Przeznaczenie

Transkrypt

Przeznaczenie

COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
HIM
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Informacje dotycz¹ce
zamówienia
HIM
COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
COBAS AMPLICOR
Wash Buffer
WB
48 Tests P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
500 Tests P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
Przeznaczenie
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) jest to test
amplifikacji kwasu nukleinowego in vitro s³u¿¹cy do oznaczenia iloœciowego
RNA ludzkiego wirusa niedoboru odpornoœci typu 1 (Human Immunodeficiency
Virus Type 1, HIV-1) w ludzkim osoczu za pomoc¹ analizatora COBAS
AMPLICOR. Test umo¿liwia oznaczenie iloœciowe HIV-1 RNA w zakresie
50-750 000 kopii/ml, wykorzystuj¹c po³¹czenie dwóch procedur przygotowania
próbki, standardowej oraz ultraczu³ej.
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, nie jest przeznaczony do
stosowania jako test przesiewowy krwi lub produktów krwiopochodnych na
obecnoœæ HIV-1. Nie jest równie¿ przeznaczony do stosowania jako test
diagnostyczny potwierdzaj¹cy obecnoœæ zaka¿enia HIV-1.
9/2005, Revision 5.0
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5
1/52
P/N: 04497821 190
Test jest przeznaczony do zastosowania w postêpowaniu klinicznym u pacjentów
zaka¿onych HIV-1, z uwzglêdnieniem stanu klinicznego oraz innych
wskaŸników laboratoryjnych progresji choroby. Test mo¿e s³u¿yæ do oceny
rokowania w oparciu o pomiar pocz¹tkowego poziomu HIV-1 RNA; mo¿e tak¿e
s³u¿yæ do monitorowania leczenia przeciwretrowirusowego w oparciu o pomiar
zmian poziomu HIV-1 RNA w osoczu podczas trwania tego leczenia. Poziomy
HIV-1 RNA, oznaczane za pomoc¹ reakcji ³añcuchowej polimerazy (Polymerase
Chain Reaction, PCR), wykorzystano jako jeden z zastêpczych wskaŸników
w przyspieszonym procesie weryfikacji prowadzonym przez FDA nastêpuj¹cych
leków: inhibitorów proteazy – INVIRASE (metanosulfonian sakwinawiru),
CRIXIVAN® (sulfonian indinawiru), NORVIR® (ritonawir) i FORTOVASE
(sakwinawir); nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy –
VIRAMUNE® (newirapina), SUSTIVA® (efavirenz) i ZIAGEN® (abakawir); oraz
inhibitorów odwrotnej transkryptazy – EPIVIR® (lamiwudyna).
Podsumowanie i objaœnienie testu
Ludzki wirus niedoboru odpornoœci (HIV) jest czynnikiem etiologicznym zespo³u
nabytego niedoboru odpornoœci (Acquired Immunodeficiency Syndrome,
AIDS)1-3. Zaka¿enie HIV mo¿e byæ przenoszone drog¹ kontaktu p³ciowego,
nara¿enia na zaka¿on¹ krew lub produkty krwiopochodne albo z zaka¿onej matki
na p³ód4. W ci¹gu trzech do szeœciu tygodni od nara¿enia na HIV, ogólnie u osób
zaka¿ony wystêpuje krótki, ostry zespó³ charakteryzuj¹cy siê objawami
grypopodobnymi, któremu towarzyszy du¿a wiremia we krwi obwodowej5-8.
PóŸniej u wiêkszoœci zaka¿onych osób wystêpuje swoista dla HIV odpowiedŸ
immunologiczna oraz zmniejszenia wiremii w osoczu; ma to zazwyczaj miejsce
od czterech do szeœciu tygodniu od pocz¹tku objawów9,10. Po serokonwersji
zaka¿one osoby wchodz¹ zazwyczaj w fazê o stabilnym przebiegu klinicznym,
bezobjawow¹, która mo¿e trwaæ wiele lat11-13. Okres bezobjawowy
charakteryzuje siê utrwalon¹ niewielk¹ wiremi¹ w osoczu14 oraz stopniowym
zanikaniem limfocytów T CD4+, co prowadzi do ciê¿kiego niedoboru odpornoœci,
mnogich zaka¿eñ oportunistycznych, nowotworów z³oœliwych i zgonu15.
Pomimo, ¿e poziomy wiremii w fazie bezobjawowej zaka¿enia we krwi
obwodowej s¹ stosunkowo ma³e, to replikacja wirusa i jego usuwanie wydaj¹ siê
byæ procesem dynamicznym, w którym du¿a produkcja wirusa i zaka¿anie
komórek CD4+ jest równowa¿one przez odpowiednio nasilone usuwanie wirusa,
œmieræ zaka¿onych komórek i uzupe³nianie komórek CD4+. Powoduje to, ¿e
poziomy wiremii i komórek CD4+ w osoczu s¹ wzglêdnie sta³e16-18.
Za pomoc¹ pomiarów iloœciowych wiremii HIV we krwi obwodowej wykazano,
¿e wiêksze poziomy wirusa mog¹ wi¹zaæ siê ze zwiêkszonym ryzykiem progresji
klinicznej choroby wywo³ywanej przez HIV. Ponadto wykazano, ¿e zmniejszenie
poziomów wirusa w osoczu mo¿e wi¹zaæ siê ze zmniejszonym ryzykiem progresji
klinicznej19-21. Poziomy wirusa we krwi obwodowej mo¿na oznaczyæ iloœciowo
mierz¹c antygen p24 HIV w surowicy, prowadz¹c iloœciow¹ hodowlê HIV
z osocza lub bezpoœrednio oceniaj¹c zawartoœæ wirusowego RNA w osoczu za
pomoc¹ amplifikacji kwasu nukleinowego lub technologii amplifikacji
sygna³u22-26.
Antygen p24 jest g³ównym bia³kiem rdzeniowym wirusa HIV i znajduje siê
w surowicy w postaci wolnej lub zwi¹zanej z przeciwcia³em przeciwko p24.
Wolny antygen p24 mo¿na mierzyæ za pomoc¹ dostêpnych w handlu badañ
immunoenzymatycznych (EIA). Niemniej jednak przydatnoœæ antygenu p24 jako
markera obci¹¿enia organizmu wirusem jest ograniczona, poniewa¿ mo¿e byæ on
wykryty tylko u 20% bezobjawowych pacjentów i 40-50% pacjentów z objawami.
Postêpowanie zmierzaj¹ce do rozbicia kompleksów antygen-przeciwcia³o
poprawia czu³oœæ badañ mierz¹cych poziom antygen p24, ale bia³ko wirusa nadal
nie jest wykrywane u wiêkszoœci bezobjawowych pacjentów22.
HIV w osoczu mo¿na hodowaæ inokuluj¹c nim pobudzone komórki jednoj¹drowe
krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pochodz¹ce od
zdrowych dawców. Oznaczenie iloœciowe uzyskuje siê inokuluj¹c PBMC za
pomoc¹ seryjnych rozcieñczeñ próbki osocza. Hodowla iloœciowa ma
ograniczon¹ u¿ytecznoœæ w monitorowaniu poziomów wirusa u osób
zaka¿onych, poniewa¿ jedynie niewielka frakcja cz¹stek wirusa jest zakaŸna
w warunkach in vitro. ZakaŸny wirus jest czêsto niewykrywalny u osób bez
objawów22.
HIV RNA w osoczu mo¿na oznaczyæ iloœciowo za pomoc¹ technologii
amplifikacji kwasu nukleinowego, takich jak reakcja ³añcuchowa polimerazy
(PCR)27-29. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje
technologiê PCR w celu osi¹gniêcia maksymalnej czu³oœci oraz dynamicznego
zakresu iloœciowego detekcji HIV-1 RNA w osoczu zawieraj¹cym dodatek
antykoagulantów (EDTA lub ACD)24.
2/52
HIV-1 MONITOR
Zasady procedury
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR , v1.5, opiera siê na piêciu g³ównych
procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja docelowego RNA w celu
utworzenia komplementarnego DNA (cDNA)30; amplifikacja PCR30 docelowego
cDNA z wykorzystaniem primerów swoistych dla HIV-1; hybrydyzacja
zamplifikowanego produktu z sondami oligonukleotydowymi swoistymi dla celu
(celów); oraz wykrycie zwi¹zanych z sondami zamplifikowanych produktów za
pomoc¹ kolorymetrii.
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, umo¿liwia równoczesne
przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji oraz amplifikacji PCR docelowego
HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard RNA. Mieszanina g³ówna (Master Mix)
zawiera parê primerów swoistych zarówno dla HIV-1 RNA jak i dla HIV-1
Quantitation Standard RNA. Opracowano j¹ w celu zapewnienia równowa¿nego
oznaczenia iloœciowego podtypów HIV-1 grupy M. Nie ustalono charakterystyki
dzia³ania testu dla próbek grupy O.
Oznaczenie iloœciowe HIV-1 wirusowego RNA przeprowadza siê za pomoc¹
HIV-1 Quantitation Standard. HIV-1 Quantitation Standard to niezakaŸny
transkrypt RNA zawieraj¹cy identyczne miejsca wi¹zania odcinków primerowych
z posiadanymi przez docelowy HIV-1 RNA, oraz charakterystyczne miejsce
wi¹zania sondy, które umo¿liwia zró¿nicowanie amplikonu Quantitation Standard
od amplikonu HIV-1. HIV-1 Quantitation Standard wchodzi w sk³ad ka¿dej
próbki; znana jest liczba jego kopii; razem z docelowym HIV-1 jest
przeprowadzany przez proces przygotowania próbki, odwrotn¹ transkrypcjê,
amplifikacjê PCR, hybrydyzacjê i detekcjê, a tak¿e jest amplifikowany. Analizator
COBAS AMPLICOR oblicza poziomy HIV-1 RNA w badanych próbkach,
porównuj¹c sygna³ HIV-1 z sygna³em Quantitation Standard dla ka¿dej próbki.
Quantitation Standard rekompensuje wp³yw hamowania oraz kontroluje proces
amplifikacji, aby umo¿liwiæ dok³adne oznaczenie iloœciowe HIV-1 RNA w ka¿dej
próbce.
Przygotowanie próbki
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, mo¿e byæ stosowany z dwiema
procedurami przygotowania próbki, procedur¹ standardow¹ oraz procedur¹
ultraczu³¹. W standardowej procedurze przygotowania próbki HIV-1 RNA izoluje
siê z bezpoœrednio z osocza poprzez lizê cz¹steczek wirusa przy u¿yciu czynnika
chaotropowego, a nastêpnie str¹cenie RNA z alkoholem. W ultraczu³ej procedurze
przygotowania próbki cz¹steczki wirusa HIV-1 w osoczu s¹ w pierwszym etapie
koncentrowane za pomoc¹ wirówki o du¿ej prêdkoœci, a nastêpnie poddawane lizie
przy u¿yciu czynnika chaotropowego, po której ma miejsce str¹cenie HIV-1 RNA
z alkoholem. Znana liczba cz¹steczek Quantitation Standard RNA jest
wprowadzana do ka¿dej próbki z odczynnikiem lizuj¹cym. HIV-1 Quantitation
Standard przeprowadza siê przez etapy przygotowania próbki, odwrotnej
transkrypcji, amplifikacji i detekcji oraz wykorzystuje siê do iloœciowego
oznaczenia HIV-1 RNA w badanej próbce.
3/52
Odwrotna transkrypcja
i amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Wybór docelowej sekwencji RNA dla HIV-1 zale¿y od identyfikacji regionów
w obrêbie genomu HIV-1, które wykazuj¹ najwiêkszy konserwatyzm sekwencji.
Zgodnie z tym, w³aœciwy wybór odcinków primerowych oraz sondy ma kluczowe
znaczenie dla zdolnoœci testu do detekcji genotypu HIV-1. Test COBAS
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje primery SK145 i SKCC1B
w celu okreœlenia sekwencji 155 nukleotydów w obrêbie bardzo
konserwatywnego regionu genu gag HIV-131. Region gag koduje antygeny
charakterystyczne dla grupy oraz bia³ka strukturalne rdzenia wirionu. Ogólnie
geny gag HIV-1 posiadaj¹ oko³o 1500 nukleotydów i znajduj¹ siê w przybli¿eniu
w pozycjach 789-2290 genomu HIV. Sekwencja nukleotydów odcinków
primerowych zosta³a zoptymalizowana w taki sposób, aby zapewniæ równowa¿n¹
amplifikacjê podtypów grupy M HIV-1.
Odwrotna transkrypcja
Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR wykonywane s¹ przy u¿yciu
termostabilnego, rekombinowanego enzymu – Thermus thermophilus polimeraza
DNA (rTth pol). W obecnoœci manganu i w odpowiednich warunkach uk³adu
buforowego, rTth pol wykazuje aktywnoœæ zarówno odwrotnej transkryptazy, jak
i polimerazy DNA30. Pozwala to na zachodzenie reakcji odwrotnej transkrypcji
i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej.
Poddane obróbce próbki dodaje siê do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do
amplifikacji (A-tubes), w których zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak
i amplifikacja PCR. Primer inicjuj¹cy transkrypcjê nici sensownej, okreœlany jako
primer antysensowny (SKCC1B) oraz primer inicjuj¹cy transkrypcjê nici
antysensownej, okreœlany jako primer sensowny (SK145) s¹ biotynylowane na
koñcach 5'. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby umo¿liwiæ primerowi
antysensownemu swoiste wtopienie do docelowego HIV-1 RNA oraz do HIV-1
Quantitation Standard RNA. W obecnoœci Mn2+ oraz nadmiaru trójfosforanów
deoksynukleozydu (deoxynucleoside triphosphates, dNTPs), w tym trójfosforanów
deoksyadenozyny, deoksyguanozyny, deoksycytydyny oraz deoksytymidyny, rTth
pol wyd³u¿a wtopiony primer, buduj¹c niæ DNA (cDNA) komplementarn¹ do
docelowego RNA.
Amplifikacja odcinka docelowego
Po odwrotnej transkrypcji docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation
Standard RNA, mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby dosz³o do denaturacji
hybrydy RNA:cDNA oraz ods³oniêcia docelowych sekwencji dla primera. Po
och³odzeniu mieszaniny i swoistym wtopieniu primera sensownego (SK145)
z nici¹ cDNA, rTth pol wyd³u¿a primer syntetyzuj¹c drug¹ niæ DNA. W ten
sposób koñczy siê pierwszy cykl PCR. W jego wyniku powsta³a dwuniciowa
kopia DNA regionu docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation Standard
RNA. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po raz kolejny, w celu rozdzielenia
powsta³ego dwuniciowego DNA i ods³oniêcia sekwencji docelowych dla
primerów. W miarê stygniêcia mieszaniny, primery SK145 i SKCC1B
przy³¹czaj¹ siê do docelowego DNA. rTth pol w obecnoœci Mn2+ oraz nadmiaru
dNTPs wyd³u¿a przy³¹czone primery wzd³u¿ docelowych wzorców, w celu
wytworzenia cz¹steczki dwuniciowego DNA, zawieraj¹cej 155 par zasad,
nazwanej amplikonem. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie powtarza
powy¿szy proces przez okreœlon¹ liczbê cykli, w ka¿dym z nich skutecznie
podwajaj¹c iloœæ DNA amplikonu. Amplifikacja zachodzi wy³¹cznie w regionie
genomu HIV-1, który znajduje siê pomiêdzy dwoma primerami; ca³y genom
HIV-1 nie jest amplifikowany.
4/52
HIV-1 MONITOR
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej
zachodzi w teœcie COBAS AMPLICOR HIV-1, v1.5, dziêki zastosowaniu
enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny
(dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje zniszczenie nici DNA
zawieraj¹cych dezoksyurydynê32, nie wp³ywaj¹c na DNA zawieraj¹cy
dezoksytymidynê. W DNA wystêpuj¹cym w naturze nie stwierdza siê
dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, z uwagi na
stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spoœród trójfosforanów
dezoksynukleozydu (dNTPs) w odczynniku Master Mix; dlatego te¿
dezoksyurydynê zawiera wy³¹cznie amplikon.
Dezoksyurydyna powoduje wra¿liwoœæ zanieczyszczaj¹cego amplikonu na
rozk³ad przez enzym AmpErase przed amplifikacj¹ docelowego DNA. Enzym
AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozszczepienie DNA
zawieraj¹cego dezoksyurydynê przy resztach dezoksyurydynowych na drodze
otwarcia ³añcucha w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu
termicznym w pH zasadowym odczynnika Master Mix, ³añcuch amplikonu DNA
pêka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczaj¹c dalsz¹ amplifikacjê
DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powy¿ej 55°C, tj.
w czasie trwania ca³ego cyklu termicznego, dlatego te¿ nie niszczy on amplikonu
docelowego.
Po amplifikacji ka¿dy resztkowy enzym jest denaturowany poprzez dodanie
roztworu denaturacyjnego. W ten sposób zapobiega siê degradacji dowolnego
amplikonu docelowego. Wykazano, ¿e enzym AmpErase w teœcie COBAS
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 inaktywuje co najmniej 103 kopii amplikonu
HIV-1 zawieraj¹cego dezoksyurydynê w przeliczeniu na jedn¹ reakcjê PCR.
Reakcja hybrydyzacji
Po amplifikacji PCR analizator COBAS AMPLICOR automatycznie dodaje
roztwór denaturacyjny do probówek amplifikacyjnych (A-tubes) w celu chemicznej
denaturacji amplikonu HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard i uzyskania
jednoniciowego DNA. W celu uzyskania wyników iloœciowych obejmuj¹cych du¿y
zakres dynamiczny, analizator COBAS AMPLICOR seryjnie rozcieñcza
zdenaturowany amplikon w naczyñkach u¿ywanych do detekcji (D-cups). Do
ka¿dego z czterech rozcieñczeñ amplikonu HIV-1 lub do ka¿dego z dwóch
rozcieñczeñ amplikonu HIV-1 Quantitation Standard dodaje siê zawiesinê
cz¹steczek magnetycznych op³aszczonych sond¹ oligonukleotydow¹ swoist¹ dla,
odpowiednio, amplikonu HIV-1 (SK102) lub amplikonu HIV-1 Quantitation
Standard (CP35). Amplikony znakowane biotyn¹ ulegaj¹ hybrydyzacji ze
swoistymi dla materia³u docelowego sondami oligonukleotydowymi zwi¹zanymi
z cz¹steczkami magnetycznymi. Ka¿de oznaczenie iloœciowe wymaga czterech
niezale¿nych pomiarów absorbancji odczynników, wykorzystuj¹cych zawiesinê
sondy HIV-1, oraz dwóch pomiarów absorbancji wykorzystuj¹cych zawiesinê
sondy HIV-1 Quantitation Standard.
Reakcja detekcji
Po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS AMPLICOR przemywa cz¹steczki
magnetyczne w pojemnikach D-cup w celu usuniêcia niezwi¹zanego materia³u,
a nastêpnie dodaje kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa. Kompleks awidynaperoksydaza chrzanowa wi¹¿e siê ze znakowanymi biotyn¹ amplikonami, które
uleg³y hybrydyzacji ze swoistymi dla materia³u docelowego sondami
oligonukleotydowymi zwi¹zanymi z cz¹steczkami magnetycznymi. Analizator
COBAS AMPLICOR usuwa niezwi¹zany koniugat przez wyp³ukanie cz¹steczek
magnetycznych, a nastêpnie dodaje do ka¿dego pojemnika D-cup roztwór substratu,
zawieraj¹cy nadtlenek wodoru i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynê (TMB). W
obecnoœci nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa zwi¹zana z cz¹steczkami
katalizuje utlenianie TMB tworz¹c barwny kompleks. Analizator COBAS
AMPLICOR mierzy wartoœæ absorbancji tego kompleksu przy d³ugoœci fali 660 nm.
5/52
Oznaczenie iloœciowe HIV-1 RNA
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, iloœciowo oznacza wirusowy
RNA HIV-1, wykorzystuj¹c drug¹ sekwencjê docelow¹ (HIV-1 Quantitation
Standard), któr¹ w znanym stê¿eniu dodaje siê do badanej próbki. HIV-1
Quantitation Standard to niezakaŸna cz¹steczka RNA sk³adaj¹ca siê z 233
transkrybowanych in vitro nukleotydów, której miejsca wi¹zania primera s¹
identyczne ze znajduj¹cymi siê w docelowej sekwencji HIV-1. HIV-1
Quantitation Standard zawiera miejsca wi¹zania primerów SK145 i SKCC1B
oraz wytwarza produkt amplifikacji o tej samej d³ugoœci (155 zasad) i sk³adzie
zasad, jak docelowy HIV-1 RNA. Miejsce wi¹zania sondy amplikonu HIV-1
Quantitation Standard zosta³o zmodyfikowane w celu ró¿nicowania amplikonu
HIV-1 Quantitation Standard i amplikonu docelowego HIV-1.
