Łukasz Gałgański

„Analiza funkcjonalna kompleksów kinaz MAP A. thaliana
w warunkach stresowych”
Łukasz Gałgański
Stypendysta projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych
za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Ze względu na osiadły tryb życia rośliny lądowe posiadają bardzo ograniczone
możliwości unikania niekorzystnych warunków środowiska. Rozwinęły w toku ewolucji
mechanizmy obronne i adaptacyjne, umożliwiające dostosowanie metabolizmu komórek
do bieżących potrzeb. Właściwa odpowiedź na zmiany w środowisku i skuteczna ochrona
przed czynnikami szkodliwymi jest uwarunkowana m.in. odpowiednim odbiorem bodźców
przez receptory i inne białka sensoryczne wiążące ligandy i istnieniem zróżnicowanych
systemów transdukcji sygnału. Do najważniejszych szlaków sygnalizacyjnych u wszystkich
eukariontów należą kinazy aktywowane mitogenem (kinazy MAP). Kinazy MAP tworzą
kaskady, w których kinazy kinaz kinaz aktywowanych mitogenem (MKKK) fosforylują
i aktywują kinazy kinaz aktywowanych mitogenem (MKK), które następnie aktywują kinazy
aktywowane mitogenem (MPK). Poprzez fosforylację zróżnicowanych białek komórkowych
MPK wpływają na ich aktywność, stabilność lub/i lokalizację. Przekłada się to
na uruchomienie właściwych odpowiedzi. Polegają one na regulacji ekspresji genów,
uruchomieniu podziałów komórkowych czy programowanej śmierci komórki. W ten sposób
sygnał przekazywany przez kinazy MAP przekłada się na odpowiedź komórki na zmieniające
się środowisko.
U większości roślin zaledwie kilka MPK (homologi MPK3, MPK4 i MPK6 modelowej
rośliny Arabidopsis thaliana) stanowi centralny element sygnalizacji wielu różnych stresów
(biotyczny, oksydacyjny, susza, zasolenie i chłód) i hormonów (etylen, kwasy: abscysynowy,
jasmonowy i salicylowy), a także ważny element regulacji licznych procesów rozwojowych
(rozwój zarodka, korzeni, aparatów szparkowych, organów generatywnych), w tym starzenia
i śmierci komórki. Jednak w zdecydowanej większości tych szlaków transdukcji sygnału rola
MPK3/4/6 jest całkowicie nieznana. Wiadomo tylko, że dochodzi do aktywacji MPK3/4/6
i do zaburzenia regulacji tych procesów w mutantach pozbawionych MPK3/4/6. Ponadto
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
dobrze poznanych jest zaledwie kilka białek fosforylowanych przez MPK3/4/6 (substratów
MPK3/4/6), choć w badaniach in vitro przewidziano co najmniej kilkaset substratów MPK A
thaliana. Wobec powyższych danych założyłem, że za niezwykłą różnorodność funkcji
zaledwie
trzech
MPK
odpowiadają
odmienne
białka
fosforylowane
przez
MPK
w poszczególnych procesach, a być może również inne kinazy niż kinazy MAP (MKK
i MKKK) wpływające na funkcjonowanie MPK.
Poszukując nowych substratów i regulatorów MPK3/4/6, oczyściłem z komórek
zawiesiny T87 A. thaliana kompleksy tych MPK uformowane w wyniku działania stresów
i hormonów (łącznie kilkadziesiąt warunków). Kompleksy, w których stwierdziłem aktywację
MPK, zostały przebadane w celu wykrycia nieznanych dotychczas fosforylacji MPK3/4/6
oraz oddziaływań MPK3/4/6 z innymi białkami. Analiza składu kilkuset kompleksów
przez spektrometrię mas wskazała m.in. inne drogi regulacji aktywności MPK niż dotychczas
znane oraz udział licznych nieznanych dotąd fosforylacji (poza pętlą aktywującą) MPK
w regulacji ich aktywności.
Odkryte oddziaływania MPK3/4/6 indukowane stresem i hormonami wskazują
na niezwykle istotną rolę badanych MPK w regulacji uruchamiania nie tylko odpowiedzi
obronnych, lecz również procesów rozwojowych. MPK3/4/6 podczas działania stresów
i hormonów wchodzą w interakcje z białkami regulującymi wzrost oraz starzenie roślin,
indukcję kwitnienia, utrzymanie merystemu wierzchołkowego czy rozwój włośników
korzeniowych. Uzyskane dane jednoznacznie wskazują, że u roślin kinazy MAP stanowią
element integrujący odpowiedź na stres, regulację hormonalną (m. in. etylenu, kwasu
jasmonowego i kwasu abscysynowego) i procesy rozwojowe. MPK3/4/6 tworząc jeden
z poziomów komunikowania się (cross-talk) różnych procesów i szlaków komórkowych,
umożliwiają dostosowanie wzrostu i rozwoju roślin do aktualnych warunków środowiska.
O znacznej wiarygodności otrzymanych wyników świadczy identyfikacja w badanych
kompleksach białek, które wcześniej były znane z oddziaływań z MPK3/4/6, a także
potwierdzenie oddziaływań innymi metodami.
Dla rozwoju rolnictwa w Wielkopolsce ważne są próby zwiększenia zdolności
adaptacyjnych roślin do warunków niedoboru wody, zasolenia i poprawienia odporności
na stres biotyczny. W sygnalizacji tych wszystkich stresów kluczową rolę pełnią kinazy MAP.
Co więcej, znane są liczne zastosowania biotechnologiczne MPK3/4/6 – np. nadekspresja
MPK4 rzepaku przekłada się bezpośrednio na zwiększoną odporność rzepaku na grzyba
Sclerotinia sclerotiorum, powodującego wysokie straty w uprawach. Poprzez zmiany
w poziomie kinaz MAP udało się uzyskać kukurydzę o zwiększonej tolerancji na niską
temperaturę i niedobór wody oraz ziemniaka o zwiększonej odporności na patogeny. Jednak
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
manipulacje genetyczne na poziomie kinaz MAP nie są najlepszym rozwiązaniem
ze względu na ich potencjalny udział w niekorzystnym z gospodarczego punktu widzenia
hamowaniu wzrostu czy uruchamianiu śmierci komórek. Na przykład MPK6 wzmacnia
odporność na patogeny oraz adaptację do niedoboru wody, chłodu i wysokiego zasolenia,
lecz jednocześnie (m.in. jako element sygnalizacji etylenowej) wpływa na przyśpieszenie
starzenia. Zatem kluczowe jest poznanie (przed biotechnologicznym wykorzystaniem) białek
regulowanych przez kinazy MAP w określonych procesach, np. czynników transkrypcyjnych,
których działanie jest znacznie mniej plejotropowe.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego