autoreferat - Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w

autoreferat - Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w

Załącznik 2a
dr Monika Derda
AUTOREFERAT
Monika Derda
Tytuł osiągnięcia naukowego:
„Nowe możliwości w wykrywaniu
i zwalczaniu pełzaków wolno żyjących
z rodzaju Acanthamoeba”
Poznań, 2016
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Autoreferat
1. Imię i Nazwisko: Monika Derda
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe:
1994 - Dyplom magistra analityki medycznej, Akademia Medyczna (obecnie Uniwersytet
Medyczny) im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Wydział Farmacji, Oddział
Analityki Medycznej. Praca magisterska pt.: „Doświadczalna włośnica: proteazy
i antyoksydanty pasożyta i żywiciela”. Opiekunem pracy magisterskiej był
prof. dr hab. Edward Hadaś.
1998 - Tytuł doktora nauk biologicznych na podstawie rozprawy pt.: „Biochemiczne
mechanizmy reakcji obronnych żywiciela w doświadczalnej włośnicy”. Promotorem
pracy doktorskiej był prof. dr hab. Edward Hadaś, natomiast recenzentem
prof. dr hab. Andrzej Malczewski oraz prof. dr hab. Zbigniew Pawłowski.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
 od 01.10.1997 r. - do 30.09.2001 r. – asystent,- Katedra i Zakład Biologii
i Parazytologii Lekarskiej, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu
 od 01.10.2001 r. - do 30.09.2010 r. - adiunkt - Katedra i Zakład Biologii
i Parazytologii Lekarskiej, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego
w Poznaniu (od 2007 zmiana nazwy na Uniwersytet Medyczny im. Karola
Marcinkowskiego w Poznaniu)
 od 01.10.2010 r. - starszy wykładowca - Katedra i Zakład Biologii i Parazytologii
Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r.
o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki
(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
Strona 2 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
tytuł osiągnięcia naukowego:
a)
„Nowe możliwości w wykrywaniu i zwalczaniu pełzaków wolno żyjących
z rodzaju Acanthamoeba”
b) wykaz publikacji:
Osiągnięcie naukowe obejmuje cykl 8 prac oryginalnych, dotyczących wykrywania
i zwalczania pełzaków wolno żyjących z rodzaju Acanthamoeba. W 7 pracach jestem
pierwszym autorem, w ósmej pracy jestem wymieniona na drugim miejscu, ale jestem w tej
pracy autorem korespondencyjnym i jednocześnie autorem równorzędnym z pierwszym
autorem. Łączna wartość wskaźnika IF dla prezentowanego cyklu prac wynosi 11,201;
punktacja MNiSW = 150,0.
1).
Derda M., Winiecka-Krusnell J., Linder M.B., Linder E. Labeled Trichoderma reesei
cellulase as a marker for Acanthamoeba cyst wall cellulose in infected tissues. Applied
and Environmental Microbiology, 75 ,6827-6830, 2009
IF: 3.686
2).
punkty MNiSW: 32
liczba cytowań: 2
Derda M., Hadaś E. Wykorzystanie obecności celulozy w ścianie komórkowej cyst
Acanthamoeba do celów diagnostycznych. Wiadomości Parazytologiczne, 55 (1), 4751, 2009
punkty MNiSW: 4
3).
liczba cytowań: 3
Derda M., Wojtkowiak-Giera A., Hadaś E. Comparative analyses of different genetic
markers for the detection of Acanthamoeba spp. isolates. Acta Parasitologica, 59 (3),
472-477, 2014
IF: 0.965
4).
punkty MNiSW: 15
liczba cytowań: 3
Derda M., Hadaś E., Thiem B. Plant extracts as natural amoebicidal agents.
Parasitology Research,104 (3), 705-708, 2009
Strona 3 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
IF: 1.721
5).
liczba cytowań: 15
punkty MNiSW: 20
Derda M., Hadaś E., Thiem B., Wojt W.J., Wojtkowiak-Giera A., Cholewiński M.,
Skrzypczak Ł. Tanacetum vulgare L. jako roślina o potencjalnych właściwościach
leczniczych w Acanthamoeba keratitis. Nowiny Lekarskie, 620-625 (4), 311-314, 2012
punkty MNiSW: 4; liczba cytowań: 0
liczba cytowań: 0
punkty MNiSW: 4
6).
Derda M., Thiem B., Budzianowski J., Hadaś E., Wojt W.J., Wojtkowiak-Giera A. The
evaluation of the amebicidal activity of Eryngium planum extracts. Acta Poloniae
Pharmaceutica– Drug Research, 70 (6), 1027-1034, 2013
IF: 0.683
7).
liczba cytowań: 2
punkty MNiSW: 15
Kuźma Ł., Derda M., Hadaś E., Wysokińska H. 2015. Abietane diterpenoids from
Salvia sclarea transformed roots as growth inhibitors of pathogenic Acanthamoeba spp.
Parasitology Research, 114 (1), 323-327
IF: 2.098
8).
liczba cytowań: 0
punkty MNiSW: 30
Derda M., Hadaś E., Cholewiński M., Skrzypczak Ł., Grzondziel A., WojtkowiakGiera A. 2016. Artemisia annua L. as a plant with potential use in the treatment of
acanthamoebiasis. Parasitology Research, 115 (4), 1635-1639
IF: 2.098
punkty MNiSW: 30
liczba cytowań: 0
c) omówienie celu naukowego ww. pracy i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich
ewentualnego wykorzystania.
Pełzaki z rodzaju Acanthamoeba to organizmy występujące kosmopolitycznie
w glebie, w powietrzu oraz w zbiornikach wody słodkiej i słonej. Uczestniczą one w obiegu
pokarmowym
i
energetycznym
redukując
naturalne
zanieczyszczenia
biologiczne
w zbiornikach wodnych oraz działają jako drapieżniki regulujące populacje bakterii.
Strona 4 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
W ich cyklu życiowym występują dwa stadia rozwojowe. Pierwsze z nich to stadium
wegetatywne – trofozoit, drugie to stadium przetrwalnikowe – cysta, która umożliwia
pełzakom przetrwać w warunkach niesprzyjających.
Pełzaki z rodzaju Acanthamoeba zaliczane są do tzw. pierwotniaków amfizoicznych.
Najczęściej występują one w środowisku jako organizmy wolno żyjące, ale w sprzyjających
warunkach mogą stać się pasożytami chorobotwórczymi. W latach 50-tych po raz pierwszy
stwierdzono ich patogeniczność dla myszy, małp, a także dla mięczaków. W 1965 roku
Fowler i Carter wykazali, że omawiane pełzaki wolno żyjące mogą być również pasożytami
człowieka. Opisali oni pierwsze przypadki zapalenia opon mózgowych i mózgu wywołane
przez pełzaki (Fowler i Carter, 1965). Szczegółowe badania doprowadziły do opisania
ziarniniakowego zapalenia mózgu, tzw. GAE (granulomatous amebic encephalitis). GAE jest
chorobą przewlekłą. Dotyczy ona najczęściej pacjentów z nieprawidłowo funkcjonującym
systemem immunologicznym lub przyjmujących leki immunosupresyjne.
Pełzaki z rodzaju Acanthamoeba najczęściej dostają się do organizmu żywiciela drogą
inhalacyjną lub przez uszkodzoną rogówkę oka. Prawdopodobnie mogą one dostać się do
organizmu człowieka również drogą naczyń krwionośnych, wnikając przez uszkodzoną skórę.
W inwazji ośrodkowego układu nerwowego do typowych objawów zaliczamy: ból głowy,
gorączkę, zaburzenia wzrokowe, zaburzenia neurologiczne, halucynacje oraz dezorientację.
Poza ośrodkowym układem nerwowym pełzaki mogą powodować zmiany w wielu
narządach człowieka i zwierząt. Inwazje obserwowano między innymi w płucach,
nadnerczach, skórze, uchu, żuchwie. Od pewnego czasu rośnie też liczba przypadków
pełzakowego zapalenia rogówki oka (AK – Acanthamoeba keratitis). Pierwsze doniesienie
dotyczące AK opublikowano w roku 1974. Większość współczesnych przypadków ma
związek z noszeniem soczewek kontaktowych i używaniem skażonych roztworów do ich
pielęgnacji. W nielicznych przypadkach zarażenie wiąże się z mechanicznymi urazami
rogówki.
Diagnostyka laboratoryjna inwazji Acanthamoeba spp. oparta jest głównie na
identyfikacji pasożyta w tkankach żywiciela. Chociaż zostały opisane różne techniki
identyfikacji pełzaków, włączając w to metody immunocytologiczne i molekularne, to
podstawową procedurą jest nadal hodowla na agarze. Ta metoda zwykle jest łączona
z histopatologiczną oceną preparatu w celu potwierdzenia inwazji tkanki przez pasożyta.
Rozpoznanie pasożytów w preparatach z tkanek jest często trudne i zależy od wiedzy
specjalistycznej z zakresu patomorfologii. Często w tradycyjnych metodach barwienia
Strona 5 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
histologicznego używa się specyficznych pasożytniczych przeciwciał, natomiast do
wizualizacji pasożytów w preparatach tkankowych używa się kalkofluoru.
Leczenie akantamebozy jest bardzo trudne, długotrwałe i rzadko skuteczne. W celu
terapeutycznym stosuje się głównie antybiotyki oraz leki zapobiegające dalszym następstwom
uszkodzenia tkanki, które mają działanie pełzakobójcze lub pełzakostatyczne. Są to często
substancje silnie drażniące, toksyczne oraz wywołujące szereg skutków ubocznych.