W liniowym zakresie testu, poch³anianie dla d³ugoœci fali wynosz¹cej 660 nm
(A660) dla ka¿dego pojemnika D-cup jest proporcjonalne do iloœci amplikonów
HIV-1 lub HIV-1 Quantitation Standard w pojemniku D-cup. Analizator COBAS
AMPLICOR oblicza ca³kowita absorbancja HIV-1 i HIV-1 Quantitation Standard
mno¿¹c poch³anianie pojemnika D-cup przez wspó³czynnik rozcieñczenia
amplikonu dla tego pojemnika, a nastêpnie wybiera pojemnik o maksymalnym
ca³kowitym poch³anianiu. Obliczona ca³kowita absorbancja jest proporcjonalna do
iloœci HIV-1 RNA lub HIV-1 Quantitation Standard RNA obecnej w ka¿dej reakcji
odwrotnej transkrypcji/amplifikacji PCR. Iloœæ HIV-1 RNA w ka¿dej próbce
oblicza siê ze wspó³czynnika ca³kowitego absorbancji HIV-1 i ca³kowitego
absorbancji HIV-1 Quantitation Standard, oraz wprowadzonej liczby cz¹steczek
HIV-1 Quantitation Standard RNA, za pomoc¹ nastêpuj¹cego równania:
HIV-1 A
[Total
Total QS A ]
AF
gdzie:
6/52
x Input HIV-1 QS kopie/PCR x Sample Volume Factor = HIV-1 RNA kopie/ml
Total HIV-1 A = obliczona ca³kowita absorbancja dla amplikonu HIV-1
Total QS A = obliczona ca³kowita absorbancja dla amplikonu
Quantitation Standard
Input HIV-1 QS copies/PCR = liczba kopii Quantitation Standard w ka¿dej reakcji;
liczba ta jest swoista dla serii
Sample Volume Factor = wspó³czynnik konwersji jednostek: kopie/PCR do
kopii/ml
AF = wspó³czynnik dostosowania do standaryzacji wyników
testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 do
wyników testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5
(wspó³czynnik dostosowania = 1,11)
Sample Volume Factor = 40 (dla standardowej procedury przygotowania próbki)
Sample Volume Factor = 4 (dla ultraczu³ej procedury przygotowania próbki)
HIV-1 MONITOR
Odczynniki
HIM
COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Odczynniki do przygotowania
próbki
48 testów P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
HIV-1 LYS
(HIV-1 MONITOR odczynnik lizuj¹cy)
Bufor Tris-HCl
68% tiocyjanian guanidyny
3% ditiotreitol
< 1% glikogen
68% (udzia³ wagowy) tiocyjanian guanidyny
+
Xn
4 x 9,0 ml
Produkt szkodliwy
HIV-1 QS, v1.5
4 x 0,1 ml
(HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5)
< 0,001% niezakaŸny, transkrybowany in vitro RNA
(pochodzenia bakteryjnego) zawieraj¹cy sekwencje wi¹¿¹ce
primery HIV-1 oraz unikalny obszar wi¹¿¹cy sondê
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
0,05% azydek sodu
HIV-1 DIL
(HIV-1 MONITOR rozcieñczalnik próbki)
Bufor Tris-HCl
EDTA
0,05% azydek sodu
Odczynniki kontroli
4 x 4,8 ml
HIM CTL
NHP
4 x 1,6 ml
[Osocze ujemne (ludzkie)]
Ludzkie osocze , niereaktywne w testach (licencjonowanych
w USA przez FDA) dla przeciwcia³a przeciwko HCV, przeciwcia³a
przeciwko HIV-1/2, antygenu p24 HIV oraz HBsAg; brak
wykrycia HIV-1 RNA, HCV RNA lub HBV DNA za pomoc¹
PCR w zmieszanych jednostkach od wielu dawców; brak
wykrycia przeciwcia³a przeciwko rdzeniowi HBV
w zmieszanych jednostkach od wielu dawców za
pomoc¹ testów licencjonowanych przez FDA.
0,1% ProClin® 300
HIV-1 (–) C
[HIV-1 (–) Kontrola]
EDTA
0,05% azydek sodu
4 x 0,05 ml
7/52
HIV-1 L(+)C
4 x 0,05 ml
[HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola]
(pochodzenia bakteryjnego) zawieraj¹cy sekwencje HIV-1
EDTA
0,05% azydek sodu
HIV-1 H(+)C
4 x 0,05 ml
[HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola]
(pochodzenia bakteryjnego) zawieraj¹cy sekwencje HIV-1
EDTA
0,05% azydek sodu
Odczynniki do amplifikacji
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
4 x 0,7 ml
(HIV-1 MONITOR Master Mix, wersja 1.5)
Bufor bicynowy
Glicerol
< 0,01% rTth polimeraza DNA (rTth pol, bakteryjna)
Octan potasu
< 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,001% primery SKCC1B i SK145, biotynylowane
< 0,01% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjna)
0,05% azydek sodu
HIV-1 Mn2+, v1.5
(HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5)
< 2% mangan
Kwas octowy
Barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
Odczynniki do swoistej
reakcji detekcji
4 x 0,1 ml
HIM DK
AD3
(Odczynnik do rozcieñczenia amplikonu)
EDTA
0,8% wodorotlenek sodu
0,8% (udzia³ wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
2 x 75 testów
Produkt dra¿ni¹cy
IM PS1, v1.5
2 x 100 testów
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1, wersja 1.5)
Bufor MES
< 0,01% zawiesina Dynabeads® (cz¹steczkek paramagnetycznych)
op³aszczonych oligonukleotydow¹ sond¹ swoist¹ dla
HIV-1 (SK102)
0,09% azydek sodu
8/52
HIV-1 MONITOR
IM4, v1.5
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2, wersja 1.5)
Bufor fosforanowy
< 0,2% detergent
24,9% tiocyjanian sodu
2 x 100 testów
IQ PS1, v1.5
1 x 100 testów
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1
standardu oznaczania, wersja 1.5)
Bufor MES
< 0,01% zawiesina Dynabeads (cz¹steczkek paramagnetycznych)
op³aszczonych oligonukleotydow¹ sond¹
swoist¹ dla HIV-1 Quantitation Standard (CP35)
0,09% azydek sodu
IQ4, v1.5
(HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2
standardu oznaczania, wersja 1.5)
Bufor fosforanowy
< 0,2% detergent
24,9% tiocyjanian sodu
Odczynniki do nieswoistej
reakcji detekcji
DK
DN4
(Roztwór denaturacyjny)
1,6% wodorotlenek sodu
EDTA
B³êkit tymolowy
1 x 100 testów
1,6% (udzia³ wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
1 x 100 testów
Produkt dra¿ni¹cy
CN4
3 x 100 testów
(Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa)
Bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej
Albumina wo³owa (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% ProClin 150
SB3
(Substrat A)
Roztwór soli kwasu cytrynowego
0,01% nadtlenek wodoru
0,1% ProClin 150
5 x 75 testów
9/52
SB
(Substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)
40% dimetyloformamid (DMF)
T
5 x 5 ml
40% (udzia³ wagowy) dimetyloformamid (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Mo¿e dzia³aæ szkodliwie na dziecko w ³onie
matki. Dzia³a szkodliwie przez drogi
oddechowe i w kontakcie ze skór¹. Dzia³a
dra¿ni¹co na oczy.
S: 53-45
Unikaæ nara¿enia - przed u¿yciem zapoznaæ
siê z instrukcj¹. W przypadku awarii lub je¿eli
Ÿle siê poczujesz, niezw³ocznie zasiêgnij
porady lekarza - je¿eli to mo¿liwe, poka¿
etykietê.
COBAS AMPLICOR
WB
Wash Buffer
COBAS AMPLICOR bufor p³ucz¹cy
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat p³ucz¹cy)
< 2% bufor fosforanowy
< 9% chlorek sodu
EDTA
< 2% detergent
0,5% ProClin 300
2 x 250 testów
Ostrze¿enia i œrodki ostro¿noœci
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Test ten jest przeznaczony wy³¹cznie do stosowania z ludzkim osoczem pobranym do
EDTA lub ACD (antykoagulanty). Wykazano, ¿e heparyna hamuje PCR i nie wolno
jej stosowaæ w tej procedurze.
Nie pipetowaæ ustami.
Nie jeœæ, nie piæ oraz nie paliæ w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy
obchodzeniu siê z próbkami i odczynnikami z zestawów stosowaæ jednorazowe
rêkawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiedni¹ ochronê oczu. Dok³adnie umyæ
rêce po obchodzeniu siê z próbkami i odczynnikami testowymi.
Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikaæ ska¿enia
bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleaz¹. Zaleca siê
u¿ywanie ja³owych jednorazowych pipet oraz koñcówek pipet wolnych od RNazy.
Nie mieszaæ odczynników pochodz¹cych z ró¿nych serii lub ró¿nych butelek tej samej
serii.
Wyrzuciæ wszystkie nieu¿yte odczynniki, postêpuj¹c zgodnie z przepisami krajowymi,
federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie u¿ywaæ zestawu po up³ywie daty przydatnoœci.
10/52
HIV-1 MONITOR
Regionalne biuro Roche na ¿yczenie mo¿e dostarczyæ informacje o bezpieczeñstwie
materia³ów (Material Safety Data Sheets, MSDS).
Praca w laboratorium musi zachodziæ w sposób jednokierunkowy, z pocz¹tkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronê obszaru
„poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynnoœci wykonywane przed
amplifikacj¹ musz¹ rozpoczynaæ siê od przygotowania odczynników, nastêpnie zaœ
nale¿y przygotowywaæ próbki. Materia³y i urz¹dzenia musz¹ byæ przypisane do ka¿dej
z czynnoœci przedamplifikacyjnych i nie wolno ich u¿ywaæ do ¿adnych innych
czynnoœci lub przenosiæ pomiêdzy obszarami. W ka¿dym z obszarów nale¿y u¿ywaæ
rêkawic; rêkawice musz¹ byæ zmieniane przed opuszczeniem ka¿dego z obszarów.
Wyposa¿enie i materia³y zastosowane do przygotowania odczynnika nie mog¹ byæ
u¿ywane podczas czynnoœci zwi¹zanych z przygotowywaniem próbki lub
pipetowaniem albo obróbk¹ zamplifikowanego DNA lub innych Ÿróde³ docelowego
DNA. Materia³y i urz¹dzenia u¿ywane w czynnoœciach po amplifikacji musz¹
pozostawaæ zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
Z próbkami nale¿y obchodziæ siê tak, jak z materia³em zakaŸnym, stosuj¹c
laboratoryjne procedury bezpieczeñstwa, takie jak okreœlone w dokumencie Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories33 oraz w CLSI Document
M29-A34. Dok³adnie oczyœciæ i odkaziæ wszystkie powierzchnie robocze œwie¿o
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub
destylowanej.
Uwaga
Dostêpny w handlu p³ynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn
sodu w stê¿eniu 5,25%. Rozcieñczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10
przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
UWAGA: Niniejszy zestaw zawiera sk³adnik (NHP) otrzymany z ludzkiej krwi.
Materia³ Ÿród³owy badano przy u¿yciu testów zatwierdzonych przez US FDA
i stwierdzono, ¿e jest on niereaktywny pod wzglêdem obecnoœci przeciwcia³
przeciwko HCV, przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu
powierzchniowemu wirusa zapalenia w¹troby typu B (HBsAg). Ponadto badano
zmieszane jednostki od wielu dawców; nie wykryto HIV-1 RNA, HCV RNA i HBV
DNA za pomoc¹ PCR oraz nie wykryto przeciwcia³a przeciwko rdzeniowi HBV za
pomoc¹ licencjowanego przez FDA testu. ¯adna ze znanych metod badania nie
mo¿e zaoferowaæ ca³kowitej pewnoœci, ¿e produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie
bêd¹ przenosiæ czynników zakaŸnych. Dlatego te¿ wszelkie materia³y pochodzenia
ludzkiego nale¿y traktowaæ jako potencjalnie zakaŸne. Z NHP nale¿y obchodziæ siê
jak z materia³em zakaŸnym, stosuj¹c bezpieczne procedury laboratoryjne takie jak
procedury wymienione w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories33 oraz w dokumencie CLSI M29-A34. Nale¿y dok³adnie czyœciæ
i dezynfekowaæ wszystkie powierzchnie robocze przy u¿yciu 0,5% roztworu
podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn2+, v1.5; HIV-1 (–) C;
HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 i IQ PS1, v1.5 zawieraj¹ azydek sodu.
Azydek sodu mo¿e wchodziæ w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
wykonanymi z o³owiu lub miedzi, tworz¹c silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwaj¹c roztwory zawieraj¹ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale¿y
sp³ukaæ rury du¿¹ objêtoœci¹ wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
Nale¿y nosiæ okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne oraz jednorazowe
rêkawiczki podczas obchodzenia siê z HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4;
AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB i substratem roboczym
(zmieszanymi odczynnikami SB3 i SB). Unikaæ kontaktu wymienionych
materia³ów ze skór¹, oczami i b³onami œluzowymi. Je¿eli dojdzie do kontaktu,
natychmiast sp³ukaæ du¿¹ objêtoœci¹ wody. Je¿eli nie zostan¹ podjête
odpowiednie œrodki, mo¿e dojœæ do oparzeñ. W razie rozlania powy¿szych
odczynników przed wytarciem plam nale¿y rozcieñczyæ je wod¹.
11/52
Unikaæ kontaktu skóry i b³on œluzowych z SB lub substratem roboczym. Je¿eli
dojdzie do kontaktu ze skór¹, natychmiast sp³ukaæ du¿¹ objêtoœci¹ wody.
Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym mo¿e dzia³aæ szkodliwe
na p³ód w ³onie matki; opisywano ponadto dzia³ania toksyczne po doustnym
przyjêciu du¿ych dawek. Nale¿y unikaæ kontaktu ze skór¹, wdychania oparów
oraz spo¿ycia. Je¿eli dojdzie do kontaktu ze skór¹, dok³adnie sp³ukaæ za pomoc¹
myd³a i wody oraz natychmiast zwróciæ siê o pomoc medyczn¹.
Nie wolno dopuœciæ, aby HIV-1 LYS, który zawiera tiocyjanian guanidyny, lub
IM4, v1.5 i IQ4, v1.5, które zawieraj¹ tiocyjanian sodu, nawi¹za³y kontakt
z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Mieszaniny takie mog¹
spowodowaæ powstanie silnie toksycznego gazu.
Do przygotowywania próbek oraz kontroli nale¿y u¿ywaæ probówek z zakrêcanym
korkiem, aby zapobiegaæ rozlaniu i mo¿liwoœci ska¿enia krzy¿owego próbek.
Nie nale¿y u¿ywaæ probówek z korkami zatrzaskowymi.
Wymagania dotycz¹ce przechowywania i u¿ytkowania
Nie zamra¿aæ odczynników.
Przechowywaæ HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 oraz HIV-1 DIL w temperaturze
2-8°C. Nieotwarte odczynniki zachowuj¹ stabilnoœæ do podanej daty wa¿noœci.
Po otwarciu nieu¿yt¹ czêœæ nale¿y wyrzuciæ.
Podczas przechowywania HIV-1 LYS w temperaturze 2-8°C powstaje osad.
Przed u¿yciem nale¿y rozpuœciæ osad, ogrzewaj¹c HIV-1 LYS do 25-37°C.
Ogrzewanie HIV-1 LYS kontynuowaæ przez maksymalnie 30 minut, a nastêpnie
dok³adnie wymieszaæ, a¿ kryszta³y ulegn¹ rozpuszczeniu. Przed u¿yciem nale¿y
zbadaæ ka¿d¹ butelkê HIV-1 LYS, obserwuj¹c j¹ na bia³ym tle, poszukuj¹c
œladu ¿ó³tego koloru lub cech wyciekania. Je¿eli stwierdzono jakikolwiek œlad
¿ó³tego koloru lub obecnoœæ wycieku, nie u¿ywaæ danej butelki do badania.
Nale¿y skontaktowaæ siê z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu
wymiany. Po otwarciu opakowania, pozosta³e po badaniu odczynniki nale¿y
wyrzuciæ. Roboczy odczynnik lizuj¹cy (przygotowany poprzez dodanie HIV-1
QS, v1.5 do HIV-1 LYS) musi byæ przechowywany w temperaturze pokojowej
i zu¿yty w ci¹gu 4 godzin od przygotowania.
HIV-1 MMX, v1.5 i HIV-1 Mn2+, v1.5 przechowywaæ w temperaturze 2-8°C.
Odczynniki te zachowuj¹ stabilnoœæ do podanej daty przydatnoœci. Po otwarciu
opakowania pozosta³e po badaniu odczynniki nale¿y wyrzuciæ. Roboczy
odczynnik Master Mix (przygotowany przez dodanie HIV-1 Mn2+, v1.5 do HIV-1
MMX, v1.5) musi byæ przechowywany w temperaturze 2-8°C i jest stabilny przez 4
godziny w temperaturze 2-8°C.
NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C przechowywaæ w temperaturze
2-8°C. Odczynniki te zachowuj¹ stabilnoœæ do podanej daty przydatnoœci. Po
otwarciu opakowania pozosta³e po badaniu odczynniki nale¿y wyrzuciæ.
AD3 przechowywaæ w temperaturze 2-25°C. Po za³adowaniu do analizatora
COBAS AMPLICOR, AD3 jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8°C lub
do up³ywu daty wa¿noœci. AD3 stosowaæ mo¿na maksymalnie w ci¹gu 4 cykli
pracy urz¹dzenia (24 godziny/cykl), a pomiêdzy poszczególnymi cyklami nale¿y
przechowywaæ go w temperaturze 2-8°C.
IM PS1, v1.5 i IM4, v1.5 przechowywaæ w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te s¹
stabilne do oznaczonej daty przydatnoœci. Po wymieszaniu IM PS1, v1.5 i IM4,
v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 14 dni w temperaturze 2-8°C.
Odczynnik roboczy mo¿e byæ stosowany przez maksymalnie 2 cykle pracy
urz¹dzenia (24 godziny/cykl), a pomiêdzy cyklami musi byæ przechowywany
w temperaturze 2-8°C.
12/52
HIV-1 MONITOR
IQ PS1, v1.5 i IQ4, v1.5 przechowywaæ w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te s¹
stabilne do oznaczonej daty przydatnoœci. Po wymieszaniu IQ PS1, v1.5 i IQ4,
v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8°C.
Odczynnik roboczy mo¿e byæ stosowany przez maksymalnie 4 cykle pracy
urz¹dzenia (24 godziny/cykl), a pomiêdzy cyklami musi byæ przechowywany
w temperaturze 2-8°C.
DN4 przechowywaæ w temperaturze 2-25°C. DN4 zachowuje stabilnoœæ do
oznaczonej daty przydatnoœci. Po otwarciu opakowania, DN4 jest stabilny przez 30
dni w temperaturze 2-8°C lub do up³ywu daty wa¿noœci. DN4 stosowaæ mo¿na
maksymalnie w ci¹gu 4 cykli pracy urz¹dzenia (24 godziny/cykl), a pomiêdzy
poszczególnymi cyklami nale¿y przechowywaæ go w temperaturze 2-8°C.
CN4 przechowywaæ w temperaturze 2-8°C. CN4 zachowuje stabilnoœæ do
oznaczonej daty przydatnoœci. Po otwarciu opakowania, odczynnik CN4 jest
trwa³y przez 30 dni w temperaturze 2-8°C lub do up³ywu daty wa¿noœci. CN4
stosowaæ mo¿na maksymalnie w ci¹gu 4 cykli pracy urz¹dzenia (24 godziny/cykl),
a pomiêdzy poszczególnymi cyklami nale¿y przechowywaæ go w temperaturze
2-8°C.
SB3 i SB przechowywaæ w temperaturze 2-8°C. Nieotwarte, odczynniki te s¹
stabilne do oznaczonej daty wa¿noœci. Substrat roboczy musi byæ przygotowywany
codziennie, poprzez wymieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS AMPLICOR
substrat roboczy jest stabilny przez 16 godzin. Ani SB3, SB ani substratu
roboczego nie nale¿y poddawaæ dzia³aniu metali, œrodków utleniaj¹cych lub
bezpoœredniego œwiat³a.
WB przechowywaæ w temperaturze 2-30°C. WB zachowuje stabilnoœæ do podanej
daty wa¿noœci. Zbadaæ WB przed rozcieñczeniem, i jeœli potrzeba, ogrzaæ do
temperatury 30-37°C, aby rozpuœciæ ewentualny osad. Roboczy roztwór p³ucz¹cy
(1X), przygotowany poprzez rozcieñczenie WB 1:10 w wodzie destylowanej lub
dejonizowanej, musi byæ przechowywany w temperaturze 2-25°C w zbiorniku
buforu p³ucz¹cego COBAS AMPLICOR i zachowuje stabilnoœæ przez 2 tygodnie
od daty przygotowania.
Pomiêdzy uruchomieniami urz¹dzenia czêœciowo zu¿yte odczynniki detekcji
nale¿y przechowywaæ w temperaturze 2-8°C. Przed wprowadzeniem do
analizatora COBAS AMPLICOR odczynników z otwartych opakowañ lub
odczynników roboczych, nale¿y sprawdziæ ich datê wa¿noœci.
