Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w

Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 3 • 269-273
Praca oryginalna • Original Article
Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia
iohexolu w osoczu krwi
Validation of the modified method for plasma iohexol
concentration measurement
Joanna Berska1, Jolanta Bugajska1, Anna Litwin1, Katarzyna Zachwieja2, Krystyna Sztefko1
1
Zakład Biochemii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ, Kraków, 2Klinika Nefrologii Dziecięcej, Uniwersytecki Szpital
Dziecięcy, Kraków
Streszczenie
Cel: Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi.
Metoda: Iohexol oznaczono ilościowo na chromatografie cieczowym, wyposażonym w detektor absorpcyjny UV-VIS (Waters,
USA).
Wyniki: Liniowość metody mieściła się w zakresie od 5,06 do 647µg/ml. Wartość LOD (granica pomiaru) oraz LOQ (granica
oznaczalności) wynosiły odpowiednio: 4,2µg/ml i 12,7µg/ml. Współczynnik korelacji (r) pomiędzy stężeniem iohexolu a polem
powierzchni dla piku izomeru 2 iohexolu wyniósł 1,000. Współczynniki zmienności wewnątrz serii wynosiły poniżej 4,5%, natomiast między seriami poniżej 5,5%. Średni odzysk mieścił się w zakresie od 98,6 do 101,1%.
Wniosek: Opracowana metoda oznaczania stężenia iohexolu z zastosowaniem standardu wewnętrznego przy użyciu kolumny
XTerra (C18; 3,5 μm; 3,0 mm x 150 mm) i 4% roztworu acetonitrylu jako fazy ruchomej o izokratycznym przepływie 0,4 ml/min
nadaje się do ilościowego oznaczania iohexolu w osoczu krwi.
Summary
Aim: Validation of the modified method for plasma iohexol level measurement.
Method: Iohexol have been determined on the liquid chromatograph with a UV-VIS detector (Waters, USA).
Results: Linear working range of the method from 5,06 to 647µg/ml has been obtained. The value of LOD (limit of detection)
and LOQ (limit of quantification) were respectively: 4,2µg/ml and 12,7µg/ml. The correlation coefficient (r) between the concentration of iohexol and area under the peak (isomer 2) was 1,000. Coefficients of variation within and between series were
below 4,5% and below 5,5%, respectively. The mean value of recovery test was between 98.6 and 101.1%.
Conclusion: Our new method for iohexol level measurement using the internal standard using a XTerra column (C18; 3,5 µm;
3,0 mm x 150 mm) and 4% solution of acetonitrile as mobile phase with isocratic flow of 0,4 ml/min is suitable for quantitative
determination of iohexol in blood plasma.
Słowa kluczowe:iohexol, HPLC, walidacja metody
Key words:iohexol, HPLC, method validation
Wstęp
Ocena przesączania kłębuszkowego (GFR) jest niezbędnym
elementem w diagnostyce chorób nerek. W celu oszacowania wielkości GFR stosuje się różne egzogenne i endogenne
markery. Jednym z takich markerów jest iohexol, niejonowy polimer fruktozy o niskiej osmolalności, zawierający jod.
Iohexol nie wiąże się z białkami osocza, nie ulega wydzielaniu, resorpcji i metabolizmowi w nerce, a usuwany jest
z krwi tylko drogą filtracji kłębuszkowej. Wykazano zgodność
oszacowania klirensu w oparciu o wielokrotne pomiary stężenia iohexolu z klirensem wyznaczonym w oparciu o inuli-
nę (złoty standard) [2,7,15] i EDTA-Cr51 [3,12]. Dzięki swoim
właściwościom iohexol jest zalecany przez The National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative
(NKFDOQI) Guidelines [13].
