPTI (z 10 µmol roztworu buforowego o pH = 7.4)
na modyfikowanych dwuwarstwami CTAB nanocząstek Au prowadzi do zmian w
drugorzędowej strukturze tego białka, tj. do wzrostu konformacji -kartki. Względna
intensywność pasma drgań rozciągających disiarczków jest w przybliżeniu taka sama dla
BPTI w roztworze (normalne widmo Ramana) i po adsorpcji na nanostrukturach, wskazując,
że reszty cysteiny nie uczestniczą w bezpośrednim wiązaniu białka do powierzchni Au a silne
wzmocnienie modów CH i CC aromatycznych łańcuchów bocznych wskazuje, że mogą one
preferencyjnie interkalować do warstw CTAB.
W omawianej pracy zaprezentowano również możliwość wykorzystania spektroskopii
Ramana do badań nad procesami zwijania i rozwijania białek, które dostarczają istotnych
informacji na temat struktury białek, oddziaływań molekularnych w białkach i zrozumienia
ich funkcji biochemicznych. Procesy zwijania białka indukowano ditiotreitolem (DTT), który
powoduje redukcję mostków disiarczkowych oraz termalnie, poprzez wzrost temperatury
(rysunek 16) i wykazano istotne różnice w zmianach strukturalnych BPTI wywołanych tymi
dwiema metodami.
35
A)
B)
Rysunek 16. (A) Widma SERS (obszar 3350-2350cm-1) białka BPTI immobilizowanego na
CTAB-Au/Si strukturach przed (a) i (b) po denaturacji DTT.
2.5.
Podsumowanie
Najważniejsze osiągnięcia badawcze opisane w prezentowanym cyklu prac.
1. Analiza oddziaływań antygenów i przeciwciał wirusa HBV (wywołującego przewlekłe
zapalenie wątroby typu B), zaprojektowanie nowej „immuno-sondy” i nanostruktur
plazmonicznych, co w efekcie pozwoliło na opracowanie czułego, selektywnego i
dającego powtarzalne analizy immunosensora do detekcji antygenów HBsAg
wirusa HBV.
2. Analiza oddziaływań antygenów głównych grup krwi ABO i ich przeciwciał,
zaprojektowanie
hybrydowych
nanostruktur
Ag-Au
wzmacniających
sygnały
ramanowskie oraz wprowadzenie chemometrycznych analiz numerycznych do
uzyskanych danych spektralnych pokazały możliwość użycia techniki SERS do
rozróżniania podstawowych grup krwi AB0.
3. Analiza oddziaływań neopteryny (markera chorób bakteryjnych i immunologicznych)
z nanostrukturami metalicznymi. Pokazanie, po raz pierwszy, możliwości użycia
36
techniki SERS do detekcji tego markera z osocza krwi i płynu-mózgowo
rdzeniowego (opracowanie metody detekcji jakościowej i ilościowej).
4. Wykazanie zależności między poziomem neopteryny w próbkach klinicznych płynu
mózgowo-rdzeniowego a określoną infekcją bakteryjną.
5. Opracowanie metody (a szczególnie nowatorskich podłoży, które pozwalają nie tylko
na wzmocnienie sygnału Ramana ale także na filtrację i immobilizację pożądanych
składników płynów ustrojowych) detekcji i identyfikacji wybranych gatunków
bakterii, w tym bakterii powodujących zakażenia monitorowane jednocześnie pod
kątem poziomu stężenia neopteryny.
6. Przeprowadzenie oceny klinicznej skuteczności proponowanej metody detekcji
neopteryny (próbki kliniczne analizowane metodą referencyjną ELISA).
7. Określenie struktury białka modelowego inhibitora trypsyny (BPTI) po adsorpcji na
zaprojektowanych podłożach wzmacniających (zmodyfikowanych dwu-warstwą
CTAB) oraz wykazanie możliwości wykorzystania techniki SERS do badań nad
procesami zwijania tego białka.
8. Wykazanie możliwości integracji nanostruktur wzmacniających z układami
mikrofluidycznymi, co umożliwia precyzyjną kontrolę procesów modyfikacji
nanostruktur i poprawę parametrów spektralnych rejestrowanych widm, głównie
powtarzalności rejestrowanych sygnałów SERS.
9. Wykazanie potencjału zastosowania chemometrycznych metod numerycznych
(analiza głównych składowych; PCA) do analizy danych spektralnych – wyznaczanie
pasm diagnostycznych, rozróżnianie zbiorów danych. Pokazano np. możliwość
rozróżnienia próbek płynu-mózgowo rdzeniowego od pacjentów zdrowych i
zainfekowanych bakteriami Neisseria meningitides z 98% specyficznością i 95%
czułością.
10. Opracowanie serii nanostruktur plazmonicznych (rysunek 17) wzmacniających
sygnały Ramana pod kątem ich potencjalnych zastosowań dla analizowanych
układów biologicznych (np. zaprojektowano specjalne podłoża wzmacniające do
37
analiz bakterii z płynów, szczególnie z próbek o niskim stężeniu tych
mikroorganizmów). Struktury GaN/Au i Si/ZnO/Au zostały opracowane we
współpracy z Instytutem Wysokich Ciśnień i Instytutem Fizyki PAN w Warszawie.
Si/ZnO/Au
Zgłoszenie
patentowe-406026
osadzania warstw
atomowych (ang.
ALD) + fizyczne
osadzanie z fazy
gazowej
(ang. PVD )
Współczyn
nik
wzmocnieni
a (ang. EF)
Stabilność
w czasie
Współczy
nnik
korelacji,
Г
Ag/Au
Polimer/Au
Zgłoszenie
patentowe-402089
Zgłoszenie
patentowe406900
szlifowanie +
cykle utlenianiaredukcji +
elektroosadzanie
elektroprzędzenie
+ fizyczne
osadzanie z fazy
gazowe
(ang. PVD)
GaN/Au
Patent, 219706
(2014) Poland;
Patent UA 109104
(2014), Ucraine
Patent US
8,531,660 (2014)
USA;
fototrawienie +
fizyczne osadzanie
z fazy gazowej
(ang. PVD)
Membrany/
Ag-Au
-----------------------
membrany z
poliwęglanu +
fizyczne osadzanie z
fazy gazowej (ang.
PVD)
Własności spektralne ( dla kwasu p-merkaptobenzoesowego)
104 –107
105– 106
105– 106
104– 107
104– 106
do 1 miesiący
do 1 miesiąca
do 2 miesiący
do 3 miesiący
do 3 miesięcy
0.87-0.9
0.80-0.87
0.65-0.86
0.85-0.92
----------------------------
Rysunek 17. Obrazy SEM opracowanych nanostruktur wzmacniających, opisanych w cyklu
prac składających się na habilitację i najważniejsze parametry spektralne uzyskiwanych na
nich widm SERS.
38
2.6.
Przyszłe plany badawcze.
Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana jest techniką, która w ostatniej
dekadzie jest coraz częściej wykorzystywana w kierunku badań biologicznych i medycznych.
O potencjale tej metody świadczy liczba manuskryptów o tej tematyce - wprowadzenie
akronimu „SERS” do bazy ISI Web of Science, daje wynik prawie 1800 artykułów na rok
2015. W mojej dalszej pracy naukowej planuję przyczynić się do poszerzenia obszarów badań
biomedycznych wykorzystujących technikę SERS.
