pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str. 705–715
PRACA ORYGINALNA – Original Article
KRZYSZTOF ILNICKI, ELśBIETA URBANOWSKA1
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej na ich przeŜycie i potencjał
proliferacyjny
Impact of the long term storage temperature on survival and proliferative potential of the cord blood nuclear cells
Z Zakładu Genetyki, Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie
Kierownik: Prof. dr hab. Małgorzata Krajewska-Walasek
1
Z Katedry i Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik: Prof. dr hab. W.W. Jędrzejczak
STRESZCZENIE
Tematem pracy jest ocena przechowywania przez okres 4 lat komórek jądrowych krwi pępowinowej w ogólnie dostępnej zamraŜarce mechanicznej (–80ºC) i fazie ciekłej ciekłego azotu
(–196ºC) oraz wpływ takiego sposobu przechowywania na ich właściwości klonogenne. Wydaje
się, Ŝe główną przyczyną zmniejszania liczby Ŝywych komórek obdarzonych zdolnością tworzenia kolonii krwiotwórczych jest temperatura przechowywania komórek, a dopiero następną w
kolejności zmniejszanie się liczby komórek jądrowych wskutek aglutynacji, w zaleŜności od ich
początkowego stęŜenia w próbce. Nie stwierdzono jednak, by zamraŜanie komórek jądrowych
krwi pępowinowej w wysokich stęŜeniach oddziaływało wybiórczo na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w obrębie komórek jądrowych pozostających w zawiesinie uŜytej po
rozmroŜeniu do hodowli. Przechowywanie zamroŜonych komórek jądrowych w stabilnej temperaturze –196ºC fazy ciekłej, ciekłego azotu jest znacząco bardziej wydajne niŜ przechowywanie
w zamraŜarce udostępnionej do ogólnego uŜytku.
SŁOWA KLUCZOWE: Krew pępowinowa – Kriokonserwacja – Potencjał proliferacyjny komórek
jądrowych
SUMMARY
The aim of this work was to evaluate the result of the 4 years period of the umbilical cord blood
nuclear cells in the general purpose laboratory mechanical freezer (–80ºC) as well as in the liquid
phase of the liquid nitrogen (–196ºC). It was detected the impact of such storage conditions on
survival and proliferative potential of these cells. It seems probable, that the main reason of
diminution of the pool of clonogenic cells is the temperature of storage. The secondary reason is
agglutination of these cells as a consequence of their initial concentration in the freezed probe.
However, it was not observed, that the freezing process of the nuclear cells have had some effect
on the enrichment or specific diminution of the pool of CFC that remain in the suspension after
thawing. Storage of the cryopreserved nuclear cells in the stable temperature of liquid phase of
706 K. ILNICKI i wsp.
liquid nitrogen (-196ºC) seems to be significantly more effective than the storage in the general
purpose mechanical freezer.
KEY WORDS: Cord blood – Cryopreservation – Proliferative potential of nuclear cells
WSTĘP
Pierwsze udane zabiegi przeszczepienia krwi pępowinowej wykazały, Ŝe pojedyncza jednostka takiej krwi zawiera wystarczającą liczbę komórek krwiotwórczych, pozwalającą na odnowę krwiotworzenia biorcy. Czynniki takie, jak wyŜsza aktywność
proliferacyjna komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej w porównaniu do komórek
szpiku, ich odpornościowa niedojrzałość, łatwiejszy dobór dawcy i biorcy oraz praktycznie nieograniczony dostęp do niej spowodowały wzrost zainteresowania tym
źródłem komórek krwiotwórczych do przeszczepienia.
Procedurę pozyskiwania i preparowania komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej moŜna podzielić na następujące etapy: pobranie krwi pępowinowej, oddzielenie
komórek jądrowych od erytrocytów, granulocytów i płytek krwi, zagęszczenie zawiesiny komórek jądrowych, wśród których są obecne komórki krwiotwórcze, krioprezerwację tych komórek, ich przechowywanie oraz rozmroŜenie z ewentualnym usunięciem krioprotektora.
Od momentu zamroŜenia krwi pępowinowej do wydania do przeszczepienia, musi
być ona przechowywana w temperaturze kriogenicznej. Klasycznie, temperaturą do
przechowywania zamroŜonego materiału komórkowego jest temperatura ciekłego azotu (–196°C), która pozwala na wieloletnie przechowywanie takiego materiału i pozostaje bez ujemnego wpływu na aktywność proliferacyjną komórek krwiotwórczych [1].
Komórki krwiotwórcze mogą być równieŜ przechowywane w temperaturze
zamraŜarki mechanicznej (–80°C) [2], co nie wymaga stałego uzupełniania odparowanego ciekłego azotu, tak jak musi to być dokonywane w metodzie poprzedniej. Dodatkowo, zewnętrzne powierzchnie pojemników krioochronnych nie są obmywane przez
ciekły azot, który moŜe ułatwiać rozprzestrzenianie zakaŜeń (np. wirusowych) pomiędzy pojemnikami.
Przed przeszczepieniem biorcy krew pępowinowa dotychczas przechowywana w
zamroŜeniu musi zostać rozmroŜona. Regułą jest bardzo szybkie rozmroŜenie porcji
zawiesiny komórek poprzez krótkotrwałe (minuty) ogrzanie w łaźni wodnej o temperaturze 36°–38°C [3, 4] Spowolnienie takiego tempa rozmraŜania przez np. kilkugodzinne rozmraŜanie w temperaturze +4°C obniŜa Ŝywotność komórek jądrowych i liczbę
tworzonych przez nie kolonii krwiotwórczych.
Czynnikami branymi pod uwagę w kwalifikacji jednostki krwi pępowinowej do
przeszczepienia jest nie tylko liczba komórek jądrowych, ale takŜe liczba kolonii
krwiotwórczych wskazujące na wielkość potencjału proliferacyjnego komórek hematopoetycznych . Nie ma jednak wystarczającej liczby badań porównujących wpływ
długotrwałego (wieloletniego) przechowywania komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej w ciekłym azocie i w zamraŜarce mechanicznej na właściwości klonogenne
tych komórek. Dlatego celem naszej pracy było porównanie przechowywania przez
okres 4 lat wyizolowanych i zamroŜonych komórek krwiotwórczych krwi pępowino-
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania
707
wej w temperaturze fazy ciekłej ciekłego azotu (–1960C) i w ogólnie dostępnej laboratoryjnej, pionowej zamraŜarce mechanicznej (–800 C).
MATERIAŁ I METODY
Pracę wykonano na 60 porcjach krwi pępowinowej pobranej w trakcie porodów
rozwiązywanych siłami natury. Określano objętość zebranej krwi oraz liczono bezwzględną liczbę komórek jądrowych (za pomocą analizatora hematologicznego Cell
Dyna 1700 firmy Abbott).
Izolacja, zamraŜanie i rozmraŜanie komórek jądrowych krwi pępowinowej
Na Gradisol L nawarstwiano krew pępowinową i wirowano przy 1000 g. przez 20
minut, a następnie zbierano frakcję leukocytarną. Otrzymane komórki płukano, zawieszano w podłoŜu Iscove’a, liczono oraz określano ich Ŝywotność metodą wchłaniania
błękitu trypanu oceniając odsetek komórek, które nie wchłonęły barwnika. Otrzymane
w wyniku rozdziału komórki jądrowe zawieszano w płodowej surowicy cielęcej w
stęŜeniach 50; 20; 10 i 5 mln/ml i przenoszono do fiolek do krioprezerwacji (Nalge
Nunc Int.), a następnie dodawano podłoŜe do mroŜenia, tak aby końcowe stęŜenie
DMSO wynosiło 7,5%. ZamraŜanie prowadzono zgodnie ze schematem zamraŜania
komórek jądrowych krwi. Połowę zamroŜonych próbek z kaŜdej grupy przenoszono do
ogólnie dostępnej laboratoryjnej, pionowej zamraŜarki mechanicznej firmy Revco
(temp –80°C), Pozostały materiał komórkowy przenoszono do kriostatu firmy TaylorWharton i umieszczano w fazie ciekłej, ciekłego azotu (temp. –196°C). Czas przechowywania wynosił 4 lata. Po upływie tego czasu, próbkę po wyjęciu z ciekłego azotu
lub zamraŜarki, rozmraŜano w łaźni wodnej w temp. 37°C nieustannie mieszając. Po
rozmroŜeniu, do ampułki dodawano kroplami podłoŜe Iscove’a z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Gibco Ltd). W rozmroŜonej zawiesinie określano liczbę komórek jądrowych oraz ich Ŝywotność.
Badanie liczby komórek krwiotwórczych tworzących kolonie in vitro
Do podłoŜa z metylcelulozą (MethoCult H 4433 Stem Cell Technologies) dodawano zawiesinę komórek w podłoŜu Iscove’a z dodatkiem płodowej surowicy cielęcej.
Otrzymaną mieszaninę rozlewano do dwóch płytek testowych (Nalge Nunc). Po inkubacji odczytywano liczbę wyrośniętych kolonii krwiotwórczych na 100 000 nasadzonych komórek. Kolonie krwiotwórcze klasyfikowano według kryteriów opracowanych
przez Sutherland i wsp. [5]. Wynik był średnią z odczytu z 2 płytek.
Otrzymane wartości przedstawiano jako średnie ± odchylenie standardowe. Porównania pomiędzy grupami przeprowadzano stosując test t Studenta, a wartości p poniŜej 0,05 uznawano za znamienne statystycznie.
708 K. ILNICKI i wsp.
WYNIKI
1. Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej w temperaturze
ciekłego azotu (–196°C) i zamraŜarki mechanicznej (–80°C) na parametry fizjologiczne tych komórek.
a. Ŝywotność komórek
Po przechowywaniu komórek jądrowych w ciekłym azocie i ich rozmroŜeniu, Ŝywotność tych komórek wynosiła 82,5±7%, natomiast po przechowywaniu w zamraŜarce i rozmroŜeniu Ŝywotność wynosiła 48,9 ±15%. RóŜnica w odsetku przeŜycia tych
komórek w zaleŜności od temperatury przechowywania (między grupami (–196°C i –
80°C) była statystycznie znamienna. Rycina 1 ilustruje wpływ temperatury przechowywania na Ŝywotność komórek jądrowych po ich rozmroŜeniu.
90
80
śywotność (%)
70
60
50
40
30
20
p= 0,0134
10
0
temperatura
- 196°C
- 80°C
Ryc. 1. Wpływ temperatury przechowywania na Ŝywotność komórek jądrowych
Fig. 1. Influence of the storage temperature on the viability of the nuclear cells
b. Odsetek odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze
Liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w próbkach przechowywanych
w ciekłym azocie, po rozmroŜeniu wyniosła 82 ± 15% w stosunku do liczby tych komórek w materiale nie poddanym krioprezerwacji, natomiast liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w próbkach przechowywanych w zamraŜarce wyniosła 45
± 16%. RóŜnica w odsetku odzysku komórek w zaleŜności od temperatury przechowywania jest statystycznie znamienna. Na Rycinie 2 przedstawiono wpływ temperatury przechowywania na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po rozmroŜeniu.
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania
709
odsetek liczby komórek tworzących kolonie
krwiotwórcze
100
90
80
70
60
50
40
30
p = 0,0344
20
10
0
temperatura
- 196°C
- 80°C
Ryc. 2. Wpływ temperatury przechowywania na tworzenie kolonii przez komórki tworzące kolonie hematopoetyczne
Fig. 2. Influence of storage temperature on the colonies formation by the hematopoietic colony forming
cells
2. Wpływ temperatury –1960C i –800C na odsetek odzysku rozmraŜanych komórek jądrowych uprzednio zamroŜonych w róŜnych stęŜeniach.
Odsetek odzysku komórek jądrowych po rozmroŜeniu zmniejszał się wraz ze
wzrostem stęŜenia tych komórek przechowywanych zarówno w ciekłym azocie jak i w
zamraŜarce. RóŜnice w odzysku pomiędzy grupą I (5 mln/ml) i IV (50 mln/ml) były
znamienne statystycznie w odniesieniu do materiału przechowywanego w zamraŜarce
(Rycina 3).
3. Wpływ temperatur –1960C i –800C na odsetek odzysku komórek tworzących
kolonie krwiotwórcze.
Populacje rozmroŜonych komórek jądrowych, które były przechowywane w ciekłym azocie prezentują zbliŜone wartości odsetka odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na 100 000 hodowanych komórek, niezaleŜnie od ich stęŜenia
w próbce. Podobna zbieŜność wyników dotyczy równieŜ populacji komórek przechowywanych w zamraŜarce. Rycina 4 ilustruje wpływ stęŜenia izolowanych komórek
jądrowych krwi pępowinowej, krioprezerwowanych i przechowywanych w ciekłym
azocie lub zamraŜarce po rozmroŜeniu, na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. JednakŜe, odsetek odzysku liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze
w populacji przechowywanej w temperaturze ciekłego azotu był znamiennie wyŜszy
niŜ odsetek odzysku tych komórek w populacji przechowywanej w zamraŜarce, niezaleŜnie od stęŜenia komórek w próbce. Wyjściowa liczba komórek tworzących kolonie
krwiotwórcze wynosiła 140±85 na 100 000 komórek jądrowych i 15 000 ± 8000 na
710 K. ILNICKI i wsp.
1 ml zawiesiny tych komórek. Obserwowano ponad dwukrotny spadek liczby komórek
tworzących kolonie krwiotwórcze na 100 000 komórek jądrowych pozostających
w zawiesinie, w próbkach przechowywanych w zamraŜarce, w porównaniu do próbek
przechowywanych w ciekłym azocie.
100
90
odsetek liczby komórek jądrowych
80
70
60
50
40
30
P=0,0387
20
10
0
stęŜenie
komórek
5mln/ml
10 mln/ml
20mln/ml
50mln/ml
Komórki przechowywane w temp. - 196°C
Komórki przechowywane w temp. - 80°C
Ryc. 3. Wpływ temperatury –196°C i –80°C na odsetek odzysku rozmraŜanych komórek jądrowych,
zamraŜanych w róŜnych stęŜeniach
Fig. 3. Influence of the temperatures –196°C and –80°C on the percentage of recuperation of thawed
nuclear cells, frozen in different concentrations
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania
711
odsetek liczby komórek tworzacych kolonie
krwiotwórcze
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
P=0,05384
p = 0,0441
P= 0,0485
P= 0,0362
0
stęŜenie
komórek
5mln/ml
10mln/ml
20mln/ml
50mln/ml
Komórki przechowywane w temp. - 196°C
Komórki przechowywane w temp. - 80°C
Ryc. 4. Wpływ stęŜenia krioprezerwowanych komórek jądrowych przechowywanych w ciekłym azocie
lub w zamraŜarce na odsetek odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po ich rozmroŜeniu (na
100 000 komórek pozostających w zawiesinie).
Fig. 4. Influence of concentrations of the cryopreserved nuclear cells stored in liquid nitrogen and freezer
on the percentage of recuperation of the colony forming cells after thawing (per 100 000 cells that remain
in the suspension).
OMÓWIENIE WYNIKÓW
Krew pępowinowa przechowywana w bankach krwi pępowinowej stanowi cenne
uzupełnienie rejestrów szpiku. Do efektywnego przeszczepienia krwi pępowinowej
zapewniającej trwałą odnowę układu krwiotwórczego wymagana jest infuzja co najmniej 3 × 107/kg m.c. biorcy komórek jądrowych, wśród których są obecne komórki
krwiotwórcze [6]. Czynności, które obejmują wyizolowanie komórek jądrowych
z krwi pępowinowej, ich przechowywanie i rozmraŜanie muszą być wykonywane w taki sposób, aby gwarantowały najmniejsze ich straty, zarówno w czasie obróbki, jak teŜ
i wieloletniego przechowywania. Jest to o tyle istotne, Ŝe zwykle pobiera się niewielką
712 K. ILNICKI i wsp.
objętość krwi pępowinowej (ok. 80 do 150 ml), zawierającą ograniczoną liczbę komórek krwiotwórczych, która wystarcza do ustanowienia krwiotworzenia u dzieci, ale jest
niewystarczającą do odtworzenia układu krwiotwórczego u biorców dorosłych. W tym
ostatnim przypadku dokonuje się przeszczepienia dwóch lub więcej jednostek krwi
pępowinowej [7]. Konieczne jest więc zastosowanie nie tylko wydajnych metod preparowania krwi pępowinowej, ale takŜe takich sposobów krioprezerwacji i przechowywania wyizolowanych komórek jądrowych, aby ich odzysk i potencjał proliferacyjny
do celów przeszczepienia był jak najwyŜszy.
Warunki krioprezerwacji komórek jądrowych krwi pępowinowej.
W obecnej pracy uŜyto dwumetylosulfotlenku (DMSO) jako krioprotektora w stęŜeniu 7,5% w podłoŜu zawierającym 80% surowicy cielęcej płodowej. Almici i wsp.
[8] i wielu innych autorów stosuje wyŜsze (10%) stęŜenie DMSO, natomiast Galmes i
wsp. [9] stosowali niŜsze (5%) stęŜenie DMSO. Ahmed i wsp. [10] stosowali mieszaninę 5% DMSO i 6% HES. Ballint i wsp. [11] wykazali, Ŝe wyŜsze stęŜenie DMSO
jest optymalne dla krioprezerwacji bardziej niedojrzałych komórek krwiotwórczych,
natomiast niŜsze dla komórek juŜ zróŜnicowanych (CFU-GM).
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej na ich przeŜycie.
Krioprezerwowany materiał przechowywano w ciekłym azocie w temp. -196°C
oraz w zamraŜarce w temp. –80°C. śywotność komórek jądrowych mierzona pochłanianiem błękitu trypanu wynosiła po przechowywaniu w ciekłym azocie ponad 80%,
natomiast po przechowywaniu w zamraŜarce niecałe 50%. Simon i wsp. (12) uzyskali
wyŜsze wyniki przeŜycia (ok. 80%) krioprezerwowanych limfocytów przechowywanych w zamraŜarce. Stiff i wsp. [13] uzyskali wynik przeŜycia 70% komórek szpiku
zamroŜonych w mieszaninie DMSO i HES po 14 miesiącach przechowywania w temperaturze –80°C. Był to wynik lepszy od wyniku przeŜycia (50%) komórek szpiku
zamroŜonych w tych samych warunkach i przechowywanych w temp. –170°C przez
okres sześciu miesięcy.
Makino i wsp. [14] uzyskali 90% przeŜycia komórek krwiotwórczych pobranych
drogą aferezy z krwi obwodowej a następnie zamroŜonych w mieszaninie DMSO i
HES, które przechowywano przez okres 3 miesięcy w temp. -80°C. Feremans i wsp.
[15] uzyskali 75% przeŜycia komórek z krwi obwodowej, zamroŜonych w obecności
mieszanimy DMSO i HES, przechowywanych do 65 dni w -80°C. Galmes i wsp. [9]
uzyskali 90% przeŜycia komórek krwi obwodowej pozyskanych w powyŜszy sposób,
zamroŜonych w obecności 10% DMSO i przechowywanych przez jeden miesiąc. Ratajczak i wsp. [16] uzyskali 84% przeŜycie komórek szpiku mroŜonych w obecności
10% DMSO, przechowywanych w temp. –80°C. Był to wynik lepszy od wartości odsetka przeŜycia (76%) tych komórek mroŜonych w identyczny sposób, lecz przechowywanych w ciekłym azocie.
Przytoczone powyŜej wyniki nie są zgodne z wynikami uzyskanymi w obecnej
pracy. Jeszcze wyraźniej ta niezgodność jest zaakcentowana w przypadkach, w których
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania
713
porównywane jest przechowywanie materiału komórkowego w ciekłym azocie i zamraŜarce (9; 16). Wytłumaczeniem tej niezgodności moŜe być sposób przechowywania zamroŜonego materiału. Autorzy poniŜszej pracy wykorzystywali do tych celów
pionową zamraŜarkę firmy Revco przeznaczoną do ogólnego uŜytku w laboratorium.
ZamraŜarka pionowa tym zasadniczo róŜni się od zamraŜarki poziomej (z klapą poziomą umieszczoną na szczycie), Ŝe w momencie otwarcia całe, bardziej gęste i zimne
powietrze wypływa z niej i jest zastępowane powietrzem ciepłym, o mniejszej gęstości. Niewiele w tym względzie pomocny jest podział wnętrza komory na indywidualnie
zamykane sekcje. Umieszczony w takiej komorze materiał komórkowy podlega kilkakrotnie w ciągu dnia krótkotrwałym wahaniom temperatury, które wynikają z uŜytkowania zamraŜarki., a wahania takie mogą sięgać nawet kilkudziesięciu stopni Celsjusza. Nie są one rejestrowane przez urządzenia pomiarowo-kontrolne zamraŜarki wykazujące duŜą bezwładność. Przechowywany materiał podlega więc wielu cyklom zmian
termicznych, zachodzących, co prawda w temperaturach poniŜej 0°C, ale mogących
mieć destrukcyjny wpływ na zamroŜone struktury biologiczne komórek jądrowych.
Rowley [17] równieŜ zwraca uwagę na destrukcyjny wpływ zmian termicznych zachodzących w kriostatach napełnionych ciekłym azotem, w których materiał umiejscowiony jest w fazie gazowej tego chłodziwa. Dobrym rozwiązaniem problemu zmian termicznych wydaje się być umieszczenie zamroŜonych próbek w pudełku ze styropianu
lub poliuretanu przed jego umieszczeniem w zamraŜarce.
Wpływ przechowywania krioprezerwowanego materiału w ciekłym azocie i zamraŜarce na liczbę tworzonych kolonii krwiotwórczych.
Wyjściowa liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze wynosiła średnio:
142 ± 85 na 100 000 komórek jądrowych. Jest to zgodne z wynikami uzyskanymi
przez Briddella i wsp. [18]. Wpływ na ten znaczny rozrzut mogą mieć, poza zmiennością osobniczą, nawet niewielkie róŜnice w terminie porodu, chwili przecięcia naczyń
pępowinowych w momencie pobrania krwi, dlatego Ŝe wahaniom ulega liczba komórek ukierunkowanych w krwi pępowinowej oraz w krwi noworodka. Liczba komórek
tworzących kolonie krwiotwórcze zmienia się w tym okresie raptownie, na co wskazują wyniki Broxmeyera i wsp. [1]. Briddell i wsp. [18] określili pojęciem “0 day culture” hodowlę komórek krwiotwórczych zainicjowaną w dniu wypreparowania frakcji
komórek jądrowych, której wynik słuŜył następnie jako odniesienie do dalszych eksperymentów.
Przechowywanie zamroŜonego materiału w ciekłym azocie i zamraŜarce powodowało zmniejszenie liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. Odzysk tych
komórek wyniósł od 63 do 81% dla materiału przechowywanego w ciekłym azocie i
od 20 do 45% dla materiału przechowywanego w zamraŜarce. Występowała duŜa
zmienność wyników, ale róŜnice są statystycznie znamienne. W niektórych indywidualnych przypadkach stwierdzono w obecnej pracy większą liczbę kolonii w hodowlach
z materiału rozmroŜonego po przechowywaniu w ciekłym azocie, niŜ w materiale
wyjściowym nie mroŜonym – nigdy nie miało to miejsca w przypadku materiału przechowywanego w zamraŜarce.
714 K. ILNICKI i wsp.
Beaujean i wsp. [19] sugeruje moŜliwość eliminacji poprzez proces krioprezerwacji, komórek supresorowych i w konsekwencji zwiększenie potencjału klonogennego
komórek macierzystych. Ale jednocześnie Nicol i wsp. [20] stwierdzili obniŜenie aktywności receptorów dla czynnika wzrostu (GM-CSF) w Ŝywych komórkach macierzystych bezpośrednio po rozmroŜeniu. Na tak duŜą, obserwowaną zmienność wyników miała więc z pewnością wpływ duŜa zmienność wyjściowa liczby kolonii w hodowlach zainicjowanych z materiału nie krioprezerwowanego, a ponadto nakładać się
mogły inne, wzmiankowane wyŜej czynniki nie związane bezpośrednio z Ŝywotnością
komórki. MoŜna przypuszczać, Ŝe czynniki te dotyczą materiału po krioprezerwacji .
Wpływ metody rozmraŜania na liczbę, Ŝywotność i zdolność tworzenia kolonii
krwiotwórczych przez komórki jądrowe krwi pępowinowej.
Materiał przechowywany równolegle w ciekłym azocie w temperaturze -196°C
oraz w zamraŜarce w temperaturze -80°C był rozmraŜany metodą klasyczną. Liczba
komórek jądrowych po rozmroŜeniu była niŜsza, niŜ przed zamroŜeniem. Wyraźnie
widoczny był wprost proporcjonalny wpływ wzrostu stęŜenia komórek poddanych
krioprezerwacji na wielkość strat powstających przy rozmraŜaniu tą metodą (21). Obserwowane zjawisko dotyczyło w takim samym zakresie komórek przechowywanych
w ciekłym azocie jak i w zamraŜarce.
Podsumowując moŜna stwierdzić, Ŝe głównym czynnikiem sprawczym zmniejszania liczby Ŝywych komórek jądrowych zdolnych do tworzenia kolonii krwiotwórczych
jest temperatura przechowywania komórek, a następnym w kolejności czynnikiem jest
zmniejszanie liczby komórek jądrowych wskutek aglutynacji, w zaleŜności od początkowego stęŜenia tych komórek w zamroŜonej próbce. Ponadto, proces zamraŜania
komórek jądrowych krwi pępowinowej w róŜnych stęŜeniach nie wpływa wybiórczo
na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w obrębie puli komórek pozostających w zawiesinie uŜytej do hodowli.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Broxmeyer HE, Cooper S. High-efficiency recovery of immature hemopoietic progenitor cells with
extensive proliferative capacity from human cord blood cryopreserved for 10 years. Clinical and Experimental Immunology 1997; 107 Suppl. 1: 45-53.
Paczkowska E. Freezing of umbilical cord blood cells in mechanical freezer (–80ºC) Ann. Acad.
Med Stettin. 2002; 48: 117-133.
Rowley S.D, Bensinger WI, Gooley TA, Buckner C.D. Effect of cell concentration on bone marrow
and peripheral blood stem cell cryopreservation. Blood 1994; 83: 2731-2736.
Mikołajek W. Optimalisation for preparation and expansion of ex vivo human Umbilical Cord Blood
cells for transplantation. Ann. Acad. Med Stettin. 2002; 48: 117 – 133.
Sutherland HJ, Eaves AC, Eaves C.J. Quantitative assays for human hematopoietic progenitor cella.
Bone Marrow Processing and Purging. A Practical Guide Wyd: A.P.Gee, CRC Press Inc. 1991; 155171.
Larghero J, Garcia J, Gluckmann E. Sources of procurement of stem cells In Haematopoietic Stem
Cell Transplantation. The EBMT Handbook, 5-th Edition, p. 113-127.
Jędrzejczak W.W, Rokicka M, Urbanowska E, Torosian T, Graczyk-Pol E, Tomaszewska A, Król
M,Paluszewska M, Jołkowska J, Witt M. Simultaneous transplantation of two allogenic unit of cord
Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
715
blood in an adult patient with acute myeloblastic leukemia. A case report. Arch. Immunol. Ther. Exp.