Ilościowo stężenie iohexolu oznacza się za pomocą chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem detektora
absorpcyjnego [4,6,11,12,14] lub detektora masowego (MS)
[1]. W dotychczas publikowanych pracach przedstawiających metody oznaczania iohexolu stosowano różne warunki
rozdziału, m.in. różny skład, pH oraz przepływ fazy ruchomej
oraz różny sposób elucji (gradientową lub izokratyczną), jak
269
Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi
też kolumny chromatograficzne o zróżnicowanej długości
i wypełnieniu, co sprawiało, że czasy trwania analiz znacznie się od siebie różniły. Ponadto, tylko nieliczni autorzy stosowali standard wewnętrzny wykorzystując pole powierzchni
tego piku do obliczeń ilościowych [11,14].
Badania klirensowe, szczególnie prowadzone u dzieci, wymagają wiarygodnego oznaczenia stężenia odpowiedniego
markera, dlatego ważne jest zawsze określenie takich parametrów metody jak: zakres liniowości, granica wykrywalności, granica oznaczalności, powtarzalność, dokładność
i swoistość metody [5,9,10].
Cel pracy
Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia
iohexolu w osoczu krwi i porównanie jej z metodami w piśmiennictwie.
Materiał i metody badań
Warunki rozdziału na chromatografie.
Rozdziały próbek przeprowadzano na chromatografie cieczowym (Waters), wyposażonym w detektor absorpcyjny
UV-VIS oraz dozownik automatyczny 717 Plus. Do rozdziału
zastosowano kolumnę XTerra (C18; 3,5μm; 3,0mm x 150mm
firmy Waters). Na kolumnę podawano 10μl próbki. Temperatura kolumny wynosiła 30°C, a długość fali detektora 254nm.
Rozdział przeprowadzano w warunkach izokratycznych.
Fazę mobilną stanowiła mieszanina woda-acetonitryl (96:4,
v/v). Przy przepływie 0,4 ml/min całkowity czas rozdziału
jednej próbki wynosił 15 minut. Zbieranie oraz opracowywanie danych przeprowadzono za pomocą programu Empower
firmy Waters.
Kalibracja metody.
Stosując wzorzec Omnipaque 300 firmy Amersham Health
AS (zawierający 647mg Iohexolu/ml) przygotowano serię
ośmiu roztworów wzorcowych o następujących stężeniach
iohexolu: 5,06µg/ml, 10,1µg/ml, 20,2µg/ml, 40,4µg/ml,
80,9µg/ml, 161,8µg/ml, 323,5µg/ml i 647µg/ml, które wykorzystano do przygotowania krzywej kalibracyjnej. Do 100µl
każdego roztworu wzorcowego dodawano 25µl standardu
wewnętrznego (IS - Iohexol Related Compound B firmy USP)
oraz 800µl wody, próbki mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirowano przez 20 minut
przy 5000 obrotów na minutę. Oznaczenia stężenia iohexolu
w roztworach wzorcowych wykonano trzykrotnie a krzywą
kalibracyjną ustalono w oparciu o wartości średnie uzyskane
dla każdego stężenia wzorca. Piki iohexolu identyfikowano
na podstawie czasów retencji. Analizę ilościową przeprowadzono w oparciu o zależność pomiędzy sygnałem z detektora, którego miarą jest powierzchnia piku iohexolu, a jego stężeniem. Ustalono zakres liniowości i współczynnik korelacji
(r) pomiędzy stężeniem iohexolu a polem powierzchni pików
w przygotowanych roztworach kalibracyjnych. Do oceny statystycznej wykorzystano średnie arytmetyczne, odchylenie
standardowe i współczynniki zmienności. Stężenie iohexolu
podano w µg/ml.
270
Powtarzalności rozdziałów chromatograficznych
W celu oceny powtarzalności rozdziałów wykonano 22-krotny pomiar jednej próbki osocza, obliczono średni czas retencji i współczynnik zmienności.
Granica pomiaru i granica oznaczalności
Granicę pomiaru dla iohexolu (LOD) wyznaczono z krzywej
kalibracyjnej na podstawie wzoru: LOD=3,3 x syx /α, gdzie:
syx – odchylenie standardowe, α - współczynnik kierunkowy
prostej (tangens kąta nachylenia). Granicę oznaczalności
(LOQ) obliczono według wzoru: LOQ= 10 x syx /α.
