cwiczenia nr 11

Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Ćwiczenie 11
Część teoretyczna
I. FERMENTACJA MLEKOWA
Bakterie fermentacji mlekowej (Lactobacillaceae) stanowią niejednorodną grupę mikroorganizmów
przeprowadzających beztlenową fermentację mlekową. Substratami tej fermentacji mogą być cukry proste,
disacharydy oraz niektóre tri- lub polisacharydy. Przekształcają cukier mleczny (laktozę) w kwas mlekowy.
Kwas mlekowy wykazuje właściwości konserwujące.
Zaliczamy tutaj gramdodatnie:
 ziarniaki: Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus
 regularne, nieprzetrwalnikujące laseczki (zwane pałeczkami mlekowymi): Lactobacillus
 ze względu na podobne wykorzystanie i podobieństwo prowadzonych procesów również
nieregularne, nieprzetrwalnikujące pałeczki Bifidobacterium są coraz częściej zaliczane do
bakterii fermentacji mlekowej (choć nie należą do rodziny Lactobacillaceae)
Cechy charakterystyczne:
• grupa silnie zróżnicowana morfologicznie (pałeczki, laseczki, formy kuliste),
• nie wytwarzają przetrwalników,
• są to bakterie gramdodatnie,
• są beztlenowcami,
• mają zdolność rozkładu laktozy do kwasu mlekowego,
• nie wytwarzają katalazy,
• nie redukują azotanów,
• do swojego wzrostu wymagają adeniny, tyminy i hipoksantyny.
Bakterie fermentacji mlekowej dzielimy na dwie grupy:
• bakterie homofermentatywne – wytwarzają głównie kwas mlekowy i bardzo małe ilości innych
związków – Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum i Lactobacillus
acidophilus,
• bakterie heterofermentatywne – oprócz kwasu mlekowego tworzone są pewne ilości kwasu octowego
oraz aldehydu octowego – Lactobacillus brevis i Lactobacillus fermentum.
1
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Kefir – sporządzany z mleka krowiego lub koziego, fermentację powodują drobnoustroje w postaci ziaren
kefirowych złożonych z bakterii Lactobacillaceae (Streptococcus lactis 75% i Betabacterium caucasicum
25%) żyjących w symbiozie z drożdżami z gatunku Candida kefyr.
Minimum cukrowe – najmniejsza ilość cukru zawarta w kiszonym materiale, dostateczna aby bakterie
fermentacji mlekowej mogły go rozkładać do kwasu mlekowego w takiej ilości, aby pH całej zakiszanej
masy wyniosło 4,2.
II. PROBIOTYKI
Probiotyki to pojedyncze lub mieszane kultury żywych mikroorganizmów, które podawane
człowiekowi lub zwierzętom wywierają na ich organizmy korzystny wpływ. Ich działanie polega na
utrzymywaniu właściwej równowagi mikroflory zasiedlającej organizm ludzki.
Mikroflora jelitowa człowieka:
autochtoniczna – Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus
allochtoniczna (przejściowa, w tym również patogenna)
rywalizuje o miejsce bytowania i w niektórych sytuacjach (np. po kuracji antybiotykowej) wypiera
prawidłowe mikroorganizmy, podawanie preparatów probiotycznych pozwala przywrócić naturalną
mikroflorę, bakterie probiotyczne muszą być odporne na niskie pH soku żołądkowego i na sole żółci
Do bakterii o udokumentowanych cecha probiotycznych zalicza się: Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, bakterie z rodzaju Bifidobacterium.
III. PRÓBA REDUKTAZOWA – opis i zasada
a) 10 cm3 dokładnie wymieszanego mleka przenieść do sterylnej probówki i jałowo dodać 0,5 cm3 błękitu
metylenowego, zamienić korek z waty na jałowy korek z tworzywa sztucznego lub zakleić parafilmem,
b) dokładnie wymieszać zawartość probówki, obracając ja kilkakrotnie do góry dnem,
c) probówkę wstawić do łaźni wodnej o temp. 35-37ºC,
d) jednocześnie umieścić w łaźni probówkę z 1 cm3 mleka i termometrem w celu stwierdzenia, kiedy
zawartość probówki osiągnie temp. 37ºC,
e) od tego momentu liczyć czas inkubacji mleka w łaźni. Obserwacje prowadzić na początku, co 10 min., a
później co 30 min. Co 30 min należy probówkę odwrócić do góry dnem i z powrotem co zapobiega
powstawaniu warstwy tłuszczu unieruchamiającej drobnoustroje,
f) oznaczenie uznać za zakończone, gdy mleko w probówce (z wyjątkiem 0,5 cm warstwy górnej) zostanie
odbarwione,
g) zależność między czasem odbarwienia, a zawartością drobnoustrojów przedstawia tabela:
Czas odbarwiania błękitu
metylenowego
< 20 min.
20 min. – 2 godz.
2,0 – 5,5 godz.
5,5 – 7,0 godz.
> 7,0 godz.