Moim celem badawczym będzie zbadanie oddziaływań wybranych markerów
immunologicznych (tj. wybranych cytokin IL6, IL8 i IL18) i ich przeciwciał, zarówno w
roztworach buforowych jak i płynach ustrojowych, do ustalenia optymalnych warunków
tworzenia się określonych immuno-kompleksów w użytych roztworach, tj. temperatury, pH i
siły jonowej oraz orientacji przestrzennej immobilizowanych przeciwciał z wykorzystaniem
zaprojektowanych i zoptymalizowanych struktur plazmonicznych.
Badania te pozwolą na zrozumienie procesów związanych z oddziaływaniami
antygen-przeciwciało i zrozumienia złożonych interakcji między tymi cząsteczkami i
strukturami plazmonicznymi. Uzyskana wiedza i wnioski mogą posłużyć do tworzenia
praktycznych prototypów sensorów immuno-markerów w analizach klinicznych. Planuję
kontynuować współpracę ze środowiskiem medycznym, aby zaprojektowane badania miały
charakter interdyscyplinarny i aby przed wszystkim były odpowiedzią na rzeczywiste
problemy związane z analizą badanych układów biologicznych.
Drugi główny kierunek badań, który chcę poszerzać rozwijać to wykorzystanie
techniki SERS w analizie, detekcji i identyfikacji mikroorganizmów tj. bakterii (wybrane
gatunki, zarówno Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne, będące przyczyną zakażeń
oportunistycznych oraz przewodu pokarmowego) oraz grzybów (wywołujących dermatozy).
W tych badaniach zostanie podjęty temat poznania czynników, które mają istotny wpływ na
widmo SERS badanych mikroorganizmów oraz na wzmocnienie tego sygnału. Czynniki te
możemy pogrupować na: (i) związane z warunkami/rodzajem hodowli i sposobem
przygotowania próbki oraz (ii) te które odnoszą się do platform i parametrów stosowanych
podczas pomiarów SERS. Szybka identyfikacja mikroorganizmów pozwoliłaby na podjęcie
odpowiednich działań w kierunku opracowania nowych i szybkich metod diagnostycznych
stosowanych np. w szpitalach oraz w laboratoriach analitycznych i mikrobiologicznych.
39
3.
OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH
BADAWCZYCH
3.1.
Przebieg pracy naukowej.
OSIĄGNIĘĆ
NAUKOWO
–
Badania naukowe prowadzone przed uzyskaniem stopnia naukowego doktora.
Już od czasów szkolnych chemia była moją pasją. Znalazło to swoje odzwierciedlenie
w wyborze kierunku kształcenia w I Liceum Ogólnokształcącym w Kraśniku o profilu
biologiczno-chemicznym, a następnie na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego.
Podczas studiów magisterskich a następnie doktoranckich w Pracowni Oddziaływań
Międzymolekularnych UW, rozwijałam swoją pasję badawczo-naukową w zakresie
spektroskopii molekularnej a głównie spektroskopii Ramana. W tym czasie moje badania
naukowe skupiały się na wytwarzaniu i analizie ramanowskiej samoorganizujących się
monowarstw tiolowych (ω-funkcjonalizowane alkanotiole, (HS-(CH2)n-X) na aktywnych
podłożach SERS-owskich bazujących na elektrochemicznie chropowaconym Ag i Au.
Wytworzone monowarstwy tiolowe o określonej strukturze były kolejno wykorzystywane
jako „element” łączący różne związki organiczne i układy biologiczne takie jak barwniki czy
Cytochrom C do powierzchni metalicznych. Analiza ramanowska w połączeniu z
technikami elektrochemicznymi, SEM i spektroskopią w podczerwieni wykazała, że
struktura monowarstw dwufunkcyjnych tioli zależy od rodzaju substratu (podłoża SERSowskiego), na którym prowadzony jest proces samoorganizacji, stężenia i pH roztworu
modyfikującego czy czasu inkubacji warstwy tiolowej na podłożu. Wykazano, że cysteamina
adsorbuje się na powierzchni metalu w dwóch formach: konformacji gauche (w
oddziaływanie z powierzchnią zaangażowany jest jeden atom siarki z grupy tiolowej jak i
grupa aminowa) i w konformacji trans (wiązanie do powierzchni metalu następuje tylko przez
atom siarki). Wyniki badań pokazały, na przykład bardzo silną zależność struktury
monowarstw cysteaminy od powierzchniowej koncentracji preadsorbowanych chlorków,
pojawiających się na podłożach Ag podczas procesu przygotowywania tych powierzchni do
badań SERS. Ten czynnik nigdy jeszcze w badaniach nad tiolami nie był brany pod
uwagę. Po raz pierwszy, wykazano także wpływ elektrolitów zawierających aniony ClO 4 – i
SO42- i kationy Cu2+, Ni2+, Co2+ na zmiany konformacyjne molekuł cysteaminy. Wyniki tych
prac wchodziły w treść mojej pracy doktorskiej i zostały opublikowane w renomowanych
czasopismach (Załącznik 4, publikacje nr 1, 2, 4) a także były prezentowane na
międzynarodowych konferencjach. Za jedno z najważniejszych osiągnięć naukowych z tego
okresu
uważam
wyjaśnienie
mechanizmów
40
adsorpcji
molekuł
kwasu
p-
merkaptobenzoesowego (p-MBA) na podłożach Ag i Au. Molekuły p-MBA adsorbują się
silnie na powierzchni Ag i Au. Sposób oddziaływania tych molekuł z powierzchnią i ich
orientacja silnie zależy od stężenia tego tiolu w roztworze, z którego następuje modyfikacja,
jego pH czy czasu adsorpcji. Niskie stężenie roztworu modyfikującego lub wysokie stężenie
pH (pH≈1) prowadzą do płaskiej orientacji molekuł p-MBA na powierzchni Ag i Au, gdzie
oddziaływanie z powierzchnią metalu zachodzi jednocześnie przez atom siarki i grupę COO- .
Do bardziej uporządkowanych monowarstw z prostopadle (w stosunku do powierzchni
metalu) ułożonymi molekułami p-MBA, stabilizowanych poprzez wewnątrzmolekularne
wiązania wodorowe pomiędzy grupami COOH prowadzi modyfikacja Ag i Au w zasadowych
roztworach p-MBA (pH≈10). Oddziaływanie grup karboksylowych z powierzchnią metalu
prowadzi do dekarboksylacji molekuł p-MBA z utworzeniem molekuł tiofenolu. Główną rolę
w tym procesie odgrywają „chropowatości” (prawdopodobnie w postaci małych klastrów
metalu) obecne na powierzchni. Obniżenie wartości pH roztworu, z którego następuje
adsorpcja zapobiega destrukcji monowarstw p-MBA na powierzchni Ag i Au. Wyniki tych
badań zostały opublikowane w pracy, która ma 230 cytowań (Załącznik 4, publikacja nr 6).
P-MBA jest obecnie bardzo szeroko wykorzystywane jako „analit podstawowy” do badania
własności spektroskopowych otrzymywanych podłoży SERS-owskich.
Po obronie pracy doktorskiej przez dwa lata kontynuowałam badania struktury
monowarstw tiolowych i ich potencjalnych zastosowań jako warstw łącznikowych, a ich
wyniki zostały również opublikowane (Załącznik 4, publikacje nr 7-9). Samoorganizujące się
monowarstwy tiolowe o odpowiedniej strukturze i właściwościach były z dużym
powodzeniem wykorzystywane do immobilizacji enzymów lakazy, tyrozyny i oksydazy
galaktozowej, co przedstawiają wyniki doświadczeń opisanych w publikacjach nr 8-12 i 27
(Załącznik 4).
41
Badania
naukowe
prowadzone
po
uzyskaniu
stopnia
naukowego
doktora
nieuwzględnione we wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego.
Moje zainteresowania naukowe oraz doświadczenie w stosowaniu spektroskopii
Ramana a głównie techniki SERS do analizy oddziaływań międzymolekularnych warstw
tiolowych, zdobyte podczas pracy naukowej na Wydziale Chemii UW, miałam możliwość
wykorzystać i poszerzyć podczas stażu post-doktorskiego na Uniwersytecie w Dublinie, w
grupie prof. Roberta Forstera. Prowadzone przeze mnie badania dotyczyły głównie
opracowania nowych nanostruktur wzmacniających sygnał ramanowski do analiz układów
biologicznych takich jak aminokwasy i białka. Wyniki tych badań, zostały opisane w
rozdziale 2.4. W tym okresie, w nauce, nastąpił bardzo silny rozwój technik do wytwarzania
nanomateriałów, które z dużym powodzeniem były wykorzystywane do fabrykacji aktywnych
SERS-osko podłoży. Coraz lepsze własności spektralne otrzymywanych nanostruktur
otworzyły możliwości analiz sersowskich nie tylko prostych związków nieorganicznych i
organicznych ale także złożonych układów biologicznych czy nawet mikroorganizmów.
Od tego czasu moja aktywność naukowa skupiła się na opracowaniu aktywnych-SERS-owsko
podłoży dedykowanych analizie konkretnych związków i ich optymalizacji pod kątem
potencjalnych zastosowań aplikacyjnych. W roku 2008, po powrocie ze stażu postdoktorskiego, podjęłam pracę w Instytucie Chemii Fizycznej PAN w Warszawie na
stanowisku adiunkta i wkrótce przystąpiłam do realizacji grantu Ministerstwa Nauki i
Szkolnictwa Wyższego „Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe do zastosowań w
biologii i medycynie” (POIG.01.01.02-00-008/08) jako vice-lider i wykonawca jednego z
głównych zadań projektu: „Opracowanie podstaw budowy sensora przeciwciał na bazie
powierzchni GaN i ZnO modyfikowanej polipeptydami”. Prowadzone w ramach projektu
prace badawcze dotyczyły opracowania nowatorskich podłoży wzmacniających bazujących
na warstwach GaN i ZnO pokrytych metalami Ag i/lub Au do detekcji określonych
przeciwciał z płynów ustrojowych. Badania nad otrzymywaniem i optymalizacją podłoży
GaN prowadziłam we współpracy z Instytutem Wysokich Ciśnień. Wyniki tych badań
przedstawiają prace nr 20, 24, 26 (Załącznik 4) nie ujęte w cyklu prac habilitacyjnych.
42
Istotnym osiągnięciem moich badań naukowych było wykazanie możliwości
wykorzystania techniki SERS do detekcji neurotransmiterów. Badania prowadziłam między
innymi w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego, Iuventus plus:
„Detekcja neurotransmiterów z wykorzystaniem platform do powierzchniowo wzmocnionej
spektroskopii Ramana bazujących na nanocząsteczkach Au”, którego byłam kierownikiem.
Opracowane, we współpracy z innymi badaczami, nanostruktury wzmacniające do
analiz spektroskopowych bazowały na nanocząstkach Au elektroosadzanych na warstwach
ITO (Au/ITO) oraz na tzw. mikrokwiatach Au (AuMFs) sedymentujących na podłożach Si.
Otrzymane podłoża (Au/ITO) charakteryzowały się wysokimi współczynnikami wzmocnienia
(EF=106 dla kwasu p-MBA i 104 dla acetylocholiny). Dawały także silne i powtarzalne obrazy
spektralne także dla dopaminy, choliny, epinefryny i melaniny. Dla wszystkich zbadanych
neurotransmiterów dokonano analizy spektroskopowej uzyskanych widm (przypisanie
obserwowanych pas odpowiednim drganiom). Wyniki tych badań prezentuje praca nr 22
(Załącznik 4).
Publikacja nr 19 (Załącznik 4) opisuje syntezę, wspomnianych już, nowych złotych
cząstek o rozgałęzionej, silnie pofałdowanej strukturze – mikrokwiaty Au (AuMFs). Są to
cząstki o średnicy 1 - 3 µm otrzymywane w reakcji kwasu chloroaurikowego (HAuCl4) i
chlorowodorku hydroksyloaminy (NH2OH·HCl) w środowisku wodnym. Wykazano, że
morfologią tych struktur można łatwo sterować poprzez odpowiedni dobór proporcji molowej
reagentów oraz czasu reakcji. W publikacji zaprezentowano zarówno sposób otrzymywania
AuMFs i kinetykę autokatalitycznej reakcji ich syntezy, jak i sposób pokrywania powierzchni
ciał stałych mono-lub wielowarstwą tych złotych mikrostruktur. Analizę spektralną tych
podłoży wykonałam dla kwasu p-merkaptobenzoesowego (p-MBA) oraz bakteriofaga λ, które
wykazały doskonałą powtarzalność nowych platform, a współczynnik wzmocnienia
wyznaczony dla p-MBA wyniósł 106.
Jeden z ciekawszych i ważnych aspektów moich badań dotyczy możliwości
wykorzystania techniki SERS do detekcji mutacji w genie BRC-ABL związanym z
występowaniem przewlekłej białaczki szpikowej. Badania były prowadzone we współpracy z
Prof. Jakubem Gołąbem z Uniwersytetu Medycznego w Warszawie w ramach kierowanego
przeze mnie grantu Fundacji Nauki Polskiej, POMOST: „Platformy SERS w diagnostyce
molekularnej”. Opracowana w trakcie tych badań metoda detekcji mutacji, opierała się na
rejestracji sygnałów SERS immobilizowanych na platformach cząsteczek DNA (nici DNA
komplementarne i nici nie komplementarne z mutacjami genu BCR-ABL) w trakcie ich
rehybrydyzacji indukowanej potencjałem lub temperaturą. Dodatkowo aby zwiększyć czułość
43
i specyficzność rejestrowanych sygnałów użyto jako znacznika Zieleni Malachitowej.
Otrzymane wyniki otwierają nową drogę do szybkiego wykrywania mutacji DNA, co ma
zasadnicze znaczenie dla wczesnej diagnostyki, profilaktyki i leczenia chorób. Praca nr 1
(Załącznik 4, I.C.) pokazuje możliwość rozróżnienia mutacji punktowych z wykorzystaniem
opisanej wyżej metody.
Na uwagę zasługuje praca nr 29 (Załącznik 4) pokazująca możliwości
zidentyfikowania aminokwasów z ich mieszanin. Praca ta pokazuje ogromny potencjał
techniki SERS, połączonej z analizami numerycznymi rejestrowanych spektrogramów, do
identyfikacji poszczególnych składników z mieszanin. We wspomnianej pracy, na 20
przebadanych mieszanin aminokwasów, ich skład zidentyfikowany został poprawnie w 18
przypadkach.