Powtarzalność wewnątrz serii i między seriami
Powtarzalność wewnątrz serii określono w oparciu o 21-krotne oznaczenie jednej próbki przeprowadzone w tych samych
warunkach pomiarowych, natomiast powtarzalność między
seriami określono w oparciu o 21 niezależnie przygotowanych próbek oznaczonych w ciągu 14 dni. Obliczono współczynniki zmienności oznaczeń (CV) wewnątrz serii i między
seriami.
Ocena odzysku
Dla oceny odzysku, próbkę osocza, która nie zawierała iohexolu, obciążono iohexolem (Omnipaque) o następujących
stężeniach: 16,18µg/ml, 32,35µgS/ml, 64,7µg/ml, 129,4µg/
ml, 647µg/ml. Każde obciążenie wykonano trzykrotnie.
Oznaczanie stężenia iohexolu w osoczu
Grupę badaną stanowiło 90 dzieci w wieku od 2 do 20 lat
(średnia: 12,7 ± 4,5 lat), u których wykonano oznaczenie klirensu iohexolu. W tym celu, pacjentom podawano dożylnie
Omnipaque 300 firmy Amersham Health AS w dawce 5ml
dla pacjentów o masie poniżej 40kg oraz 10ml dla pacjentów o masie powyżej 40kg (1ml preparatu Omnipaque 300
zawiera 647mg iohexolu). Następnie pacjentom pobierano
krew włośniczkową na EDTA w drugiej, trzeciej i czwartej godzinie po podaniu preparatu. Po odwirowaniu próbek, uzyskane osocze (100µl) odbiałczano stosując 800µl 5% kwasu
nadchlorowego. Następnie, do każdej próbki dodawano 25μl
standardu wewnętrznego, próbki mieszano w temperaturze
pokojowej przez 10 minut a następnie wirowano przez 20
minut przy 5000 obrotów na minutę. Nadsącz rozdzielano
na chromatografie.
Porównano parametry prezentowanej metody z metodami oznaczania iohexolu opisanymi w literaturze (tabela I).
Zestawiono rodzaje stosowanych kolumn chromatograficznych, skład i przepływ fazy ruchomej oraz uzyskane przez
autorów danych metod współczynniki zmienności wewnątrz
serii i między seriami, liniowość, odzysk i granice wykrywalności oraz oznaczalności.
Wyniki
Na rycinie 1. przedstawiono przykładowy rozdział chromatograficzny roztworu wzorcowego, uzyskany za pomocą opracowanej metody. Na chromatogramie obecne są piki dwóch
izomerów iohexolu i pik standardu wewnętrznego. Średni
procentowy udział pola powierzchni piku dla izomeru 1 wynosił: 19,7 ± 0,3% a dla izomeru 2: 80,3 ± 0,3% niezależnie
od stężenia iohexolu w próbce i rodzaju próbki (wzorzec,
Nucleosil 5C18
200x4,6 mm
5% ACN
2,5
1,5 ml/min
izokratyczny
8 min
bez
brak danych
1,5
0,5
7,5
3,2
brak danych
brak danych
brak danych
90 – 106
Faza ruchoma
pH
przepływ
Czas rozdziału
Standard wewnętrzny (IS)
Temperatura kolumny
CV wewnątrz serii [%]
dla niskich stężeń
dla wysokich stężeń
CV między seriami [%]
dla niskich stężeń
dla wysokich stężeń
Liniowość [μg/ml]
LOD [μg/ml]
LOQ [μg/ml]
Odzysk [%]
ALC/GPC 204
HPLC 440 UV
254nm
Kolumna
długość fali detektora
Model aparatu
Krutzen i wsp.