Liczba bakterii w 1 cm3
(mln)
> 20
20 – 4
4 – 0,5
0,5 – 0,1
< 0,1
Jakość mleka
Bardzo zła
Zła
Średnia
Dobra
Bardzo dobra
2
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Próba reduktazowa polega na badaniu szybkości zużycia tlenu znajdującego się w mleku. Każde mleko
zawiera mikroorganizmy, to lepszej jakości będzie ich posiadało mniej, to złej jakości więcej. Więcej
drobnoustrojów to szybsze zużycie tlenu, mniej to wolniejsze zużycie. Po zużyciu tlenu drobnoustroje
wykorzystują jako akceptora wodoru błękit metylenowy, który na skutek zmian osydo-redukcyjnych
środowiska staje się bezbarwny. Im szybciej nastąpi odbarwienie mleka tym pewniejsze, że mleko posiada
dużo mikroorganizmów i jest gorszej jakości.
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia należy wykonać w warunkach sterylnych!
1. Odczyty posiewów z metody popłuczyn
a) policzyć ilość drobnoustrojów na agarze odżywczym przed myciem i po myciu, uwzględniając
rozcieńczenia, obliczyć efekt dezynfekcyjny dla bakterii (y = 100 – B/A * 100%). Te same obliczenia
wykonać dla drobnoustrojów na agarze brzeczkowym
b) wyniki zapisać w tabeli zbiorczej (na ćwiczeniach)
c) wykorzystując średnie dla drobnoustrojów, objętość popłuczyn i posiewów oraz pole powierzchni butelki
obliczyć ilość bakterii oraz grzybów w jtk na 1 cm2 powierzchni
d) obliczenia, tabelę zbiorczą i omówienie wyników zamieścić w sprawozdaniu 3.
2. Odczyty posiewów z metody bezpośredniej (Richtera)
a) policzyć ilość drobnoustrojów wyrosłych wewnątrz słoiczka i pole powierzchni słoiczka
b) obliczyć ilość mikroorganizmów w jtk na 1 cm2 powierzchni
c) wyniki zapisać w tabeli zbiorczej (na ćwiczeniach)
d) obliczenia, tabelę zbiorczą i omówienie wyników zamieścić w sprawozdaniu 3.
3. Odczyty posiewów z metody tamponowej
a) policzyć ilość drobnoustrojów wyrosłych na szalce Petriego
b) znając rozcieńczenie, objętość rozpuszczalnika, pole szablonu obliczyć ilość mikroorganizmów w jtk na
100 cm2 powierzchni
c) wyniki zapisać w tabeli zbiorczej (na ćwiczeniach)
d) obliczenia, tabelę zbiorczą i omówienie wyników zamieścić w sprawozdaniu 3.
4. Odczyty posiewów z metody odciskowej
a) policzyć ilość drobnoustrojów wyrosłych na szalce Petriego
b) obliczyć ilość mikroorganizmów w jtk na 100 cm2 powierzchni
c) wyniki zapisać w tabeli zbiorczej (na ćwiczeniach)
d) obliczenia, tabelę zbiorczą i omówienie wyników zamieścić w sprawozdaniu 3.
3
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
5. Preparaty mikroskopowe z mlecznych napojów fermentowanych (zsiadłe mleko, kefir, jogurt)
a) każdą próbkę z ww napojów przelać do probówek (po około 5 cm3) i ogrzewać w łaźni wodnej o temp.
45-50ºC do momentu oddzielenia się skrzepu od serwatki
b) wykonać rozmazy z serwatki (dla każdego napoju osobno)
c) preparat suszyć na powietrzu (nie ogrzewać nad płomieniem!)
d) utrwalić w metanolu przez 3 minuty
e) odtłuścić kilkanaście sekund w eterze
f) spłukać wodą destylowaną przez zanurzenie preparatu w zlewce z dużą ilością wody
g) wysuszyć na powietrzu
h) barwić fuksyną do Grama około 2 minuty
i) fuksynę spłukać delikatnie wodą tak jak w sposób podany wyżej
j) oglądać pod immersją, obserwować mikroorganizmy, zanotować i narysować
6. Preparaty mikroskopowe z kiszonek (zalewa z ogórków, sok z kiszonej kapusty, żurek)
a) preparaty przygotować w sposób standardowy i barwić metodą Grama
b) oglądać pod immersją
c) obserwować mikroorganizmy pod mikroskopem – policzyć w trzech polach widzenia ilość bakterii i
drożdży
7. Ocena jakości kiszonek
a) na podstawie obrazu mikroskopowego oraz pomiaru pH ocenić jakość kiszonek, biorąc pod uwagę
następujące kryteria:
Jakość kiszonki
Ilość drożdży
Ilość bakterii
pH
Bardzo dobra
1
80-200
3,5
Dobra
1
3-30
4,5
Zła
Więcej niż
Mniej niż 30
Wyższe niż 4,5
b) wyniki zanotować i omówić
8. Posiewy mikrobiologiczne pozwalające na rozróżnienie paciorkowców mlecznych od enterokoków
a) na sterylne szalki Petriego zawierające bulion o pH 9,6 i bulion z dodatkiem 6,5% NaCl posiać metodą
powierzchniową badane próbki mleka w ilości 0,5 cm3
b) opisane szalki odłożyć do inkubacji w 28ºC.
4