W ramach prowadzonych przez zemnie badań, wraz z innymi badaczami
opracowaliśmy nowatorską metodę wyznaczania współczynnika wzmocnienia sygnału
Ramana (EF), co opisuje artykuł nr 32 (Załącznik 4). Współczynnik wzmocnienia jest
niezmiernie istotnym parametrem charakteryzujący jedną z podstawowych własności podłoży
SERS-owskich - czułość. Technika SERS jest „krytykowana” głównie za brak dobrej i
uniwersalnej metody wyznaczania wartości współczynnika wzmocnienia. W omawianej pracy
zaprezentowano, nowe podejście do jego ilościowego oznaczenia, bazujące na wykorzystaniu
zjawisk: rezonansowej spektroskopii Ramana (RRS, ang. rezonanse Raman spectroscopy),
powierzchniowo wzmocnionej rezonansowej spektroskopii Ramana (SERRS, ang. SurfaceEnhanced Resonance Raman Spektroscopy) oraz wykorzystaniu molekuł ulegających
reakcjom redox i jednocześnie mających silne pasma adsorpcji przy 750 nm (takich jak: 4αCoIITAPc czyli 1,8,15,22-tetra-amino-ftalocyjanina kobaltu (II)). Opracowana metoda
wyznaczania współczynnika wzmocnienia może być stosowany do każdego rodzaju podłoża
SERS, wybierając odpowiednią linię lasera oraz odpowiednią molekułę jako sondę.
Chciałabym również podkreślić, że w swoich badaniach nad projektowaniem,
wytwarzaniem i analizą nanostruktur wzmacniających sygnały SERS, nie ograniczyłam się
tylko do podłoży bazujących Ag i Au, które są najczęściej stosowane do fabrykacji
aktywnych podłoży SERS-owskich, ale w pracy nr 33 (Załącznik 4), wraz z innymi
badaczami, wykazałam dobre własności spektralne podłoży bazujących na miedzi, tj. wysoki
współczynnik wzmocnienia, EF=106 dla kwasu p-MBA i powtarzalność rejestrowanych
sygnałów. Podłoża te wykazywały również zadawalające wzmocnienia widm bakterii E. coli.
W czasie badań naukowych prowadzonych w ramach Grantu Narodowego Centrum
Badań i Rozwoju: „Opracowanie komercyjnej metody produkcji podłoży SERS do ultra44
czułych i szybkich analiz biomedycznych" skupiłam się na możliwości wykorzystania
techniki SERS do detekcji bakterii z produktów spożywczych. Badania wykazały, że technika
SERS może być wykorzystana jako alternatywna metoda do szybkiej detekcji i identyfikacji
bakterii z produktów żywnościowych(ryby, mięso, zioła, mleko) a opracowana metoda
detekcji może być z dużym powodzeniem wprowadzona do norm ISO zamiast zazwyczaj
stosowanych testów biochemicznych. Wykazano, czas identyfikacji bakterii z gatunku
Salmonella spp, Cronobacter spp oraz Listeria monocytogenes, z zachowanie norm ISO,
został skrócony z 5-6 dni do 2-3 po wprowadzeniu techniki SERS do ścieżki
identyfikacyjnej. Wyniki eksperymentów pokazują, że łącząc technikę SERS z metodami
chemometrycznymi takimi jak np. PCA (analiza głównych składowych) można odróżnić od
siebie, w krótkim czasie, dwa gatunki patogenne z rodzaju Listeria: L. monocytogenes i L.
ivanovii. Odróżnienie od siebie tych dwóch gatunków patogennych, których kolonie
wyglądają identycznie, metodami klasycznymi (testy biochemiczne, PCR) jest trudne i
wymaga dodatkowych czasochłonnych analiz.
Ostatnie wyniki badań wyraźnie wskazują na ogromne możliwości techniki SERS w
badaniach aplikacyjnych i wskazują, że potencjał i przyszłość tej techniki tkwi w jej
połączeniu z metodami chemometrycznymi.
Wykaz rozdziałów w monografiach.
1. T. Roliński, S. Gawinkowski, A. Kamińska, J. Waluk, „Raman Spectra of Solid
Aminoacids: Spectral Correlation Analysis as the First Step Towards Identification by
Raman Spectroscopy”, In Optical Spectroscopy and Computational Methods in Biology
and Medicine, edited by Barańska, M. Dordrecht: Springer Science+Business Media,
2014.
3.2.
Wykaz patentów i zgłoszeń patentowych.
Przyznane patenty
1P. Platform for Surface Enhanced Raman Spectroscopy, Patent, 219706 (2014) Poland; IN564/MUM/2011 India; Patent UA 109104 (2014), Ucraine; RU 20111110372 Russia; Patent
US 8,531,660 (2014) USA; I. Dzięcielewski, R. Hołyst, A. Kamińska, S. Porowski, T. Suski,
J. Weyher.
Przedmiotem wynalazku jest platforma do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego
efektu Ramana (SERS) obejmująca powierzchnię azotku zawierającego gal, pokrytą metalem
wybranym spośród złota, srebra, platyny, miedzi i/lub ich stopów. Opracowane platformy
45
bazują na powierzchni azotku, rozwiniętej techniką foto-trawienia z wykorzystaniem platyny
jako katalizatora w ten sposób, że tworzą się wąsy z azotku zawierającego gal, wewnątrz
których znajdują się defekty liniowe, ewentualnie zebrane w pęczki, pokryte następnie
warstwą odpowiedniego metalu (osadzanie „electroless” z roztworów oraz naparowanie w
próżni). Otrzymane platformy charakteryzują się wysoką powtarzalnością morfologiczną
budujących je nanostruktur, co zapewnia wysoką powtarzalność uzyskanych sygnałów SERS
- jednego z najistotniejszych parametrów stawianych przed podłożami do analiz
ramanowskich.
2P. Method for deposition of metal nanoparticles onto surface, the surface obtained by this
process and its use, countries: Patent CH 703728, 2014, Switzerland; PL 220942, 2014,
Poland J. Niedziółka-Jonsson, I. Kamińska, A. Michota-Kamińska, M. Opałło, R. Hołyst.
Przedmiotem wynalazku jest sposób osadzania nanocząstek metalu na powierzchni
elektrody, powierzchnia w ten sposób pokryta oraz jej zastosowanie jako platformy do
pomiarów metodami wykorzystującymi rezonans plazmonów powierzchniowych, tj.
powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS) oraz zlokalizowanego rezonansu
plazmonów powierzchniowych (ang. Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR).
3P. Method of hydrophilic coating of solid gold layer with a developed surface, Patent219899, Poland, 2014, Patent CH 703612, 2014, Switzerland, K. Winkler, M. Fiałkowski, A.
Kamińska, R. Hołyst.
Przedmiotem wynalazku jest metoda pokrywania powierzchni hydrofilowych ciał
stałych (metali, półprzewodników i dielektryków), w szczególności krzemu, szkła, tlenku
indowo-cynowego (ITO), aluminium i azotku galu, złotymi strukturami o silnie rozbudowanej
powierzchni, zwanymi dalej złotymi „nano-kwiatami” lub „mikro-kwiatkami”. W metodzie
według wynalazku stosuje się roztwory wodne kwasu tetrachlorozłotowego i chlorowodorku
hydroksyloaminy.
4P. Application of borohydride for purification of the Surface Enhanced Raman Spectroscopy
platforms containing a layer of gold, Patent; CH 703842, 2014, Switzerland, V. Sashuk, A.
Kamińska, R. Hołyst, M. Fiałkowski.
Przedmiotem wynalazku jest chemiczna metoda regeneracji platform do pomiarów
pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (Patent, 219706 (2014),A.
Kamińska, R. Hołyst, J. Weyher, I. Dzięcielewski, T. Suski, S. Porowski „Powierzchnia do
pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana) w celu wielokrotnego ich użycia.
Dotychczasowe, dostępne handlowo podłoża do pomiarów SERS są materiałami
jednorazowego użytku. Regeneracja platform do pomiarów SERS ma ogromne znaczenie ze
względów ekonomicznych. Opracowano skuteczną chemiczną metodę regeneracji platform
bazującą na wodnych lub wodno-alkoholowych roztworach zawierającego utleniacz lub
reduktor z/bez regulatorów pH. W jednym z przykładów realizacji wynalazku wspomniany
roztwór jest roztworem wodnym amoniaku i wody utlenionej czy też wodnym roztworem
nadsiarczanu amonu. Regeneracja platform do pomiarów SERS głównie sprowadza się do
czyszczenia, czyli usunięcia różnorodnych obiektów pochodzenia chemicznego lub
46
biologicznego z powierzchni podłoża (molekuł zaadsorbowanych chemicznie lub fizycznie na
powierzchni).
5P. The solid surface covering method by two-dimensional network of nanoparticles and a
solid surface covered by this mehtod, Patent, PL 218683, Poland (2015), J. Paczesny, K.
Sozański, A. Żywociński, W. Adamkiewicz, I. Dzięcielewski, K. Winkler, A. Kamińska, R.
Hołyst.
Przedmiotem wynalazku jest metoda pokrywania powierzchni ciała stałego dwuwymiarową
siecią nanocząstek z wykorzystaniem techniki Langmuira-Blodgett. Odpowiednio
przygotowana mieszani nananocząstek oraz związku ciekłokrystalicznego 8CB (4’-n-oktylo4-cyjanodifenyl) po naniesieniu na powierzchnię wody tworzy dwuwymiarową sieć
nanocząstek, w której wielkość komórki sieciowej można łatwo kontrolować. Wynalazek
dotyczy również sposobu na dobranie optymalnych parametrów prowadzenia procesu dla
uzyskania sieci o określonej morfologii. Wynalazek obejmuje także powierzchnię ciała
stałego pokrytą tym sposobem.
6P. SERS measurement platform and a method for its manufacture, Patent CH 703728 (2015)
Switzerland, Patent PL 218683, Poland, J. Paczesny, K. Sozański, A. Żywociński, W.
Adamkiewicz, I. Dzięcielewski, K. Winkler, A. Kamińska, R. Hołyst.
Przedmiotem wynalazku jest stabilna i efektywna powierzchnia do wykorzystania w
powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii rozpraszania ramanowskiego (SERS).
Zbudowana jest z mikrokwiatków złota (Au MFs) osadzonych na podłożu pokrytym
nanodrutami azotku galu (GaN). Do przygotowania takiej platformy wykorzystano
trójetapowy proces. W pierwszym etapie na stały substrat nanoszona jest, z wykorzystaniem
techniki Langmuira-Blodgett (LB), dwuwymiarowa sieć nanocząstek złota (Au NPs). Etap
drugi to wzrost nanodrutów azotku galu (GaN) z wykorzystaniem metody chemical vapor
deposition (CVD). Ponieważ w procesie CVD złoto odgrywa rolę katalizatora, nanodruty
GaN powstają tylko w miejscach, gdzie w etapie pierwszym osadzone były Au NPs. Trzeci
etap to depozycja mikrokwiatków złota, które osadzają się preferencyjnie na nanodrutach
GaN, a nie w przestrzeniach pomiędzy nimi. Tak przygotowana powierzchnia jest stabilna
mechanicznie i w czasie oraz wykazuje znakomite własności jako podłoże do SERS.
Wynalazek dotyczy również sposobu na dobranie najbardziej pożądanych parametrów
przeprowadzenia każdego z etapów.
7P. Method for depositing metal nanoparticles on the surface and platform to the
measurements SERS or LSPR, Patent, PL 220820, Poland, Patent NL 2009442, 2014,
Netherlands, M. Siek, J. Niedziółka-Jönsson, M. Opałło, A. Kamińska, A. Kelm, R. Hołyst
Zgłoszenia patentowe.
8P. Method of fabricating copper platform for surface-enhanced Raman scattering
measurements and copper platform for surface enhanced Raman scattering measurement,
2013, P-404988 Poland, A. Kowalska, A. Michota-Kamińska, W. Adamkiewicz, M. Tkacz.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymania platform z miedzi do pomiarów
47
powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, charakteryzujący się tym, że obejmuje
etapy, w których wodorek miedzi poddaje się redukcji w wyniku procesu prasowania pod
zwiększonym ciśnieniem, dodatkowo otrzymaną platformę poddaje się czyszczeniu za
pomocą stężonego kwasu octowego. Wynalazek obejmuje również platformę z miedzi do
pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, uzyskaną powyższym sposobem,
szczególnie do pomiarów żywych komórek, w której wielkość krystalitów miedzi wynosi 30
– 120 nm, i w której krystality miedzi rozmieszczone są równomiernie w objętości i na
powierzchni platformy.
9P. The method of uniform coating of the silver surface by electrochemically roughened gold
layer with a highly developed surface and the platform for measuring the surface-enhanced
Raman effect, in particular for bacteria, 2013, P-402089,Poland, E. Witkowska, S.
Arumugam, A. Kamińska, W. Adamkiewicz, J. Waluk.
Przedmiotem wynalazku jest sposób równomiernego pokrywania schropowaconej
elektrochemicznie powierzchni srebra warstwą złota o wysoce rozbudowanej powierzchni,
charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące kroki: a) elektrochemiczne chropowacenie
elektrody Ag drogą woltamperometrii cyklicznej w roztworze soli, z wytworzeniem szorstkiej
elektrody Ag; (b) utworzenie ogniwa elektrochemicznego w roztworze zawierającym
rozpuszczalne sole złota, w którym elektrodą pracującą jest właśnie schropowacona elektroda
Ag, (c) elektroosadzanie nanostruktur złota na podłożu srebrnym prowadząca do otrzymania
złoto-srebrnych hybryd.
10P. A method for preparing a platform for testing of chemicals via surface-enhanced Raman
spectroscopy (SERS) and platform obtained by this method, 2013, P-406026, Poland,
E. Guziewicz, D. Snigurenko, T. Szymborski, E. Witkowska, and A. Kamińska-Michota.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania platformy do badań substancji
chemicznych techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i otrzymana
tym sposobem platforma. Bardziej szczegółowo, wynalazek ujawnia nową powierzchnię do
analizy wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana (SERS) bazującą na warstwie
tlenku cynku otrzymaną metodą osadzania warstw atomowych (ALD), o wysoce
rozbudowanej powierzchni, pokrytej złotem.
11.P. The platform for testing chemicals and microorganisms via Surface Enhanced Raman
Spectroscopy and method of preparation of the platform. 2014, P-409210,Poland,
T. Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk, A. Michota - Kamińska
Przedmiotem wynalazku jest platforma do badań substancji chemicznych oraz
mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób
jej otrzymywania. Wynalazek ujawnia nową powierzchnię do analizy wzmocnionej
powierzchniowo spektroskopii Ramana bazującą na warstwie nano-włókien polimerowych
wykonanej techniką „force - spinning”, o wysoce rozbudowanej powierzchni, pokrytej
złotem.
48
12.P. The method of the detection of bacteria: Salmonella spp, Cronobacter spp and Listeria
monocytogenes from food samples, 2016, P-416927, Poland, E. Witkowska, D. Korsak, M.
Księżopolska- Gocalska, A. Michota – Kamińska
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest metoda wykrywania bakterii z rodzaju Salmonella
spp, Cronobacter spp. i Listeria monocytogenes w produktach żywnościowych (np. łososiu,
jajkach, mleku w proszku - mieszanka dla niemowląt, mieszankach ziół), w tym procedura
odróżniająca L. monocytogenes od L. ivanovii przez połączenie techniki powierzchniowo
wzmocnionej spektroskopii Ramana z analizą głównych składowych (PCA).