Dostarczane materia³y
COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR Test,
version 1.5
Odczynniki do przygotowania
próbki
HIM
P/N: 21118390 123
ART: 11 1839 0
US: 83369
HIM PREP
HIV-1 LYS
(HIV-1 MONITOR odczynnik lizuj¹cy)
HIV-1 QS, v1.5
(HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5)
HIV-1 DIL
(HIV-1 MONITOR rozcieñczalnik próbki)
13/52
Odczynniki kontroli
HIM CTL
NHP
[Osocze ujemne (ludzkie)]
HIV-1 (–) C
[HIV-1 (–) Kontrola]
HIV-1 L(+)C
[HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola]
HIV-1 H(+)C
[HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola]
Odczynniki do amplifikacji
HIM AMP
HIV-1 MMX, v1.5
(HIV-1 MONITOR odczynnik Master Mix, wersja 1.5)
HIV-1 Mn2+, v1.5
(HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5)
Odczynniki do swoistej
reakcji detekcji
HIM DK
AD3
(Odczynnik do rozcieñczenia amplikonu)
IM PS1, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 1, wersja 1.5)
IM4, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 2, wersja 1.5)
IQ PS1, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 1 standardu oznaczania, wersja 1.5)
IQ4, v1.5
(HIV-1 zawiesina sondy 2 standardu oznaczania, wersja 1.5)
Odczynniki do nieswoistej
reakcji detekcji
DK
DN4
(Roztwór denaturacyjny)
CN4
(Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa)
SB3
(Substrat A)
SB
(Substrat B)
COBAS AMPLICOR
Wash Buffer
COBAS AMPLICOR bufor p³ucz¹cy
WB
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat p³ucz¹cy)
14/52
HIV-1 MONITOR
Materia³y wymagane, lecz niedostarczane
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowywania odczynników
– Pierœcieñ A-ring wyposa¿ony w 12 probówek A-tubes COBAS AMPLICOR
(ART: 10 4563 6; P/N: 21045636001)
– Uchwyt pierœcienia A-ring do aparatu COBAS AMPLICOR
– Pipeta Eppendorf Multipette® z pojemnikiem 1,25 ml Combitip® (ja³owa,
pojedynczo pakowana)
– Pipetory (o pojemnoœci 50 µl i 100 µl)* z koñcówkami pozbawionymi RNazy
z barier¹ dla aerozoli lub wyrzutnikiem
– Jednorazowe rêkawiczki, bezpudrowe
Przed amplifikacj¹ – obszar przygotowania próbki i kontroli
– Probówki z zakrêtk¹ o pojemnoœci 2,0 ml, ja³owe (Sarstedt 72.694.006 lub
odpowiednik)**
– Probówki z zakrêtk¹ o pojemnoœci 1,5 ml, ja³owe (Sarstedt 72.692.105 lub
odpowiednik)**
– Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik)
– 95% etanol, do stosowania w biologii molekularnej lub histologii (œwie¿o
rozcieñczony do 70% za pomoc¹ wody destylowanej lub dejonizowanej)
– Alkohol izopropylowy, o stopniu czystoœci odczynnika chemicznego
– Ja³owe pipety transferowe o cienkich koñcówkach, wolne od RNazy
– Ja³owe, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml)
– Pipetory (pojemnoœæ 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl,
600 µl, 800 µl i 1000 µl)* z koñcówkami pozbawionymi RNazy z barier¹ dla
aerozoli lub wyrzutnikiem
– Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g);
Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik
– Ch³odzona ultrawirówka i nieruchomy wirnik k¹towy (45 stopni, mieszcz¹cy
co najmniej 24 probówki o pojemnoœci 1,5 ml) z RCF 23 600 x g (Heraeus
17RS z wirnikiem HFA 22.1, Biofuge 28RS lub odpowiednik)
– Mieszad³o wibracyjne
– Bezpudrowe rêkawiczki jednorazowe
Po amplifikacji – obszar amplifikacji/detekcji
– Analizator i drukarka COBAS AMPLICOR
– Instrukcja obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR
– Podrêcznik metodyki testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5
– Stojaki dla pojemników D-cups (ART: 10 4564 4; P/N: 21045644001)
– Woda destylowana lub dejonizowana
– Pipety serologiczne o pojemnoœci 5 ml
– Mieszad³o wibracyjne
– Niepudrowane rêkawiczki jednorazowe
*
Pipetory powinny byæ dok³adne z zakresie 3% objêtoœci znamionowej. We
wskazanych przypadkach u¿ywaæ nale¿y pozbawionych RNazy koñcówek
do pipet z barier¹ dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobie¿enia
ska¿eniu krzy¿owemu miêdzy próbk¹ i amplikonem.
** Do przygotowania próbek i kontroli nale¿y bezwzglêdnie u¿ywaæ probówek
zakrêcanych, aby unikn¹æ rozpryœniêcia i mo¿liwoœci krzy¿owego ska¿enia
próbek i kontroli. Nie stosowaæ korków zatrzaskowych.
15/52
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga
Ze wszystkimi próbkami nale¿y obchodziæ siê jak z materia³em zdolnym do
przenoszenia czynników zakaŸnych.
Pobieranie próbek
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 przeznaczono do u¿ycia tylko
z próbkami osocza. Krew pobieraæ do ja³owych probówek stosuj¹c jako
antykoagulant EDTA (nakrêtka lawendowa) lub ACD (nakrêtka ¿ó³ta). Próbki
pobrane na heparynê nie nadaj¹ siê do badania przy u¿yciu tego testu. Pe³n¹
krew przechowywaæ w 2-25°C nie d³u¿ej ni¿ 6 godzin. Zastosowanie próbek
zabezpieczonych przed krzepniêciem za pomoc¹ ACD przyniesie wyniki, które s¹
o oko³o 15% mniejsze ni¿ wyniki uzyskane z próbek zabezpieczonych za pomoc¹
EDTA. Wynika to z rozcieñczenia za pomoc¹ 1,5 ml ACD znajduj¹cego siê
w probówce. Na rysunku 1 przedstawiono wp³yw antykoagulantów ACD i EDTA
na wyniki oznaczania HIV-1 RNA w próbkach osocza.
Próbki z ACD
Przeciętny wynik testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR
(HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2)
Rysunek 1
Porównanie antykoagulantów ACD i EDTA *
AMPLICOR HIV-1 MONITOR
Wyniki dla próbek z EDTA i ACD
Próbki z EDTA
Przeciętny wynik testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR
(HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2)
* Dane przedstawione na rysunku 1 otrzymano za pomoc¹ testu AMPLICOR HIV-1
MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki.
Oddzieliæ osocze od pe³nej krwi w ci¹gu 6 godzin od pobrania, odwirowuj¹c
(800-1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Osocze nale¿y
przenieœæ do ja³owych probówek polipropylenowych.
Transport próbek
Transport pe³nej krwi lub osocza musi przebiegaæ zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi lub lokalnymi, dotycz¹cymi transportowania
czynników etiologicznych35. Krew pe³n¹ nale¿y transportowaæ w temperaturze
2-25°C i obrabiaæ w przeci¹gu 6 godzin od pobrania. Osocze mo¿e byæ
transportowane w 2-8°C lub zamro¿one w temperaturze –20°C do –80°C.
Przechowywanie próbek
Próbki osocza mog¹ byæ przechowywane w temperaturze pokojowej przez 1 dzieñ
lub w temperaturze 2-8°C przez 5 dni, albo zamro¿one w temperaturze –20°C do
–80°C. Zaleca siê, aby próbki przechowywaæ w równych objêtoœciach (600700 µl) w ja³owych polipropylenowych probówkach 2,0 ml z zakrêcanymi
korkami (takimi jak Sarstedt 72.694.006). Próbki osocza mo¿na zamra¿aæ
i rozmra¿aæ najwy¿ej trzykrotnie. Rysunek 2 przedstawia dane z badañ
dotycz¹cych zamra¿ania i rozmra¿ania.
16/52
HIV-1 MONITOR
HIV-1 RNA kopie/ml
Znormalizowany do pierwszego rozmrożenia
Rysunek 2
Przeciêtne wyniki HIV-1 z trzech mieszanin osocza HIV-1
dodatniego po 2, 3 i 4 cyklach zamro¿enia-rozmro¿enia*
Liczba rozmrożeń
* Dane przedstawione na rysunku 2 otrzymano za pomoc¹ testu AMPLICOR HIV-1
MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki.
Instrukcja u¿ytkowania
Uwaga
Dok³adna instrukcja obs³ugi znajduje siê w Instrukcji obs³ugi analizatora
COBAS AMPLICOR.
Uwaga
Przed u¿yciem wszystkie odczynniki musz¹ osi¹gn¹æ temperaturê otoczenia.
Potwierdziæ wzrokowo obecnoœæ wystarczaj¹cej objêtoœci ka¿dego
z odczynników przed przyst¹pieniem do procedury testowej.
Uwaga
Próbki osocza przed u¿yciem musz¹ mieæ temperaturê otoczenia. Tam, gdzie jest
to wskazane, u¿ywaæ pipetorów z koñcówkami z barier¹ aerozolow¹ lub
wyrzutnikiem. Do³o¿yæ wszelkich starañ, aby zapewniæ wybiórcz¹ amplifikacjê.
Uwaga
Do przygotowywania próbek badanych oraz kontrolnych nale¿y stosowaæ
probówki z zakrêcanym korkiem, aby zapobiegaæ rozlaniu i potencjalnemu
ska¿eniu krzy¿owemu próbek. Nie stosowaæ korków zatrzaskowych.
Uwaga
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 mo¿na wykonywaæ tylko
w trybie podstawowym (Basic).
Wielkoœæ przebiegu
Ka¿dy zestaw zawiera odczynniki wystarczaj¹ce dla czterech przebiegów po 12
oznaczeñ ka¿dy, które wykonywaæ mo¿na oddzielnie lub w dwóch przebiegach po 24
oznaczeñ. Maksymalna liczba próbek na przebieg wynosi 24 (21 próbek + 3
kontrole). Co najmniej jedno powtórzenie ka¿dej AMPLICOR HIV-1 (–) Kontroli,
AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) Kontroli oraz AMPLICOR HIV-1
MONITOR High (+) Kontroli musi byæ w³¹czone do ka¿dego uruchomienia testu
(zobacz rozdzia³ Kontrola jakoœci).
Odczynniki przygotowania próbki oraz amplifikacji próbki pakowane s¹ do
butelek jednokrotnego u¿ytku, wystarczaj¹cych do wykonania 12 testów. Aby
zapewniæ efektywne u¿ycie odczynników, próbki i kontrole nale¿y badaæ
w seriach o liczebnoœci bêd¹cej wielokrotnoœci¹ liczby 12.
Uwaga
Przebieg pracy
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 mo¿na zakoñczyæ w ci¹gu
jednego lub dwóch dni. Aby przeprowadziæ oznaczenie w ci¹gu jednego dnia
roboczego nale¿y kolejno wykonywaæ instrukcje w punktach Przygotowanie
odczynników, przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, oraz Odwrotna
transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Badanie mo¿na wykonywaæ przez 2 dni,
17/52
przeprowadzaj¹c Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu,
a nastêpnie Przygotowanie odczynników i Odwrotn¹ transkrypcjê, amplifikacjê
i detekcjê w 2 dniu.
W celu przeprowadzenia przygotowania próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu,
a odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji w 2 dniu, nale¿y wykonaæ albo
Standardowe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy A.1 do A.14)
albo Ultraczu³e przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy B.1 do
B.19). Poddane obróbce próbki nale¿y przechowywaæ w warunkach wskazanych
w etapie A.14 lub B.19. W 2 dniu nale¿y rozpocz¹æ od Przygotowania
odczynników, a nastêpnie w temperaturze pokojowej rozmroziæ poddane obróbce
próbki badane i kontrolne, po czym przyst¹piæ do Standardowego przygotowania
próbek badanych i kontrolnych, etap A.15, lub Ultraczu³ego przygotowania
próbek badanych i kontrolnych, etap B.20, oraz do Odwrotnej transkrypcji,
amplifikacji i detekcji.
Przygotowanie odczynników Wykonywane w: Obszarze
przygotowania odczynników
przedamplifikacyjnym
–
obszarze
1.
Okreœl, jaka liczba pierœcieni A-ring jest potrzebna do badania próbek od
pacjentów i kontroli. Umieœciæ pierœcieñ (pierœcienie) A-ring w statywie
(statywach).
2.
Przygotowaæ roboczy odczynnik Master Mix dodaj¹c 100 µl HIV-1 Mn2+,
v1.5 do jednej fiolki HIV-1 MMX, v1.5. Odmierzanie objêtoœci Master Mix
nie jest konieczne. Dodaæ 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 do ca³ej fiolki HIV-1
MMX, v1.5. Zamkn¹æ ponownie probówkê i wymieszaæ zawartoœæ
odwracaj¹c 10-15 razy. Nie mieszaæ roboczego odczynnika Master Mix na
mieszadle wibracyjnym. Ró¿owy barwnik znajduj¹cy siê w HIV-1 Mn2+,
v1.5 wykorzystuje siê do wizualnego potwierdzenia, ¿e HIV-1 Mn2+, v1.5
zosta³ dodany do Master Mix. Pozosta³¹ czêœæ HIV-1 Mn2+, v1.5 nale¿y
wyrzuciæ. Roboczy odczynnik Master Mix musi byæ przechowywany
w temperaturze 2-8°C i u¿yty w ci¹gu 4 godzin po przygotowaniu.
3.
Dodaæ 50 µl roboczego odczynnika Master Mix do ka¿dej z probówek
A-tube, u¿ywaj¹c pipetora do powtarzalnego dozowania jednakowych
objêtoœci cieczy lub pipetora z koñcówkami wyposa¿onymi w barierê dla
aerozoli lub wyrzutnik. W tym czasie nie nale¿y zamykaæ korków probówek
A-tube. Niezu¿yty roboczy odczynnik Master Mix nale¿y wyrzuciæ.
4.
Umieœciæ pierœcieñ (pierœcienie) A-ring zawieraj¹cy roboczy odczynnik
Master Mix w zamykanej torebce foliowej i zamkn¹æ szczelnie torebkê.
Przenieœæ pierœcieñ(nie) A-ring do obszaru przedamplifikacyjnego –
przygotowania próbek. Pierœcieñ(nie) A-ring zawieraj¹ce roboczy odczynnik
Master Mix nale¿y przechowywaæ w temperaturze 2-8°C w obszarze
przedamplifikacyjnym – przygotowania próbek, do czasu zakoñczenia
przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Roboczy odczynnik
Master Mix w probówkach A-tube zamkniêtych szczelnie w plastykowym
worku w temperaturze 2-8°C zachowuje stabilnoœæ przez 4 godziny.
Przygotowanie próbek
badanych i kontroli
Wykonywane w: Obszarze przedamplifikacyjnym – przygotowania próbki
Uwaga
Aby wykonaæ amplifikacjê uprzednio przygotowanych próbek i kontroli, nale¿y
najpierw wykonaæ kroki opisane w czêœci „Przygotowanie odczynników”.
W temperaturze pokojowej nale¿y rozmroziæ poddane obróbce próbki badane
i kontrolne, a nastêpnie wykonaæ „Standardowe przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych”, etap A.15 lub „Ultraczu³e przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych”, etap B.20.
Uwaga
W HIV-1 LYS podczas przechowywania w temperaturze 2-8°C tworzy siê osad.
Przed u¿yciem ogrzaæ do temperatury 25-37°C i dok³adnie wymieszaæ, aby
doprowadziæ do rozpuszczenia osadu.
18/52
HIV-1 MONITOR
Uwaga
Przed u¿yciem nale¿y zbadaæ ka¿d¹ butelkê HIV-1 LYS, obserwuj¹c j¹ na bia³ym tle,
poszukuj¹c œladu ¿ó³tego koloru lub cech wyciekania. Je¿eli stwierdzono jakikolwiek
œlad ¿ó³tego koloru lub obecnoœæ wycieku, nie u¿ywaæ danej butelki do badania.
Nale¿y skontaktowaæ siê z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu
wymiany.
Standardowe przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych
A.1. Przygotowaæ 70% etanol. Dla 12 testów, wymieszaæ 11,0 ml 95% etanolu
i 4,0 ml wody dejonizowanej lub destylowanej.
A.2. Oznaczyæ jedn¹ probówkê o pojemnoœci 2,0 ml z zakrêcanym korkiem dla
ka¿dej próbki pochodz¹cej od pacjenta oraz dodatkowo oznaczyæ trzy
probówki jako „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” i „HIV-1 H(+)C”.
A.3. Przygotowaæ standardowy roboczy odczynnik lizuj¹cy. Mieszaæ HIV-1 QS,
v1.5 za pomoc¹ mieszad³a wibracyjnego przez co najmniej 10 sekund przed
u¿yciem. Dla ka¿dej serii sk³adaj¹cej siê maksymalnie z 12 próbek badanych
i kontrolnych, dodaæ 100 µl HIV-1 QS, v1.5 do jednej butelki HIV-1 LYS
i dok³adnie wymieszaæ. Mierzenie objêtoœci HIV-1 LYS nie jest konieczne.
Ró¿owy barwnik znajduj¹cy siê w HIV-1 QS, v1.5 wykorzystuje siê do
wizualnego potwierdzenia, ¿e HIV-1 QS, v1.5 zosta³ dodany do HIV-1 LYS.
Pozosta³¹ czêœæ HIV-1 QS, v1.5 nale¿y wyrzuciæ. W temperaturze pokojowej
roboczy odczynnik lizuj¹cy jest stabilny przez 4 godziny.
Uwaga
W razie u¿ywania zamro¿onych próbek, nale¿y je rozmroziæ w temperaturze
pokojowej i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Odwirowaæ
krótko probówkê z próbk¹, aby pobraæ próbkê z dna probówki. Zachowaæ
ostro¿noœæ, aby unikn¹æ ska¿enia rêkawic przy obchodzeniu siê z próbkami.
A.4. Dodaæ 600 µl standardowego roboczego odczynnika lizuj¹cego do ka¿dej
oznaczonej probówki; nastêpnie zamkn¹æ probówki. Sprawdziæ, czy roboczy
odczynnik lizuj¹cy jest ró¿owy, aby potwierdziæ, ¿e HIV-1 QS, v1.5 zosta³
dodany do HIV-1 LYS.
A.5. Przygotowaæ próbki kontrolne w nastêpuj¹cy sposób:
–
Mieszaæ na mieszadle wibracyjnym NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C
i HIV-1 H(+)C przez 3-5 sekund.
–
Dodaæ 200 µl NHP do ka¿dej spoœród trzech probówek kontrolnych.
Zamkn¹æ probówki i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez co
najmniej 3-5 sekund.
–
Dodaæ 50 µl HIV-1 (–) C do probówki opisanej „HIV-1 (–) C”
zawieraj¹cej standardowy roboczy odczynnik lizuj¹cy oraz NHP.
Zamkn¹æ probówkê i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3-5
sekund.
–
Dodaæ 50 µl HIV-1(+)C do probówki opisanej „HIV-1(+)C”
sekund.
–
Dodaæ 50 µl HIV-1 H(+)C do probówki opisanej „HIV-1 H(+)C”
sekund.
A.6. Dodaæ 200 µl ka¿dej próbki pobranej od pacjenta do oznaczonych we
w³aœciwy sposób probówek zawieraj¹cych roboczy odczynnik lizuj¹cy.
Zamkn¹æ probówki i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej
3-5 sekund.
19/52
A.7. Inkubowaæ probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w temperaturze
pokojowej przez 10 minut.
A.8. Do ka¿dej probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi, po jej otwarciu,
dodaæ 800 µl 100% alkoholu izopropylowego (w temperaturze pokojowej),
ponownie zamkn¹æ probówkê i energicznie mieszaæ na mieszadle
wibracyjnym przez 3-5 sekund. Jednoczeœnie mo¿e byæ otwarta tylko jedna
probówka.
A.9. Na ka¿dej probówce umieœciæ znak orientacyjny; probówki umieœciæ
w mikrowirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne by³y skierowane na
zewn¹trz. W ten sposób peletki ustawi¹ siê zgodnie ze znakami. Odwirowaæ
próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy
maksymalnej prêdkoœci (12 500-16 000 x g).
A.10. U¿ywaj¹c dla ka¿dej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienk¹ koñcówk¹ ostro¿nie odci¹gn¹æ i usun¹æ supernatant z ka¿dej
probówki, zachowuj¹c ostro¿noœæ, aby nie wzburzyæ peletki (która mo¿e byæ
nie widoczna). Usun¹æ tak du¿o p³ynu, ile jest mo¿liwe bez wzburzenia
peletki. Usun¹æ powoli supernatant, pozwalaj¹c na ca³kowite sp³yniêcie
p³ynu po œcianie probówki. Nie stosowaæ aspiracji pró¿niowej.
A.11. Do ka¿dej probówki dodaæ 1,0 ml 70% etanolu (w temperaturze pokojowej),
a nastêpnie zamkn¹æ j¹ i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3-5
sekund.
A.12. Umieœciæ probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi
skierowanymi na zewn¹trz i wirowaæ probówki przez 5 minut
w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prêdkoœci (12 500-16 000 x g).
A.13. Za pomoc¹ nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienk¹ koñcówk¹,
oddzielnej dla ka¿dej probówki, ostro¿nie usun¹æ supernatant bez
wzburzenia peletki. Na tym etapie peletka powinna byæ wyraŸnie widoczna.
Usun¹æ tak du¿o supernatantu, ile jest mo¿liwe. Pozosta³oœci etanolu mog¹
hamowaæ amplifikacjê.
A.14. Dodaæ 400 µl HIV-1 DIL do ka¿dej probówki. Zamkn¹æ ponownie
probówki. Energicznie mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund
w celu ponownego uzyskania zawiesiny wyekstrahowanego RNA. Pozostaæ
mo¿e niewielka iloœæ nierozpuszczalnego materia³u. W ci¹gu 2 godzin po
przygotowaniu poddane obróbce próbki badane i kontrolne nale¿y
amplifikowaæ. Je¿eli amplifikacja nie mo¿e rozpocz¹æ siê w ci¹gu 2 godzin
po przygotowaniu, próbki mo¿na przechowywaæ zamro¿one w temperaturze
co najmniej –20°C nie d³u¿ej ni¿ jeden tydzieñ, z nie wiêcej ni¿ jednym
cyklem zamro¿enia-rozmro¿enia. Wiêcej ni¿ jeden cykl zamro¿eniarozmro¿enia mo¿e spowodowaæ utratê liczby kopii.
Uwaga
Je¿eli poddane obróbce próbki badane i kontrolne przed amplifikacj¹
przechowywano zamro¿one, to przed przejœciem do etapu A.15 nale¿y je rozmroziæ
w temperaturze pokojowej i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
A.15. Do odpowiednich probówek A zawieraj¹cych odczynnik roboczy Master
Mix za pomoc¹ pipetora wyposa¿onego w koñcówki z barier¹ dla aerozoli
lub wyrzutnikiem dodaæ 50 µl ka¿dej z poddanych obróbce próbek badanych
i kontrolnych. Do ka¿dej próbki badanej i kontrolnej u¿yæ nowej koñcówki.
Zachowaæ ostro¿noœæ, aby nie przenieœæ jakiegokolwiek wytr¹conego
materia³u, który móg³ nie ulec rozpuszczeniu. Zamkn¹æ probówki A-tube.
A.16. Zanotowaæ po³o¿enie próbek i kontroli w pierœcieniu A-ring. Amplifikacja
musi rozpocz¹æ siê w ci¹gu 45 minut od dodania poddanych obróbce próbek
i kontroli do probówek A-tube zawieraj¹cych roboczy odczynnik Master
Mix. Przenieœæ poddane obróbce próbki i kontrole w pierœcieniach A-ring do
20/52
HIV-1 MONITOR
obszaru amplifikacji/detekcji. Pozosta³oœci poddanych obróbce próbek
mo¿na zamroziæ i przechowywaæ w temperaturze co najmniej –20°C nie
d³u¿ej ni¿ 1 tydzieñ, z nie wiêcej ni¿ jednym cyklem zamro¿eniarozmro¿enia. Wiêcej ni¿ jeden cykl zamro¿enia-rozmro¿enia mo¿e
spowodowaæ utratê liczby kopii.
Ultraczu³e przygotowanie próbek
badanych i kontrolnych
B.1. Wstêpnie sch³odziæ ultrawirówkê oraz wirnik do 2-8°C w sposób opisany
w instrukcji obs³ugi ultrawirówki.
B.2. Przygotowaæ 70% etanol. Dla 12 testów, wymieszaæ 11,0 ml 95% etanolu
i 4,0 ml wody dejonizowanej lub destylowanej.
B.3. Oznaczyæ jedn¹ probówkê o pojemnoœci 1,5 ml z zakrêcanym korkiem dla
ka¿dej próbki pochodz¹cej od pacjenta oraz dodatkowo oznaczyæ trzy
probówki jako „HIV-1 (–) C”, „HIV-1 L(+)C” i „HIV-1 H(+)C”.
B.4. Przygotowaæ ultraczu³y roboczy odczynnik lizuj¹cy. Mieszaæ HIV-1 QS, v1.5
za pomoc¹ mieszad³a wibracyjnego przez co najmniej 10 sekund przed
u¿yciem. Dla ka¿dej serii sk³adaj¹cej siê maksymalnie z 12 próbek badanych
i kontrolnych, dodaæ 25 µl HIV-1 QS, v1.5 do jednej butelki HIV-1 LYS
i dok³adnie wymieszaæ. Mierzenie objêtoœci HIV-1 LYS nie jest konieczne.
Ró¿owy barwnik znajduj¹cy siê w HIV-1 QS, v1.5 wykorzystuje siê do
wizualnego potwierdzenia, ¿e HIV-1 QS, v1.5 zosta³ dodany do HIV-1 LYS.
Pozosta³¹ czêœæ HIV-1 QS, v1.5 nale¿y wyrzuciæ. W temperaturze pokojowej
ultraczu³y roboczy odczynnik lizuj¹cy jest stabilny przez 4 godziny.
Uwaga
W razie u¿ywania zamro¿onych próbek, nale¿y je rozmroziæ w temperaturze
pokojowej i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Odwirowaæ
krótko probówkê z próbk¹, aby pobraæ próbkê z dna probówki. Zachowaæ
ostro¿noœæ, aby unikn¹æ ska¿enia rêkawic przy obchodzeniu siê z próbkami.
B.5. Dodaæ 500 µl ka¿dej próbki pochodz¹cej od pacjenta do odpowiednio
oznaczonych probówek.
B.6. Dodaæ 500 µl NHP do ka¿dej spoœród odpowiednio oznaczonych probówek.
B.7. Na ka¿dej probówce umieœciæ znak orientacyjny; probówki umieœciæ
w ultrawirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne by³y skierowane na
próbki badane i kontrolne z prêdkoœci¹ 23 600 x g przez 60 minut w 2-8°C.
B.8. U¿ywaj¹c dla ka¿dej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienk¹ koñcówk¹ odci¹gn¹æ ostro¿nie i usun¹æ supernatant z ka¿dej
Uwaga
Peletki wirusa uzyskane w etapie B.8 ultraczu³ej procedury przygotowania
próbki zachowuj¹ stabilnoœæ do 6 godzin w temperaturze pokojowej.
W temperaturze co najmniej –20°C zachowuj¹ stabilnoœæ przez minimum
14 dni.
B.9. Dodaæ 600 µl roboczego odczynnika lizuj¹cego do ka¿dej oznaczonej
probówki; nastêpnie zamkn¹æ probówki. Sprawdziæ, czy roboczy odczynnik
lizuj¹cy jest ró¿owy, aby potwierdziæ, ¿e HIV-1 QS, v1.5 zosta³ dodany do
HIV-1 LYS. Mieszaæ na mieszadle wibracyjnym probówkê przez 3-5
sekund, aby ponownie wprowadziæ peletkê w stan zawiesiny.
21/52
B.10. Przygotowaæ ultraczu³e próbki kontrolne w nastêpuj¹cy sposób:
–
Mieszaæ na mieszadle wibracyjnym HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1
H(+)C przez 3-5 sekund.
–
Dodaæ 12,5 µl HIV-1 (–) C do probówki opisanej „HIV-1 (–) C” zawieraj¹cej
ultraczu³y roboczy odczynnik lizuj¹cy. Zamkn¹æ probówkê i mieszaæ na
mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
–
Dodaæ 12,5 µl HIV-1 L(+)C do probówki opisanej „HIV-1 L(+)C” zawieraj¹cej
ultraczu³y roboczy odczynnik lizuj¹cy. Zamkn¹æ probówkê i mieszaæ na
mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
–
Dodaæ 12,5 µl HIV-1 H(+)C do probówki opisanej „HIV-1 H(+)C”
zawieraj¹cej ultraczu³y roboczy odczynnik lizuj¹cy. Zamkn¹æ probówkê
i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
B.11. Inkubowaæ probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w temperaturze
pokojowej przez 10 minut.
B.12. Do ka¿dej probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi, po jej otwarciu,
dodaæ 600 µl 100% alkoholu izopropylowego (w temperaturze pokojowej),
ponownie zamkn¹æ probówkê i energicznie mieszaæ na mieszadle wibracyjnym
przez 3-5 sekund. Jednoczeœnie mo¿e byæ otwarta tylko jedna probówka.
B.13. Na ka¿dej probówce umieœciæ znak orientacyjny; probówki umieœciæ
w mikrowirówce w taki sposób, aby znaki orientacyjne by³y skierowane na
próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy
maksymalnej prêdkoœci (12 500-16 000 x g).
B.14. U¿ywaj¹c dla ka¿dej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej
z cienk¹ koñcówk¹ odci¹gn¹æ ostro¿nie i usun¹æ supernatant z ka¿dej
B.15. Do ka¿dej probówki dodaæ 1,0 ml 70% etanolu (w temperaturze pokojowej),
a nastêpnie zamkn¹æ j¹ i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund.
B.16. Umieœciæ probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi
skierowanymi na zewn¹trz i wirowaæ probówki przez 5 minut
w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prêdkoœci (12 500-16 000 x g).
B.17. Za pomoc¹ nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienk¹ koñcówk¹,
oddzielnej dla ka¿dej probówki, ostro¿nie usun¹æ supernatant bez
wzburzenia peletki. Na tym etapie osad (peletka) powinien byæ wyraŸnie
widoczny. Usun¹æ tak du¿o supernatantu, ile jest mo¿liwe. Pozosta³oœci
etanolu mog¹ hamowaæ amplifikacjê.
B.18. Powtórzyæ etap B.17 w celu usuniêcia tak du¿o pozosta³oœci supernatantu, ile
jest mo¿liwe. Pozosta³oœci etanolu mog¹ hamowaæ amplifikacjê.
B.19. Dodaæ 100 µl HIV-1 DIL do ka¿dej probówki. Zamkn¹æ ponownie
probówki. Energicznie mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 10 sekund
w celu ponownego uzyskania zawiesiny wyekstrahowanego RNA. Pozostaæ
mo¿e niewielka iloœæ nierozpuszczalnego materia³u. W ci¹gu 2 godzin po
przygotowaniu poddane obróbce próbki badane i kontrolne nale¿y
amplifikowaæ. Je¿eli amplifikacja nie mo¿e rozpocz¹æ siê w ci¹gu 2 godzin
po przygotowaniu, próbki mo¿na przechowywaæ zamro¿one w temperaturz
co najmniej –20°C nie d³u¿ej ni¿ jeden tydzieñ, z nie wiêcej ni¿ jednym
cyklem zamro¿enia-rozmro¿enia. Wiêcej ni¿ jeden cykl zamro¿eniarozmro¿enia mo¿e spowodowaæ utratê liczby kopii.
22/52
HIV-1 MONITOR
Uwaga
Je¿eli poddane obróbce próbki badane i kontrolne przed amplifikacj¹
przechowywano zamro¿one, to przed przejœciem do etapu B.20 nale¿y je rozmroziæ
w temperaturze pokojowej i mieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund.
B.20. Do odpowiednich probówek A-tube zawieraj¹cych odczynnik roboczy
Master Mix za pomoc¹ pipetora wyposa¿onego w koñcówki z barier¹ dla
aerozoli lub wyrzutnikiem dodaæ 50 µl ka¿dej z poddanych obróbce próbek
badanych i kontrolnych. Do ka¿dej próbki badanej i kontrolnej u¿yæ nowej
koñcówki. Zachowaæ ostro¿noœæ, aby nie przenieœæ jakiegokolwiek
wytr¹conego materia³u, który móg³ nie ulec rozpuszczeniu. Zamkn¹æ
probówki A-tube.
B.21. Zanotowaæ po³o¿enie próbek i kontroli w pierœcieniu A-ring. Amplifikacja
musi rozpocz¹æ siê w ci¹gu 45 minut od dodania poddanych obróbce próbek
i kontroli do probówek A-tube zawieraj¹cych roboczy odczynnik Master
Mix. Przenieœ przygotowane próbki badane i kontrolne w pierœcieniach
(A-ring) do obszaru amplifikacji/detekcji. Pozosta³oœci poddanych obróbce
próbek mo¿na zamroziæ i przechowywaæ w temperaturze co najmniej –20°C
nie d³u¿ej ni¿ 1 tydzieñ, z nie wiêcej ni¿ jednym cyklem zamro¿eniaodmro¿enia. Wiêcej ni¿ jeden cykl zamro¿enia-rozmro¿enia mo¿e
spowodowaæ utratê liczby kopii.
Odwrotna transkrypcja,
amplifikacja
i detekcja
Wykonywana w: Obszar poamplifikacyjny – amplifikacji/detekcji
Nale¿y wykonywaæ codzienne czynnoœci serwisowe w sposób okreœlony
w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, w tym:
– Przecieraæ stanowisko startowe przy u¿yciu wilgotnej szmatki pozbawionej
k³aczków, a nastêpnie osuszyæ je
–
Przecieraæ koñcówkê uchwytu do pojemników D-cup przy u¿yciu wilgotnej
szmatki pozbawionej k³aczków, a nastêpnie osuszyæ j¹
–
Sprawdziæ pojemnik buforu p³ucz¹cego i nape³niæ go w razie potrzeby
–
Przygotowaæ roboczy roztwór p³ucz¹cy (1X) w sposób podany poni¿ej. Zbadaæ
WB oraz, je¿eli jest to konieczne, ogrzaæ w temperaturze 30-37°C w celu
ponownego rozpuszczenia osadu. Dodaæ 1 objêtoœæ WB do 9 objêtoœci
destylowanej lub dejonizowanej wody. Dobrze wymieszaæ. Przez ca³y czas
utrzymywaæ co najmniej 3-4 litry roboczego buforu p³ucz¹cego (1X)
w zbiorniku buforu p³ucz¹cego systemu
–
Opró¿niæ pojemnik na odpady
–
W³¹czyæ analizator
–
W czasie uruchamiania sprawdziæ strzykawki i przewody
–
W czasie uruchamiania sprawdziæ koñcówkê transferow¹
Przed ka¿dym przebiegiem
– Sprawdziæ pojemnik na odpady i opró¿niæ go w razie potrzeby
–
Sprawdziæ zbiornik buforu p³ucz¹cego, w razie potrzeby dodaæ buforu
–
Usun¹æ zu¿yte stojaki do pojemników D-cup
–
W³¹czyæ analizator
£adowanie urz¹dzenia i dzia³anie systemu
1.
Sprawdziæ iloœæ odczynników w analizatorze COBAS AMPLICOR.
Przygotowaæ iloœæ pojemników z odczynnikami wystarczaj¹c¹ do
ukoñczenia zaplanowanej pracy.
2.
Dok³adnie wymieszaæ IM PS1, v1.5 na mieszadle wibracyjnym. Dodaæ 2,5 ml
IM PS1, v1.5 do jednej kasety z IM4, v1.5. Umieœciæ kasetê w stojaku na
odczynniki przeznaczone do okreœlonego testu. Usun¹æ zu¿yt¹ fiolkê IM PS1,
v1.5. Zanotowaæ datê przygotowania odczynnika na kasecie IM4, v1.5.
23/52
3.
Dok³adnie wymieszaæ IQ PS1, v1.5 na mieszadle wibracyjnym. Dodaæ
2,5 ml IQ PS1, v1.5 do jednej kasety z IQ4, v1.5. Umieœciæ kasetê
w stojaku na odczynniki przeznaczone do okreœlonego testu. Usun¹æ
zu¿yt¹ fiolkê IQ PS1, v1.5. Zanotowaæ datê przygotowania odczynnika na
kasecie IQ4, v1.5.
4.
Przygotowaæ substrat roboczy pipetuj¹c 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby
wymieszaæ, kilkakrotnie nabraæ i usun¹æ p³yn z pipety. Usun¹æ otwart¹ fiolkê
SB. Zanotowaæ datê przygotowania na kasecie z SB3.
5.
Umieœciæ substrat roboczy w ogólnym stojaku na odczynniki.
6.
Umieœciæ kasetê AD3 w stojaku na odczynniki przeznaczone do okreœlonego
testu. Zanotowaæ datê na kasecie z AD3.
7.
Umieœciæ kasety z DN4 i CN4 w ogólnym stojaku na odczynniki. Na ka¿dej
kasecie zanotowaæ datê jej otwarcia.
8.
Zdefiniowaæ stojaki na odczynniki jako ogólne lub przeznaczone do
okreœlonego oznaczenia przy u¿yciu klawiatury lub czytnika kodów paskowych
w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, lub
u¿ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób opisany w Instrukcji
obs³ugi oprogramowania AMPLILINK.
9.
Skonfigurowaæ stojaki dla odczynników wprowadzaj¹c pozycje odczynników
i numery serii do urz¹dzenia przy u¿yciu klawiatury lub czytnika kodów
paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS
AMPLICOR, lub u¿ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób opisany
w Instrukcji obs³ugi oprogramowania AMPLILINK.
10. Za³adowaæ stojak z odczynnikami do urz¹dzenia przy u¿yciu klawiatury lub
czytnika kodów paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora
COBAS AMPLICOR, lub u¿ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób
opisany w Instrukcji obs³ugi oprogramowania AMPLILINK. Upewniæ siê, ¿e
ka¿da kaseta na odczynnik jest w prawid³owej pozycji i pasuje dok³adnie do
swojego uchwytu.
11. Umieœciæ stojak na pojemniki D-cup na przeznaczonej dla nich platformie. Do
wykonania niezale¿nej, podwójnej analizy próbek przez analizator COBAS
AMPLICOR na ka¿d¹ próbkê i roztwór kontrolny potrzebnych jest
6 pojemników D-cup, a na ka¿dy pojemnik z odczynnikiem roboczym – dwa
pojemniki D-cup.
12. Umieœciæ pierœcieñ(nie) A-ring w segmencie(tach) termocyklera analizatora
COBAS AMPLICOR.
13. Za³adowaæ pierœcieñ(nie) A-ring do analizatora przy u¿yciu klawiatury lub
czytnika kodów paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora
COBAS AMPLICOR, lub u¿ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób
opisany w Instrukcji obs³ugi oprogramowania AMPLILINK.
14. Przygotowaæ listê robocz¹ pierœcienia A_ring zgodnie z opisem w Instrukcji
obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR.
Uwaga
Na tym etapie u¿ytkownik bêdzie musia³ wprowadziæ do analizatora COBAS
AMPLICOR liczbê kopii Quantitation Standard charakterystyczn¹ dla serii
odczynnika, oraz zakresy kontroli Low (+) i High (+) Control, które znajduj¹ siê
na kartach danych COBAS AMPLICOR HIV-1 Test, v1.5 Data Card.
Wprowadziæ odpowiednie zakresy kontroli w oparciu o zastosowan¹ procedurê
przygotowania próbki (tj. standardow¹ lub ultraczu³¹). Zakresy te s¹
wprowadzane do analizatora COBAS AMPLICOR za pomoc¹ klawiatury,
skanera kodu kreskowego lub oprogramowania AMPLILINK podczas
ustawiania listy pracy dla pierœcienia A-ring (patrz Instrukcja obs³ugi).
15. Nale¿y szczelnie zamkn¹æ pokrywê segmentu(ów) termocyklera.
24/52
HIV-1 MONITOR
16. Uruchomiæ Analizator COBAS AMPLICOR w sposób opisany w Instrukcji
obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR.
17. Poczekaæ na komunikat analizatora oznaczaj¹cy zakoñczenie kontroli
za³adowania.
Uwaga
Analizator COBAS AMPLICOR umo¿liwia wykonanie 2 oddzielnych testów
iloœciowych zawartoœci ka¿dej probówki A-tube. Analizator oblicza wymagan¹
iloœæ ka¿dego odczynnika detekcji, a kontrola za³adowania, która wykonywana
jest na pocz¹tku ka¿dego cyklu, okreœla czy dostêpna iloœæ odczynników jest
wystarczaj¹ca do ¿¹danych testów.
18. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie wykonuje odwrotn¹
transkrypcjê, amplifikacjê, rozcieñczenie amplikonu i detekcjê. Wyniki s¹
wyra¿one jako liczba kopii HIV-1 RNA w przeliczeniu na mililitr (kopie/ml).
Uwaga
Wyniki
Obliczenie wyników
Uwaga
Dla ka¿dej próbki badanej i kontrolnej, analizator COBAS AMPLICOR
automatycznie:
•
Wybiera wszystkie rozcieñczenia amplikonu HIV-1 i Quantitation Standard,
które mieszcz¹ siê w liniowym zakresie absorbancji testu (0,15-2,0 A660).
Aby mo¿liwe by³o obliczenie wyników, co najmniej jedno rozcieñczenie
HIV-1 oraz co najmniej jedno rozcieñczenie Quantitation Standard musi
mieœciæ siê w wymienionym liniowym zakresie.
•
Koryguje wszystkie wybrane wartoœci absorbancji ze wzglêdu na
poch³anianie t³a.
•
Okreœla, czy wartoœæ A660 dla HIV-1 QS mo¿e byæ zaakceptowana,
potwierdzaj¹c, ¿e etapy obróbki próbki, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji
i detekcji zosta³y wykonane poprawnie.
•
Okreœla, czy wszystkie docelowe rozcieñczenia HIV-1 (–) C przynosz¹
wartoœci A660 ≤ 0,099.
•
Okreœla wartoœci Total HIV-1 i QS A660 dla wszystkich wybranych
rozcieñczeñ i oblicza liczbê kopii dla HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C oraz dla
ka¿dej próbki, wykorzystuj¹c maksymaln¹ wartoœæ Total A660.
•
Okreœla, czy obliczona liczba kopii dla HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C mieœci
siê w przypisanym zakresie.