Przykładem stosowanych leków są pochodne chloroheksydyny, standardowo
stosowane do dezynfekcji. Doniesienia o skutecznym leczeniu inwazji centralnego układu
nerwowego lub gałki ocznej u chorych immunokompetentnych, zanotowano tylko
w przypadku zastosowania terapii kombinowanej i rozpoczętej we wczesnym etapie choroby.
W późnych stadiach zarażenia, leczenie zazwyczaj jest nieskuteczne. Z tych powodów
poszukuje się alternatywnych metod leczenia, które nie wywoływałyby skutków ubocznych
u pacjenta. Nowych leków najczęściej poszukuje się pośród substancji pochodzenia
roślinnego.
Poza doborem odpowiednich leków, istotnym czynnikiem w leczeniu akantamobozy
jest również jak najszybsze jej zdiagnozowanie oraz szybkie rozpoczęcie terapii.
Od wielu lat pełzaki z rodzaju Acanthamoeba stanowią przedmiot moich
zainteresowań naukowych. Cykl przedstawionych przeze mnie prac dotyczy zarówno
wykrywania pełzaków, jak również zwalczania ich poprzez stosowanie preparatów
pochodzenia roślinnego.
Nowe metody diagnostyczne
Publikacja 1 i 2
W wyniku przeprowadzonych badań opracowałam kilka wariantów nowej metody
służącej do identyfikacji cyst pełzaków z rodzaju Acanthamoeba. Wyniki badań zostały
przedstawione w pracach: „Labeled Trichoderma reesei cellulase as a marker for
Acanthamoeba cyst wall cellulose in infected tissues” oraz “Wykorzystanie obecności
celulozy w ścianie komórkowej cyst Acanthamoeba do celów diagnostycznych”.
W metodzie tej wykorzystałam nietypową jak na pierwotniaka budowę chemiczną ściany cyst
Acanthamoeba spp.
Wiele pasożytniczych pierwotniaków posiada zdolność tworzenia cyst jako stadiów
przetrwalnikowych. Przeważnie głównym składnikiem ściany cyst jest chityna.
Strona 6 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Acanthamoeba stanowi jeden z wyjątków wśród pierwotniaków, ponieważ w ścianie
cyst zamiast chityny posiada celulozę. Celuloza składa się z cząstek D-glukozy połączonych
wiązaniami 1,4-glikozydowymi. Chityna jest bardzo podobna do celulozy, ale zawiera
monomery N-acetylo-D-glukozoaminy. Ponadto, oba wielocukry zawierają 1,4-heksozę, stąd
też różnicowanie cytochemiczne między celulozą i chityną w mikroskopie świetlnym nie było
dotychczas możliwe z powodu podobieństwa składowej szkieletu. Badania biochemiczne
wykazały, że obecność celulozy, m.in. w tkankach roślinnych, ale również w ścianie cyst
pierwotniaków można łatwo wykryć wykorzystując do tego celu specyficzną budowę celulaz
(Linder i wsp., 2002; Shpigel i wsp., 1998). Większość celulaz składa się z dziedziny
katalitycznej oraz dziedziny wiążącej celulozę (CBD - Cellulose- Binding Domain).
Katalityczna dziedzina zawiera aktywne miejsce z pozostałością aminokwasu odpowiedzialną
za mechanizmy hydrolityczne. Zadaniem CBD jest przyłączanie się do celulozy. Celuloza
zawarta w ścianie komórkowej cyst może wiązać się z dziedziną wiążącą celulazy (CBD).
Zdolność CBD do wiązania się z celulozą może być wykorzystywana w diagnostyce.
Indywidualne typy CBD mogą różnić się znacząco w swoich własnościach, takich jak
powinowactwo, preferencje do krystalicznej albo bezpostaciowej celulozy oraz krzyżowe
reakcje z innymi, podobnymi węglowodanami.
W przeprowadzonych przeze mnie badaniach przygotowałam cztery różne koniugaty.
Substancją wyjściową do uzyskania koniugatów była rekombinowana dimeryczna celulaza
pozyskana z grzyba Trichoderma reecei. Trzy z tych koniugatów otrzymałam jako połączenie
rekombinowanego białka z barwnikiem fluorescencyjnym. Zastosowałam trzy różne
barwniki, ponieważ nie wiedziałam, z którym uzyskam najlepszy efekt barwny. Zastosowane
barwniki to: Alexa Fluor® 350 (niebieski), Alexa Fluor® 488 (zielony) oraz Alexa Fluor®
568 (pomarańczowo-czerwony) z zestawu Protein Labeling Kit firmy Molecular Probes.
Otrzymane koniugaty wykorzystałam do uzyskania reakcji widocznej w mikroskopie
fluorescencyjnym.
Ponieważ nie wszystkie laboratoria dysponują mikroskopami fluorescencyjnymi
opracowałam również koniugat, który pozwolił na uzyskanie reakcji barwnej widocznej
w mikroskopie świetlnym. Koniugat ten otrzymałam przez znakowanie białka biotyną
używając do tego celu EZ - Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce).
Podczas barwienia preparatów tkankowych, wystąpiła nieswoista reakcja z endogenną
peroksydazą i endogenną biotyną. Reakcja ta wystąpiła zarówno w preparatach z tkanek, jak
i preparatach zawierających cysty z hodowli aksenicznej. W celu zredukowania nieswoistej
reakcji spowodowanej obecnością endogennej biotyny, preparaty inkubowałam ze
Strona 7 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
streptawidyną (białko wiążące biotynę) oraz z peroksydazą chrzanową (HRP – enzym
o właściwościach katalitycznych). Do tego celu użyłam kompleksu streptawidyna - HRP
(StreptABComplex / HRP firmy Dako).
W przeprowadzonych badaniach po raz pierwszy wykazały, że zastosowanie
fluorescencyjnych koniugatów CBD pozwala na szybkie wykrywaniu cyst Acanthamoeba
spp. Do identyfikacji cyst Acanthamoeba spp. pochodzących z hodowli mogą być
wykorzystywane wszystkie opracowane przeze mnie koniugaty fluorescencyjne. Przy
identyfikacji pasożytów w tkankach najlepsze efekty uzyskałam stosując koniugat CBD
z Alexa Fluor® 568. W przypadku preparatów tkankowych reakcja barwna po zastosowaniu
Alexa Fluor® 350 i Alexa Fluor ® 488 jest słabiej widoczna. Jasna autofluorescencja cyst
Acanthamoeba w świetle UV przeszkadza w niebieskim zabarwieniu celulozy, gdy użyty jest
Alexa Fluor® 350 i zielonym zabarwieniu celulozy, gdy użyty jest Alexa Fluor® 488.
Czerwony fluorochrom w koniugacie z Alexa Fluorem® 568, daje możliwość rozróżnienia
między autofluorescencją zewnętrznej ściany, a badaną reakcją w wewnętrznej ścianie,
i pozwala dokładnie zlokalizować celulozę w cyście Acanthamoeba spp.
Wykazałam, że CBD przygotowane jako białko biotynylowane może zostać użyte
do identyfikacji cyst Acanthamoeba spp. w mikroskopie świetlnym. Powinowactwo
wiązania awidyna - biotyna jest powszechnie używane w metodach histochemicznych.
Jednakże obecność biotyny endogennej w różnych komórkach i tkankach może spowodować
fałszywe pozytywne wyniki (Wang i Pevsner, 1999). Przy badaniu preparatów z tkanek
konieczne jest zniwelowanie ewentualnych fałszywie pozytywnych wyników. W tym celu do
opracowanej przeze mnie metody wprowadziłam dodatkowo fazę blokowania endogennej
biotyny, co znacząco zmniejszyło tło zanieczyszczające.
Wprowadzenie fazy blokowania endogennej biotyny wydłużyło nieco czas potrzebny
do dokonania analizy próby, ale wywołało zadowalające efekty niwelujące zanieczyszczenia.
Badania opisane w pracy „Labeled Trichoderma reesei cellulase as a marker for
Acanthamoeba cyst wall cellulose in infected tissues” bazowały na wykorzystaniu
rekombinowaj dimerycznej celulazy pochodzącej z grzyba Trichoderma reecei. Celulazę tę
pozyskałam w ramach współpracy z Profesorem Markusem B. Linderem z VTT
Biotechnology, VTT Technical Research Centre of Finland, w Espoo w Finlandii. Dotychczas
celulaza ta dostępna była tylko do celów badawczych w ramach współpracy naukowej.
Zachęcona uzyskanymi wynikami spróbowałam w badaniach zastąpić celulazę
z Trichoderma reecei, celulazą dostępną na rynku. W dalszych badaniach wykorzystałam
rekombinowane CBD pozyskane od celulolitycznych bakterii Clostridium cellulovorans,
Strona 8 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
sprzedawane przez Firmę Sigma. Badania te opisałam w publikacji “Wykorzystanie
obecności
celulozy
w
ścianie
komórkowej
diagnostycznych”. Badania przeprowadzone
cyst
do
Acanthamoeba
celów
z celulazą pozyskaną z Clostridium
cellulovorans dały identyczne wyniki z opisanymi powyżej. Wykorzystanie celulazy
dostępnej na rynku, pozwoli na łatwiejsze wykorzystanie metody do celów diagnostycznych.
Opisane
przeze
mnie
koniugaty
CBD
są
alternatywnymi
narzędziami
diagnostycznymi wykorzystywanymi do bezpośredniego barwienia cyst Acanthamoeba
w próbach tkankowych pochodzących od pacjentów. Mogą one być również
przydatnymi narzędziami do identyfikacji pełzaków pochodzących ze środowiska.
Publikacja 3
W diagnostyce chorób pasożytniczych coraz częściej stosuje się metody molekularne.
Podstawową metodą jest reakcja PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy). W publikacjach
naukowych opisano kilka różnych par starterów wykorzystywanych w technice PCR do
identyfikacji pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
W środowisku występuje szereg pełzaków wolno żyjących należących do rodzajów
Acanthamoeba, Balamuthia, Echinamoeba, Hartmannella, Naegleria, Mastigina, Sappinia,
Vahlkampfia, Vannella oraz Vexillifer. Potencjalnie najbardziej niebezpieczne dla ludzi są
niektóre gatunki należące do rodzaju Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia oraz Sappinia.
Z tego też powodu istotna jest właściwa identyfikacja pełzaków wolno żyjących.
Zastosowanie techniki PCR nie zawsze pozwala na prawidłowe zidentyfikowanie
pełzaków wolno żyjących. W reakcji PCR często powstają nieswoiste produkty.
Stąd też kolejnym etapem moich badań, było znalezienie jak najlepszej pary starterów
wykorzystywanej w reakcji PCR do wykrywania pełzaków z rodzaju Acanthamoeba. Moje
badania opisane w pracy „Comparative analyses of different genetic markers for the
detection of Acanthamoeba spp. isolates” dotyczyły efektywności techniki PCR
w akantamebozie.
W pracy tej porównałam efektywność działania najpopularniejszych par starterów
wykorzystywanych w reakcji PCR do identyfikacji pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
Zbadałam działanie następujących starterów: startery Aca 16S for i rev (Yagi et al., 2007),
Nelson for i rev (Mathers et al., 2000), GP 1383 for i GP 1655 rev (Lehmann et al., 1998),
Ac6/210 for i rev (Howe et al., 1997) oraz JDP1 i JDP2 (MacLean et al., 2007).
Celem pracy było opracowanie szybkiej metody wykrywania i identyfikacji pełzaków
z rodzaju
Acanthamoeba spp. Do badań wykorzystałam szczepy wzorcowe pełzaków:
Strona 9 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Acanthamoeba castellanii – 309 (Kasprzak and Mazur 1972), A. polyphaga – 298 (Kasprzak
and Mazur 1972), A. rhysodes – Chang (Pussard and Pons 1977), Hartmannella
vermiformis – ATCC 50256 oraz izolaty pełzaków pochodzące z wody wodociągowej,
z gejzera Strokkur na Islandii oraz z jeziora Malta w Poznaniu.
Wszystkie szczepy pełzaków poddałam identyfikacji przy użyciu tradycyjnych metod
stosowanych w diagnostyce akantamebozy tj.: założyłam hodowle na podłożu agarowym,
a następnie hodowle akseniczne na podłożu płynnym, wykonałam preparaty barwione,
dokonałam pomiaru cyst, w przypadku pełzaków z rodzaju Naegleria wykonałam również
test flagellacji. W przypadku wszystkich prób wykonałam testy na zwierzętach
doświadczalnych w celu zbadania patogeniczności pełzaków. Z badanych pełzaków
wyizolowałam DNA, a następnie wykonałam reakcje PCR.
Startery, które wykorzystałam w swoich badaniach były wcześniej opisane przez
różnych autorów jako swoiste do wykrywania pełzaków z rodzaju Acanthamoebae. Niestety
moje badania nie potwierdziły ich swoistości. Większość zbadanych przeze mnie par
starterów okazała się nieswoista dla Acanthamoeba. Próby wykorzystania ich do identyfikacji
pełzaków z prób środowiskowych okazały się niezadawalające. Przy ich zastosowaniu można
było błędnie identyfikować jako Acanthamoeba również pełzaki innych rodzajów, jak np.
Hartmanella, czy Neagleria.
Z pięciu przebadanych par starterów tylko jedna okazała się swoista do wykrywania
Acanthamoeba i pozwoliła na rozróżnienie szczepów Acanthamoeba od innych pełzaków
wolno żyjących. Są to startery Aca 16S. Najmniej przydatna okazała się para starterów GP,
przy pomocy której można było wykryć tylko w niektórych pozytywnych (potwierdzonych
tradycyjnymi metodami) próbach pełzaki z rodzaju Acanthamoeba. Pozostałe startery były
zbyt mało swoiste ponieważ oprócz Acanthamoeba wykrywały również pełzaki z rodzaju
Hartmanella lub Naegleria.
Na podstawie badań, stwierdziłam, że cztery z pięciu przebadanych par starterów
(ACA 16S, AC 6/210, JDP, Nelson) mogą być zaledwie pomocne w identyfikacji
pełzaków wolno żyjących, a tylko jedna z nich jest swoista dla rodzaju Acanthamoeba.
Wykazałam, że dzięki zastosowaniu techniki PCR, z wykorzystaniem starterów Aca
16S, można w krótkim czasie wykryć i rozpoznać w badanym materiale obecność
pojedynczych trofozoitów lub cyst pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
Strona 10 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Terapia doświadczalna w akantamebozie
Akantameboza jest rzadką, ale bardzo trudną w leczeniu chorobą pasożytniczą.
Jak już wcześniej wspomniałam w terapii akantamebozy stosuje się zazwyczaj leczenie
kompleksowe z wykorzystaniem antybiotyków i środków dezynfekcyjnych. Są to często
substancje silnie drażniące i toksyczne dla pacjenta. Z tych też powodów co raz częściej
poszukuje się nowych leków, zwłaszcza co raz popularniejszych środków pochodzenia
roślinnego. W terapii akantamebozy zbadano dotychczas możliwość zastosowania ekstraktów
z Buddleia cordata, Pterocaulon
polystachyum, Arachis
hypogaea, Curcuma
longa,
Pancratinum maritimum, Peucedanum caucasicum, P. palimbioides, P. chryseum,
P. longibracteolatum, Pouzolzia indica, Teucrium polium, T. chamaedrys, Croton pallidulus,
C. ericoides, C. isabelli i innych. Większość ze zbadanych dotychczas roślin, to rośliny
występujące w strefie tropikalnej lub subtropikalnej. W przypadku niektórych z nich
stwierdzono obiecujące efekty terapeutyczne.
Zastosowanie fitoterapii w zwalczaniu chorób pasożytniczych, a szczególnie w terapii
akantamebozy, to kolejny temat moich zainteresowań naukowych. Celem moich badań stało
się znalezienie naszych rodzimych roślin, które podobnie jak już opisane rośliny tropikalne
mogłyby znaleźć zastosowania w leczeniu akantamebozy. Efektem moich badań jest cykl
prac dotyczących terapii doświadczalnej. W/w prace to „Plant extracts as natural amoebicidal
agents”, “The evaluation of the amebicidal activity of Eryngium planum extracts”,
“Tanacetum vulgare L. jako roślina o potencjalnych właściwościach leczniczych
w Acanthamoeba keratitis”, „Abietane diterpenoids from Salvia sclarea transformed roots as
growth inhibitors of pathogenic Acanthamoeba spp.” oraz „Artemisia annua L. as a plant with
potential use in the treatment of acanthamoebiasis”.
Publikacja 4
Celem pracy „Plant extracts as natural amoebicidal agents” było zbadanie
pełzakobójczego lub pełzakostatycznego działania ekstraktów roślinnych uzyskanych
z Solidago virgaurea L. (nawłoć pospolita), Solidago graminifolia L. (nawłoć wąskolistna),
Pueraia lobata (Wild.) (ołownik łatkowaty) oraz Rubus chamaemorus L.(malina moroszka).
Badania opisane w powyższej publikacji przeprowadziłam we współpracy z Katedrą
i Zakładem Botaniki Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu.
Strona 11 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Materiałem roślinnym stosowanym do sporządzenia ekstraktów były nadziemne części
roślin wraz z kwiatami z S. virgaurea i S. graminifolia, korzenie z P. lobata oraz liście
z R. chamaemorus.
Badane ekstrakty roślinne były analizowane fitochemicznie na obecność flawonoidów
w S. virgaurea i S. graminifolia, kwasu elagowego w R. chamaemorus i izoflawonów
w P. lobata. Badania fitochemiczne wyciągów przeprowadzano metodami chromatografii
kolumnowej, chromatografii cienkowarstwowej preparatywnej i HPLC (wysokosprawna
chromatografia cieczowa).
Materiałem badanym były również czyste substancje chemiczne pochodzenia
roślinnego, takie jak kwas ellagowy (Fluka), którego jednym ze źródeł są liście
R. chamaemorus i pueraryna (Sigma), główny z izoflawonów obecnych w P. lobata.
Dodatkowo przebadałam frakcje chloroformowe i eterowe metanolowego wyciągu
z kwiatów i liści Solidago graminifolia. We frakcjach tych wykazano obecność szeregu
lipofilnych flawonoidów. Z wybranej do dalszych badań frakcji chloroformowej
z kwiatostanów, w wyniku chromatografii kolumnowej i chromatografii cienkowarstwowej
preparatywnej wyodrębniono najbardziej lipofilny flawonoid. Na podstawie analizy
spektralnej w nadfiolecie (UV) wysunęłam wniosek, że związek ten jest pochodną flawonu
lub flawonolu. Dalsze badania wyodrębnionych flawonoidów polegały na ich oczyszczeniu
na kolumnach z zastosowaniem celulozy, poliamidu i Sephadexu LH20. Otrzymaną
mieszaninę lipofilnych flawonoidów rozdzielono metodą chromatografii preparatywnej na
poliamidzie na 10 związków, które ostatecznie oczyszczono na Sephadexie LH-20. Trzy
związki spośród najbardziej lipofilnych składników zidentyfikowano przy pomocy metod
spektralnych i spektroskopii UV. Zidentyfikowano następujące substancje: 5,7-dihydroxy6,8,3’,4’-tetrametoxyflawon; 5,7-dihydroxy-6,3’,4’-trimetoxyflawon oraz 5,7,4’-trihydroxy6,8,3’,5’-tetrametoxyflawon.