1984
92 – 100,9
10
6
10 – 750
3,2
1,6
3,7
0,5
30 ˚C
+
12 min
0,8 → 1,2 ml/min
gradientowy
96,9 – 99,2
10
~1
10 – 50
7,8
4,8
7,8
4,8
40 ˚C
bez
20 min
0,1% TFA, MeOH
2,2
1 ml/min
gradientowy
Supleco
C18 5μm
250x4,0 mm
μBondapak
C18 10μm
150x3,9 mm
4%ACN →14%ACN
254 nm
HP 1090 HPLC
Farthing i wsp.
2005
Hitachi D-7000
HPLC-UV
254 nm
Soman i wsp.
2005
Tabela I.
Porównanie parametrów metody oznaczania stężenia iohexolu z metodami opisanymi w literaturze.
73,6 – 82,6
brak danych
brak danych
20 – 200
brak danych
brak danych
brak danych
+
45 min
buf. fosf.:MeOH
brak danych
brak danych
gradientowy
RP-8,RP-18,
RP-30
264 nm
HPLC-UV
Klenner i wsp.
2007
brak danych
10,76
3,08
12,95 – 1295
17
2,7
15
2,4
40 ˚C
bez
6 min
5% ACN
3
1 ml/min
izokratyczny
Lichrospher
Merck C18 5μm
250x4,0 mm
Hewlett-Packard 1100
254 nm
Cavalier i wsp.
2008
99 – 102
2,5
brak danych
2,5 – 1500
6,3
4,0
5,0
2,1
50 ˚C
+
1,5 min
0,4 ml/min
gradientowy
ACN/HCOOH
Watres Oasis
HLB 5μm
21x20 mm
UPLC-MS/MS
Annesley i wsp.
2009
98,6 – 101,1
12,7
4,2
5 – 647
5,5
3,7
4,5
2,3
30 ˚C
+
15 min
0,4 ml/min
izokratyczny
4% ACN
XTerra
C18 3,5μm
150x3 mm
Waters
UV
254 nm
Opisywana metoda
J. Berska i inni
271
Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi
Tabela II.
Powtarzalność wewnątrz serii i między seriami dla próbek o niskim
i wysokim stężeniu iohexolu.
Powtarzalność
Rycina 1.
Rozdział chromatograficzny roztworu wzorcowego o stężeniu iohexolu 161,8 µg/ml.
osocze pacjenta). Ze względu na znacznie większe pole powierzchni izomeru 2 iohexolu, w porównaniu do izomeru 1,
do kalibracji i ilościowego oznaczania iohexolu w próbkach
pacjentów wykorzystano pole powierzchni izomeru 2. Średni czas retencji izomeru 2 iohexolu wynosił 4,52 ± 0,02min
(CV= 0,46%).
Zależność pola powierzchni piku izomeru 2 iohexolu od stężenia iohexolu dla krzywej kalibracyjnej opisuje równanie
prostej: y = 4192,5x – 9470,1 a współczynnik korelacji wynosi r = 1,000 (ryc.2). Zakres liniowości dla opracowanej metody mieści się w granicach od 5,06 do 647μg/ml, zaś granica pomiaru i granica oznaczalności wynoszą odpowiednio:
4,2μg/ml i 12,7μg/ml.
Rycina 2.
Krzywa kalibracyjna iohexolu.
W tabeli II przedstawiono wyniki oznaczeń powtarzalności
wewnątrz serii i między seriami dla próbek o niskim i wysokim stężeniu iohexolu. Odzysk dla próbki obciążonej kolejno
iohexolem o stężeniu od 16,18μg/ml do 647μg/ml wynosi
98,6 – 101,1%.
Dyskusja
Ilościowo stężenie iohexolu w osoczu krwi można oznaczyć
za pomocą HPLC z detektorem absorpcyjnym lub stosując chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią
272
stężenie iohexolu
29,7 µg/ml
129,5 µg/ml
- wewnątrz serii
CV [%]
4,5
2,3
- między seriami
CV [%]
5,5
3,7
masową (LC/MS-MS), która daje najkrótszy czas analizy
i najniższe CV, najlepsze odzyski oraz zakresy wykrywalności iohexolu [1], jednak wiąże się z bardzo dużymi kosztami
aparaturowymi.