•
Generuje wydruk zawieraj¹cy wartoœci A660 dla wszystkich rozcieñczeñ HIV-1
i Quantitation Standard, a tak¿e obliczon¹ liczbê kopii (HIV-1 RNA kopie/ml)
dla ka¿dej próbki badanej i kontrolnej. Liczba kopii znajduje siê na wydruku,
poni¿ej miejsca identyfikacji próbki, w obrêbie informacji naukowej.
W zale¿noœci od uznania u¿ytkownika, wyniki testu mo¿na rêcznie
przekonwertowaæ z wyra¿onych w kopiach na mililitr (kopie/ml) na jednostki
miêdzynarodowe (IU/ml).
W oparciu o wspólne badania wielu oœrodków uzgodniono, ¿e wspó³czynnik
konwersji dla pierwszego standardu miêdzynarodowego wynosi 0,51 HIV-1 RNA
kopii na jednostkê miêdzynarodow¹36.
Seria sprawdzaj¹ca
Aby upewniæ siê o poprawnym przebiegu serii, sprawdŸ sygna³y i komentarze
umieszczone na wydruku. Seria nie jest wa¿na, je¿eli dowolny spoœród
poni¿szych sygna³ów i komentarzy dotyczy kontroli HIV-1 MONITOR.
25/52
Uwaga
Oznaczenie
_Q_
Szczegó³owe informacje o drukowaniu wyników oraz interpretacji sygna³ów
i komentarzy odnaleŸæ mo¿na w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS
AMPLICOR.
Komentarz
QS_INVALID
_N_
_H_
NC_INVALID
HPC_INVALID
_L_
LPC_INVALID
OD_SEQUENCE
QS_SEQUENCE
TARGETOD_HI
TARGETOD_LO
TARG_RANGE
•
Przegl¹d danych
Interpretacja
Wartoœæ HIV-1 QS A660 dla dowolnej próbki kontrolnej wiêksza lub
mniejsza ni¿ akceptowalny zakres.
Wartoœæ HIV-1 (–) CA660 wiêksza ni¿ akceptowalna granica (> 0,099).
Liczba kopii HIV-1 H(+)C wiêksza lub mniejsza ni¿ przypisany
zakres.
Liczba kopii HIV-1 L(+)C wiêksza lub mniejsza ni¿ przypisany
zakres.
Wskazuje na docelow¹ wartoœæ A660 poza sekwencj¹. Wyniki nie bêd¹
obliczone. Powtórzyæ ca³¹ procedurê testu, w tym przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, amplifikacjê oraz detekcjê.
Wskazuje na wartoœæ QS A660 poza sekwencj¹. Wyniki nie bêd¹
obliczone. Powtórzyæ ca³¹ procedurê testu, w tym przygotowanie
próbek badanych i kontrolnych, amplifikacjê oraz detekcjê.
Wszystkie docelowe wartoœci gêstoœci optycznej (optical density, OD)
s¹ wiêksze ni¿ najwiêksza wartoœæ z okreœlonego przedzia³u.
W przypadku wyst¹pienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low
Positive Control lub High Positive Control analizator COBAS
AMPLICOR nie oblicza miana. W przypadku braku obliczonej
wartoœci miana, wynik danej kontroli oraz przebieg oznaczenia s¹
niewa¿ne.
Wszystkie docelowe wartoœci gêstoœci optycznej (OD) s¹ mniejsze ni¿
najmniejsza wartoœæ z okreœlonego przedzia³u. W przypadku
wyst¹pienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low Positive
Control lub High Positive Control analizator COBAS AMPLICOR nie
oblicza miana. W przypadku braku obliczonej wartoœci miana, wynik
danej kontroli oraz przebieg oznaczenia s¹ niewa¿ne.
Co najmniej jedna docelowa wartoœæ gêstoœci optycznej (OD) jest
mniejsza oraz jedna jest wiêksza ni¿ wartoœci z okreœlonego
przedzia³u, lecz ¿adna nie mieœci siê w obrêbie tego przedzia³u.
W przypadku wyst¹pienia takiego oznaczenia w odniesieniu do Low
Positive Control lub High Positive Control analizator COBAS
AMPLICOR nie oblicza miana. W przypadku braku obliczonej
wartoœci miana, wynik danej kontroli oraz przebieg oznaczenia s¹
niewa¿ne.
Jeœli seria jest niewa¿na, nale¿y powtórzyæ ca³e oznaczenie, w tym
przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotn¹ transkrypcjê,
amplifikacjê i detekcjê.
Analizator COBAS AMPLICOR przedstawia wydruk wyników A660, a tak¿e liczbê
kopii obliczon¹ dla ka¿dej próbki badanej i kontrolnej. Wartoœci A660 dla seryjnych
rozcieñczeñ amplikonu docelowego oraz QS powinny stopniowo zmniejszaæ siê A660
wraz ze zwiêkszaniem siê wspó³czynników rozcieñczeñ. Wyj¹tek stanowi¹
rozcieñczenia, dla których wartoœci A660 przekraczaj¹ zakres liniowy oznaczenia
(próbki o du¿ym mianie), lub rozcieñczenia, w których wartoœci A660 s¹ zbli¿one do t³a
(próbki o ma³ym mianie).
Rozcieñczenia amplikonu HIV-1
Rozcieñczenia HIV-1 #1, #2, #3 i #4 odpowiadaj¹ roztworowi amplikonu HIV-1
RNA bez zanieczyszczeñ oraz seryjnym rozcieñczeniom 1:9, 1:81 i 1:729.
Wartoœci absorbancji powinny zmniejszaæ siê wraz z seryjnymi
rozcieñczeniami – najwiêksza wartoœæ A660 dla ka¿dej próbki badanej i kontrolnej
w pierwszym rozcieñczeniu (rozcieñczenie #1) oraz najmniejsza wartoœæ A660
w ostatnim rozcieñczeniu (rozcieñczenie #4). Je¿eli wartoœci HIV-1 A660 nie s¹
w sekwencji, to wyœwietlona zostanie wiadomoœæ b³êdu OD_SEQUENCE dla
danej próbki badanej lub kontrolnej.
26/52
HIV-1 MONITOR
Rozcieñczenia amplikonu HIV-1 QS
Rozcieñczenia HIV-1 QS #1 i #2 odpowiadaj¹ roztworowi amplikonu HIV-1 QS
bez zanieczyszczeñ oraz rozcieñczeniu seryjnemu 1:9. Je¿eli wartoœæ A660 dla
rozcieñczenia #2 jest wiêksza ni¿ wartoœæ A660 dla rozcieñczenia #1, to
wyœwietlona zostanie wiadomoœæ b³êdu QS_SEQUENCE. Wynik testu dla tej
próbki badanej lub kontrolnej jest niewa¿ny. Powtórzyæ ca³¹ procedurê testu
(w tym obróbkê próbki, amplifikacjê i detekcjê) dla tej próbki badanej lub
kontrolnej.
Interpretacja wyników z wartoœciami A660 poza sekwencj¹
•
Wartoœci A660 dla rozcieñczeñ amplikonu HIV-1 powinny charakteryzowaæ
siê zmniejszaniem wartoœci A660 wraz ze zwiêkszaniem wspó³czynnika
rozcieñczenia, z wyj¹tkiem rozcieñczeñ, które s¹ wysycone, oraz
rozcieñczeñ charakteryzuj¹cych siê wartoœciami A660 t³a.
•
W reakcjach zawieraj¹cych du¿o kopii HIV-1 RNA na mililitr rozcieñczenia
#1, #2 i #3 mog¹ staæ siê wysycone, co spowoduje zmniejszenie wyników
A660 (patrz przyk³ad 1 w tabeli 1). Wyniki te s¹ wa¿ne nawet wówczas, gdy
rozcieñczenia HIV-1 od #1 do #4 nie charakteryzuj¹ siê zmniejszaj¹cymi siê
wartoœciami A660.
•
W reakcjach zawieraj¹cych ma³o kopii HIV-1 RNA na mililitr rozcieñczenia
#2, #3 i #4 mog¹ posiadaæ wartoœci A660 t³a (patrz przyk³ad 2 w tabeli 1).
Wyniki te s¹ wa¿ne nawet wówczas, gdy rozcieñczenia HIV-1 od #1 do #4
nie charakteryzuj¹ siê zmniejszaj¹cymi siê wartoœciami A660.
•
Wszystkie rozcieñczenia o wartoœciach A660 pomiêdzy 0,15 a 2,0 powinny
charakteryzowaæ siê zmniejszaniem wartoœci A660 dla rozcieñczeñ od #1 do
#4. Je¿eli wartoœci A660 pomiêdzy 0,15 and 2,0 nie charakteryzuj¹ siê
zmniejszaniem wartoœci A660 dla rozcieñczeñ od #1 do #4, to wystêpuje b³¹d
(patrz przyk³ady 3, 4 i 5 w tabeli 1). Wyniki testu dla tej próbki badanej lub
kontrolnej s¹ niewa¿ne. Nale¿y powtórzyæ ca³¹ procedurê testu dla tej próbki
(w tym obróbkê próbki, amplifikacjê oraz detekcjê).
Tabela 1
Przyk³ady wyników A660 poza sekwencj¹
Docelowa A660
(wspó³czynnik rozcieñczenia)
*
Przyk³ad 1
1:1
2,578
1:9
3,603
1:81
3,201
1:729
*0,700
QS A660
(wspó³czynnik)
rozcieñczenia)
1:1
1:9
2,618
*0,397
Przyk³ad 2
*0,216
0,004
0,016
0,007
3,236
*0,743
WA¯NY: Próbka o niskim mianieA660 na poziomie
lub w pobli¿u poziomu wykrywalnoœci.
Przyk³ad 3
0,002
0,007
0,004
0,339
4,218
*0,883
NIEWA¯NY: wyœwietlana wiadomoœæ
OD_SEQUENCE.
Przyk³ad 4
3,052
1,597
3,384
2,887
1,357
*0,158
OD_SEQUENCE.
Przyk³ad 5
0,016
0,267
0,007
0,004
3,612
*0,793
OD_SEQUENCE.
Interpretacja wyników
WA¯NY: Próbka o wysokim mianieA660 powy¿ej
liniowego zakresu poch³aniania.
Oznacza wartoœæ A660 wybran¹ przez analizator COBAS AMPLICOR do obliczenia wyniku, tak jak wskazano na wydruku.
Nie wybrano wyniku dla próbek z wartoœciami A660 poza sekwencj¹.
Interpretacja
wyników
Aby przebieg by³ wa¿ny, nale¿y sprawdziæ, czy ¿adnej z próbek nie towarzysz¹
sygna³y lub komentarze na wydruku wyników. Wyniki nale¿y interpretowaæ
w nastêpuj¹cy sposób:
27/52
Uwaga
Analizator COBAS AMPLICOR zaprogramowano tak, aby sygnalizowa³
najczêstsze b³êdy i niespójnoœci wyników. Niemniej jednak zaleca siê, aby
elementem rutynowej oceny danych w laboratorium by³o przegl¹danie odczytów
wartoœci A660, w celu zapewnienia maksymalnej integralnoœci wyników.
•
•
•
Oznaczenie
_Q_
Komentarz
QS_INVALID
Wyniki próbek, którym na wydruku nie towarzysz¹ sygna³y lub komentarze,
mo¿na og³osiæ.
Wa¿ny przebieg mo¿e zawieraæ zarówno wyniki próbek wa¿nych, jak
i niewa¿nych, w zale¿noœci od sygna³ów i/lub komentarzy dla
poszczególnych próbek.
Próbki, którym towarzysz¹ sygna³y i/lub komentarze, nale¿y interpretowaæ
w nastêpuj¹cy sposób:
Interpretacja
Brak rozcieñczenia QS o wartoœci A660 w zakresie liniowego zakresu poch³aniania testu.
Wynik testu dla tej próbki jest niewa¿ny. Próbki z wynikami niewa¿nymi powinny byæ
ponownie zbadane; nale¿y powtórzyæ przygotowanie próbek badanych i kontrolnych,
odwrotn¹ transkrypcjê, amplifikacjê oraz detekcjê.
TARGETOD_LO
Wartoœci A660 dla wszystkich rozcieñczeñ HIV-1 mniejsze ni¿ liniowy zakres absorbancji
testu. Wyniki nale¿y przedstawiæ jako „nie wykryto HIV-1 RNA (mniej ni¿ 400 HIV-1 RNA
kopii/ml)” lub jako „nie wykryto HIV-1 RNA (mniej ni¿ 50 kopii/ml)” w zale¿noœci od tego,
czy zastosowano standardow¹ (Standard), czy ultraczu³¹ (UltraSensitive) procedurê
przygotowania próbki.
TARGETOD_HI
Wartoœci A660 dla wszystkich rozcieñczeñ HIV-1 wiêksze ni¿ zakres liniowy absorbancji testu.
Wynik nale¿y przedstawiæ jako „nie oznaczono”. Je¿eli zastosowano standardow¹ procedurê
rzygotowania próbki, to nale¿y przygotowaæ rozcieñczenie próbki oryginalnej i HIV-ujemnego
ludzkiego osocza oraz powtórzyæ test, stosuj¹c standardow¹ procedurê przygotowania próbki.
Pomno¿yæ uzyskany wynik przez wspó³czynnik rozcieñczenia. Je¿eli zastosowano ultraczu³¹
procedurê przygotowania próbki, to nale¿y powtórzyæ badanie oryginalnej próbki osocza,
wykorzystuj¹c standardow¹ procedurê przygotowania próbki.
RESULT_LO
Obliczona liczba kopii/ml jest mniejsza ni¿ liniowy zakres testu. Dla standardowej procedury
przygotowania próbki wyniki nale¿y przedstawiæ jako „wykryto HIV-1 RNA, mniej ni¿ 400
HIV-1 RNA kopii/ml”. Je¿eli oczekuje siê wyników iloœciowych, nale¿y ponownie zbadaæ
oryginaln¹ próbkê osocza, wykorzystuj¹c ultraczu³¹ procedurê przygotowania próbki. Dla
ultraczu³ej procedury przygotowania próbki wyniki nale¿y przedstawiæ jako „wykryto HIV-1
RNA, mniej ni¿ 50 HIV-1 RNA kopii/ml”.
RESULT_HI
Obliczona liczba kopii/ml jest wiêksza ni¿ liniowy zakres testu. Dla standardowej procedury
przygotowania próbki wyniki nale¿y przedstawiæ jako „wiêcej ni¿ 7,5 x 105 HIV-1 RNA
kopii/ml”. Je¿eli oczekuje siê wyników iloœciowych, mo¿na rozcieñczyæ oryginaln¹ próbkê
z ludzkim osoczem HIV-1-ujemnym i powtórzyæ test. Pomno¿yæ uzyskany wynik przez
wspó³czynnik rozcieñczenia. Dla ultraczu³ej procedury przygotowania próbki wyniki nale¿y
przedstawiæ jako „wiêcej ni¿ 1,0 x 105 HIV-1 RNA kopii/ml”. Je¿eli oczekuje siê wyników
iloœciowych, mo¿na ponownie zbadaæ oryginaln¹ próbkê, wykorzystuj¹c standardow¹
procedurê jej przygotowania.
TARG_RANGE
Wszystkie docelowe wartoœci A660 nie mieszcz¹ siê w liniowym zakresie testu. Wynik nale¿y
przedstawiæ jako „nie oznaczono”. Powtórzyæ badanie oryginalnej próbki, ponawiaj¹c
przygotowanie próbki, odwrotn¹ transkrypcjê, amplifikacjê i detekcjê.
OD_SEQUENCE
Wskazuje na docelow¹ wartoœæ A660 poza sekwencj¹. Wyniki nie bêd¹ obliczone. Powtórzyæ
ca³¹ procedurê testu, w tym przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikacjê oraz
detekcjê.
QS_SEQUENCE
28/52
Wskazuje na wartoœæ QS A660 poza sekwencj¹. Wyniki nie bêd¹ obliczone. Powtórzyæ ca³¹
procedurê testu, w tym przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikacjê oraz
detekcjê.
HIV-1 MONITOR
Kontrola jakoœci
Co najmniej jedno powtórzenie ka¿dej kontroli AMPLICOR HIV-1 MONITOR
(–) Control, AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) Control oraz AMPLICOR
HIV-1 MONITOR High (+) Control musi byæ w³¹czone do ka¿dego
uruchomienia testu. Tak jak w przypadku ka¿dej nowej procedury laboratoryjnej,
nowy operator powinien rozwa¿yæ zastosowanie dodatkowych kontroli za
ka¿dym razem, kiedy przeprowadzany jest test, do czasu osi¹gniêcia du¿ego
stopnia zaufania dotycz¹cego poprawnoœci przeprowadzania testu. Nie ma
wymagañ dotycz¹cych po³o¿enia kontroli w pierœcieniu A-ring.
Aby upewniæ siê o poprawnym przebiegu oznaczenia, sprawdziæ sygna³y
i komentarze umieszczone na wydruku dla danego przebiegu. Objaœnienia
znaczników i omentarzy znajduj¹ siê w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS
AMPLICOR.
Kontrola ujemna
Oznaczenie kontroli HIV-1 (–) Control powinno przynieœæ wynik HIV-1 RNA Not
Detected, t.j. wszystkie wartoœci HIV-1 A660 ≤ 0,099. Je¿eli HIV-1 (–) Kontrola nie
spe³nia tego kryterium, to ca³y przebieg testu jest niewa¿ny. Nale¿y powtórzyæ
ca³y proces (przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna
transkrypcja, amplifikacja i detekcja). Je¿eli poch³anianie HIV-1 (–) Control
systematycznie wynosi wiêcej ni¿ 0,099, to nale¿y skontaktowaæ siê z lokalnym
przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrole dodatnie
Przypisany zakres AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) oraz High (+) Control
jest swoisty dla danej serii kontroli w zale¿noœci do zastosowanego sposobu
przygotowania próbki (standardowego lub ultraczu³ego). Znajduje siê on na karcie
danych COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Data Card, któr¹
dostarczono wraz z zestawem. Zakresy te s¹ wprowadzane do analizatora COBAS
AMPLICOR za pomoc¹ klawiatury, skanera kodu kreskowego lub
oprogramowania AMPLILINK podczas ustawiania listy pracy dla pierœcienia
A-ring (patrz Instrukcja obs³ugi).
Liczba kopii HIV-1 RNA na mililitr dla HIV-1 MONITOR Low (+) Control oraz
dla HIV-1 MONITOR High (+) Control powinna mieœciæ siê w zakresie
wskazanym na karcie danych COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Data Card. Je¿eli jedna lub obie kontrole HIV-1 MONITOR (+) Control nie
spe³niaj¹ tych kryteriów, to ca³y przebieg testu jest niewa¿ny. Nale¿y powtórzyæ
ca³y proces (przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, odwrotna
transkrypcja, amplifikacja i detekcja). Je¿eli liczba kopii HIV-1 RNA na mililitr
dla jednej lub obu kontroli HIV-1 MONITOR (+) Control systematycznie mieœci
siê poza przypisanym zakresem, proszê zwróciæ siê do regionalnego biura Roche
w celu uzyskania pomocy technicznej.
Œrodki ostro¿noœci dotycz¹ce procedury
Praca w laboratorium musi zachodziæ w sposób jednokierunkowy, z pocz¹tkiem
w obszarze „przedamplifikacyjnym” i z jednokierunkowym ruchem w stronê
obszaru „poamplifikacyjnego” (amplifikacji/detekcji). Czynnoœci wykonywane
przed amplifikacj¹ nale¿y rozpocz¹æ od przygotowania odczynników, a nastêpnie
przygotowania próbek. Materia³y i urz¹dzenia musz¹ byæ przypisane do ka¿dej
z czynnoœci przedamplifikacyjnych i nie wolno ich u¿ywaæ do ¿adnych innych
czynnoœci lub przenosiæ pomiêdzy obszarami. W ka¿dym z obszarów nale¿y
u¿ywaæ rêkawic; rêkawice musz¹ byæ zmieniane przed opuszczeniem ka¿dego
z obszarów. Wyposa¿enie i materia³y zastosowane do przygotowania odczynnika
nie mog¹ byæ u¿ywane podczas czynnoœci zwi¹zanych z przygotowywaniem
próbki lub pipetowaniem lub obróbk¹ zamplifikowanego DNA lub innych Ÿróde³
docelowego DNA. Materia³y i urz¹dzenia u¿ywane w czynnoœciach po
amplifikacji musz¹ pozostawaæ zawsze w obszarze poamplifikacyjnym.
29/52
Jak w przypadku ka¿dej procedury testowej, dla prawid³owego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysok¹ czu³oœæ analityczn¹ tego testu, nale¿y zachowaæ najwy¿sz¹
ostro¿noœæ, aby nie dopuœciæ do ska¿enia odczynników w zestawach lub
mieszanin amplifikacyjnych. Nale¿y monitorowaæ czystoœæ wszystkich
odczynników. Wyrzuciæ wszelkie podejrzane odczynniki.
Ograniczenia metody
Test ten zosta³ sprawdzony wy³¹cznie w przypadku stosowania ludzkiego osocza
pobranego do EDTA lub ACD (antykoagulanty). Badanie innych rodzajów
próbek mo¿e skutkowaæ wynikami fa³szywie ujemnymi lub fa³szywie dodatnimi.
Heparyna hamuje PCR; nie wolno stosowaæ próbek pobranych z heparyn¹ jako
antykoagulantem w teœcie COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5.
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, zoptymalizowano dla HIV-1
grupy M, podtypów A-H. Dzia³anie testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR,
v1.5 w przypadku HIV-1 grupy O oraz HIV-2 nie jest znane. Niniejszy test nie
powinien byæ stosowany w postêpowaniu klinicznym z pacjentami zaka¿onymi HIV-2
lub HIV-1 grupa O.
Wiarygodne wyniki uzale¿nione s¹ od w³aœciwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur obróbki.
Obecnoœæ AmpErase w AMPLICOR HIV-1 MONITOR Master Mix, v1.5,
zmniejsza ryzyko ska¿enia amplikonu. Mimo tego ska¿enia miêdzy próbkami
kontrolnymi wykazuj¹cymi pozytywny odczyn w kierunku HIV-1 i próbkami
klinicznymi unikn¹æ mo¿na jedynie dziêki dobrej praktyce laboratoryjnej
i dok³adnemu przestrzeganiu procedur wyszczególnionych w Podrêczniku
metodyki.
Niniejszy produkt powinien byæ stosowany wy³¹cznie przez personel przeszkolony
w technikach PCR.
Niniejszego produkt u¿ywaæ mo¿na wy³¹cznie w analizatorze COBAS
AMPLICOR.
Wytyczne proceduralne
Decyzja o zastosowaniu standardowej lub ultraczu³ej procedury przygotowania
próbki zale¿eæ bêdzie od charakterystycznej populacji pacjentów, których osocze
trafia do laboratorium. Zaleca siê, aby ka¿de laboratorium oceni³o
charakterystykê populacji pacjentów, w celu ustalenia najlepszej procedury
laboratoryjnej dla pocz¹tkowego badania. Ponadto nale¿y okreœliæ, w których
przypadkach stosowana bêdzie alternatywna procedura przygotowania próbki. Na
przyk³ad, je¿eli w populacji pacjentów nie ma osób dotychczas nieleczonych lub
wiadomo, ¿e wszyscy pacjenci otrzymuj¹ leczenie przeciwko retrowirusom, to
laboratorium mo¿e wybraæ ultraczu³¹ procedurê przygotowania próbki jako
metodê rutynow¹; procedurê standardow¹ stosowaæ natomiast tylko wówczas,
gdy obci¹¿enie organizmu wirusem przekracza 100 000 kopii/ml. Je¿eli nie jest
znana populacja pacjentów (w odniesieniu do leczenia lub wstêpnego obci¹¿enia
organizmu wirusem), laboratorium mo¿e wybraæ standardow¹ procedurê
przygotowania próbki jako procedurê rutynow¹; procedurê ultraczu³¹ stosowaæ
natomiast tylko po zastosowaniu procedury standardowej i uzyskaniu wyniku
wskazuj¹cego na obci¹¿enie organizmu wirusem mniejsze ni¿ 400 kopii/ml.
30/52
HIV-1 MONITOR
Substancje interferuj¹ce
Heparyna hamuje PCR. Nie stosowaæ próbek pobranych do heparyny.
Zwiêkszone poziomy lipidów, bilirubiny oraz hemoglobiny w próbkach nie
interferuj¹ z oznaczeniem iloœciowym HIV-1 RNA za pomoc¹ tego testu.
Nastêpuj¹ce leki nie interferuj¹ z oznaczeniem iloœciowym HIV-1 RNA za
pomoc¹ testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5:
Inhibitory proteazy HIV
• Indinawir
• Ritonawir
• Nelfinawir
• Sakwinawir
Nienukleozydowe inhibitory
odwrotnej transkryptazy
• HBY 097
• Newirapina
• Delawirdyna
Inhibitory odwrotnej transkryptazy
nukleozydu HIV
• Zydowudyna
• Didanozyna
• Zalcytabina
• Stawudyna
• Lamiwudyna
Zwi¹zki stosowane w leczeniu CMV
• Gancyklowir
• Walinian gancyklowiru
Ocena dzia³ania poza zastosowaniami klinicznymi
Opis badania
Granica detekcji, dok³adnoœæ i zakres liniowy testu COBAS AMPLICOR HIV-1
MONITOR, v1.5, okreœlono za pomoc¹ analizy rozcieñczeñ seryjnych
szczegó³owo poznanej hodowli macierzystej wirusa HIV-1 w HIV-ujemnym
osoczu ludzkim. Wirus zosta³ dostarczony przez Laboratorium kontroli jakoœci
wirusologicznej (Virology Quality Assurance, VQA) grupy ds. badañ klinicznych
AIDS (AIDS Clinical Trials Group, ACTG), wydzia³u ds. AIDS Narodowych
instytutów zdrowia (National Institutes of Health, NIH) w Bethesda, Maryland,
USA. Stê¿enie wirusowego RNA w hodowli macierzystej oszacowano za pomoc¹
mikroskopii elektronowej, stê¿enia antygenu p24, oraz testu AMPLICOR HIV-1
MONITOR, a tak¿e analizy rozga³êzionych ³añcuchów DNA. Wszystkie metody
przynios³y porównywalne wyniki36. Przygotowanie próbek oraz analizê za
pomoc¹ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzono
wewn¹trz laboratorium. Panel seryjnych rozcieñczeñ analizowano ka¿dego
spoœród dwunastu dni, za pomoc¹ standardowej oraz ultraczu³ej procedury
przygotowania próbki z dwoma seriami testu COBAS AMPLICOR HIV-1
MONITOR, v1.5.
Granica detekcji
W badaniach przytoczonych powy¿ej wykazano, ¿e test COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR, v1.5, po ultraczu³ym przygotowaniu próbki, umo¿liwia
wykrycie w osoczu HIV-1 RNA zwi¹zanego z wirionem w stê¿eniach nawet tak
ma³ych, jak 50 kopii RNA na mililitr, z odsetkiem wyników dodatnich wiêkszym
ni¿ 95% oraz w stê¿eniach tak ma³ych jak 400 kopii RNA na mililitr z odsetkiem
wyników dodatnich wiêkszym ni¿ 95%, stosuj¹c standardow¹ procedurê
przygotowania próbki (tabela 2), zak³adaj¹c, ¿e OD wybranych pojemników
D-cup znajduje siê w okreœlonym zakresie OD (0,15-2,00).
31/52
Tabela 2
Granica wykrywalnoœci testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5
Standardowe przygotowanie próbki
Ultraczu³e przygotowanie próbki
Nominalna wartoœæ
Nominalna wartoœæ
wejœciowa
Liczba
Liczba Dodatnich
wejœciowa
Liczba
(HIV-1 RNA
powtórzeñ odsetek
(HIV-1 RNA
powtórzeñ
kopie/ml)
kopie/ml)
Liczba Dodatnich
odsetek
850 000
36
36
100%
100 000
36
36
100%
750 000
36
36
100%
75 000
36
36
100%
650 000
36
36
100%
50 000
36
36
100%
500 000
36
36
100%
35 000
36
36
100%
350 000
36
36
100%
25 000
35
35
100%
100 000
36
36
100%
5000
35
35
100%
35 000
36
36
100%
1000
36
36
100%
7000
36
36
100%
400
32
32
100%
2000
36
36
100%
100
36
36
100%
600
36
36
100%
80
36
36
100%
500
48
46
96%
60
36
35
97%
400
36
36
100%
50
36
35
97%
250
36
29
81%
40
36
32
89%
175
36
27
75%
25
36
29
81%
Dok³adnoœæ
Dok³adnoœæ wewn¹trzseryjn¹ oraz ca³kowit¹ oceniono zgodnie z metodyk¹
okreœlon¹ w wytycznych CLSI EP5-T2, „Ocena dok³adnoœci dzia³ania urz¹dzeñ
do testów chemicznych w zastosowaniach klinicznych” („Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices”). Procedura ta dopuszcza
oznaczenie dok³adnoœci wewn¹trzseryjnej i ca³kowitej poprzez przeprowadzenie
pojedynczego badania obejmuj¹cego wiele dni i wielu u¿ytkowników. Seriê
sk³adaj¹c¹ siê z 3 powtórzeñ ka¿dej próbki przeprowadzano codziennie przez
12 dni. Ka¿d¹ próbkê przeprowadzono poprzez ca³¹ procedurê testu COBAS
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, w tym przygotowanie próbki, odwrotn¹
transkrypcjê, amplifikacjê i detekcjê. Dlatego przedstawiana tutaj dok³adnoœæ
odzwierciedla wszystkie aspekty procedury testu. Wyniki pochodz¹ce z badania
dotycz¹cego dok³adnoœci przedstawiono w tabelach 3 oraz 4.
Tabela 3
Dok³adnoœæ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 standardowa
procedura przygotowania próbki
Próbka
Próbka 1 Próbka 2
Próbka 3
Próbka 4
Ca³kowita liczba powtórzeñ
36
36
36
36
Przeciêtne miano HIV-1 RNA
(kopie/ml)
705
10 056
162 119
535 083
Odchylenie standardowe
341
3082
44 188
148 708
CV
48%
31%
27%
28%
340
2916
53 556
190 702
CV
48%
29%
33%
36%
Wewn¹trz serii
Ogó³em
32/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 4
Dok³adnoœæ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 ultraczu³a
procedura przygotowania próbki
Próbka
Próbka 1
Próbka 2
Próbka 3
Próbka 4
Ca³kowita liczba powtórzeñ
36
36
35*
36
Przeciêtne miano HIV-1 RNA
(kopie/ml)
84
1045
5578
39 825
44
331
823
12 451
52%
32%
15%
31%
39
382
1350
12 074
47%
37%
24%
30%
Wewn¹trz serii
CV
Ogó³em
CV
* Dla próbki 3 uzyskano jeden wynik niewa¿ny QS; nie w³¹czono go do obliczenia
dok³adnoœci.
Zakres liniowy
Tak jak przedstawiono na rysunku 3, wykazano, ¿e test COBAS AMPLICOR HIV-1
MONITOR, v1.5 przynosi odpowiedŸ liniow¹ od 50 (Log10 = 1,70) HIV-1 RNA
kopii/ml do co najmniej 100 000 (Log10 = 5,00) HIV-1 RNA kopii/ml, podczas
stosowania ultraczu³ej procedury przygotowania próbki oraz od 400 (Log10 = 2,60)
HIV-1 RNA kopii/ml do co najmniej 750 000 (Log10 = 5,87) HIV-1 RNA kopii/ml,
podczas stosowania standardowej procedury przygotowania próbki. Ponadto
zaobserwowano siln¹ zale¿noœæ pomiêdzy standardow¹ i ultraczu³¹ procedur¹
przygotowania próbki we wspólnym zakresie liniowym testu COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR, v1.5, tj. 400 do 100 000 kopii/ml.
7,0
Standardowe przygotowanie próbki
y = -0,16731 + 1,06x R = 0,99912
Ultraczułe przygotowanie próbki
y = -0,18823 + 1,0465x R = 0,99946
6,0
5,0
4,0
3,0
10
Wynik testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, wersja 1.5
Log (HIV-1 RNA kopie/ml)
Rysunek 3
Liniowoœæ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 standardowa
i ultraczu³a procedura przygotowania próbki
2,0
1,0
Słupki błędu - 1 odchylenie standardowe
N = 27 do 36
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Stężenie nominalne
Log (HIV-1 RNA kopie/ml)
10
33/52
Zakres zdolnoœci diagnostycznej
(dzia³anie na podtypach grupy M)
Izolaty HIV-1, które zebrano na ca³ym œwiecie, wykazuj¹ istotne zró¿nicowanie
genetyczne; mog¹ byæ klasyfikowane do grup filogenetycznych w oparciu
o sekwencjê nukleotydów38,39. Grupa M (major – g³ówna) zawiera zdecydowan¹
wiêkszoœæ izolatów HIV-1; grupa O (outliers – pozosta³e) reprezentuje niewielk¹
liczbê izolatów, pochodz¹cych w wiêkszoœci z Kamerunu i Gabonu. Grupê M
mo¿na dalej podzieliæ na co najmniej 9 podtypów (lub kladów), które oznacza siê
literami od A do I.
Dzia³anie testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, w przypadku
podtypów grupy M oceniono analizuj¹c 30 dobrze poznanych hodowanych
izolatów HIV-1, reprezentuj¹cych podtypy od A do G (patrz tabela 5). Ka¿dy
izolat hodowano in vitro. Stê¿enia hodowli macierzystej wirusa oceniono
obliczaj¹c liczbê cz¹steczek w mikroskopie elektronowym, zgodnie z metod¹
Layne i wsp.40 Ka¿da hodowla macierzysta wirusa zosta³a rozcieñczona
w ujemnym osoczu ludzkim do stê¿enia wynosz¹cego w oko³o 12 500 oraz 1250
cz¹steczek wirusa/ml. Ka¿de rozcieñczenie hodowli macierzystej wirusa
analizowano w jednym laboratorium, w trzech powtórzeniach, wykorzystuj¹c
zarówno standardow¹, jak i ultraczu³¹ procedurê przygotowania próbki.
Poniewa¿ ka¿da cz¹stka wirusa zawiera dwa genomy wirusowe, oczekiwane
stê¿enia HIV RNA wynosz¹ w przybli¿eniu 25 000 kopii/ml i 2500 kopii/ml.
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, przyniós³ równowa¿ne
wyniki dla wszystkich 30 izolatów; liczby kopii dla wszystkich badanych
podtypów by³y zgodne pomiêdzy sob¹ oraz zgodne z oczekiwan¹ liczb¹ cz¹stek
wirusa (patrz rysunek 4). Dla próbek zawieraj¹cych 25 000 kopii/ml, œredni
wynik dla standardowej procedury przygotowania próbki wynosi³ 43 906
kopii/ml z 4,5-krotnym zakresem (od 18 567 do 82 917 kopii/ml) oraz dla
ultraczu³ej procedury przygotowania próbki – 29 019 kopii/ml z 6,3-krotnym
zakresem (do 12 233 do 77 250 kopii/ml). Dla próbek zawieraj¹cych 2500
kopii/ml œredni wynik dla standardowej procedury przygotowania próbki wynosi³
4045 kopii/ml z 6,4-krotnym zakresem (od 1379 do 8807 kopii/ml) oraz dla
ultraczu³ej procedury przygotowania próbki – 3710 kopii/ml z 5,7-krotnym
zakresem (do 1390 do 7977 kopii/ml).
Powy¿sze wyniki wskazuj¹ na siln¹ korelacjê pomiêdzy standardow¹ i ultraczu³¹
procedur¹ przygotowania próbki. Nie badano izolatów grupy O. Dzia³anie testu
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 wobec izolatów grupy O nie jest
znane.
34/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 5
Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 badanie zdolnoœci
diagnostycznej dla podtypów – badane izolaty HIV-1
Izolat
Kraj
izolacji
Podtyp
Pozycja piœmiennictwa
Numer akcesyjny
do GenBank
UG273
Uganda
A
43
L22957
DJ258
D¿ibuti
A
41, 43
L11763, L22939
DJ263
D¿ibuti
A
43, 47
AF063223, L22941
US1
USA
B
44
L14573
US2
USA
B
44
L14574
US3
USA
B
44
L14575
US4
USA
B
44
L14576
CM237
Tajlandia
B
44
L14570
BK132
Tajlandia
B
45
L03696, L03697
BZ167
Brazylia
B
41, 42
L11752, L22087
ZAM18
Zambia
C
43, 46, 50
L03705, L22945
UG268
Uganda
C
41, 43, 46
L11799, L22948
ETH2220
Etiopia
C
46, 52
U46016
SE364
Senegal
C
43
L22944
SM145
Somalia
C
41, 43
L11803, L22946
SE365
Senegal
D
41, 43
L11797, L22945
UG270
Uganda
D
41
L11800
UG274
Uganda
D
41, 43, 46
L11801, L22950
CM235
Tajlandia
E
45
L03698
CM238
Tajlandia
E
41, 44
L11760, L14571
CM240
Tajlandia
E
41, 44, 48
U54771, L11761, L14572
L03702, L03703
CM243
Tajlandia
E
45
POC30506
Tajlandia
E
46, 49
U48272
ID12
Indonezja
E
46, 51
U68193
ID17
Indonezja
E
46, 51
U68191
NP1465
Tajlandia
E
46
nie jest w GenBanku
BZ126
Brazylia
F
42
L22083, L22082
BZ162
Brazylia
F
41, 42
L11751, L22084
BZ163
Brazylia
F
42
L22086, L22085
HH8793
Kenia
G
46, 47
AF061640
35/52
BZ163 / F
HH8793 / G
BZ162 / F
BZ126 / F
ID17 / E
NP1465 / E
ID12 / E
CM243 / E
POC30506 / E
CM240 / E
CM238 / E
UG274 / D
CM235 / E
SE365 / D
UG270 / D
SE364 / C
1
SM145 / C
10
UG268 / C
2
ETH2220 / C
10
BZ167 / B
3
ZAM18 / C
10
BK132 / B
4
US4 / B
10
CM237 / B
5
US3 / B
10
US2 / B
6
US1 / B
10
Ultraczuła - 2 500 k/ml
Ultraczuła - 25 000 k/ml
Standardowa - 2 500 k/ml
Standardowa - 25 000 k/ml
DJ263 / A
7
DJ258 / A
10
UG273 / A
Wynik testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, wersja 1.5
(HIV-1 RNA kopie/ml)
Rysunek 4
Dzia³anie testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5,
na podtypy HIV-1 od A do G
Izolat i podtyp
Swoistoœæ kliniczna
Swoistoœæ kliniczn¹ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5,
ustalono za pomoc¹ analizy anty-HIV-1 ujemnych dawców krwi. Ogó³em,
stosuj¹c standardow¹ procedurê przygotowania próbki, zbadano 507 próbek
z dodatkiem antykoagulantu EDTA (267) lub ACD (240); natomiast stosuj¹c
ultraczu³¹ procedurê przygotowania próbki zbadano 504 próbki z dodatkiem
antykoagulantu EDTA (307) lub ACD (197). W badaniu tym zastosowano trzy
serie testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5. Wszystkie próbki by³y
ujemne dla HIV-1 RNA w przypadku procedury standardowej, a 503 próbki by³y
ujemne w przypadku procedury ultraczu³ej. Jedna próbka, która w przypadku
ultraczu³ej procedury przygotowania próbki by³a dodatnia dla HIV-1 RNA,
charakteryzowa³a siê wartoœci¹ HIV A660 w pojemniku D-cup bez
zanieczyszczenia wynosz¹c¹ 0,156 (patrz tabela 6). Po podwójnym powtórzeniu
badania tej próbki za pomoc¹ procedury ultraczu³ej, oba powtórzenia przynios³y
wyniki ujemne (HIV A660 w pojemniku D-cup bez zanieczyszczenia = 0,002
i 0,002). Zak³adaj¹c, ¿e u seroujemnych dawców krwi czêstoœæ wystêpowania
zaka¿enia HIV-1 wynosi zero, swoistoœæ kliniczna testu COBAS AMPLICOR
HIV-1 MONITOR, v1.5 i standardowej obróbki próbki wynosi 100%,
a ultraczu³ej obróbki próbki – 99,8%.
Tabela 6
Swoistoœæ kliniczna testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5
Anty-HIV-1 ujemni dawcy krwi
Procedura
przygotowania
próbki
Standardowa
Ultraczu³a
36/52
N
507
504
HIV-1 RNA
kopie/ml
Nie wykryto
507
503
Dodatnie
0
1
HIV-1 A660
(w rozcieñczeniu bez zanieczyszczenia
w pojemniku detekcyjnym D-cup)
Minimum Przeciêtnie Maksimum
SD
0,000
0,004
0,082
0,006
0,000
0,005
0,156
0,010
HIV-1 MONITOR
Swoistoœæ analityczna
Swoistoœæ analityczn¹ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5,
oceniono dodaj¹c hodowane komórki, hodowane wirusy lub oczyszczone kwasy
nukleinowe z organizmów i wirusów wymienionych w tabeli 7 do HIV ujemnego
osocza ludzkiego (po etapie A.6. “Instrukcji u¿ytkowania”). Ka¿d¹ próbkê
analizowano za pomoc¹ testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, po
standardowej obróbce próbki. Dla ¿adnego spoœród organizmów, wirusów lub
oczyszczonych kwasów nukleinowych innych ni¿ HIV nie uzyskano wyniku
dodatniego w kierunku RNA HIV-1. Dwa spoœród czterech badanych izolatów
HIV-2 (7824A i 60415K) przynios³y wyniki dodatnie; niemniej nie mo¿na
wypowiedzieæ siê o zdolnoœci tego testu do amplifikacji izolatów HIV-2.