Głównym związkiem fenolowym występującym w ekstraktach z liści gatunku Rubus
chamaemorus L. jest kwas elagowy, który jest prawdopodobnie odpowiedzialny za działanie
ekstraktu. Metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oznaczono ilość
wolnego i całkowitego (uwolnionego przez hydrolizę) kwasu elagowego w R. chamaemorus.
Ponadto metodę chromatografii cienkowarstwowej stwierdzono w ekstraktach obecność
kwasu galusowego i małe ilości flawonów.
W ekstrakcie z liści Pueraria lobata, głównymi metabolitami są związki należące do
grupy izoflawonów: daidzeina, genisteina i formononetyna. W młodych korzeniach P. lobata,
Strona 12 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
metodą chromatografii cienkowarstwowej stwierdzono także obecność izoflawonu –
pueraryny.
Wpływ substancji leczniczych uzyskanych z roślin testowałam in vitro na szczepie
309 Acanthamoeba castellanii (patogeniczny dla myszy, izolowany ze środowiska; Kasprzak
i Mazur 1972), oraz szczepie „Ograbek” Acanthamoeba sp. (patogenicznym dla człowieka,
izolowanym z przypadku Acanthamoeba keratitis – szczep własny nieopisany).
Szczepy wzrastały aksenicznie na podłożu płynnym opisanym przez Červę (1969). Do
aksenicznej hodowli pełzaków (5x104 komórek/ml) dodawałam ekstrakty roślinne
w stężeniach od 0,01 mg/ml do 1,5 mg/ml. Przyrost liczby pełzaków badałam w odstępach 24
godzinnych, stosując komorę Thoma. Kontrolę stanowiła hodowla pełzaków bez środków
leczniczych. Przeprowadziłam również badania wpływu ekstraktów roślinnych na przebieg
zarażenia u zwierząt. Zarażonym myszom codziennie przez 3 dni podawałam dootrzewnowo
sterylnie przygotowane roztwory ekstraktów roślinnych w stężeniach od 0,1 do 0,5 mg
suchego ekstraktu na 1 g wagi myszy.
Następnie wyznaczyłam współczynnik IC50 (najniższe stężenie badanej substancji,
które hamuje wzrost pełzaków w 50%), LD50 (dawka powodująca zgon 50% populacji
myszy), ED50 (dawka przy której 50% badanych osobników wykazuje oczekiwany efekt
terapeutyczny) oraz TI (indeks terapeutyczny - stosunek dawki leku wywołującej objawy
toksyczne do dawki wywołującej efekt terapeutyczny).
Przeprowadzone przeze mnie badania po raz pierwszy wykazały, że ekstrakty
z Solidago virgaurea, Solidago graminifolia, Pueraia lobata oraz Rubus chamaemorus
wykazują działanie pełzakobójcze zarówno w warunkach in vitro, jak również
w warunkach in vivo. Ekstrakty z S. virgaurea i P. lobata oraz substancje czyste, takie
jak kwas ellagowy i pueraryna mają właściwości pełzakobójcze w warunkach in vitro już
w stężeniach poniżej 0,01 mg/ml, natomiast ekstrakty z S. graminifolia oraz R. chamaemorus
w stężeniu ok. 0,05 mg.ml.
Najwyższy indeks
terapeutyczny TI stwierdzono
w przypadku
ekstraktów
z R. chamaemors i wynosi on 20; dla S. virgaurea indeks terapeutyczny wynosi 7,5.
Badania wykazały, że preparaty lecznicze przygotowane z przebadanych przeze
mnie ekstraktów mogłyby być stosowane w kombinowanej terapii z antybiotykami.
W przypadkach zarażenia ludzi Acanthamoeba spp., kombinowana terapia w połączeniu
z antybiotykami będzie bardziej skuteczna niż terapia samym, pojedynczym lekiem.
Strona 13 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Wykorzystanie właściwości pełzakobójczych zbadanych przeze mnie ekstraktów
może być bardzo istotne ze względu na fakt iż wiele stosowanych obecnie leków posiada
właściwości pełzakostatyczne, lecz nie posiada właściwości pełzakobójczych.
Publikacja 5
Tanacetum vulgare L. (wrotycz pospolity) to roślina należący do rodziny astrowatych.
Występuje w całej Europie i na obszarach Azji o umiarkowanym klimacie, a co ważniejsze
jest gatunkiem bardzo pospolitym w Polsce. Jest to roślina od dawna stosowana w medycynie
ludowej, ale po raz pierwszy podjęłam próbę wykorzystania jej w terapii akantamebozy.
Wyniki moich badań opisałam w pracy “Tanacetum vulgare L. jako roślina
o potencjalnych właściwościach leczniczych w Acanthamoeba keratitis”.
Wykazałam, że ekstrakty uzyskane z Tanacetum vulgare wykazują silne działanie
pełzakostatyczne. Surowcem leczniczym są części nadziemne rośliny – ziele i kwiaty. Ziele
wrotyczu zawiera do 0.6% olejku lotnego, a kwiaty od 1 do 1,5%. Głównym składnikiem
olejku jest toksyczny β-tujon (około 70%), kamfora, borneol, α-pinen, 1,8-cyneol, sabinen.
Pozostałe składniki to terpenoidy, steroidy oraz flawonoidy, pochodne kwercetyny i luteoliny
oraz akacetyna, kwas kawowy, garbniki, kwas askorbinowy i sole mineralne. Lecznicze
działanie tej rośliny związane jest przede wszystkim z obecnością β- tujonu oraz laktonów
seskwiterpenowych. Badania wykazały, że ekstrakty sporządzone już z około 25 mg suchej
masy rośliny na 1 ml roztworu, wykazują silne właściwości terapeutyczne przeciw pełzakom
Acanthamoeba spp. Niestety badania przeprowadzone na myszach wykazały, że substancje
te działają toksyczne nie tylko na pełzaki, ale i na zwierzęta. Ze względu na potencjalnie silne
właściwości toksyczne wrotyczu, preparaty uzyskane z tej rośliny prawdopodobnie będzie
można stosować tylko zewnętrznie np. w AK.
Publikacja 6
Efektem moich dalszych badań jest praca “The evaluation of the amebicidal activity
of Eryngium planum extracts”. Badania opisane w powyższej publikacji przeprowadziłam
we współpracy z Katedrą i Zakładem Botaniki Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego
w Poznaniu, z Zakładem Biochemii i Jakości Plonów IUNG w Puławach oraz z Laboratorium
Kontroli Jakości w Phytopharm Klęka S.A.
Celem badań było zbadanie pełzakobójczego i pełzakostatycznego działania
ekstraktów etanolowych otrzymanych z liści odziomkowych i korzeni Eryngium planum L.
(mikołajek płaskolistny). Rośliny zostały zebrane z naturalnego stanowiska, na Kujawach.
Strona 14 z 29
Załącznik 2a
Wykonano
dr Monika Derda
analizę
fitochemiczną
ekstraktów
przy
użyciu
chromatografii
cienkowarstwowej TLC oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC. Następnie
w wyniku rozdziału ekstraktów metodą chromatografii kolumnowej otrzymano szereg frakcji.
W badaniach wykorzystałam sześć frakcji tj.: flawonoidową, flawonoidowo-saponinową,
saponinową oraz kwasów fenolowych uzyskane z liści oraz saponinową i kwasów
fenolowych z korzeni.
Na podstawie chromatogramów HPLC oraz profili MS stwierdzono, że
frakcje
saponinowe otrzymane z etanolowych ekstraktów z liści i korzenia E. planum zawierały
saponiny triterpenowe. Natomiast frakcja kwasów fenolowych z liści i korzeni zawierała
głównie: kwas rozmarynowy, kwas chlorogenowy, kwas kawowy oraz heksozyd kwasu
rozmarynowego.
Działanie pozyskanych frakcji testowałam w warunkach in vitro na patogenicznym
szczepie Acanthamoeba castellanii 309 (Kasprzak i Mazur 1972). Pełzaki pochodziły
z hodowli aksenicznej na podłożu płynnym Červy (Červa 1969). Przyrost liczby pełzaków
badałam w odstępach 24 godzinnych, stosując komorę Thoma.
Przeprowadzone
przeze
mnie
badania
działania
pełzakobójczego
oraz
pełzakostatycznego wybranych frakcji z E. planum wykazały, że zarówno frakcje
saponinowe, jak i frakcje kwasów fenolowych pozyskane z liści i korzeni działają
pełzakostatycznie na pełzaki z rodzaju Acanthamoeba. Najefektywniejsze działanie
stwierdziłam w zakresie stężeń od 1mg/ml do 5 mg/ml hodowli pełzaków. Najwyższy spadek
liczby trofozoitów obserwowano po podaniu frakcji saponinowej z liści w stężeniu 1 mg/ml.
Stwierdziłam, że zarówno frakcje saponinowe, jak i frakcje kwasów fenolowych
mogłyby znaleźć zastosowanie w fitoterapii akantamebozy.
Pozostałe frakcje
(flawonoidowo-saponinowa i flawonoidowa) są nieprzydatne w terapii akantamebozy.