3.4. Nagrody i wyróżnienia
Srebrny Medal:
42-nd International Exhibition of Inventions of Geneva 2014; Silver Medal "Platform for
SERS and method of its fabrication"; W. Adamkiewicz, J. Paczesny, K. Sozański, R. Hołyst,
I. Dzięcielewski, K. Winkler, A. Kamińska and A. Żywociński.
3.5. Podsumowanie dorobku naukowego
Liczba publikacji (w czasopismach z tzw. Listy filadelfijskiej): 38
Liczba publikacji po uzyskaniu stopnia doktora: 32
Sumaryczny IF: 151.296, (3.9/publ.)
Liczba cytowań (bez autocytowań): 732
Indeks Hirscha: 15
Liczba patentów: 10
Liczba zgłoszeń patentowych: 5
Kierowanie grantami: 4
4.
DZIAŁALNOŚĆ DYDAKTYCZNA
Zajęcia dla studentów Wydziału Chemii UW w latach 2001-2007.
W trakcie moich studiów doktoranckich i pracy na Wydziale Chemii UW byłam
zaangażowana w prowadzenie zajęć dydaktycznych. W latach 2001- 2007 były to zajęcia w
Pracowni Chemii Fizyczne i Pracowni Fizyki w ramach pięcioletnich studiów magisterskich.
1. Spektroskopia molekularna –ćwiczenia rachunkowe i ćwiczenia laboratoryjne.
(studenci III roku studiów).

statystyki wygenerowane przez Web of Science (Thomson Reuters℠), 21 kwietnia 2016.
49
2.
Pracownia Chemii Fizycznej -ćwiczenia laboratoryjne (studenci II roku studiów).
3.
Pracownia Fizyki-ćwiczenia laboratoryjne (studenci I roku studiów).
Prace magisterskie – promotor.
1.
Radosław Miernik, tytuł pracy: „Analiza ramanowska struktur monowarstw
dwufunkcyjnych tioli na powierzchni srebra”, Szkoła Główna Gospodarstwa
Wiejskiego, Warszawa, 2012.
2.
Aleksandra Czekaj, tytuł pracy: „Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana
w badaniach DNA”, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa, 2013.
3.
Paweł Albrycht, tytuł pracy: „Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana
(SERS) w badaniach kryminalistycznych”, 2013.
Prace magisterskie – opiekun.
1.
Aleksandra Karczmarczyk, tytuł pracy: „Opracowanie aktywnych podłoży bazujących
na GaN i ZnO do pomiarów powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana”.
Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny, 2012. Praca zdobyła III nagrodę w
konkursie Hasco-lek na pracę magisterską wykonywaną w IChF PAN.
2.
Anna Kelm, tytuł pracy: „Nowe podłoża do badań powierzchniowo wzmocnionego
efektu Ramana i ich zastosowanie w detekcji wybranych neuroprzekaźników”.
Wydział Chemii UW, 2012.
3.
Agata Toś, tytuł pracy: „Opracowanie procedury badania składu pierwiastkowego
tkanek jajników ludzkich”. Wydział Chemii UW, 2013.
Prace licencjackie – promotor .
1. Ewelina Mariola Kryśkiewicz: „Zastosowanie podłoży Si/ZnO/Au do detekcji bakterii
gatunku Escherichia coli przy zastosowaniu metody powierzchniowo wzmocnionej
spektroskopii Ramana”. UKSW, Warszawa, 2015.
2. Natalia Borucka: „Detekcja grzybów chorobotwórczych z wykorzystaniem
powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana”. UKSW, Warszawa, 2015.
Prace doktorskie: opiekuję się pracą doktorską mgr. Evelin Witkowskiej.
50
5.
WSPÓŁPRACA KRAJOWA I MIĘDZYNARODOWA
Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa , Polska,
Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa, Polska,
School of Chemical Sciences, Dublin City University, Dublin, Ireland,
Wydział Immunologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa, Polska,
Instytut Fizyki, Polska Akademia Nauk, Warszawa, Polska,
Instytut Wysokich Ciśnień, Polska Akademia Nauk, Warszawa, Polska,
Narodowy Instytut Leków, Warszawa, Polska.
6.
POPULARYZACJA NAUKI
Od kilku lat angażuję się we współpracę z Krajowym Funduszem Na Rzecz Dzieci.
Przygotowuję tygodniowe zajęcia w ramach warsztatów organizowanych przez IChF PAN.
Wyniki moich badań i moich współpracowników dotyczące opracowaniu nowatorskich
podłoży do pomiarów SERS były prezentowane w postaci popularnonaukowych notek
prasowych na stronach internetowych o zasięgu krajowym i międzynarodowym np.:
Informacje Prasowe
IChF http://www.ichf.edu.pl/press/
PAN
Serwis
PAP
(Nauka
w http://naukawpolsce.pap.pl/aktualnosci/news,380328,zlote-
Polsce);
plytki-do-wykrywania-przeciwcial.html
News Medical Net
http://www.news
medical.net/news/20110304/8533/Polish.aspx
Nanowerk News
http://www.nanowerk.com/news/newsid=20400.php.
Udzieliłam wywiadu w telewizji TVN 24 Biznes i Świat na temat nowatorskich podłoży
SERS do detekcji przeciwciał. W ramach popularyzacji nauki w przestrzeni internetowej (a
szczególnie spektroskopii Ramana i jej biomedycznych i analitycznych zastosowań)
prowadzę następującą stronę internetową: bio-sers.pl i
51
6.1. Organizowanie konferencji.
Ważnym elementem mojej działalności naukowo-popularyzatorskiej był udział w
zorganizowaniu, w ramach projektu Noblesse, dwóch międzynarodowych konferencji z
udziałem
światowej
sławy
wykładowców,
obejmujących
tematykę
spektroskopii
molekularnej, nanostruktur plazmonicznych i aplikacji technik spektroskopowych.
Konferencje te, poza ich ogromną wartością naukową pozwoliły na integrację środowiska
naukowego a szczególnie dużej liczby młodych naukowców.
1. Advanced Infrared and Raman Spectroscopy (AIRS), Łochów, Poland, November
16-18, 2012 within the framework of “Nanotechnology, Biomaterials and Alternative
Energy Source for ERA integration project. Główna współorganizatorka i viceprzewodnicząca konferencji.
2. BioRaman Workshop, Warsaw, Poland, May 15-17, 2014 within the framework of
“Nanotechnology, Biomaterials and Alternative Energy Source for ERA integration
project. Conferene co-chairman. Główna współorganizatorka i vice-przewodnicząca
konferencji.
Udział w konferencjach krajowych i międzynarodowych
6.2.
Wykłady na zaproszenie.
1. „Highly reproducible, stable and multiply regenerated surface-enhanced Raman
scattering substrate for biomedical applications” – Institute of Physics Seminar,
Nicolaus Copernicus University, Toruń, Poland, 2011.
2. „SERS-owskie platformy diagnostyczne bazujące na GaN/Au”, Seminarium: Polski
potencjał badawczy i technologiczny w dziedzinie półprzewodników azotowych.
Instytut Wysokich Ciśnień PAN, 2011.
3. „Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) platform for molecular diagnostics –
Dublin City University”, School of Chemical Sciences and NCSR Seminar, Dublin,
2012.
