wykład 5 - Samodzielna Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej

METODY PRZECHOWYWANIA
I UTRWALANIA BIOPRODUKTÓW
METODY ZAMRAŻANIA CZ.1
Opracował: dr S. Wierzba
Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej
Uniwersytetu Opolskiego
METODY ZAMRAŻANIA
Odporność drobnoustrojów na niskie temperatury jest znacznie większa niż na wysokie
temperatury.
Redukcja OLB następuje głównie w wyniku przemian fazowych wody:
• pożywka przechłodzona (-30C) – przeżywalność ok.. 97%,
• pożywka zamrożona (-30C) – przeżywalność ok.. 2%
• bakterie G- bardziej wrażliwe na niskie temperatury niż G+
• większa przeżywalność dla drobnoustrojów w fazie stacjonarnej niż logarytmicznej
• drobnoustroje patogenne i nie patogenne nie wykazują różnic pod względem
przeżywalności
• Clostridium boutilinum nie rozwija się poniżej -3,3 0C
• Staphylococcus aureus, Sallmonella sp. – poniżej -6,70C
• dolne granice zdolności rozmnażania:
• bakterie -5¸-80C
• drożdże -10¸-120C
• pleśnie -12¸-150C
METODY ZAMRAŻANIA
Temperatury subminimalne – niższe od minimalnej temperatury wzrostu (rozmnażanie i
większość procesów metabolicznych ulega zahamowaniu), mogą być przyczyną: śmierci,
przejścia w stan anabiozy, zaburzeń metabolizmu:
• subminimalne dodatnie: „zimny szok” - krzepnięcie lipidów wchodzących w skład
biomembran – zaburzenia transportu:
• szczególnie wrażliwe G- w log fazie wzrostu – szybkie obniżenie temperatury do 0-50C
śmierć większości komórek
• skład pożywki:
- bogatszy skład – większa wrażliwość
- ochronne działanie Mg2+ i Ca2+, oraz ATP, kwasów nukleinowych, białek,
aminokwasów (przenikających na zewnątrz wskutek utraty szczelności błon
biologicznych)‫‏‬
• temperatura – większa oporność bakterii hodowanych w niższych temperaturach (200C)
• subminimalne ujemne: spadek liczebności jest wynikiem:
• mechanicznego uszkodzenia - kryształy lodu
• szoku osmotycznego – wzrost stężenia soli wywołany dehydratacją komórek
METODY ZAMRAŻANIA
Pod względem wrażliwości na temperatury subminimalne ujemne drobnoustroje dzielimy na:
• przeżywające mrożenie i rozmrażanie (przetrwalniki bakterii, zarodniki grzybów),
• niewrażliwe na zamrażanie, ale wymierające w czasie przechowywania,
• wrażliwe na zamrażanie i wymierające w czasie przechowywania,
• nie przeżywające procesu mrożenia niezależnie od warunków (glony, pierwotniaki)
METODY ZAMRAŻANIA
Schemat postępowania przy zamrażaniu
drobnoustrojów zaabsorbowanych na
perełkach szklanych, propylenowych –
wykorzystywany przy częstym pobieraniu
materiału
METODY ZAMRAŻANIA
Zamrażanie kultur drożdży i grzybów
nitkowatych – w szklanych lub
propylenowych „słomkach”:
a. b. wzrost kultur na podłożu stałym
lub płynnym
c. sporządzenie zawiesiny w
obecności czynników ochronnych
d. napełnienie sterylnych „słomek”
propylenowych lub szklanych kapilar
e. wzrost grzybni na podłożu
agarowym z 5% glicerolem
f. g. h. napełnienie kapilar grzybnią
i. k. zamrożenie w ciekłym azocie
METODY ZAMRAŻANIA
Utrwalanie drobnoustrojów w
warunkach beztlenowych –
konieczność stosowania sterylnego,
gazu obojętnego (N2, CO2)
METODY ZAMRAŻANIA
Ważnym czynnikiem w utrwalaniu drobnoustrojów jest kontrola tempa zamrażania (duża
ilość małych kryształków lodu) – znanych jest wiele metod kontrolowanego, stopniowego
zamrażania:
• zamrażarki – 1-20C/minutę, do temperatury kilka stopni powyżej punktu przemiany
faz (-20/-300C)
• ciekły azot – bardzo szybkie mrożenie, aż do przekroczenia temperatury przemiany
faz
• ewentualne ponowne wolne ochładzanie 10C/minutę, aż do właściwej temperatury
przechowywania
W przypadku długotrwałego przechowywania (wartościowych tkanek) stosuje się
zamrażanie w ciekłym azocie (-1960C), oraz witryfikację:
• jednostopniowe, głębokie zamrażanie w zawiesinie krioochronnej o bardzo dużym
ciśnieniu osmotycznym (8 mol/dm3), gwałtowne zamrażanie - 10000C/minutę:
• dehydratacja
• brak kryształów – powstaje jednolita tafla lodu
METODY ZAMRAŻANIA
Zamrażanie biopreparatów – powszechnie stosowana metoda utrwalania np. kultur
starterowych bakterii fermentacji mlekowej, drożdży piekarskich, zarodków zwierzęcych.