Frakcja flawonoidowo-saponinowa hamuje wzrost trofozoitów już w stężeniu 2 mg/ml, ale
równocześnie indukuje encystację pełzaków. Natomiast frakcja flawonoidowa z liści
E. planum pobudza pełzaki do wzrostu.
Publikacja 7
Dzięki współpracy z panią prof. dr hab. Haliną Wysokińską i dr n. farm. Łukaszem
Kuźmą z Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego
w Łodzi powstała kolejna moja publikacja pt.: „Abietane diterpenoids from Salvia sclarea
transformed roots as growth inhibitors of pathogenic Acanthamoeba spp.”.
Strona 15 z 29
Załącznik 2a
Celem
dr Monika Derda
badań
opisanych
w
tej
pracy
było
zbadanie
pełzakobójczego
i pełzakostatycznego działania diterpenów wyizolowanych z Salvia sclarea (szałwia
muszkatałowa). W badaniach wykorzystaliśmy cztery diterpeny: salvipison, aethiopinon,
1 xoethiopinon i ferruginol. Substancje te uzyskano z kultur korzeni transgenicznych
(włośnikowych) transformowanych genetycznie przy pomocy Agrobacterium rhizogenes. Do
ich identyfikacji oraz oczyszczenia zastosowano cienkowarstwową chromatografię cieczową
(TLC).
Działanie diterpenów testowałam w warunkach in vitro na patogenicznym szczepie
Acanthamoeba. Pełzaki podobnie jak w innych eksperymentach hodowałam w płynnych
kulturach aksenicznych.
Wykazałam, że ferruginol wykazuje aktywność pełzakostatyczną już w stężeniach
0,01 - 0,5 mg/ml, natomiast salvipison i aethiopinon wykazują podobne działanie dopiero
w stężeniach 1 - 5 mg/ml. W najwyższych stężeniach uzyskałam zahamowanie wzrostu
pełzaków nawet do 97%. Najsłabsze działanie stwierdziłam w przypadku zastosowania
1 oxoethiopinonu, który wykazywał bardzo słabe działanie pełzakostatyczne.
Publikacja 8
Kolejną rośliną, która wzbudziła moje zainteresowanie jest Artemisia annua L. (bylica
roczna). Działanie tej rośliny opisałam w pracy „Artemisia annua L. as a plant with
potential use in the treatment of acanthamoebiasis”.
A. annua jest jednoroczną rośliną, która występuje dziko w Azji oraz Europie
południowej. Została ona również zawleczona do Polski, Danii, Holandii, Francji, Włoch,
Lichtensteinu oraz Austrii.
A. annua uważana jest za roślinę leczniczą, ale w literaturze zielarskiej wymienia się
ją sporadycznie (Wąsowicz 2004). Dotychczas za najważniejsze uznawano wykorzystanie jej
właściwości leczniczych w malarii (De Donno et al. 2012; Ho et al. 2013). Roślina działa
również na niektóre płazińce, grzyby, bakterie oraz wirusy.
Celem moich badań było zbadanie, czy wykazuje ona działanie pełzakobójcze i/lub
pełzakostatyczne.
W badaniach wykorzystałam ekstrakty metanolowe i chloroformowe z części
nadziemnych rośliny, napar z rozdrobnionego materiału roślinnego, suchy ekstrakt z A. annua
10:1 produkcji Chińskiej (Magiczny Ogród, Poland) rozpuszczany na gorąco w wodzie
destylowanej oraz czystą artemizyninę (firmy Sigma Chemical Company).
Strona 16 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Badania przeprowadziłam w warunkach in vitro oraz in vivo. Do badań
wykorzystałam szczep 309 Acanthamoeba castellanii - patogenicznym dla myszy,
izolowanym ze środowiska (Kasprzak and Mazur 1972), oraz szczepie Ac32 Acanthamoeba
sp. - patogenicznym dla człowieka, izolowanym z przypadku Acanthamoeba keratitis,
genotyp T4 (numer akcesyjny KP184479). Pełzaki hodowałam w płynnych kulturach
aksenicznych oraz na podłożu stałym NN (non-nutrient agar). Badania wpływu ekstraktów
z Artemisia annua na przebieg zarażenia pełzakami testowałam na myszach szczepu BALB/c.
Moje
badania
wskazały,
że
zarówno
ekstrakty
wodne,
alkoholowe,
chloroformowe z ziela A. annum L. oraz czystej artemizyniny działają pełzakobójczo i
pełzakostatycznie. Użycie niskich stężeń preparatów (już ok. 5 mg/ml) powodowało
zahamowanie wzrostu pełzaków, a ponadto powiększenie objętości pełzaków i ich silną
wakuolizację. Pełzaki zwakuolizowane nie przekształcały się w cysty, a po kilku dniach
ulegały rozpadowi.
W przypadku zwierząt doświadczalnie zarażonych pełzakami z rodzaju
Acanthamoeba,
stosowanie
ww.
preparatów
znacznie
wydłuża
przeżywalność
zarażonych zwierząt.
Uzyskane wyniki są najlepsze ze wszystkich dotychczas badanych substancji
roślinnych.
Podsumowanie
Moje osiągnięcia naukowe dotyczą przede wszystkim opracowania nowej metody
diagnostycznej pozwalającą na wykrywanie pełzaków z rodzaju Acanthamoeba. Metodą tą
można wykrywać cysty Acanthamoeba spp. w materiale biologicznym pochodzącym od
pacjentów oraz w próbach środowiskowych. Opracowałam kilka wariantów tej metody.
Dzięki zaprojektowaniu różnych koniugatów umożliwiłam wykrywanie celulozy w ścianie
cyst Acanthamoeba w świetle widzialnym oraz UV.
Ponadto porównałam efektywność działania najpopularniejszych par starterów
opisanych w literaturze do identyfikacji techniką PCR pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
Dzięki temu znalazłam parę starterów, która jest najbardziej swoista do wykrywania
Acanthamoeba i pozwala na rozróżnienie szczepów Acanthamoeba od innych pełzaków
wolno żyjących.
W przeprowadzonych przeze mnie badaniach po raz pierwszy zajęłam się możliwością
wykorzystania rodzimych roślin w fitoterapii akantamebozy. Zbadałam działanie ekstraktów
Strona 17 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
roślinnych z kilku bardzo popularnych w Polsce roślin tj. Solidago virgaurea L. (nawłoć
pospolita), Solidago graminifolia L. (nawłoć wąskolistna), Pueraia lobata (Wild.)(ołownik
łatkowaty), Rubus chamaemorus L.(malina moroszka)., Tanacetum vulgare L. (wrotycz
pospolity), Eryngium planum L. (mikołajek płaskolistny), Artemisia annua L. (bylica roczna),
jak również wielu substancji z nich pozyskanych. Badania te mogą pomóc w znalezieniu
nowych leków, które będą skuteczne w terapii akantamebozy i jednocześnie nie będą
wywoływały reakcji niepożądanych dla pacjenta.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych.
Podczas mojej wieloletniej pracy w Katedrze i Zakładzie Biologii i Parazytologii
Lekarskiej uczestniczyłam i nadal uczestniczę w licznych pracach badawczych.
W dotychczasowej mojej działalności naukowej można wyróżnić kilka głównych
kierunków badań. Przede wszystkim równolegle z badaniami opisanymi w cyklu
habilitacyjnym od 20 lat prowadzę badania, których obiektem jest nicień Trichinella spiralis.
Prowadzone przeze mnie badania dotyczą:
 biochemicznych mechanizmów obronnych zachodzących w układzie pasożyt-żywiciel
w przebiegu doświadczalnej trichinellozy;
 udziału antyoksydantów enzymatycznych i nieenzymatycznych w mechanizmach
obronnych żywiciela;
 roli tlenku azotu w procesach obronnych żywiciela w przebiegu doświadczalnej
włośnicy;
 udziału transferazy-S-glutationowej w procesach detoksykacyjnych;
 roli receptorów toll-podobnych w odpowiedzi żywiciela na inwazje pasożytnicze.
Wyniki badań dotyczących mechanizmów obronnych zostały zawarte w 12 pracach
oryginalnych, których jestem współautorem. Biochemiczne mechanizmy obronne żywiciela
były przez nas badane w fazie jelitowej i mięśniowej włośnicy. W przeprowadzonych
badaniach stwierdziliśmy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich, jak
dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa i transferaza glutationowa oraz wzrostu
poziomu antyoksydantów nieenzymatycznych (TAS – całkowitego stężenia antyoksydantów).
Aktywność wzrastała zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i we krwi myszy zarażonych
T. spiralis. Zaobserwowany przez nas wzrost aktywności badanych enzymów oraz TAS
świadczy o udziale tych antyoksydantów w biochemicznych mechanizmach obronnych
Strona 18 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
żywiciela powiązanych z wolnymi rodnikami tlenowymi (Derda i Hadaś, 2000; Derda i wsp.
2004).
Równolegle badałam wpływ różnych grup leków stosowanych w leczeniu włośnicy na
poziom antyoksydantów w tkankach żywiciela. Badanymi lekami były: metyloprednizolon lek z grupy glikokortykoidów o przedłużonym działaniu przeciwzapalnym, lewamizol – lek
immunomodulujący
W przeprowadzonych
oraz
albendazol
badaniach
-
anthelmintyk
wykazaliśmy,
że
z
grupy
metyloprednizolon
benzimidazoli.
normalizował
podwyższoną aktywność peroksydazy oraz dysmutazy ponadtlenkowej w tkance żywiciela
w fazie mięśniowej włośnicy. Natomiast albendazol wyraźnie indukował aktywność
transferazy glutationowej w mięśniach myszy zarażonych T. spiralis (Boczoń i wsp. 1996;
Wandurska-Nowak i wsp. 1998).