4. „Platformy do badań powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana bazujące
na GaN”, Seminarium, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski, Poland, 2012.
5. „Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) platform for biomedical and biological
applications” – Warsaw University of Technology and CEZAMAT Group Meeting,
Warsaw, Poland, 2014.
52
6. „Biomedyczne zastosowania spektroskopii SERS”. Seminarium: Mikroskopia
ramanowska w diagnostyce medycznej. Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński w
Krakowie, 2015.
7. „Przyszłość powierzchniowo-wzmocnionej spektroskopii Ramana – diagnostyka
medyczna”. Warsztaty: Konfokalna mikroskopia ramanowska 3D. Centrum Edukacji i
Badań Interdyscyplinarnych UKSW, Warszawa, 2015.
8. „Powierzchniowo-wzmocniona spektroskopia Ramana w aplikacjach medycznych i
testach diagnostycznych”. Seminarium: Na granicy powierzchni i światła: Adsorpcja i
spektroskopia SERS, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie, 2015.
Konferencje krajowe i zagraniczne.
1. International Symposium on Progress in Surface Raman Spectroscopy-Theory,
Techniques and Applications, Xiamen 2000, plakat: „SERS studies on the structure
of cysteamine and 3-mercaptopropionic acid monolayers on silver”. A. Kudelski, A.
Michota-Kamińska, J. Bukowska.
2. XVIIth International Conference on Raman Spectroscopy, Pekin 2000, plakat:
„SERS studies on the structure of monolayers of short-chain thiols on Ag
substrates”. A. Kudelski, A. Michota-Kamińska, J. Bukowska.
3. Tenth International Conference on Vibrations at Surfaces, Saint Malo-France 2001,
plakat: „Chemisorption of cysteamine on gold and silver studied by SERS”. A.
Michota-Kamińska, A. Kudelski, J. Bukowska.
4. International Workshop on Surface Physics 2005, ECOSS-23 Satellite, Advanced
and Bio-Materials, Polanica Zdrój 2005, „Resonance Raman evidence for
immobilization of copper-protein (Laccase) on thiols-coated Ag and Au electrode”.
A. Michota-Kamińska, B. Wrzosek, J. Bukowska.
5. European Conference on Surface Science 2006, ECOSS-24, Paris 2006, plakat:
„Immobilization of copper-containing enzymes on Au, Ag and Pt surfaces evidenced
by surface plasmon resonance and Raman spectroscopy”. A. Michota-Kamińska, B.
Wrzosek, J. Bukowska.
6. XIIth European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Bobigny,
France. 1-6. 09. 2007, plakat: „Protein Compatible Metal Nanoparticle Arrays for
Surface-Enhanced Raman Spectroscopy”. A. Kamińska, O. Inya-Agha, R. J. Forster
and T. E. Keyes.
53
7. Raman Spectroscopy Workshop, Prague 2009, komunikat ustny: „Detection of
Biological Species by Surface Enhanced Raman Scattering”. A. Kamińska, J. L.
Weyher, S. Gawinkowski, J. Waluk.
8. II Konferencja Kwantowe Nanostruktury Półprzewodnikowe do Zastosowań w
Biologii i Medycynie, Instytut Fizyki PAN 13-14. 04. 2010, komunikat ustny:
„Sersowskie platformy diagnostyczne – ich właściwości i zastosowanie do detekcji
przeciwciał”. A. Kamińska, J. L.Weyher, S. Gawinkowski, J. Waluk, R. Hołyst.
9. Bio-Plasmonics Conference, Monte Verita, Switzerland 2010, plakat: „SurfaceEnhanced Raman Scattering –Active Surfaces based on Au-coated GaN”. A.
Kamińska, J. L. Weyher, S. Gawinkowski, J. Waluk.
10. XXII International Conference on Raman Spectroscopy, Boston, 7-13. 08. 2010,
poster: „SERS Active Surface Based on Au-Coated Porous GaN”. A. Kamińska, J.
L. Weyher, J. Waluk, S. Gawinkowski, R. Hołyst.
11. Third International NanoBio Conference 2010, Zurich, 23-27. 08. 2010, plakat:
„High efficiency GaN-based platforms for biology and medicine”. A. Kamińska, J.
L. Weyher, J. Waluk, S. Gawinkowski, R. Holyst.
12. E-MRS Fall Meeting Symposium, Inhomogeneous and hybrid magnetic
semiconductor systems, Warszawa 13-17. 09. 2010, plakat: „Selected Optical
Properties of Core/Shell ZnMnTe/ZnO Nanowire Structures”, K. Gas, E. Janik, W.
Zaleszczyk, E. Dynowska, M. Kutrowski , A. Michota-Kamińska , J. F. Morhange,
Ł. Wachnicki, T. Wojciechowski, R. Hołyst , M. Godlewski, E. Guziewicz, T.
Wojtowicz, W. Szuszkiewicz.
13. III Konferencja Kwantowe Nanostruktury Półprzewodnikowe do Zastosowań w
Biologii i Medycynie, Instytut Fizyki PAN 20-21. 04. 2011, komunikat ustny:
„Immobilizacja aminokwasów i peptydów na platformach sersowskich”. A.
Kamińska, J. L. Weyher, J. Waluk, K. Winkler, S. Gawinkowski, R. Hołyst.
14. 23rd International Conference on Raman Spectroscopy (ICORS), Bangalore, India,
10-15. 08. 2012 plakat nr 1: „Hybrid surface for label-free SERS detection of
bacteria” and “SERS-Melting: Method for Discriminating BCR/ABL Mutations”. A.
Kamińska, A. Sivanesan, E. Witkowska, J. Gołąb, M. Winiarska, D. Nowis, I.
Dzięcielewski, J. L. Weyher and J. Waluk; plakat nr 2: „Detection and identification
of bacterial cells in blood samples on gold-silver hybrid SERS substrate”. A.
Sivanesan, E. Witkowska, A. Kamińska, , E. Witkowska, Ł. Dziewit, J. Waluk.
15. Mikrosympozjum sprawozdawcze ICHF PAN, Warszawa, 3-5. 01. 2015, komunikat
ustny: „Highly reproducible, stable and multiply-regenerated Surface-Enhanced
54
Raman Scattering substrate for biomedical applications”. A. Kamińska, I.
Dzięcielewski, J. L. Weyher, R. Hołyst, S. Gawinkowski, J. Waluk.
16. International Conference on Vibrational Spectroscopy, Sonoma County, USA, 1217. 06. 2011, plakat: „Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) diagnostic
platform for the detection of DNA mutations”. A. Kamińska, I. Dzięcielewski, J. L.
Weyher, R. Hołyst.
17. .IV Konferencja Kwantowe Nanostruktury Półprzewodnikowe do Zastosowań w
Biologii i Medycynie, Instytut Fizyki PAN 5-6.12. 2012, komunikat ustny:
„Opracowanie podstaw budowy sensora przeciwciał na bazie powierzchni GaN i
ZnO modyfikowanej polipeptydami – biosensor do detekcji przeciwciał wirusa
HBV”. A. Kamińska, J. L. Weyher, J. Waluk, S. Gawinkowski, R. Hołyst.
18. International Turkish Congress on Molecular Spectroscopy, Istanbul, Turkey, 1520.94.2013, plakat: „Detection of BRC-ABL Mutations Using Novel SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy Diagnostic Platform”. A. Kamińska, A. Sivanesan,
E. Witkowska, J. Gołąb, M. Winiarska, D. Nowis, I. Dzięcielewski, J. L. Weyher
and J. Waluk.