Przedstawiona metoda ilościowego oznaczania stężenia iohexolu, z wykorzystaniem HPLC z UV-VIS, jest modyfikacją
izokratycznej metody opisanej przez Krutzen i wsp. [12], polegającą na zastosowaniu wzorca wewnętrznego, podobnie
jak stosowali to Soman i wsp. [14]. Autorzy Ci, przeprowadzali jednak elucję gradientową zmieniając zarówno skład
fazy ruchomej jak i jej przepływ podczas trwania analizy.
Każdy rozdział chromatograficzny wykonywany z zastosowaniem elucji gradientowej wymaga, nie tylko większego
nakładu pracy diagnosty laboratoryjnego (przygotowywanie
dodatkowych roztworów do elucji), ale także dodatkowej
pompy.
Za pomocą opisanej metody oba izomery iohexolu są wykrywalne i dobrze rozdzielone (ryc.1). Powierzchnia każdego z nich może być używana do ilościowego wyliczania
stężenia iohexolu, jednak Soman i wsp. [14] oraz Krutzen
i wsp. [12] zalecają stosowanie do obliczeń ilościowych pik
iohexolu (izomer 2) o większej powierzchni. Porównanie powierzchni obydwu pików izomerów iohexolu, wykonane dla
różnych stężeń iohexolu potwierdza także, że stosunek tych
izomerów jest stały i nie zależy od początkowego stężenia
iohexolu w próbce. Powierzchnia izomeru 2 stanowiła 80%
powierzchni całkowitej.
Skład fazy ruchomej oraz jej pH, długość i wypełnienie kolumny, wielkość przepływu i sposób eucji, wpływają na czasy retencji oznaczanych analitów. W metodach oznaczania
iohexolu opisywanych przez różnych badaczy stosowano
kolumny chromatograficzne o różnej długości i wypełnieniu
(najczęściej kolumna C18 o wielkości ziaren od 5-10μm),
które wymagały zastosowania różnego przepływu fazy ruchomej i różnego sposobu elucji (gradientowa, izokratyczna).
W związku z tym całkowite czasy rozdziału znacznie się od
siebie różniły i wahały się w zakresie od 8 do 45 minut. Najczęściej stosowaną fazą ruchomą był roztwór acetonitrylu,
który też został zastosowany w naszej metodzie. Niektórzy
autorzy [4,12] dodatkowo zakwaszali fazę ruchomą do pH
2,5 lub 3, co w prezentowanej metodzie nie było stosowane.
W przedstawionej przez nas metodzie zastosowano elucję
izokratyczną, czas rozdziału wynosił 15 minut a przepływ
fazy ruchomej 0,4ml/min i był najniższy wśród opisanych
w literaturze.
J. Berska i inni
Otrzymany zakres liniowości krzywej kalibracyjnej 5,06 –
647μg/ml jest szerszy od uzyskanego przez Klenner i wsp.
[11] oraz Farthing i wsp. [6] natomiast węższy od uzyskanego przez Cavalier i wsp. [4], lecz wystarczający w rutynowej
praktyce. Stężenie iohexolu po podaniu 5ml preparatu Omnipaque pacjentom, przeciętnie znajduje się w zakresie 25 –
600μg/ml w zależności od aktualnego stanu nerek i czasu jaki
upłynął między podaniem preparatu a pobraniem krwi do badania (2, 3 lub 4 godziny). Wartości LOD i LOQ które wynosiły
odpowiednio 4,2μg/ml i 12,7μg/ml, istotne dla oceny niskich
stężeń iohexolu są porównywalne z tymi jakie otrzymali Cavalier [4] i Soman [14]. CV wewnątrz serii oraz między seriami są niskie (<5,5%) i porównywalne do otrzymanych przez
Soman i wsp.[14] co świadczy o bardzo dobrej powtarzalności i odtwarzalności opisywanej metody rozdziału iohexolu.
