Pdf version

ARTYKUŁY ORYGINALNE
Czynniki wpływające na generację trombiny
mierzoną jako stężenie kompleksów trombina-antytrombina i metodą automatycznego
skalibrowanego trombogramu u chorych
z zaawansowaną chorobą wieńcową
Factors influencing thrombin generation measured as thrombin-antithrombin complexes
levels and using calibrated automated thrombogram in patients with advanced coronary
artery disease
Ewa Stępień1, Dariusz Plicner1, Agnieszka Branicka1, Elżbieta Stankiewicz1, Agnieszka Pazdan1,
Maria Śnieżek-Maciejewska2, Izabela Górkiewicz1, Bogusław Kapelak2, Jerzy Sadowski2
1
Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Kraków
2
Klinika Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Streszczenie: Wprowadzenie. Układ krzepnięcia odgrywa istotną rolę w patogenezie miażdżycy. Generacja
trombiny jest kluczowym etapem w procesie krzepnięcia. Cele. Porównanie metod automatycznego
trombogramu (calibrated automated thrombogram – CAT) i pomiaru kompleksów trombina-antytrombina
(TAT). Identyfikacja czynników wpływających na generację trombiny u chorych z zaawansowaną chorobą
wieńcową zakwalifikowanych do zabiegu pomostowania aortalno-wieńcowego (coronary artery bypass graft
– CABG). Analiza tradycyjnych (wiek, płeć, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca) i nowych (fibrynogen i białko
C‑reaktywne – CRP) czynników ryzyka miażdżycy oraz leczenia w okresie przedoperacyjnym (aspiryna 75–150
mg/d) w odniesieniu do aktywacji krzepnięcia. Pacjenci i metody. Oceniano 135 pacjentów ze stabilną dławicą
piersiową przyjętych do planowanego zabiegu CABG z istotnym zwężeniem pnia lewej tętnicy wieńcowej
(>50%) lub w głównych tętnicach nasierdziowych (>70%). Generację trombiny mierzono jako stężenie
kompleksu TAT oraz metodą CAT (Cmax – maksymalne stężenie trombiny, ETP – endogenous thrombin potential,
endogenny potencjał trombiny, czyli pole pod krzywą przyrastania stężenia trombiny w czasie). Mierzono
również poziom markera aktywacji płytek (β-tromboglobuliny). Wyniki. Nie stwierdzono korelacji między
TAT, Cmax i ETP oraz czynnikami ryzyka, a także poziomem β-tromboglobuliny. Zastosowanie uogólnionego
modelu regresji liniowej wykazało, że wiek oraz płeć męska i cukrzyca były niezależnymi predyktorami TAT
(odpowiednio: β = 0,5; p <0,0001 i β = 0,36; p = 0,02). CRP wpływało niezależnie na TAT oraz ETP (β = –0,24
i β = 0,22; p <0,05), natomiast fibrynogen na Cmax (β = 0,21; p <0,05). Dla β-tromboglobuliny niezależnym
predyktorem było odstawienie aspiryny i płeć męska (β = 0,46; p = 0,01). Leczenie aspiryną nie miało wpływu
na generację trombiny w badanej grupie. Wnioski. Wiek, zwiększony poziom fibrynogenu, CRP, cukrzyca i płeć
męska wpływają na zwiększenie generacji lub aktywność trombiny u chorych kwalifikowanych do CABG. Wyniki
uzyskane metodą CAT i oznaczenia TAT nie korelują ze sobą, co wskazuje na odmienny mechanizm generacji
trombiny w obu układach i wyklucza zamienne stosowanie obu metod.
Słowa kluczowe: choroba wieńcowa, generacja trombiny, kompleks trombina-antytrombina, trombogram
Abstract: Introduction. Haemostatic factors play an important role in atherothrombosis. Thrombin generation
is a crucial stage of blood coagulation. Objectives. Comparison of different thrombin generation markers:
thrombin-antithrombin complex (TAT) generation and calibrated automated thrombogram method (CAT).