19. International Conference on Advanced Infrared and Raman Spectroscopy in the
framework of Polish Photoscience Seminars, Łochów, Poland, 16 -18.09. 2012,
plakat nr 1: „Identification of amino acids in solid powder mixture by Raman
spectroscopy and stochastic optimization”. T. Roliński, S. Gawinkowski, A.
Kamińska, J. Waluk; plakat nr 2.: „Conformational analysis of Choline and
Acetylcholine in different media” A. Kelm, A. Kamińska, J. Waluk.
20. The 25th European Conference on Biomaterials; Madrid, Spain, 08.- 12 09.2013,
plakat: „Biological and biomedical applications of SERS”. E. Witkowska, A.
Kamińska, A. Sivanesan, Ł. Dziewit, J. Waluk.
21. V Konferencja Kwantowe Nanostruktury Półprzewodnikowe do Zastosowań w
Biologii i Medycynie, Instytut Fizyki PAN 17-18.04. 2013, komunikat ustny:
„Opracowanie podstaw budowy sensora przeciwciał na bazie powierzchni GaN i
ZnO modyfikowanej polipeptydami – opracowanie immunosensora bazujacego na
technice SERS”. A. Kamińska, J. L. Weyher, J. Waluk, S. Gawinkowski, R. Hołyst.
22. BioRaman Workshop, Warsaw, Poland, 15 -17.05. 2014, plakat nr 1: „Antibiotic
coated silver/gold hybrid substrate for SERS-based identification of pathogenic
bacteria”;plakat nr 2: „Detection of Hepatitis B virus antigen from human blood:
novel SERS immunoassay in a microfluidic system”. A. Kamińska, E. Witkowska,
K. Winkler, I. Dzięcielewski, J. L. Weyher, and J. Waluk; plakat nr.3: „Electrospun
polymer mat as a SERS platform for immobilization and detection of bacteria from
fluid”. T. Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk and A. Kamińska
55
23. 8th International Workshop on Zinc Oxide and Related Materials, Niagara Falls,
Ontario, Canada , 7-11, 2014, plakat: „Zinc oxide films grown by ALD as SERS
platforms”. E. Guziewicz, D. Snigurenko, K. Kopalko, A. Michota-Kamińska, E.
Witkowska, T. Szymborski.
24. International Symposium on Nanostructured Functional Materials,15-18.06, 2014,
Pułtusk, Polska, plakat: „Forcespinning polymer mat as a novel SERS platform for
biomedical applications”. E. Witkowska, T. Szymborski, W. Adamkiewicz, J.
Waluk and A. Kamińska
7.
PROJEKTY BADAWCZE
1) Grant Narodowego Centrum Nauki, OPUS (UMO-2015/17/B/ST4/04128),
„Funkcjonalizowane nanostruktury plazmoniczne do multipleksowych analiz immunomarkerów w układach mikroprzepływowych”, IChF Warszawa, 2016-2019
(kierownik grantu).
2) Grant Fundacji Nauki Polskiej, POMOST, (POMOST/2010-2/10), „Platformy SERS
w diagnostyce molekularnej” IChF Warszawa, 2010-2014 (kierownik grantu).
3) Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Iuventus plus (IP 2010025970),
„Detekcja neurotransmiterów z wykorzystaniem platform do powierzchniowo
wzmocnionej spektroskopii Ramana bazujących na nanocząsteczkach Au”, IChF
Warszawa, 2011-2012 (kierownik grantu).
4) Grant Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (PBS2/A1/8/2013), „Opracowanie
komercyjnej metody produkcji podłoży SERS do ultra-czułych i szybkich analiz
biomedycznych", 2013-2015 (wykonawca i lider jednego z czterech zadań
projektu).
5) Grant NOBLESSE - „Nanotechnology, Biomaterials and Alternative Energy Source
for ERA integration” (7 Program Ramowy, Capacities) podniesienie naukowego
poziomu IChF PAN, integracja i współpraca z renomowanymi europejskimi
jednostkami naukowymi; IChF Warszawa, 2011 - 2014 (wykonawca i vice-lider
jednego z czterech naukowych zadań projektu).
6) Grant Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego „Kwantowe nanostruktury
półprzewodnikowe do zastosowań w biologii i medycynie” (POIG.01.01.02-00008/08). Rozwój i komercjalizacja nowej generacji urządzeń diagnostyki molekularnej
opartych o nowe polskie przyrządy półprzewodnikowe. IChF Warszawa, 2007-2014
(vice-lider i wykonawca jednego z głównych zadań projektu).
56
7) .Grant Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, (501/68-BW-172113)
„Immobilization of galactose oxydase on thiols-coated Au and Ag surfaces”. Wydział
Chemii UW, 2006-2007 (kierownik grantu).
Inne aktywności związane z pracą naukowo-badawczą.
Recenzowałam około 30 publikacji naukowych w czasopismach z listy filadelfijskiej:
Biosensors and Bioelectronics, Optical Materials, Biomedical and Environmental Science,
Advanced Materials Interfaces, Chemical Papers, Analytical Methods, RSC Advances,
Analytical Chemistry, Journal of Raman Spectroscopy.
Podziękowania.
Składam serdeczne podziękowania Pani Profesor Jolancie Bukowskiej za
wprowadzenie mnie w świat spektroskopii ramanowskiej. Profesorowi Robertowi
Forsterowi i Professor Tia Keyes za możliwość spędzenia ponad roku w Ich grupie
badawczej i przekazaną mi wiedzę.
Dziękuję Profesorowi Robertowi Hołystowi za umożliwienie mi pracy w Instytucie
Chemii Fizycznej PAN.
Dziękuję Profesorowi Jackowi Walukowi za dyskusje merytoryczne i cenne
wskazówki, wsparcie naukowe oraz wszelką okazaną pomoc.
W tym miejscu chcę też wyrazić wdzięczność wszystkim współpracownikom,
kolegom i koleżankom z Instytutu Chemii Fizycznej PAN za stworzenie wspaniałej atmosfery
naukowej i przyjacielskie wsparcie a zwłaszcza Anecie i Tomkowi.
Dziękuję Dyrektorowi Instytutu Profesorowi Marcinowi Opałło za możliwość
rozwijania moich pasji naukowych w Instytucie Chemii Fizycznej PAN.
Największe podziękowania składam moim dzieciom: Oli i Jakubowi za to, że jako
maluchy dzielnie towarzyszyły mi podczas mojego pobytu na stażu post-doktorskim w
Dublinie i przetrwały ten okres samotnie bez taty. Mojej najmłodszej córeczce Hani, że przez
całe swoje dzieciństwo wykazywała się wyjątkowym zrozumieniem tego, że popołudniami i
57
weekendami kontynuowałam swoją pracę naukową i nie poświęcałam jej tyle czasu ile
powinnam. Mężowi Andrzejowi, że był ostoją cierpliwości i pomocy podczas wszystkich dni
mojej pracy.
Warszawa, 23 Maj 2016
58

autoreferat (PL) - Instytut Chemii Fizycznej PAN

Transkrypt

Podobne dokumenty

characterization of nanostructured materials

Recenzja rozprawy doktorskiej pani magister Marty Marii Siek

Wykorzystanie spektrofotometrii Ramana w szacowaniu potencjału

Czujniki ruchu do montażu na ścianie DANE TEC

RECTA Variomatic – energooszczędna, dwustrumieniowa lampa

Francja w malarstwie prof. Moniki Kamińskiej. Nowa wystawa

Swiss Garde 360 Corridor