Należy podkreślić nowatorski charakter tych badań. Aktualnie rozważa się bowiem
koncepcję wielofunkcyjnego mechanizmu działania anthelmintyków, w tym również
benzimidazoli.
Obecnie
uważa
się,
że
cechą
charakterystyczną
wielu
leków
przeciwpasożytniczych jest wielokierunkowość ich działania. Poza tym, prawdopodobnie
skuteczność terapii anthelmintykami może być dodatkowo wzmocniona przez ich
oddziaływanie na mechanizmy obronne żywiciela.
Badania udziału i roli wolnych rodników oraz antyoksydantów w biochemicznych
mechanizmach obronnych żywiciela są nadal aktualnym kierunkiem badań. Mogą się one
przyczynić do dokładniejszego wyjaśnienia patomechanizmu zaburzeń we włośnicy.
Celem dalszych badań, dotyczących biochemicznych mechanizmów obronnych
powiązanych z wolnymi rodnikami, było określenie udziału wolnych rodników azotowych
w procesach obronnych żywiciela. Przedmiotem naszych badań był udziału tlenku azotu (NO)
i indukowalnej syntazy NO (iNOS) w procesach obronnych żywiciela w przebiegu
doświadczalnej włośnicy u myszy. Od niedawna wiadomo, że tlenek azotu jest
wszechstronnym regulatorem wielu procesów zachodzących w żywych organizmach,
a najważniejszą funkcją NO syntetyzowanego przez iNOS jest udział w nieswoistej
odpowiedzi immunologicznej, stymulowanej przez limfocyty Th1. Podjęta przez nas
tematyka badawcza z pogranicza biochemii i immunologii dotyczy mechanizmów zmian
patologicznych w tkankach żywiciela, wywołanych obecnością pasożyta. W tkankach myszy
zarażonych T. spiralis stwierdzono podwyższony poziom tlenku azotu, co świadczy o udziale
NO produkowanego przez iNOS w biochemicznych procesach obronnych żywiciela. Podanie
zarażonym zwierzętom albendazolu wywołało dodatkową stymulację poziomu NO
w tkankach żywiciela, co wskazuje, że ten lek może również poza bezpośrednią aktywnością
Strona 19 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
przeciwpasożytniczą przyczyniać się do intensyfikacji biochemicznych procesów obronnych
żywiciela (Wandurska-Nowak i wsp. 2003). Sprawdziliśmy również jaki efekt może wywołać
podawanie endogennego NO w trakcie inwazji pasożytniczej. Podawaliśmy zarażonym
zwierzętom leki biorące udział w uwalnianiu egzogennego NO, takie jak: Nitrogliceryna,
Izosorbid, Nitrendypina, Sildenafil oraz Pentaerythritol. Wykazaliśmy, że podawanie przez
dłuższy czas w trakcie włośnicy dużych dawek egzogennego NO, w postaci niektórych
powszechnie stosowanych leków uwalniających NO, przyczynia się do nasilenia
intensywności zarażenia larwami włośnia (Hadaś i wsp. 2002).
W ostatnich latach brałam również udział w badaniach roli transferaz-Sglutationowych (GST) w mechanizmach obronnych. Transferazy –S-glutationowe to grupa
wielofunkcyjnych enzymów, które odgrywają kluczową rolę w detoksykacji komórek.
W naszych badaniach zajmowaliśmy się udziałem GST w biochemicznej obronie przed
zarażeniem Trichinella spiralis. Jednym z naszych celów było zbadanie wpływu inwazji
T. spiralis na całkowitą aktywność GST oraz zbadanie właściwości kinetycznych cytozolowej
GST w jelicie oraz w mięśniach szkieletowych myszy. Badaliśmy kinetykę reakcji
enzymatycznych zachodzących w przebiegu fazy jelitowej i mięśniowej włośnicy.
Stworzyliśmy wykres Lineweavera–Burka, a następnie wyznaczyliśmy stałą Michaelisa (Km)
dla przebiegu reakcji enzymatycznej. Przedstawiał on kinetykę GST nasycenia substratu
w jelitach i mięśniach myszy zarażonych T. spiralis. Substratem w tej reakcji była
Zredukowana forma glutationu GSH.
Wyniki nasze wykazały statystycznie znamienny
wzrost aktywności całkowitej GST w jelicie cienkim i grubym u myszy. Ponadto
stwierdziliśmy, że inwazja Trichinella wywołuje w jelicie cienkim 12-krotny spadek wartości
Km w niskim stężeniu substratu i sześciokrotny wzrost wartości w wysokim zakresie Km.
W jelicie grubym inwazja wywołuje jedynie pięciokrotny spadek wartości Km w niskich
stężeniach substratu, podczas gdy wartość Km w wysokich stężeniach substratu , pozostaje
bez zmian. Wyniki te sugerują że GST z jelita cienkiego myszy może uczestniczyć
w usuwaniu produktów wydalniczo-wydzielniczych pasożyta do jelita żywiciela podczas
włośnicy. Wyniki badań sugerują, że obecność pasożyta i prawdopodobnie jego produktów
wydalniczo-wydzielniczych w jelicie zarażonej myszy, silnie stymuluje całkowitą aktywność
GST. Jednocześnie modyfikuje to kinetyka tego enzymu zmieniając jego właściwości
katalityczne (Wojtkowiak-Giera i wsp. 2011). Dokonaliśmy również oceny wpływu
albendazolu na kinetykę cytozolowej GST w mięśniach szkieletowych. Uzyskane przez nas
wyniki wykazały w trzecim tygodniu po zarażeniu, 2,3- krotny wzrost Km w wysokich
stężeniach substratu oraz ponad 2,8-krotny spadek Km w niskich stężeniach substratu.
Strona 20 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
W szóstym tygodniu po zarażeniu Km w wysokich stężeniach substratu nie uległo zmianie,
natomiast w niskich stężeniach wzrosło 2,3-krotnie. Ponadto wyniki naszych badań wskazują
na dodatkowe zmiany w kinetyce nasycenia substratu GST w mięśniach myszy zarażonych
T. spiralis i leczonych albendazolem (Wojtkowiak-Giera i wsp. 2007). Badaliśmy również
wpływ albendazolu na cytoplazmatyczną transferazę-S-glutationową oraz zmiany aktywności
GST przed i po leczeniu lewamizolem. Po leczeniu albendazolem stwierdzono dwukrotną
stymulację GST w mięśniach, w drugim tygodniu od zarażenia oraz w fazie mięśniowej (6-7
tydzień). Podczas leczenia lewamizolem szczyt stymulacji GST przypadał na 2 i 4 tpz. Żaden
z leków nie wywoła zmian aktywności GST w surowicy. Wynik te sugerują, że oba leki
zwiększają całkowitą aktywność GST biorącej udział w biochemicznych mechanizmach
obronnych z wolnymi rodnikami tlenowymi (Derda i wsp. 2003). Zbadaliśmy również
wpływ albendazolu na transferazę glutationową w jelitach. Uzyskane wyniki wykazały
statystycznie znamienny spadek aktywności całkowitej GST w jelicie cienkim i grubym
myszy zarażonych T. spiralis i leczonych albemdazolem, w porównaniu z myszami
nieleczonymi. Ponadto stwierdziliśmy, że podawanie albendazolu modyfikuje kinetykę
nasycenia substratem GST w jelitach, ponieważ lek zmienia wartości stałej Michaelisa tego
enzymu. Na podstawie naszych badań możemy przypuszczać, że albendazol wpływa na
całkowitą aktywność i kinetykę GST. Prawdopodobnie powoduje on również zmiany
w czwartorzędowa strukturze tego enzymu. Doszliśmy do wniosku, że skoro GST bierze
udział w biochemicznej obronie żywiciela, może to mieć dodatkowy wpływ na mechanizmy
obronne żywiciela (Wojtkowiak-Giera i wsp. 2012)
Jak już wcześniej wspominałam dwa główne modele badawcze, którymi zajmuję się
równolegle od wielu lat to nicień Trichinella spiralis
oraz pełzaki wolno żyjące
z wyszczególnieniem pełzaków z rodzaju Acanthamoeba. W kręgu moich zainteresowań
znalazła się nie tylko diagnostyka i terapia akantamebozy, ale również biologia,
epidemiologia, jak również rola pełzaków wolno żyjących w transporcie innych patogenów.

Stąd też kolejne moje badania dotyczyły pełzaków jako przenosicieli patogenicznych
bakterii.
Mechanizm wywoływania zmian chorobotwórczych przez pełzaki z rodzaju
Acanthamoeba nie jest do końca poznany. Wiadomo, że może być on związany
z odżywianiem się pełzaka tkanką żywiciela. Jednakże coraz częściej bierze się pod uwagę
rolę pełzaków jako przenosicieli chorobotwórczych bakterii. Pełzaki w naturalnym
środowisku w znacznym stopniu ograniczają liczebność populacji bakterii, ale mogą też
Strona 21 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
ułatwiać przeżywalność chorobotwórczych dla człowieka szczepów, stanowiąc ich naturalny
rezerwuar.
Żyjące w środowisku naturalnym bakterie stanowią główne źródło pokarmu dla
pełzaków. Jednakże istnieją gatunki bakterii, którym udało się rozwinąć mechanizmy
ochronne przed sfagocytowaniem, lub mechanizmy blokujące procesy zabijania i trawienia po
wchłonięciu przez komórkę pierwotniaka. I tak niektóre populacje bakterii potrafią
wykorzystać dostęp do bogatego i bezpiecznego wewnątrzkomórkowego środowiska dla
własnej reprodukcji lub ochrony przed skutkami oddziaływań szkodliwych czynników
środowiska zewnętrznego. W takich przypadkach, po wchłonięciu przez pierwotniaka
bakterie hamują fuzję fagocytosomu z lizosomami uniemożliwiając rozpoczęcie procesu
wewnątrzkomórkowego trawienia. Bakterie namnażają się w wodniczkach pokarmowych.
Końcowym etapem infekcji jest liza komórki gospodarza, prowadząca do uwolnienia nowych
generacji bakterii. W niektórych przypadkach (Listeria monocytogenes) obserwujemy jednak
inny model zakażenia komórki pierwotniaka. Bezpośrednio po wchłonięciu bakteria uwalnia
się z fagocytarnej wakuoli i przenika do cytoplazmy, w której mnoży się aż do spowodowania
lizy komórki gospodarza (Ly i wsp. 1990). Znane są także gatunki mnożące się bez
wywołania
lizy
(Vibrio
cholerae)
oraz
gatunki
przeżywające
bez
możliwości
wewnątrzkomórkowych podziałów (Thom i wsp. 1992).
Bakterie, które uwalniają się z komórki pierwotniaka mogą ponownie zakażać inne
pełzaki, lub dostawać się do organizmu człowieka np. podczas wdychania aerozoli
zawierających ich infekcyjne formy. Inną drogą transmisji mogą być uwalniane przez pełzaki,
zwłaszcza przez gatunki z rodzaju Acanthamoeba pęcherzyki, zawierające duże ilości
bakterii, które mogą działać jak cząsteczki zakaźne. Ale niebezpieczne mogą już same pełzaki
wypełnione bakteriami, których wdychanie może być jedną z dróg zakażenia bakteriami.
Szczególną
ochronę
zapewniają
bakteriom
pierwotniaki
wytwarzające,
charakterystyczne dla danego gatunku, formy przetrwalnikowe. Zdolność do okresowego
przebywania bakterii w ich wnętrzu umożliwia ponadto kolonizację nowych, często odległych
terenów w wyniku wędrówki cyst z wiatrem lub wodą.
Przetrwanie radykalnej zmiany otoczenia, którą przechodzą bytujące w komórkach
pierwotniaków bakterie, wymaga posiadania sprawnych mechanizmów adaptacyjnych, które
oparte są one w dużej mierze na regulacji ekspresji genów. Wykorzystanie przez pasożytnicze
drobnoustroje tej samej strategii w nowych warunkach, tj. podczas inwazji komórek
kręgowca, pozwala na uniknięcie ataku nieswoistych i swoistych mechanizmów obronnych
Strona 22 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
organizmu, zapewnia dostęp do nowego, bogatego w czynniki odżywcze środowiska, a często
ułatwia rozprzestrzenianie się chorobotwórczych bakterii w organizmie zakażonego osobnika.
Na możliwość wykorzystania pierwotniaków jako rezerwuarów chorobotwórczych dla
człowieka gatunków bakterii zwróciły uwagę zainicjowane w latach 70-tych badania nad
biologią Legionella pneumophila, jako etiologicznego czynnika nieznanej wcześniej choroby
legionistów. Od tego czasu poznano wiele innych wewnątrzkomórkowych bakteryjnych
patogenów, które mogą atakować wolno żyjące pełzaki, włączając prątki z rodzaju
Mycobacterium, przecinkowce cholery, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis,
bakterie z rodzaju Chlamydia i Rickettsia, Burkholderia pseudomallei, a także pałeczki
Salmonella, Shigella, Yersinia i inne.
Celem
naszych
badań
było
znalezienie
powiązań
pomiędzy
potencjalnie
patogenicznymi pełzakami i przenoszonymi przez nie bakteriami, a możliwością wystąpienia
zmian patogenicznych u człowieka.
Pełzaki wykorzystane do badań były wyizolowane z jezior oraz z ujęć wody
wodociągowej na oddziałach chirurgii kilku poznańskich szpitali (sale pacjentów, sale
opatrunkowe, punkty zabiegowe).
Pełzaki hodowano na podłożu stałym i płynnym. Wykonano ocenę inwazyjności
i wirulencji na zwierzętach doświadczalnych.
Wykrywanie bakterii obecnych w wodzie, komórkach izolowanych pełzaków oraz
w tkankach zwierząt doświadczalnych przeprowadzono za pomocą testów z przeciwciałami
monoklonalnymi i metod mikrobiologicznych. Ponadto w przypadku podejrzenia istniejącego
zakażenia bakteryjnego niektóre tkanki zwierząt doświadczalnych poddawane były analizie
histopatologicznej.
Z większości prób wody pobranych z jezior i oddziałów chirurgii wyizolowano
pełzaki z rodzaju Acanthamoeba i Hartmannella. Większość izolatów była inwazyjna
i patogeniczna dla myszy. Z płuc i mózgów padłych zwierząt izolowano pełzaki.
W przypadkach, gdy po zarażeniu pełzakami myszy padały, ale z ich tkanek nie dało się
izolować pełzaków, analiza histopatologiczna wykazała zmiany w mózgach i płucach
wskazujące na typowe zakażenie bakteryjne. Potwierdziły to badania bakteriologiczne tkanek,
a także pełzaków. Ok. 50% izolatów zawierało wewnątrz komórek bakterie.
W
izolowanych
pełzakach
stwierdzono
obecność
Chryseomonas meningosept, pojedyncze ziarniaki Gram (+)
Clostridium
perfringens,
typu Micrococcus sp.,
Morganella morgani, Proteus mirabilis oraz Proteus vulgaris. Ponadto test z przeciwciałami
Strona 23 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
monoklonalnymi wykazał w pełzakach słabą reakcję pozytywną na obecność pałeczek
Legionella pneumophila.
Obecność bakterii wewnątrz pełzaków wolno żyjących lub ewentualnie na ich
powierzchni stanowi szczególne wyzwanie dla badania i kontroli czystości wód
powierzchniowych, kąpielisk oraz ujęć wody pitnej. Istnieje bowiem możliwość powiązania
występowania niektórych chorób człowieka z obecnością bakterii w pełzakach (Hadaś i wsp.
2001, 2002, 2003a,b).
Kontynuując tematykę pełzaków wolno żyjących, kolejnym tematem moich badań było:
 Badanie prób środowiskowych na obecność pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
Badania dotyczyły analizy prób środowiskowych na obecność patogenicznych
pełzaków z rodzaju Acanthamoeba.
Pełzaki wolno żyjące z rodzaju Acanthamoeba dotychczas wykrywano w wodach
z jezior, w basenach, a nawet w wodzie wodociągowej. Niektóre szczepy pełzaków stanowią
poważne zagrożenie dla ludzi z nieprawidłowo funkcjonującym układem immunologicznym,
leczonych lekami immunosupresyjnymi , a także co raz częściej dla osób noszących soczewki
kontaktowe. Dotychczas w literaturze nie ma wystarczających informacji na temat
występowania pełzaków z rodzaju Acanthamoeba w Polsce. W ramach naszych badań po raz
pierwszy w Polsce przebadaliśmy próby piasku oraz wodę z fontann.
Próby piasku pobierano z 13 piaskownic znajdujących się na placach zabaw dla dzieci
na terenie miasta Poznania. Próby wody natomiast pochodziły z 9 poznańskich fontann
iwodotrysków. Próby pobierano w okresie od maja do sierpnia, w latach 2012 - 2014.
Wyizolowane z piasku pełzaki hodowano na podłożu NN, a następnie badano ich
patogeniczności i wirulencję na zwierzętach doświadczalnych. Do badań wykorzystano 2-3
tygodniowe myszy szczepu BALB/c, którym podawano donosowo trofozoity pełzaków.
Badania wykazały obecność pełzaków z rodzaju Acanthamoeba we wszystkich badanych
piaskownicach. W 7 na 13 badanych piaskownic stwierdzono obecność patogenicznych
pełzaków. Najbardziej zjadliwe pełzaki wyizolowano z piaskownicy przy jeziorze Malta.
Powodowały one szybką śmierć myszy w ciągu 4-5 dni. Pozostałe izolaty wywoływały
przewlekłe zarażenie myszy (Cholewiński i wsp. 2013).
Pełzaki występowały również w 6 z 9 badanych fontannach. Na podstawie badań
biochemicznych oraz morfologiczno-mikroskopowych stwierdzono, że wyizolowane pełzaki
podobnie jak w przypadku izolatów z piaskownic, należą do rodzaju Acanthamoeba. Badania
pategoniczności i wirulencji przeprowadzone na zwierzętach doświadczalnych wykazały, że
badane izolaty pełzaków nie wywołały śmierci zwierząt, stwierdzono natomiast u zwierząt
Strona 24 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
nadpobudliwość (zwięszona ruchliwość oraz bardzo gwałtowna reakcja na bodźce
zewnętrzne). Wykonano posiew mózgu i płuc badanych myszy. W przypadku 1 izolatu
stwierdzono trofozoity pełzaków w mózgu i płucach, w przypadku pozostałych 5 izolatów
stwierdzono obecność pełzaków w mózgach myszy (Derda i wsp. 2013).
Aktualnie prowadzę badania, których tematem jest:

Genotypowanie izolatów pełzaków pochodzących z prób środowiskowych.
Badania prowadzone są we współpracy z Katedrą Biochemii i Biologii
Molekularnej, Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu.