Identification of factors influencing thrombin generation in patients with stable angina (SA) enrolled to the
coronary artery bypass grafting (CABG) surgery. Analysis of traditional (age, gender, hypertension and diabetes)
and novel (fibrinogen and C-reactive protein [CRP]) risk factors and the antiplatelet therapy (aspirin 75–150 mg/d)
in relation to coagulation. Patients and methods. In 135 SA patients with left main coronary artery stenosis
Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów...
297
ARTYKUŁY ORYGINALNE
(>50%) or major epicardial artery stenosis (>70%), plasma TAT levels, maximal thrombin concentration (Cmax)
and endogenous thrombin potential (ETP) were determined. A marker of the platelet activation
(β-thromboglobulin) was also measured. Results. No correlations among TAT, Cmax, ETP, risk factors and
β-thromboglobulin were observed. Linear regression model showed that independent predictors of TAT levels
were age (β = 0.5; p = <0.0001), male gender and diabetes (β = 0.36; p = 0.02). CRP independently predicted
TAT and ETP (β = –0.24 and β = 0.22; p <0.05, respectively), while fibrinogen predicted Cmax (β = 0.21; p <0.05).
Independent predictors of β-thromboglobulin were a male gender and aspirin use cessation (β = 0.46;
p = 0.01). Aspirin treatment had no effect on thrombin generation. Conclusions. Age, higher fibrinogen, CRP,
diabetes and male gender influence thrombin generation and/or coagulation activation in SA patients. Plasma
levels of thrombin-antithrombin complexes do not correlate with the parameters obtained using the calibrated
automated thrombogram method (Cmax, ETP).
Key words: calibrated automated thrombogram, coronary artery disease, thrombin generation, thrombin-antithrombin complex
WPROWADZENIE
Już od ponad 20 lat wiadomo, że układ krzepnięcia odgrywa ważną rolę w patogenezie miażdżycy [1]. Badanie ARIC
pokazało, że zwiększone poziomy fibrynogenu, czynnika VIII
(FVIII) i czynnika von Willebranda zwiększają ryzyko wystąpienia choroby wieńcowej zarówno u kobiet, jak i mężczyzn
[2]. Obecność aktywnego biologicznie czynnika tkankowego
(tissue factor – TF), który w warunkach fizjologicznych rozpoczyna proces krzepnięcia, stwierdzono w blaszkach miażdżycowych [3]. Wykazano obecność fragmentów protrombiny
F1+2 (markera generacji trombiny) w krwi pobranej z naczyń
wieńcowych od pacjentów z niestabilną chorobą wieńcową [4].
Zaobserwowano również związek między stężeniem F1+2
w osoczu a zwiększoną grubością błony wewnętrznej i środkowej tętnicy szyjnej (intima-media thickness – IMT, wskaźnik
zaawansowania miażdżycy) [5].
Trombina jest kluczowym enzymem kaskady krzepnięcia.
W osoczu, z nieaktywnego proenzymu (protrombiny) powstaje enzymatycznie czynna trombina na skutek konwersji przez
protrombinazę (kompleks aktywowanych czynników Va i Xa
na powierzchni fosfolipidów) w obecności jonów Ca2+. Aktywność osoczowa trombiny zależy zatem nie tylko od stężenia
wyjściowego protrombiny, ale także od szybkości reakcji konwersji protrombiny w trombinę oraz od procesu inaktywacji
trombiny, w którym biorą udział endo- i egzogenne inhibitory.
Endogenna inaktywacja trombiny w osoczu następuje głównie
na skutek przyłączenia się do cząsteczki trombiny jej inhibitora – antytrombiny (AT), który tworzy z trombiną równomolowe kompleksy białkowe, tzw. TAT (trombina-antytrombina).
Kompleksy te są wykrywane w osoczu krwi obwodowej [6]
oraz w nadsączu pozyskiwanym z nacięć wykonanych na skóAdres do korespondencji:
dr biol. Ewa Stępień, Samodzielna Pracownia Biologii Molekularnej i Badań Naukowych, Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, ul. Prądnicka 80, 31-202
Kraków, tel.: 0-12-614-31-45, fax: 0-12-423-39-00, e-mail: [email protected]
Praca wpłynęła: 17.06.2007. Przyjęta do druku: 13.08.2007.
Nie zgłoszono sprzeczności interesów.
Pol Arch Med Wewn. 2007; 117 (7): 297-305
Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2007
298
rze w modelu uszkodzenia mikrokrążenia [7] i są, obok pomiaru stężenia fibrynopeptydu A i fragmentów F1+2 protrom­
biny, jednym z markerów aktywacji trombiny [8,9].
AT może również działać na poziomie hamowania aktywności protrombinazy poprzez nieodwracalne przyłączanie się
do czynnika Xa. Proces inaktywacji czynnika Xa jest wzmocniony w obecności egzogennego inhibitora trombiny – heparyny [10]. Poprzez allosteryczne wiązanie heparyny do AT
zwiększa się szybkość i skuteczność inaktywacji Xa przez AT.
Heparyna działa również bezpośrednio na trombinę zmniejszającjej aktywność niemal 5-krotnie poprzez allosteryczne wiązania osłabiające aktywność enzymatyczną trombiny
[10]. Generacja trombiny zależy również w dużym stopniu od
układu fibrynolitycznego: jej aktywność jest hamowana przez
oddziaływania z fibryną [11], a tworzenie kompleksu trombina-trombomodulina powoduje zmianę specyficzności rozpoznawania fibrynogenu jako substratu i aktywację inhibitora
fibrynolizy [12].
Złożone mechanizmy powstawania trombiny i jej hamowania są regulowane w osoczu na każdym etapie przez wzajemne
oddziaływania endogennych aktywatorów i inhibitorów krzepnięcia oraz ulegają modulacji przez wprowadzenie do układu
egzogennych inhibitorów, takich jak np. heparyna niefrakcjonowana i jej pochodne drobnocząsteczkowe. Ważną rolę w hamowaniu krzepnięcia, głównie za pośrednictwem blokowania
zależnej od cyklooksygenazy aktywacji płytek krwi, odgrywa
niewątpliwie kwas acetylosalicylowy (aspiryna). Wykazano, że
lek ten osłabia również proces generacji trombiny, prawdopodobnie na drodze zmniejszania aktywności protrombinazy lub
hamowania ekspresji TF [13].
W procesie generacji trombiny in vivo duży udział mają
czynniki, które w sposób ilościowy lub jakościowy wpływają
na dostępność lub aktywność regulatorów krzepnięcia: wrodzone niedobory antytrombiny lub białek S i C, mutacje genu
protrombiny (G20210A) lub czynnika V Leiden. Do czynników środowiskowych mających wpływ na zwiększoną generację trombiny zalicza się otyłość [14], wiek [15], doustną
antykoncepcję [16], a także choroby takie jak: cukrzyca [17],
nadciśnienie tętnicze [18] czy choroba wieńcowa [19].