Tabela 7
Próbki swoistoœci analitycznej
Adenowirus typ 2
Adenowirus typ 3
Adenowirus typ 7
Cytomegalowirus AD-169
Cytomegalowirus Davis
Cytomegalowirus Towne
Wirus Epstein-Barr P-3
(komórki ch³oniaka Burkitta)
Wirus Epstein-Barr HR1
(komórki ch³oniaka Burkitta)
Wirus Epstein-Barr
(komórki ch³oniaka Burkitta RAJI)
Varicella-Zoster Ellen
Varicella Oka
Wirus zapalenia w¹troby typu B
Wirus zapalenia w¹troby typu C genotyp 1a
Wirus zapalenia w¹troby typu C genotyp 1b
Wirus zapalenia w¹troby typu C genotyp 2b
Wirus zapalenia w¹troby typu C genotyp 3a
Wirus zapalenia w¹troby typu C genotyp 4c
HIV-2 BEN
HIV-2 podtyp A/B (izolat 7312A)
HIV-2 podtyp A/B (izolat 7824A)
HIV-2 podtyp A/B (izolat 60415K)
Ludzki wirus Herpes 6
Ludzki wirus Herpes 7
Herpes simplex typ 1,F
Herpes simplex typ 1, HF
Herpes simplex typ 1, McIntyre
Herpes simplex typ 2, G
Herpes simplex typ 2, MS
Ludzki wirus papilloma 6B
Ludzki wirus papilloma 11
Komórki HTLV-1 MT-2
Komórki HTLV-1 MoT
Mycobacterium avium
Pneumocystis carinii
Propionibacterium acnes
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Dzia³anie w porównaniu
z testem AMPLICOR HIV-1
MONITOR, v1.5
Dzia³anie testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz AMPLICOR
HIV-1 MONITOR, v1.5 porównano analizuj¹c próbki osocza pochodz¹ce od
pacjentów zaka¿onych HIV-1. Próbki pozyskano od firmy Bioclinical Partners,
Inc. (Franklin, MA, USA). Dla próbek tych nie znano wczeœniej wyników testu
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, ponadto przyjêto, ¿e nale¿¹ one do podtypu B.
Ogó³em 289 próbek porównano, wykorzystuj¹c standardow¹ procedurê
przygotowania testu; 332 próbki porównano, wykorzystuj¹c ultraczu³¹ procedurê
przygotowania próbki. Korelacjê ustalono za pomoc¹ próbek, dla których wyniki
iloœciowe uzyskano pos³uguj¹c siê zarówno testem COBAS AMPLICOR, jak
i AMPLICOR HIV-1 MONITOR (225 próbek – standardowa procedura
przygotowania próbki oraz 259 próbek – ultraczu³a procedura przygotowania
próbki). Dla tych próbek, które przynios³y wyniki w zakresie liniowym
standardowej procedury przygotowania próbki (400-750 000 kopii/ml), jak
przedstawiono na rysunku 5, oraz w zakresie liniowym ultraczu³ej procedury
przygotowania próbki (50-100 000 kopii/ml), jak przedstawiono na rysunku 6,
przeprowadzono analizê regresji. Wyniki uzyskane za pomoc¹ testu COBAS
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5,
by³y bardzo dobrze skorelowane dla ka¿dej procedury przygotowania próbki.
37/52
Rysunek 5
Korelacja testów COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzanych na próbkach osocza
pochodz¹cych od pacjentów zaka¿onych HIV-1 standardowa procedura
przygotowania próbki
10
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log HIV-1 RNA-kopie/ml
7,0
y = 0,33206 + 0,95588x R = 0,93668
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log HIV-1 RNA-kopie/ml
10
Rysunek 6
Korelacja testów COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 oraz
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, przeprowadzanych na próbkach osocza
pochodz¹cych od pacjentów zaka¿onych HIV-1 ultraczu³a procedura
przygotowania próbki
7,0
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log10HIV-1 RNA-kopie/ml
y = 0,27412 + 0,93427x R = 0,91887
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
Log 10 HIV-1 RNA-kopie/ml
38/52
HIV-1 MONITOR
Skutecznoœæ kliniczna
Analizê obci¹¿enia organizmu wirusem w opisanych ni¿ej badaniach
przeprowadzono za pomoc¹ testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Badania te
przeprowadzono w USA; u wszystkich uczestnicz¹cych w nich pacjentów
oczekiwano zaka¿enia podtypem B HIV-1. Skutecznoœæ kliniczn¹ testu COBAS
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, mo¿na by³o ustaliæ na podstawie tych
badañ wówczas, gdy wykazano, ¿e test AMPLICOR HIV-1 MONITOR oraz test
COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 maj¹ równowa¿ne dzia³anie
(z wyj¹tkiem podtypów HIV-1 innych ni¿ B) i przynosz¹ równowa¿ne wyniki dla
próbek zawieraj¹cych podtyp B (dane w pliku).
Rokowanie
Stosowanie testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR w celu przewidywania progresji
choroby u osób zaka¿onych HIV oceniano w badaniach ACTG 116A i 116B/117.
Dane uzyskane w tych badaniach analizowano za pomoc¹ modelu hazardów
proporcjonalnych Coxa, w celu oceny czêstoœci progresji choroby w oparciu
o poziom HIV-1 RNA. Badanie ACTG 116A mia³o charakter badania z podwójn¹
œlep¹ prób¹, w którym porównywano skutecznoœæ kliniczn¹ zydowudyny (ZDV)
w po³¹czeniu z dwoma dawkami 2',3'-dideoksyinozyny (ddI) u pacjentów
z aawansowan¹ chorob¹ wywo³ywan¹ przez HIV, u których wczeœniej, nie d³u¿ej ni¿
przez 16 tygodni, stosowano leczenie zydowudyn¹. Badanie ACTG 116B/117 mia³o
charakter badania skutecznoœci, w którym porównywano leczenie za pomoc¹
2',3'-dideoksyinozyny (ddI) oraz zydowudyny u pacjentów zaka¿onych HIV,
u których wczeœniej stosowano leczenie zydowudyn¹ d³u¿ej ni¿ 16 tygodni.
Populacja pacjentów uczestnicz¹cych w ka¿dym z tych badañ obejmowa³a osoby, u
których na pocz¹tku badania rozpoznano AIDS, zespó³ zwi¹zany z AIDS (AIDS
related complex, ARC) oraz osoby bezobjawowe. Progresjê choroby zdefiniowano
jako przejœcie do AIDS, nowe zdarzenie w przebiegu AIDS lub zgon.
Badanie sk³adowe ACTG 116A HIV-1 RNA obejmowa³o 186 pacjentów
pochodz¹cych z badania klinicznego, u których w chwili w³¹czenia do badania
pobrano próbki osocza oraz PBMC, a nastêpnie przechowywano je w odpowiedni
sposób; ponadto próbki te musia³y byæ dostêpne dla analizy. Badanie sk³adowe
ACTG 116B/117 HIV-1 RNA obejmowa³o 99 wybranych losowo pacjentów
pochodz¹cych z badania leku, u których w chwili w³¹czenia do badania pobrano
próbki osocza, a nastêpnie przechowywano je w odpowiedni sposób; ponadto
próbki te musia³y byæ dostêpne dla analizy.
Niedostosowane i dostosowane hazardy wzglêdne dla progresji choroby, które
mierzono odwo³uj¹c siê do pocz¹tkowych poziomów HIV-1 RNA, zmian poziomów
HIV-1 RNA w ci¹gu 8 tygodni oraz liczby komórek CD4+, oceniano za pomoc¹
modeli hazardów proporcjonalnych Coxa. Nieskorygowany hazard wzglêdny
reprezentuje ryzyko zwi¹zane tylko ze zmienn¹, natomiast dostosowany hazard
wzglêdny reprezentuje ryzyko zwi¹zane z t¹ zmienn¹ po uwzglêdnieniu innych
zmiennych w modelu. Modele te wskazuj¹ na zwiêkszone ryzyko (je¿eli tylko jest
jakiekolwiek ryzyko) progresji choroby w zwi¹zku ze zmiennymi wprowadzonymi
do modelu. Analizy te przeprowadzono oceniaj¹c hazardy wzglêdne dla 5-krotnej
ró¿nicy wartoœci badanej zmiennej. Wyniki analiz przedstawiono w tabelach 8-11.
Dane, które siê w nich znajduj¹, wskazuj¹, ¿e w populacji pacjentów
z zaawansowan¹ chorob¹ wywo³ywan¹ przez HIV, otrzymuj¹cych swoiste leczenie
przeciwko odwrotnej transkryptazie, 5-krotne zwiêkszenie pocz¹tkowych
poziomów HIV-1 RNA wi¹¿e siê ze zwiêkszeniem ryzyka progresji choroby.
U pacjentów, którzy otrzymywali wczeœniej ZDV d³u¿ej ni¿ przez 16 tygodni
(uczestnicy badania ACTG 116B/117), 5-krotne zwiêkszenie pocz¹tkowych
poziomów HIV-1 RNA nie mia³o statystycznie znamiennej wartoœci
prognostycznej. U pacjentów, którzy wczeœnie nie otrzymywali ZDV lub ich
leczenie za pomoc¹ ZDV trwa³o nie d³u¿ej ni¿ 16 tygodni, 5-krotne zwiêkszenie
poziomów RNA pomiêdzy pocz¹tkiem badania a 8 tygodniem posiada³o
statystycznie znamienn¹ wartoœæ prognostyczn¹. U pacjentów, którzy otrzymywali
39/52
wczeœniej ZDV d³u¿ej ni¿ 16 tygodni, nie udowodniono, aby 5-krotne zwiêkszenie
poziomów RNA pomiêdzy pocz¹tkiem badania a 8 tygodniem posiada³o
statystycznie znamienn¹ wartoœæ prognostyczn¹.
Czêstoœæ wystêpowania progresji choroby analizowano tak¿e dla ka¿dego badania,
dziel¹c ka¿d¹ populacjê badan¹ na decyle, jak kwalifikator wykorzystuj¹c
pocz¹tkowy poziom HIV-1 RNA. Dla poszczególnych decyli oceniono czêstoœæ
progresji choroby. W ka¿dym badaniu stwierdzono, ¿e czêstoœæ wystêpowania
progresji choroby wynosi³a 60% dla wszystkich pacjentów, u których pocz¹tkowy
poziom HIV-1 RNA przekracza³ 250 000 kopii/ml. W badaniu 116A stwierdzono,
¿e czêstoœæ progresji u pacjentów znajduj¹cych siê w pierwszych 4 decylach
(< 11 912, < 34 661, < 72 438 i < 103 806 HIV-1 RNA kopii/ml) wynosi³a 35%.
W kolejnych trzech decylach (< 15 695, < 194 312 i < 247 229) czêstoœæ
wystêpowania progresji wynosi³a pomiêdzy 40% a 50%. W ostatnich trzech
decylach, w których poziom HIV-1 RNA wynosi³ > 250 000 HIV-1 RNA kopii/ml,
czêstoœæ wystêpowania progresji choroby przekracza³a 60%. W badaniu 116B/117
stwierdzono, ¿e czêstoœæ wystêpowania progresji choroby by³a bardziej zmienna,
lecz nadal wykazywa³a ogólny trend do wiêkszego ryzyka progresji u osób
z wiêkszymi poziomami HIV-1 RNA. W badaniu tym odsetek progresji wynosi³
przeciêtnie 30% (zakres = 10-60%) w pierwszych 6 decylach (< 11 571,
< 31 292, < 49 743, < 62 132, < 97 781 i < 150 866). Dla kolejnych dwóch decyli
(< 251 627 i < 403 146) odsetek progresji zwiêksza³ siê odpowiednio do 50% lub
60%. Dla ostatnich dwóch decyli (< 794 027 i < 1 456 302), w których poziom
HIV-1 RNA by³ wiêkszy ni¿ 403 000, odsetek progresji przekracza³ 80%. Na
rysunkach 7 i 8 przedstawiono tabele zbiorcze oraz wykresy s³upkowe dla
powy¿szych analiz.
Pomiar odpowiedzi na leczenie
przeciwko retrowirusom
Zastosowanie testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR w celu pomiaru skutecznoœci
leczenia przeciwretrowirusowego oceniono w badaniu klinicznym leków
przeciwko retrowirusom, w tym inhibitora odwrotnej transkryptazy, zalcytabiny
(ddC, nazwa handlowa HIVID), inhibitora proteazy, sakwinawiru (SAQ, nazwa
handlowa INVIRASE), oraz po³¹czeñ tych dwóch leków. Badanie NV14256
mia³o charakter badania z randomizacj¹, fazy III, z podwójn¹ œlep¹ prób¹,
którego pierwotnym celem by³a ocena bezpieczeñstwa, tolerancji oraz
skutecznoœci trzech sposobów leczenia (ddC, SAQ oraz SAQ z ddC), w oparciu
o kliniczne punkty koñcowe u pacjentów przerywaj¹cych (lub takich, którzy nie
mogli stosowaæ) leczenie za pomoc¹ zydowudyny (ZDV). Ponadto zamierzano
porównaæ prze¿ycia pomiêdzy trzema badanymi grupami (w tym zgony po
zdarzeniu zwi¹zanym z AIDS oraz toksycznoœæ ograniczaj¹c¹ wielkoœæ dawki).
W badaniu NV14256 wczeœniejsze leczenie za pomoc¹ ZDV stanowi³o kryterium
w³¹czenia; wiêkszoœæ pacjentów otrzymywa³a wczeœniej ZDV przez co najmniej
1 rok. Ogó³em do badania NV14256, w 49 oœrodkach, w³¹czono 970 pacjentów.
W badaniu zaplanowano nastêpuj¹ce trzy grupy pacjentów: ddC (325), sakwinawir
(327) oraz sakwinawir + ddC (318). Charakterystyka demograficzna oraz pocz¹tkowa
pacjentów uczestnicz¹cych w badaniu NV14256 odzwierciedla³a zró¿nicowanie
populacji pacjentów z zaawansowanym zaka¿eniem HIV-1, otrzymuj¹cych wczeœniej
szeroki zakres leczenia przeciwretrowirusowego.
Przydatnoœæ testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR do pomiaru skutecznoœci
leczenia w czasie oceniono analizuj¹c medianê zmiany poziomu HIV-1 RNA
pomiêdzy wartoœci¹ pocz¹tkow¹ a uœrednion¹ ró¿nic¹ w czasie (DAVGt – œrednia
zmiana pomiêdzy wartoœci¹ pocz¹tkow¹, a wartoœci¹ po liczbie t tygodni). W celu
oceny zdolnoœci testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR do detekcji zmian
w poziomach HIV-1 RNA w wyniku leczenia, analizowano medianê zmiany od
wartoœci pocz¹tkowej w czasie dla ka¿dej badanej grupy. Na rysunku
9 przedstawiono medianê zmiany od wartoœci pocz¹tkowej dla ka¿dej badanej
grupy w badaniu NV14256 w ci¹gu 48 tygodni. Zaobserwowano mo¿liwe do
zmierzenia i trwa³e zmniejszenie poziomów HIV-1 RNA, oznaczone za pomoc¹
testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Najwiêksz¹ i najbardziej trwa³¹ zmianê
40/52
HIV-1 MONITOR
poziomów HIV-1 RNA dla ka¿dego punktu czasowego stwierdzono u pacjentów
otrzymuj¹cych leczenia wielolekowe (SAQ + ddC).
Przydatnoœæ seryjnych pomiarów HIV-1 RNA do oceny odpowiedzi
wirusologicznej na leczenie przeciwko retrowirusom zbadano równie¿ stosuj¹c
model hazardów proporcjonalnych Coxa. W analizie tej po³¹czono trzy badane
grupy oraz dostosowano model Coxa stratyfikowany ze wzglêdu na grupy
terapeutyczne; jako wyra¿enia liniowe wykorzystano nastêpuj¹ce wspó³zmienne:
log10(pocz¹tkowy HIV-1 RNA), log10(ostatni HIV-1 RNA), pocz¹tkowy CD4
i ostatni CD4. W modelu tym ustalono wspó³czynnik hazardu jako 10-krotne
zwiêkszenie HIV-1 RNA lub zmniejszenie o 100 liczby CD4. Tak, jak
przedstawiono w tabeli 12, wspó³czynnik log10(ostatni HIV-1 RNA) wyra¿enia
dla tego modelu jest znamienny statystycznie i dodatni do 40 tygodnia. Zgodnie
z tym, wspó³czynniki hazardu HIV-1 RNA do 40 tygodnia wskazuj¹, ¿e poziomy
HIV-1 RNA w ka¿dym punkcie czasowym charakteryzuj¹ siê znamiennoœci¹
statystyczn¹ i posiadaj¹ ci¹g³¹ wartoœæ prognostyczn¹.
W analizie zale¿nej danych oceniono zwi¹zek pomiêdzy poziomami HIV-1 RNA
a czasem prze¿ycia. Dla potrzeb tej analizy czas prze¿ycia okreœlono jako czas
w badaniu, podczas którego u pacjenta nie wyst¹pi³y zdarzenia zwi¹zane z AIDS
lub zgon. Analizy wykonano wykreœlaj¹c krzywe prze¿ycia Kaplana i Meiera dla
ka¿dej badanej grupy, dziel¹c populacjê pacjentów w ka¿dej grupie na trzy czêœci
w oparciu o poziomy HIV-1 RNA (mniejszy, œredni, wiêkszy). Krzywe prze¿ycia
wykreœlono jako funkcjê odsetka prze¿ycia ADE dla ka¿dej grupy pacjentów
(mniejszy, œredni, wiêkszy poziom HIV-1 RNA) dla liczby tygodni po 8 tygodniu.
Szacunkowe analizy prze¿ycia Kaplana i Meiera wykazuj¹, ¿e pacjenci z ma³ymi
poziomami HIV-1 RNA maj¹ wiêksze prawdopodobieñstwo prze¿ycia bez ADE
przez d³u¿szy czas w porównaniu z pacjentami z du¿ymi poziomami HIV-1 RNA.
Na rysunkach 10, 11 i 12 przedstawiono krzywe Kaplana i Meiera dla ka¿dej
badanej grupy.
W oddzielnej analizie danych pochodz¹cych z badania NV14256, ryzyko ADE oraz
zgonu oceniono jako funkcjê ostatniego (wykonanego jako ostatni) pomiaru poziomu
HIV-1 RNA w ró¿nych tygodniach trwania badania. W szczególnoœci oceniano
wp³yw ostatniego pomiaru HIV-1 RNA na hazard wyst¹pienia pierwszego ADE lub
zgonu (w oparciu o zdarzenia kliniczne obserwowane póŸniej w badaniu). Analizê
przeprowadzono za pomoc¹ analizy prze¿ycia w modelu Cox, wykorzystuj¹c jako
wspó³zmienne log10(pocz¹tkowy HIV-1 RNA), log10(ostatni HIV-1 RNA),
pocz¹tkow¹ CD4 oraz ostatni¹ CD4. Model mia³ charakter funkcji liniowej
wspó³zmiennych wskazuj¹cych log hazardu (wspó³czynnika) dla ADE. Nastêpnie
wykorzystano funkcjê liniow¹ do ustalenia wskaŸnika ryzyka dla wszystkich
uczestników badania. Pacjenci, u których przez 4 tygodnie trwania badania nie
stwierdzono ADE, zostali uporz¹dkowani zgodnie z wskaŸnikiem ryzyka; pierwsza
grupa 25% uczestników utworzy³a grupê „ma³ego ryzyka”, natomiast pozosta³ych
pacjentów równo rozdzielono, przydzielaj¹c ich do szeœciu oddzielnych grup,
zgodnie z wskaŸnikiem ryzyka. Ka¿da spoœród tych szeœciu grup zosta³a nastêpnie
porównana z grup¹ ma³ego ryzyka za pomoc¹ modelu prze¿ycia; wykreœlono œredni
poziom HIV-1 RNA dla ka¿dej spoœród grup w porównaniu ze wspó³czynnikiem
hazardu dla ADE obliczonym za pomoc¹ cz¹stkowego modelu wyk³adniczego. Na
rysunkach 13 i 14 przedstawiono wspó³czynniki hazardu dla czasu do pierwszego
ADE w porównaniu z log10(ostatni HIV-1 RNA) dla pacjentów, u których w ci¹gu
4 tygodni nie stwierdzono ADE oraz pacjentów, u których w ci¹gu 16 tygodni nie
stwierdzono ADE. Powy¿sze dane wskazuj¹, ¿e uczestnicz¹cy w tym badaniu
pacjent, posiadaj¹cy w 4 tygodniu poziom HIV-1 RNA wynosz¹cy 100 000 kopii/ml
(log10 = 5,0) charakteryzowa³ siê 6-krotnie wiêkszym prawdopodobieñstwem
wyst¹pienia ADE lub zgonu ni¿ pacjent, którego poziom HIV-1 RNA wynosi³ 8 000
kopii/ml. Pacjent uczestnicz¹cy w tym badaniu, który 16 tygodniu posiada poziom
HIV-1 RNA wynosz¹cy 1 000 000 (log10 = 6,0), charakteryzowa³ siê 20-krotnie
wiêkszym prawdopodobieñstwem wyst¹pienia ADE lub zgonu ni¿ pacjent, które
poziom HIV-1 RNA wynosi³ 8000 kopii/ml.
41/52
Dane przedstawione tutaj, dotycz¹ce przydatnoœci klinicznej oraz zastosowania
testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR do monitorowania skutecznoœci leczenia
przeciwretrowirusowego uzyskano z jednego badania klinicznego, w którym
porównywano dwa leki oraz trzy sposoby leczenia szczególnej grupy chorych.