Pełzaki wolno żyjące z rodzaju Acanthamoeba jako przenosiciele patogenicznych
bakterii.

Określenie udziału receptorów Toll-podobnych w mechanizmach obronnych
żywiciela w przebiegu doświadczalnej akantamebozy.
Badania prowadzone są we współpracy z Katedrą i Zakładem Biologii
i Parazytologii Medycznej oraz Katedrą i Zakładem Histologii i Embriologii,
Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

Zastosowania fitoterapii w inwazjach pasożytniczych wywołanych przez nicienie.
Badania prowadzone są we współpracy z Katedrą i Zakładem Botaniki
Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu.
Podsumowanie działalności naukowej
Podsumowując, jestem autorem 88 publikacji o łącznym IF=29.385 i 485 punktach MNiSW.
Wśród wymienionych prac są 33 prace oryginalne, 7 prac przeglądowych, 1 podręcznik
akademicki i 43 streszczenia zjazdowe.
Liczba cytowani moich prac według Web of Sciences wynosi 120.
Index Hirscha wynosi 7.
Za moją działalność naukową otrzymałam 6 nagród zespołowych Rektora Uniwersytetu
Medycznego w Poznaniu.
Wykaz opublikowanych prac naukowych oraz informacja o osiągnięciach dydaktycznych,
współpracy naukowej i popularyzacji nauki zostały szczegółowo opisane w załączniku 3.
Strona 25 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Piśmiennictwo:
Cholewiński M., Hadaś E., Derda M., Wojt W.J, Skrzypczak Ł. Występowanie
patogenicznych pełzaków wolno żyjących z rodzaju Acanthamoeba w piaskownicach
miejskich. Nowiny Lekarskie, 82, 138-141, 2013.
Červa L. Amoebic meningoencephalitis: axenic culture of Naegleria. Science 163: 576, 1969.
Boczoń K., Hadaś E., Wandurska-Nowak E., Derda M.: A stimulation of antioxidants in
muscles of Trichinella spiralis infected rats. Acta Parasitologica 41, 136-138, 1996.
De Donno A., Grassi T., Idolo A., Guido M., Papadia P., Caccioppola A., Villanova L.,
Merendino A., Bagordo F., Fanizzi F.P. First-time comparison of the in vitro
antimalarial activity of Artemisia annua herbal tea and artemisinin. Transactions of the
Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 106, 696-700, 2012.
Derda M., Boczoń K., Wandurska-Nowak E., Wojt W. Changes in the activity of glutathioneS-transferase in muscles and sera from mice infected with Trichinella spiralis after
treatment with albendazole and levamisole. Parasitology Research, 89, 509-512, 2003.
Derda M., Hadaś E. Antioxidants and proteolytic enzymes in experimental trichinellosis. Acta
Parasitologica, 45, 71-76, 2000.
Derda M., Hadaś E., Antczak E., Wojt W.J. Incidence of Entamoeba gingivalis in the oral
cavity of students. Journal of Stomatology, 64, 784-795, 2011.
Derda M., Hadaś E., Thiem B., Sułek A. Natural products as amebicidal drug against
Acanthamoeba spp. Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, 61, 24-26, 2004.
Derda M., Hadaś E., Wojtkowiak-Giera A., Wojt W.J., Cholewiński M., Skrzypczak Ł.
Występowanie pełzaków pierwotnie wolno żyjących w fontannach. Problemy Higieny
i Epidemiologii, 94, 147-150, 2013.
Derda M., Wandurska-Nowak E., Boczoń K. Glutathione-S-transferase activity in mouse
muscle during experimental trichinellosis. Wiadomości Parazytologiczne, 42, 227-232,
2001.
Derda M., Wandurska-Nowak E., Hadaś E. Changes in the level of the antioxidant in the
blood from mice infected with Trichinella spiralis. Parasitology Research, 93, 207-210,
2004.
Fowler M., Carter R.F. Acute pyogenic meningitis probably due to Acanthamoeba sp.:
a preliminary report. British Medical Journal, 2, 740-742, 1965.
Strona 26 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
Hadaś E., Derda M. Free-living amoebae as carriers of pathogenic bacteria. IXth International
Meeting on the Biology and Pathogenicity of Free-Living Amoebae, Proceedings, 158,
2001.
Hadaś E., Derda M. Termiczne odkażanie w celu zapobieżenia nawracającym inwazjom
Enterobius vermicularis. Problemy Higieny i Epidemiologii, 95, 643-645, 2014.
Hadaś E., Derda M., Boczoń K., Wandurska-Nowak E. Biochemical investigations of the
dynamics of proteinase activity at different stages of trichinellosis in mice. Wiadomości
Parazytologiczne, 40, 329-335, 1994.
Hadaś E., Derda M., Sułek A., Wojt W. Free-living amoebae as potential pathogenic
organisms to man and carriers of pathogenic bacteria. Xth International Congress of
Parasitology, Vancouver, Canada, 194, 2002.
Hadaś E., Derda M., Sułek A. Acanthamoeba spp. as vector of pathogenic bacteria. XV
Wrocławska Konferencja Parazytologiczna “Parazytologia w ochronie środowiska i
zdrowia”. Wrocław-Karpacz. Wiadomości Parazytologiczne, 49, 394-395, 2003a.
Hadaś E., Derda M., Wandurska-Nowak E. Effect of exogenous nitric oxide in experimental
trichinellosis. Parasitology Research, 88, 86-88, 2002.
Hadaś E., Derda M., Winiecka-Krusnell J., Sułek A. Acanthamoeba spp. as vehicles of
pathogenic bacteria. Acta Parasitologica, 49, 276-280, 2004.
Hadaś E., Derda M., Winiecka-Krusnell J., Sułek A. Amoebae of genus Acanthamoeba as
vector of pathogenic bacteria. Xth International Meeting on the Biology and
Pathogenicity of Free-Living Amoebae. October 5-10, 2003b, Cd. Obregon, Senora,
Mexico. Proceedings. Eds.: F. Lares-Villa, G.C. Booton, F. Marciano-Cabral. s. 235240 il. bibliogr. abstr.
Ho W.E., Peh H.Y., Chan T.K., Wong W.S. Artemisinins: Pharmacological actions beyond
anti-malarial. Pharmacology and Therapeutics, 142, 126-139, 2014.
Howe D.K., Vodkin M.H., Novak R.J., Visvesvara G., McLaughlin G.L. Identification of two
genetic
markers
that
distinquish
pathogenic
and
nonpathogenic
strains
of
Acanthamoeba spp. Parasitology Research, 83, 345–348, 1997.
Kasprzak W., Mazur T. Free-living amoeba isolated from waters frequented by people in the
vicinity of Poznan, Poland. Experimental studies in mice on the pathogenicity of the
isolates. Zeitschrift für Tropenmedizin und Parasitologie, 23, 391–398, 1972.
Lehmann O.J., Green S.M., Morlet N., Kilvington S., Keys M.F., Matheson M.M., Dart
J.K.G., McGill J.I., Watt P.J. Polymerase chain reaction analysis of corneal epithelial
Strona 27 z 29
Załącznik 2a
dr Monika Derda
and tear samples in the diagnosis of Acanthamoeba keratitis. Investigative
Ophthalmology and Visual Science, 39, 1261–1265, 1998.
Linder M., Winiecka-Krusnell J., Linder E. Use of recombinant cellulose binding domains of
Trichoderma reesei cellulase as a selective immunocytochemical marker for cellulose in
protozoa. Applied and Environmental Microbiology 68, 2503-2508, 2002.
Ly T.M.C., Muller H.E. Interactions of Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri and Listeria
innocula with protozoans. Journal of General and Applied Microbiology, 36, 143-150,
1990.
MacLean R.C., Hafez N., Tripathi S., Childress C.G., Ghatak N.R., Marciano-Cabral F.
Identification of Acanthamoeba sp. in paraffin-embedded CNS tissue from an HIV+
individual by PCR. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 57, 289–294,
2007.
Mathers W.D., Nelson S.E., Lane J.L., Wilson M.E., Allen R.C., Folberg R. Confirmation of
confocal microscopy diagnosis of Acanthamoeba keratitis using polymerase chain
reaction analysis. Archives of Ophthalmology, 118, 178–183, 2000.
Pussard M., Pons R. Morphologie de la paroi kystique et taxonomie du genere Acanthamoeba
(Protozoa, Amoebida). Protistologica, 13, 557–598,1977.
Shpigel E., Roiz L., Goren R., Shoseyov O. Bacterial cellulose-binding domain modulates in
vitro elongation of different plant cells. Plant Physiology, 117, 1185-1194, 1998.
Thom S., Warhurst D., Drasar B.S.F. Association of Vibrio cholera with fresh water
amoebae. Journal of Medical Microbiology, 36, 303-306, 1992.
Wandurska-Nowak E., Boczoń K., Derda M., Hadaś E., Matias-Guzek A. The effect of
methylprednisolone on the dynamics of oxygen uptake and peroxidase and superoxide
dismutase activities in skeletal muscles of mice infected with Trichinella spiralis larvae.
Acta Parasitologica, 43, 54-56, 1998.
Wandurska-Nowak E., Hadaś E., Derda M., Wojt W. Effect of nitric oxide releasing drugs on
the intensity of infection during experimental trichinellosis in mice. Parasitology
Research, 90, 164-165, 2003.
Wang, H., Pevsner J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the
hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue
Resarches, 296, 511–516, 1999.
Wąsowicz A. Occurrence of Artemisia annua L. in Wrocław city area (Lower Silesia,
Poland). Acta Botanica Silesiaca, 1, 141–146, 2004.
Strona 28 z 29