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
PACJENCI I METODY
Badaniu poddano grupę kolejnych 135 pacjentów ze stabilną dławicą piersiową, przyjętych na oddział Kliniki Chirurgii
Serca, Naczyń i Transplantologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego do planowanego zabiegu pomostowania aortalno-wieńcowego (coronary artery bypass graft – CABG)
w okresie styczeń–maj 2006 roku. Średnia punktacja według
klasyfikacji EUROSCORE dla pacjentów kwalifikowanych do
zabiegu wynosiła 2 punkty. W badaniu koronarograficznym
rozpoznano istotne zwężenia pnia lewej tętnicy wieńcowej
(>50%) lub w głównych tętnicach nasierdziowych (>70%),
nie zakwalifikowane do interwencji przezskórnej (PCI). Wynik oznaczenia poziomu troponiny I w dniu włączenia do
badania wynosił <0,1 ng/ml. Kryteria wyłączające z udziału w badaniu to: zabiegi inne niż CABG wykonane w tym
samym czasie, objawy ostrej infekcji, stosowanie acenokumarolu, heparyny lub tienopirydyn, żylna choroba zakrzepowozatorowa w wywiadzie, przebycie ostrego zespołu wieńcowego
w okresie krótszym niż 3 miesiące przed włączeniem, poważne
stężenie
maksymalne
stężenie trombiny (nM)
Do oceny aktywności trombiny in vivo stosuje się testy
oparte na pomiarze stężenia produktów aktywacji protrombiny (peptydy F1+2) [8], oraz poziomu kompleksów TAT przy
użyciu metody ELISA [9]. Oznaczenia TAT i F1+2 nie mają
jednak zastosowania w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej.
Mimo zalet wynikających ze swoistości tych metod pomiaru,
są one niewystandaryzowane i stosuje się je wyłącznie w celach
badawczych.
Inną metodą, opracowaną w latach 90. przez Hemkera [20]
i zaproponowaną przez niego do rutynowej analizy, jest ocena
trombogennego potencjału osocza, czyli tzw. metoda skalibrowanego automatycznego trombogramu (calibrated automated
trombogram – CAT) [21]. W próbce osocza ubogopłytkowego
(platelet poor plasma – PPP) dokonuje się kinetycznego pomiaru
sygnału (fluorescencji) emitowanego przez syntetyczny substrat trombiny dodany do osocza. Skalibrowana wartość tego
sygnału, przedstawiona w postaci krzywej zależności stężenia
trombiny od czasu, pozwala na obliczenie takich parametrów,
jak: czas opóźnienia reakcji – Tlag (lag time), stężenie maksymalne – Cmax (peak) i pole pod krzywą – endogenny potencjał
trombiny (endogenous thrombin potential – ETP) (ryc. 1), które
opisują dynamikę generacji trombiny w osoczu po dodaniu TF.
Metodę CAT charakteryzuje automatyzacja pomiaru oraz uniwersalność – mierzona jest de facto aktywność enzymatyczna
endogennej trombiny w porównaniu do wzorca.
Celem pracy było porównanie 2 metod oznaczania poziomu generacji trombiny u chorych z zaawansowaną chorobą
wieńcową: pomiaru stężenia TAT oraz metody CAT. Ponadto postawiono sobie za cel próbę identyfikacji, które spośród
czynników ryzyka miażdżycy (wiek, płeć, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca) i tzw. nowych czynników ryzyka, takich jak
fibrynogen i białko C-reaktywne (C-reactive protein – CRP),
wpływają na proces generacji trombiny u tych chorych.
300
200
czas
100 opóźnienia
0
pole pod krzywą – ETP
10
20
czas (min)
30
Ryc. 1. Schemat przedstawiający charakterystykę parametrów mie­­rzonych przy użyciu metody skalibrowanego automatycznego
trombogramu (calibrated automated trombogram – CAT). ETP –
endogenny potencjał trombiny (endogenous thrombin potential)
choroby współistniejące wpływające na hemostazę: nowotwór
złośliwy, choroby autoimmunologiczne, niewydolność nerek,
uszkodzenie wątroby. Ze względu na prawdopodobieństwo
występowania przewlekłego stanu zapalnego, który mógłby
mieć wpływ na badane zależności, z analizy wykluczono pacjentów, u których stwierdzono poziom CRP >10 mg/l. Za
osoby palące uznano osoby, które w czasie zbierania wywiadu
deklarowały palenie papierosów >10 sztuk dziennie. Cukrzycę
definiowano jako wystąpienie stężenia glukozy na czczo w surowicy >7 mmol/l, przyjmowanie leków hipoglikemizujących
lub wywiad cukrzycowy – bez względu na czas trwania choroby. Nadciśnienie tętnicze rozpoznawano, gdy przynajmniej
2‑krotnie stwierdzono ciśnienie rozkurczowe >90 mm Hg lub
skurczowe 140 mm Hg, albo gdy pacjent stosował leki obniżające ciśnienie przy dodatnim wywiadzie nadciśnieniowym.
Pacjenci zażywający aspirynę przyjmowali kwas acetylosalicylowy w dawce 75 lub 150 mg/d co najmniej 3 dni przed włączeniem do badania.
Wiek pacjentów w badanej grupie mieścił się w zakresie
42–80 lat (śr. 66 lat); 104 badanych (77%) stanowili mężczyźni; 59 osób (44%) deklarowało palenie. Cukrzycę rozpoznano
u 43 chorych (32%), wśród których 22 (16%) leczyło się insuliną; 116 badanych (86%) to chorzy na nadciśnienie tętnicze,
a 108 osób (80%) przebyło zawał serca. Średni wskaźnik masy
ciała (BMI) wynosił 27,7 kg/m2 (5,33) (mediana ± rozstęp międzykwartylowy). W tabeli 1. przedstawiono dane kliniczne
i wyniki badań laboratoryjnych.
Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej działającej
przy Uniwersytecie Jagiellońskim w Krakowie.
Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów...
299
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Badania laboratoryjne
Krew do badań pobierano w ciągu 18–24 godzin przed
wykonaniem zabiegu CABG. U pacjentów wykonano rutynowe oznaczenia poziomu cholesterolu całkowitego, frakcji LDL,
HDL i triglicerydów, CRP metodą immunoturbidymetryczną
(Dimention Expand, Dade-Behring, Niemcy) i fibrynogenu
(metoda Claussa). Poziom β-tromboglobuliny (βTG) oznaczono przy użyciu testu ELISA (Diagnostic Stago, Francja). Do
badań koagulologicznych pozyskiwano PPP z krwi pobieranej do probówek z 3,2% roztworem cytrynianu i odwirowanej
w temperaturze 4oC przez 10 min (3000 g). Osocze przechowywano zamrożone w temperaturze –70oC i rozmrażano przed
oznaczeniem w temperaturze 37oC.
Oznaczanie aktywności trombiny
Do oznaczenia poziomu trombiny w krwi żylnej posłużono się oznaczeniem stężenia TAT przy użyciu testu ELISA
(Enzygnost TAT, Dade-Behring, Niemcy). Oznaczenie trombogramu wykonano przy użyciu testu CAT (Trominoscope
BV, Holandia) zgodnie z zaleceniami producenta za pomocą
96-dołkowego fluorymetru płytkowego (Ascent Reader, Thermolabsystems OY, Finlandia) wyposażonego w zestaw filtrów
o długości fali 390/460 nm, w temperaturze 37oC. Do 80 µl
osocza PPP dodano 20 µl reagentu-PPP zawierającego 5 pM
rekombi­nowa­nego czynnika tkankowego, 4 SM fosfatydyloseryno/ fosfatydylocholino/ fosfatydyloetanolaminy w formie
sonifikowanej oraz 20 µl substratu (HEPES, pH 7,35, 100
nM CaCl2, 60 mg/mL albuminy wołowej i 2,5 mM Z-GlyGly-Arg-AMC). Pomiary wykonano w duplikatach, uzyskując powtarzalność metody 5,7%. Jednocześnie wykonywano
oznaczenia w samej próbce PPP i w obecności kalibratora zawierającego 20 SI kompleksu α­2­-makroglobuliny z trombiną.