Zamrażanie biomas mikroorganizmów:
• zamrażarki mechaniczne od -100C do -800C
• ciekłe gazy (azot -1960C)
Przeżywalność mikroorganizmów uzależniona jest od:
• rodzaju mikroorganizmów np. Lactobacillus acidophilus
• wolne tempo (stres przedzamrażalniczy) – mała przeżywalność
• gwałtowne zamrożenie z 370C do -800C – mała przezywalność (ok.. 40%)
• wolne, stopniowe obniżanie temperatury (adaptacja do niższych temperatur –
wstępna inkubacja 6h – 220C, itd..) – wysoka przeżywalność (ok.. 75%)
• oddziaływanie na skład lipidów ścian komórkowych, adaptacja zwiększa udział
nienasyconych kwasów tłuszczowych, znacznie poprawia termotolerancyjność
komórek
• warunki hodowli
• pH (Lactococcus sp.)
• pH < 5,5 znaczne obniżenie krioodporności
• pH ok.. 6,0 mniejsza podatność komórek na pogorszenie żywotności
• podwyższone ciśnienie osmotyczne (dehydratacja, bisynteza trehalozy)
METODY ZAMRAŻANIA
• skład pożywki – udział krioprotektantów
• zewnątrzkomórkowych: manitol, sorbitol, dekstran, metoloceluloza, żelatyna,
• wnikających do wnętrza komórki: DMSO, alkohole polihydroksylowe
• wiek kultury – najodporniejsze komórki w stacjonarnej fazie wzrostu
Reakcja drożdży na stres temperaturowy – synteza protektorów – czynników ochronnych
komórek:
• „białka szoku cieplnego” – przeciwdziałają agregacji białek o zmienionej termicznie
strukturze:
• NSR1 – warunkujących syntezę mRNA w niskich temperaturach
• TIP1, TIP1/2 – regulujących funkcje ściany komórkowej
• CSF1 – umożliwiające aktywność fermentacji w niskich temperaturach
• glikogen
• trehaloza (disacharyd) – najważniejszy metabolit stresowy drożdży (szok temperaturowy,
osmotyczny), oddziaływuje na ściany komórkowe drożdży
METODY ZAMRAŻANIA
Rozmrażanie bioproduktów – proces zmiany stanu zawartej w nich wody i przywrócenie
produktom ich własności naturalnych (poprzez doprowadzenie ciepła z zewnątrz):
• proces przebiega na zasadzie odwróconej krzywej zamrażania,
• znacznie wolniej (ciepło jest doprowadzane z zewnątrz przez rozmrożoną powierzchnie o
niższej przewodności cieplnej, wyższym cieple właściwym, większej gęstości)
• 3-4 krotnie zmniejszony współczynnik dyfuzyjności cieplnej (mniejsza prędkość i czas
wyrównania temperatur)
• niebezpieczeństwo powierzchniowego przegrzania produktu – zbyt intensywne ogrzewanie
METODY ZAMRAŻANIA
Przemysłowe metody rozmrażania produktów:
• ogrzewanie powierzchniowe – doprowadzenie ciepła do powierzchni produktu:
• w powietrzu o temperaturze 0-40C (wolne)
• para wodna – powietrze w temperaturze 25-400C (szybkie)
• woda lub solanka w temperaturze 4-200C przez zanurzenie
• w lodzie (bardzo wolne)
• na gorącej metalowej powierzchni (bardzo szybkie) - kontaktowe
• ogrzewanie wewnętrzne całej objętości produktu w polu elektrycznym wysokiej
częstotliwości: dielektryczne, mikrofalowe, oporowe
Ogrzewanie w powietrzu:
• 1 etap – ogrzewanie do temperatury krioskopowej na powierzchni produktu