2005; 53: 364–368.
Almici C, Carlo-Stella C, Wagner J.E, Mangoni L, Garau D, Re A, Giachetti R,Cesana C, Rizzoli V.
Clonogenic capacity and ex vivo expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells are not
impaired by cryopreservation. Bone Marrow Transplantation 1997; 19: 1079-1084.
Galmes A, Besalduch J, Bargay J, Matamoros N, Morey M, Novo A, Sampol A. A simplified method
for cryopreservation of hematopoietic stem cells with –80°C mechanical freezer with dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant. Leukemia and Lymphoma 1995; 17: 181-184 .
Ahmed T, Wuest D, Ciavarella D, Ayello J, Feldman E.J, Biguzzi S, Gulati S, Hussain F, Mittelman
A, Ascensao J.L, Arlin Z.A. Marrow storage techniques: A clinical comparison of refrigeration versus
cryopreservation. Acta Haematologica 1991; 85: 173-178.
Ballint B, Ivanovic Z, Petakov M, Taseki J, Jovcic G, Stojanovic N, Milenkovic P. The cryopreservation protocol optimal for progenitor recovery is not optimal for preservation of marrow repopulating
ability. Bone Marrow Transplantation 1999; 23: 613-619.
Simon J.D.; Flinton L.J.; Albala M.M. A simple method for the cryopreservation of human lymphocytes at -80°C. Transfusion 1977; 17: 23-28.
Stiff P.J, Koestner A.R, Weidner M.K, Dvorak K, Fisher R.I. Autologous bone marrow transplantation using unfractionated cells cryopreserved in Dimethylsulfoxid and Hydroxyethyl starch without
controlled-rate freezing. Blood 1987; 70: 974-978.
Makino S, Harada M, Akashi K, Taniguchi S, Schibuya T, Inaba S. A simplified method for cryopreservation of peripheral blood stem cells at -80°C without rate controlled freezing. Bone Marrow
Transplantation 1991; 8: 239-244.
Feremans WW, Bastin G, Le moine F, Ravoet C, Delville C, Pradier O, Wallef G, Dupont E, Capel P,
Lambermont M. Simplification of the blood stem cell transplantation (BSCT) procedure: large volume apheresis and uncontrolled rate cryopreservation at -80°C. European Journal of Hematology
1996; 56: 278-282.
Ratajczak M.Z.; Ratajczak J.; Kregenov D.A.; Kuczyński W.; Skórski T.;Gewirtz A.M. Cytokine
stimulation of CD34+ bone marrow cells prior to cryopreservation enhances their post-thawing proliferative potential. Folia Histochemica et Cytobiologica 1994; 32: 149-153.
Rowley S.D. Hematopoietic stem cell cryopreservation. Hematopoietic Stem Cell Transplantation II
Edition 1994; 481-492.
Briddell R, Kern B.P, Zilm KL, Stoney G.B, McNiece IK. Purification of CD34+ cells is essential for
optimal ex vivo expansion of umbilical cord blood cells. Journal of Hematotherapy 1997; 6: 145150.
Beaujean F, Bourhis J-H, Bayle C, Jouault H, Divine M, Rieux C, Janvier M, Le Forestier C, Pico
J.L. Successful cryopreservation of purified autologous CD34+ cells: influence of freezing parameters
on cell recovery and engraftment. Bone Marrow Transplantation 1998; 22: 1091-1096.
Nicol A, Nieda M, Donaldson C, Denning-Kendall P. Analysis of cord blood CD34+ cells after
cryopreservation. Experimental Hematology 1995; 23: 1589-1594.
Ilnicki K, Urbanowska E. Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji w preparatach kriokonserwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej. Acta Haematologica Polonica 2006; 37: 361371.
Praca wpłynęła do Redakcji 17.12.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 26.06.2009 r.
Adres Autora:
Krzysztof Ilnicki
ul. Augustyna Kordeckiego 75/5
04-355 Warszawa
Tel. 0- 609-407- 300