Dla stosowanej przez nas metody oznaczania iohexolu uzyskano podobnie jak Soman i wsp. [14] i Farthing i wsp. [6]
wysokie wartości odzysku: 98,6 – 101,1%, które są wyższe
od otrzymanych przez Klenner i wsp. [11]. Świadczą one
o dobrej dokładności metody.
Dla oceny stabilności aparatury oraz powtarzalności systemu konieczne jest wyznaczenie dla minimum 5 próbek
średniego czasu retencji oraz CV. Wartości czasów retencji
powinny być stałe a dopuszczalne CV czasów retencji powinno wynosić <1% [8]. Otrzymana przez nas wartość CV
dla czasów retencji 0,46% spełnia to założenie i świadczy
o doskonałej stabilności i powtarzalności stosowanego systemu pomiarowego.
Wniosek
Opracowana metoda oznaczania stężenia iohexolu z zastosowaniem standardu wewnętrznego przy użyciu kolumny XTerra
(C18; 3,5μm; 3,0mm x 150mm) i 4% roztworu acetonitrylu jako
fazy ruchomej o izokratycznym przepływie 0,4ml/min, nadaje
się do ilościowego oznaczania stężenia iohexolu w osoczu
krwi.
rate. J Am Soc Nephrol 1995; 6: 257-263.
8. Ghulam AS. Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation requirements of the
US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and
the International Conference on Harmonization J Chromatogr A.
2003 Feb 14; 987 (1-2): 57-66.
9. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical
Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-Q2A,
Geneva 1994.
10. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical
Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Validation of Analytical Procedures: Methodology,
ICH-Q2B, Geneva 1996.
11. Klenner S, Bergmann C, Strube K i wsp. SPE for Endo- and
Exo-Iohexol Analysis with HPLC in Canine Serum and Rat Urine. Chromatogr 2007; 65, June.
12. Krutzen E, Bäck S, Nilsson-Ehle I i wsp. Plasma clearance of
new contrast agent, iohexol: A method for the assessment of
glomerular filtration rate. J Lab Clin Med 1984; 104: 955-61.
13. NKF DOQI Guideslines: Estimation of GFR. Am J Kidney Dis
2002; 39: 76.
14. Soman R, Zahir H, Akhlaghi F Development and validation of
an HPLC-UV method for determination of iohexol in human plasma. J Chromatogr B 2005; 816: 339-343.
15. Sterner G, Frennby B, Mansson S i wsp. Determining ‘true’ glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin
and comparing it with values obtained using other clearance
techniques or prediction equation Scand. J Urol Nephrol 2008;
42, 278.
Adres do korespondencji:
Joanna Berska
Zakład Biochemii Klinicznej
Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ
ul. Wielicka 265, 30-663 Kraków
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 28.07.2011.
Piśmiennictwo
1. Annesley T, Clayton L Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Assay for Iohexol in Human
Serum. Clin Chem 2009, 55:6 1196-1202.
2. Berg UB, Back R, Celsi G i wsp. Comparison of Plasma Clearance of Iohexol and Urinary Clearance of Inulin for Measurement of GFR in Children. Am J Kidney Dis. 2010 Sep 24.
3. Bird N, Peters C, Michell A i wsp. Comparison of GFR Measurements Assessed From Single Versus Multiple Samples. Am J
Kidney Dis 2009 Aug No 2 Vol 54.
4. Cavalier E, Rozet E, Dubois N i wsp. Performance of iohexol
determination in serum and urine by HPLC: Validation, risk and
uncertainly assessment. Clin Chim Act 2008; 396: 80–85.
5. EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Method, First Internet Version, 1998.
6. Farthing D, Sica D, Fakhry I i wsp. Simple HPLC-UV method for
determination of iohexol, iothalamate, p-aminohippuric acid and
n-acetyl-p-aminohippuric acid in human plasma and urine with
ERPF, GFR and ERPF/GFR ratio determination using colorimetric analysis. J Chromatogr B 2005; 826: 267-272.
7. Gaspari F, Perico N, Ruggenenti P i wsp. Plasma clearance
of nonradioactive iohexol as a measure of glomerular filtration
273