• 2 etap – właściwe rozmrażanie przemiana fazowa lodu w całej objętości produktu
Urządzenia tunelowe (obieg ciepłego, wilgotnego powietrza)
METODY ZAMRAŻANIA
Rozmrażanie przez ogrzewanie wewnętrzne – produkty o jednolitej strukturze i regularnych
kształtach:
• mikrofalowe
• fale elektromagnetyczne o częstotliwości 915 i 2450 MHz, fale są absorbowane przez
substancje dielektryczne powodując efekt grzejny
• efekt grzejny zależy od właściwości dielektrycznych produktów (tłuszcz, tkanka
mięśniowa)
• zaletami są duża równomierność nagrzewania, znaczne skrócenie czasu
rozmrażania, możliwość kontroli przebiegu procesu i jego automatyzacji
• dielektryczne, oporowe – pole elektryczne jest wytwarzane przez elektrody otaczające
produkt, częstotliwość fal 27-100 MHz
• duża szybkość, lepsza jakość produktu w porównaniu do innych metod rozmrażania,
możliwość rozmrażania wewnątrz opakowań
Rozmrażanie drobnoustrojów:
• łaźnia wodna 20-350C
• powietrze 200C i łaźnia wodna
• ważne usunięcie, rozcieńczenie krioprotektantów
METODY ZAMRAŻANIA
Czynniki chłodnicze
Woda – środowisko chłodzące stosowane w metodach wstępnego wychładzania produktów:
• zimna woda wodociągowa
• woda lodowa temperatura ok.. 00C (zraszanie woda wodociągową lodu)
Solanki – wodne roztwory chlorków sodu, wapnia, magnezu:
• zakres stosowania jest ograniczony właściwościami fizycznymi (punkt eutektyczny)
• NaCl
MgCl2
CaCl2
• zamrażanie przez zanurzenie (ograniczenie – przenikanie soli do produktu)
METODY ZAMRAŻANIA
Amoniak (R717) -33,30C – duże instalacje przemysłowe
• duża wydajność chłodnicza, ciepło parowania
• mała rozpuszczalność w oleju (pompy olejowe)
• toksyczność – dopuszczalne stężenie 0,01%
Freony – halogenowe związki węglowodorów nasyconych, mają różny potencjał zagrożenia
ekologicznego (stopniowo wycofywane z użycia), duża sprawność, rozpuszczają olej:
• CFC – w pełni halogenowe związki węgla (chlorofluorokarbony), wszystkie atomy
wodoru zastąpione chlorem i fluorem np.. R12 (CF2Cl2) wydajność ok.. 35% mniejsza
niż amoniak, duże zagrożenie ekologiczne, wycofany z użycia,
• HCFC – wodorochlorofluorokarbony, nie wszystkie atomy wodoru zastąpione chlorem
i fluorem np.. R22 (CHF2Cl) wydajność zbliżona do amoniaku, powszechnie stosowany
zamiennik R12,
• HFC – wodorofluorokarbony, część atomów wodoru zastąpiona fluorem np. R134a
(CH2FCF3), nieco mniejsza wydajność w porównaniu do R22, przewidziany jako
główny zamiennik R12,
• FC – węglowodory w pełni halogenowe, wszystkie atomy wodoru zastąpione fluorem
Ciekły azot (LIN): -195,80C, z uwagi na bardzo niską sprawność procesu (ok.. 10-krotnie
mniejsza niż w przypadku amoniaku) stosuje się na małą skalę do celów specjalnych, lub w
kombinacji z tradycyjnymi metodami
Ciekły dwutlenek węgla (LIC) pod ciśnieniem 2MPa, temperatura -20/-300C,
• współczynnik wnikania ciepła ok.. 2-krotnie mniejszy niż w LN2
• dłuższy czas zamrażania
• korzystny pod względem ekonomicznym