Z uwagi na to, ¿e jedno badanie kliniczne mo¿e niedok³adnie wykazywaæ
przydatnoœæ kliniczn¹ iloœciowego oznaczania HIV-1 RNA we wszystkich
populacjach pacjentów, we wszystkich sytuacjach klinicznych, lub ze wszystkimi
sposobami leczenia przeciwretrowirusowego, nale¿y zachowaæ w³aœciw¹
ostro¿noœæ przed objêciem dowolnego pacjenta interpretacj¹ danych z tego
badania. Podobnie jak w przypadku ka¿dego testu diagnostycznego, wyniki testu
AMPLICOR HIV-1 MONITOR nale¿y interpretowaæ z uwzglêdnieniem
wszystkich wyników badañ klinicznych i laboratoryjnych.
Tabela 8
Zale¿noœæ pomiêdzy badan¹ zmienn¹ na pocz¹tku badania a progresj¹ choroby – badanie ACTG 116A
(N = 153 pacjenti, 73 przypadków progresji)
Zmienna
Nieskorygowany hazard wzglêdny
(95% Cl)
Skorygowany hazard wzglêdny
(95% Cl)
Wartoœæ p2
Liczba kopii log HIV-1 RNA1
1,58 (1,20 - 2,09)
1,44 (1,07 - 1,93)
0,02
Log CD4+ liczba komórek1
0,39 (0,28 - 0,54)
2,00 (1,22 - 3,27)
0,95 (0,59 - 1,53)
0,45 (0,31 - 0,64)
1,39 (0,82 - 2,37)
1,12 (0,68 - 1,84)
0,0001
0,22
0,66
Rozpoznania AIDS na pocz¹tku
Leczenie z ddl
1 - Hazard wzglêdny jest to wspó³czynnik ryzyka wynikaj¹cy z 5-krotnego zwiêkszenia HIV-1-RNA lub
zmniejszenia liczby komórek CD4+
2 - Wartoœci p s¹ dla wartoœci skorygowanego ryzyka wzglêdnego
Tabela 9
Zale¿noœæ pomiêdzy zmian¹ HIV-1 RNA od wartoœci pocz¹tkowej do wartoœci w 8 tygodniu a progresj¹
choroby – badanie ACTG 116A
(N = 114 pacjentów, 62 przypadki progresji)
Zmienna
(95% Cl)
(95% Cl)
Wartoœæ p2
1,46 (1,11 - 1,93)
1,63 (1,16 - 2,28)
0,0005
Zmiana log HIV-1 RNA od wartoœci
pocz¹tkowej do 8. tygodnia1
Leczenie z ddl
1,18 (0,93 - 1,48)
1,54 (1,09 - 2,16)
0,013
0,43 (0,30 – 0,62)
1,83 (1,09 - 3,09)
0,76 (0,45 - 1,27)
0,50 (0,34 - 0,73)
1,28 (0,74 - 2,21)
0,87 (0,51 - 1,49)
0,0004
0,38
0,61
1 - Hazard wzglêdny to wspó³czynnik hazardu wynikaj¹cy z 5-krotnego zwiêkszenia HIV-1-RNA lub
2 - Wartoœci p s¹ dla wartoœci skorygowanego ryzyka wzglêdnego
Tabela 10
Zale¿noœæ pomiêdzy badanymi zmiennymi na pocz¹tku badania a progresj¹
choroby – badanie ACTG 116B/117
(N = 86 pacjentów, 39 przypadków progresji)
Zmienna
(95% Cl)
(95% Cl)
Wartoœæ p2
1,90 (1,28 - 2,82)
1,25 (0,81 - 1,94)
0,32
0,28 (0,16 - 0,48)
3,13 (1,66 - 5,92)
0,89 (0,47 - 1,69)
0,33 (0,18 - 0,62)
2,38 (1,24 - 4,58)
0,88 (0,46 - 1,71)
0,0006
0,01
0,71
Leczenie z ddl
2 - Wartoœci p s¹ dla wartoœci skorygowanego hazardu wzglêdnego
42/52
HIV-1 MONITOR
Tabela 11
Zale¿noœæ pomiêdzy zmian¹ HIV-1 RNA od wartoœci pocz¹tkowej do wartoœci w 8 tygodniu a progresj¹
choroby – badanie ACTG 116B/117
(N = 65 pacjentów, 29 przypadków progresji)
Nieskorygowany hazard wzglêdny Skorygowany hazard wzglêdny
(95% Cl)
(95% Cl)
Zmienna
Wartoœæ p2
2,10 (1,32 - 3,34)
Zmiana log HIV-1 RNA od wartoœci
pocz¹tkowej do 8. tygodnia1
Leczenie z ddl
1,41 (0,71 - 2,79)
1,58 (0,68 - 3,68)
0,29
0,25 (0,13 – 0,46)
2,43 (1,17 - 5,05)
1,07 (0,51 - 2,27)
0,29 (0,14 - 0,60)
1,87 (0,88 - 3,97)
0,98 (0,39 - 2,48)
0,001
0,10
0,96
1,58 (0,93 - 2,69)
0,09
2 - Wartoœci p s¹ dla wartoœci skorygowanego hazardu wzglêdnego
Rysunek 7
Czêstoœæ wystêpowania progresji choroby w zale¿noœci od pocz¹tkowego
poziomu HIV-1 RNA – badanie 116A
Progresja choroby w porównaniu z początkowym poziomem HIV-1 RNA
Progresja choroby (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
<2 162 193
<775 841
<417 316
<247 229
<194 312
<150 695
<103 806
<72 438
<34 661
<11 912
0
Początkowy poziom HIV-1 RNA (kopie/ml)
Numer rejestru
Decyl
n=
Liczba progresji
Liczba progresji do AIDS/zgon
%
18
36
54
72
90
108
126
144
162
179
< 11 912
< 34 661
< 72 438
< 103 806
< 150 695
< 194 312
< 247 229
< 417 316
< 775 841
< 2 162 193
18
18
18
18
18
18
18
18
18
17
15
14
17
14
16
16
14
16
17
14
5
5
6
5
7
8
6
10
12
9
33,33
35,71
35,29
35,71
43,75
50,00
42,86
62,50
70,59
64,29
43/52
Rysunek 8
Czêstoœæ wystêpowania progresji choroby w zale¿noœci od pocz¹tkowego
poziomu HIV-1 RNA – badanie 116B/117
Progresja choroby w porównaniu z początkowym poziomem HIV-1 RNA
Progresja choroby (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
< 1 456 302
< 794 027
< 403 146
< 251 627
< 150 866
< 97 781
< 62 132
< 49 743
< 31 292
< 11 571
0
Początkowy poziom HIV-1 RNA (kopie/ml)
Numer rejestru
Decyl
n=
Liczba progresji
Liczba progresji do AIDS/zgon
%
10
20
30
40
50
60
70
80
90
96
< 11 571
< 31 292
< 49 743
< 62 132
< 97 781
< 150 866
< 251 627
< 403 146
< 794 027
< 1 456 302
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
10
10
10
10
10
10
10
10
10
6
4
2
3
6
1
3
5
6
9
5
40,00
20,00
30,00
60,00
10,00
30,00
50,00
60,00
90,00
83,33
Rysunek 9
Mediany zmian HIV-1 RNA od wartoœci pocz¹tkowych w ci¹gu
48 tygodni – badanie NV14256
Tydzień 4
n1 = 98
n2 = 91
n3 = 92
Tydzień 8
n1 = 90
n2 = 85
n3 = 91
Tydzień 12
n1 = 89
n2 = 88
n3 = 85
Tydzień 16
n1 = 93
n2 = 81
n3 = 86
Tydzień 24
n1 = 86
n2 = 83
n3 = 84
Tydzień 32
n1 = 71
n2 = 73
n3 = 79
Tydzień 40
n1 = 63
n2 = 71
n3 = 69
Tydzień 48
n1 = 52
n2 = 62
n3 = 56
Tydzień 40
Tydzień 48
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
Tydzień 4 Tydzień 8 Tydzień 12 Tydzień 16
ZDV+ddC
44/52
Tydzień 24
Tydzień 32
SAQ 600mg+ZDV
SAQ 600mg+ZDV+ddC
HIV-1 MONITOR
Tabela 12
Ryzyko ADE w porównaniu z Log10(ostatni RNA) oraz innymi wspó³czynnikami w oparciu
o czas od danego tygodnia badania dla pacjentów prze¿ywaj¹cych ten tydzieñ
Podsumowanie wyników modelu Coxa – Model stratyfikowany zgodnie z badanymi
grupami – badanie NV14256
Tydzieñ badania
4
8
16
24
32
40
48
56
64
Zmienna
Wspó³czynnik modelu Coxa
WskaŸnik hazardu*
Wartoœæ p
log10(pocz¹tkowy RNA)
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
log10(ostatni RNA)
Pocz¹tkowy CD4
Ostatni CD4
0,798
0,4197
-0,0009
-0,0040
0,8096
0,4186
-0,0019
-0,0049
0,8714
0,5385
-0,0015
-0,0049
0,6910
0,7135
-0,0003
-0,0064
0,5926
0,9000
-0,0040
-0,0023
0,8003
0,7086
-0,0030
-0,0031
0,5993
0,5631
-0,0011
-0,0079
1,0917
0,0835
-0,0022
-0,0072
1,2803
-0,2500
0,0006
-0,0085
2,22
1,52
0,91
0,67
2,25
1,52
0,83
0,62
2,39
1,71
0,87
0,62
2,00
2,04
0,97
0,53
1,81
2,46
0,67
0,79
2,23
2,03
0,74
0,73
1,82
1,76
0,89
0,45
2,98
1,09
0,80
0,49
3,60
0,78
1,07
0,43
0,0012
0,0219
0,5806
0,0084
0,0004
0,0138
0,2107
0,0006
0,005
0,0046
0,3510
0.0010
0,0136
0,0017
0,8667
0.0001
0,0492
0,0003
0,0252
0,1523
0,0159
0.0096
0,1282
0,0955
0,0978
0,0629
0,6168
0,0016
0,0127
0,8025
0,4560
0,0201
0,0135
0,4988
0,8531
0,0213
* Wspó³czynnik hazardu z powodu 10-krotnego zwiêkszenia HIV-1 RNA lub zmniejszenia liczby CD4 o 100.
Rysunek 10
Szacunkowe prze¿ycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: SAQ 600 mg
Pacjenci prze¿ywaj¹cy bez ADE 8 tygodni
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA: tydzień 8
Dolna jedna trzecia
Środkowa jedna trzecia
Górna jedna trzecia
Tygodni po 8. tygodniu
45/52
Rysunek 11
Szacunkowe prze¿ycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: ddC
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA:
tydzień 8
Dolna jedna trzecia
Rysunek 12
Szacunkowe prze¿ycia (metoda Kaplana i Meiera) – grupa badania NV14256: ddC + SAQ 600 mg
Przeżycie ADE (%)
Ostatni poziom RNA: tydzień 8
Dolna jedna trzecia
46/52
HIV-1 MONITOR
Rysunek 13
Wspó³czynnik hazardu dla czasu pierwszego ADE – Pacjenci prze¿ywaj¹cy bez ADE
4 tygodnie – badanie NV14256
Wskaźnik ryzyka
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
log10 (ostatni RNA)
Rysunek 14
Wspó³czynnik hazardu dla czasu pierwszego ADE – Pacjenci prze¿ywaj¹cy bez ADE
16 tygodni – badanie NV14256
Wskaźnik ryzyka
21
16
11
6
1
3,8
4,2
4,6
5,0
5,4
5,8
log10 (ostatni RNA)
47/52
Piœmiennictwo
1.
Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F. 1983. Isolation of
a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired
immunodeficiency syndrome. Science 220:868-871.
2.
Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E., et al. 1984. Detection, isolation
and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from
patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500.
3.
Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., et al. 1984. Frequent detection
and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS
and at-risk for AIDS. Science 224:500-502.
4.
Curran, J.W., Jaffe, H.W., Hardy, A.M., et al. 1988. Epidemiology of HIV
Infection and AIDS in the United States. Science 239:610-616.
5.
Gaines, H., von Sydow, M.A., von Stedingk, L.V. 1990. Immunological
changes in primary HIV-1 infection. AIDS 4:995-999.
6.
Tindall, B., and Cooper, D.A. 1991. Primary HIV-1 infection: host responses
and intervention strategies. AIDS 5:1-14.
7.
Daar, E.S., Moudgil, T, Meyer. R.D., et al. 1991. Transient high levels of
viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1
infection. New England Journal of Medicine 324:961-964.
8.
Clark, S.J., Saag, M.S., Decker, W.D. 1991. High titers of cytopathic virus in
plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New England
Journal of Medicine 324:954-960.
9.
Albert, J., Abrahamsson, B., Nagy, K. 1990. Rapid development of isolatespecific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent
emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera.
AIDS 4:107-112.
10. Hornsburgh, C.R., Jason, J., Longini, I.M., et al. 1989. Duration of human
immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet
26:637-640.
11. Schnittman, S.M., Psallidopoulos, M.C., Lane, H.C., et al. 1989. The
reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell that maintains
expression of CD4. Science 245:305-308.
12. Schnittman, S.M., Greenhouse, J.J., Psallidopoulos, M.C. 1990. Increasing
viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency
virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppression and
clinical disease. Annals of Internal Medicine 113:438-443.
13. Pantaleo, G., Graziosi, C., Fauci, A.S. 1993. New concepts in the
immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection.
New England Journal of Medicine 328:327-335.
48/52
HIV-1 MONITOR
14. Piatak, N., Saag, M.S., Yang, L.C., et al. 1993. High levels of HIV-1 in
plasma during all stages of infection determined by competitive PCR.
Science 259:1749-1754.
15. Fauci, A.S., Schnittman, S.M., Poli, G., et al. 1991. NIH conference:
immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (HIV)
infection. Annals of Internal Medicine 114:678-693.
16. Coffin, J.M. 1995. HIV-1 population dynamics in vivo: Implications for
genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 267:483-489.
17. Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., et al. 1995. Rapid turnover of
plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 373:123-126.
18. Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., et al. 1995. Viral dynamics in human
immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 373:117-122.
19. O’Brien, W.A., Hartigan, P.M., Martin, D. et al. 1996. Changes in plasma
HIV-1 RNA and CD4 lymphocyte counts and the risk of progression to
AIDS. New England Journal of Medicine 334:426-431
20. Welles, S.L., Jackson, J.B., Yen-Leiberman, B., et al. 1996. Prognostic value
of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I (HIV-1) RNA levels in
patients with advanced HIV-1 disease and with little or no zidovudine
therapy. Journal of Infectious Diseases 174:696-703.
21. Coombs, R.W., Welles, S.L., Hooper, C., et al. 1996. Association of plasma
Human Immunodeficiency Virus Type I RNA level with risk of clinical
progression in patients with advanced infection. Journal of Infectious
Diseases 174:704-712.
22. Hammer, S., Crumpacker, C., D’Aquila, R., et al. 1993. Use of virologic
assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials:
Recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee.
Journal of Clinical Microbiology 31:2557-2564.
23. Schochetman, G., George, J.R., ed. AIDS testing: a comprehensive guide to
technical, medical, social, legal and management issues. 2nd ed. New York:
Springer-Verlag, 1994.
24. Mulder, J. McKinney, N., Christopherson, C., et al. 1994. Rapid and simple
PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in
plasma: Application to acute retroviral infection. Journal of Clinical
Microbiology 32:292-300.
25. Dewar, R.L., Highbarger, H.C., Sarmiento, M.B., et al. 1994. Application of
branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency
virus type 1 burden in human plasma. Journal of Infectious Diseases
170:1172-1179.
26. van Gemen, B., Kievits, T., Schukkink, R., et al. 1993. Quantification of
HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection.
Journal Virological Methods 43:177-188.
49/52
27. Saiki, R.K. Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of
β−globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
Sickle Cell Anemia. Science 230:1350-1354.
28. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., et al. 1988. Primer-directed enzymatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science
239:487-491.
29. Mullis, K.B., Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350.
30. Myers, T.W., and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA
amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry
30:7661-7666.
31. Kwok, S., Sninsky, J.J. 1993. PCR detection of human immunodeficiency
virus type 1 proviral DNA sequences. In: Diagnostic Molecular Biology:
Principles and Applications. eds. Persing, D.H., Smith, T.F., Smith, F.C., et
al. ASM, Washington, D.C.
32. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93:125-128.
33. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
34. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers
from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue.
Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997.
35. International Air Transport Association Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition. 2000. 704 pp.
36. Holmes, H., Davis, C., Heath, A., et al. 2001. An international collaborative
study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in
nucleic acid-based techniques. Journal Virological Methods 92:141-150.
37. Yen-Lieberman, B., Brambilla, D., Jackson, B. et al. 1996. Evaluation of a
quality assurance program for quantitation of Human Immunodeficiency
Virus Type 1 RNA in plasma by the AIDS Clinical Trials Group Virology.
Journal of Clinical Microbiology 34:2695-2701.
38. Dale, J., Dondero, T.J., Rayfield, M.A. et al. 1996. The emerging genetic
diversity of HIV. JAMA 275:210-216.
39. Gao, F., Morrison, S.G., Robertson, D.L. et al. 1996. Molecular cloning and
analysis of functional envelope genes from Human Immunodeficiency Virus
Type 1 sequence subtypes A through G. Journal of Virology 70:1651-1667.
40. Layne, S.P., Merges, M.J., Dembo, M. et al. 1992. Factors underlying
spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of Human
Immunodeficiency Virus. Virology 189:695-714.
50/52
HIV-1 MONITOR
41. Louwagie, J.J., McCutchan, F., Brennan, T. et al. 1993. Phylogenetic analysis
of gag genes from seventy international HIV-1 isolates provides evidence for
multiple genotypes. AIDS 7:769-780.
42. Louwagie, J.J., Delwart, E.L., Mullins, J.I. et al. 1994. Genetic analysis of
HIV-1 isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes.
AIDS Research and Human Retroviruses 10:561-567.
43. Louwagie, J.J., Janssens, W., Mascola, J.J. et al. 1995. Genetic diversity of
the envelope glycoprotein from Human Immunodeficiency Virus Type 1
isolates of African origin. Journal of Virology 69:263-271.
44. Mascola, J.J., Louwagie, J.J., McCutchan, F.E. et al. 1993. Two antigenically
distinct subtypes of human immunodeficiency virus type 1: viral genotype
predicts neutralization serotype. Journal of Infectious Diseases 169:48-54.
45. McCutchan, F.E., Hegerich, P.A., Brennan, T.P. et al. 1992. Genetic variants
of HIV-1 in Thailand. AIDS Research and Human Retroviruses 8:1887-1895.
46. Michael, N. The Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.
Personal communication.
47. Carr, J.K., Salminen, M.O., Albert, J. et al. 1998. Full genome sequences of
human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype
recombinants. Virology. 247:22-31.
48. Carr, J.K., Salminen, M.O., Koch, C. et al. 1996. Full-length sequence and
mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from
Thailand. Journal of Virology 70:5935-5943.
49. McCutchan, F.E., Artenstein, A.W., Sanders-Buell, E. et al. 1996. Diversity
of the envelope glycoprotein among human immunodeficiency virus type 1
isolates of clade E from Asia and Africa. Journal of Virology 70:3331-3338.
50. McCutchan, F.E., Ungar, B.L., Hegerich, P. et al. 1992. Genetic analysis of
HIV-1 isolates from Zambia and an expanded phylogenetic tree for HIV-1.
Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome 5:441-449.
51. Porter, K.R., Mascola, J.R., Hupudio, H. et al. 1997. Genetic, antigenic and
serologic characterization of human immunodeficiency virus type 1 from
Indonesia. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human
Retrovirology 14:1-6.
52. Salminen, M.O., Johansson, B., Sonnerborg, A. et al. 1996. Full-length
sequence of an ethiopian human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolate
of genetic subtype C. AIDS Research and Human Retroviruses. 12:1329-1339.
51/52
"
Distributed by
Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ 08876 USA
Cz³onek Grupy Roche
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
ROCHE, COBAS, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPERASE, FORTOVASE,
HIVID i INVIRASE s¹ znakami towarowymi firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
CRIXIVAN® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Merck & Co., Inc.
Dynabeads® cz¹steczki paramagnetyczne s¹ wykorzystywane na zasadzie licencji dla
patentu posiadanego przez firmê Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia. Dynabeads®
jest zarejestrowanym znakiem towarowym Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia,
licencjonowanym dla Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana.
Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® s¹ zarejestrowanymi znakami
towarowymi firmy Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
EPIVIR® i ZIAGEN® s¹ zarejestrowanymi znakami towarowymi firmy
GlaxoSmithKline.
NORVIR® jest zarejestrowanym znakiem towarowym Abbott Laboratories.
ProClin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym Rohm and Haas Company.
SUSTIVA® jest zarejestrowanym
Pharmaceuticals Company.
VIRAMUNE® jest
Laboratories, Inc.
zarejestrowanym
znakiem
znakiem
Copyright 2005. Roche Molecular Systems, Inc.
Wszelkie prawa zastrze¿one.
towarowym
towarowym
firmy
DuPont
firmy
Roxane
9/2005
(00058003436-04ENGL)
04497856001-02
52/52

Przeznaczenie

Transkrypt

Podobne dokumenty

6.2 Część VI.2 Podsumowanie planu zarządzania ryzykiem

Szybki test HIV 1/2

załacznik do publicznej obrony lek. A. Szymanek

JBL Studio Monitor, czyli hi-fi 25 lat później

TV plazma 3D Panasonic 13. generacji serii