Dane z pomiarów zanalizowano przy użyciu oprogramowania
Trombinoscope, w załączeniu przedstawiono przykładowe zapisy pomiarów dla próbki z małym (ryc. 2A) i średnim (ryc. 2B)
poziomem generacji trombiny. Wyniki przedstawiono jako
maksymalne stężenie trombiny (Cmax), czas opóźnienia reakcji
generacji trombiny (Tlag) i pole pod krzywą przyrastania stężenia trombiny w czasie (ETP).
Analiza statystyczna
Normalność rozkładów sprawdzono za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, wyniki przedstawiono w postaci median ± rozstęp międzykwartylowy. Różnice między grupami
zbadano testem U Manna-Whitney’a (analiza nieparametryczna), zależności między poszczególnymi zmiennymi sprawdzono stosując nieparametryczny model regresji Spearmana.
Udział niezależnych predyktorów dla zmiennych TAT, ETP
i Cmax sprawdzono stosując uogólniony model regresji liniowej.
Analizy statystycznej dokonano za pomocą oprogramowania
STATISTICA wersja 7.1 (StatSoft, Inc. 2005).
300
WYNIKI
Grupę zanalizowano pod kątem wpływu odstawienia leczenia aspiryną przed zabiegiem CABG na parametry opisujące aktywność trombinową osocza (tab. 2). Grupa pacjentów,
którzy odstawili aspirynę co najmniej 3 dni przed zabiegiem,
nie różniła się w sposób istotny statystycznie od grupy pacjentów zażywających aspirynę w dawce 75–150 mg/d do dnia
operacji pod względem poziomu TAT (3,12 ±1,05 vs 2,93
±1,23 µg/l, nieznamienna statystycznie [NS]), Cmax (336 ±113
vs 313 ±108 µmol/l, NS), parametrów Tlag i ETP (1,34 ±1 vs
1,67 ±0,67 min; 1696 ±544 vs 1712 ±722 mM*min, NS) oraz
stężenia βTG (58,5 ±12 IU/ml vs 56,5 ±14 IU/ml, NS). Grupy
nie wykazywały różnic pod względem parametrów klinicznych
(tab. 1) – poza wskaźnikiem BMI, który był statystycznie
mniejszy w grupie z odstawioną aspiryną i wynosił odpowiednio 27,6 (4,99) vs 30,5 kg/m2 (5,47), p = 0,028.
Zależność między aktywacją trombiny (CAT)
a poziomem TAT
Analiza regresji liniowej Spearmana (tab. 3) pokazała, że
dla stężenia kompleksu TAT w krwi obwodowej nie występują istotne statystycznie korelacje z parametrami opisującymi
aktywność trombiny, takimi jak Cmax, Tlag i ETP – zarówno
w grupie pacjentów kontynuujących leczenie aspiryną, jak
i w grupie z odstawionym leczeniem. Współczynnik korelacji
(r) między TAT a ETP dla pacjentów zażywających aspirynę
wynosi r = –0,36, nie wykazuje jednak istotności statystycznej.
U pacjentów po odstawieniu aspiryny stwierdzono istotną
statystycznie korelację między Cmax a wartością czasu opóźnienia: r = –0,22 (p = 0,034). Zależności takiej nie zaobserwowano u pozostałych chorych (tab. 3). Występowała silna
korelacja między Cmax a ETP dla obu grup (r = 0,74; p <0,001
vs r = 0,75, p <0,001). Pozostałe zmienne nie wykazywały
istotnych statystycznie zależności.
Zależność między aktywacją płytek krwi
a generacją trombiny
W badanej grupie wartość parametru opisującego stopień
aktywacji płytek (βTG) nie wykazywała zależności z takimi
czynnikami ryzyka miażdżycy, jak fibrynogen, CRP ani stężenie TAT (dane niepokazane). Nie stwierdzono też korelacji
między βTG a parametrami CAT takimi jak T max i ETP.
Stwierdzono jedynie odwrotną zależność między βTG a czasem opóźnienia (r = –0,20; p = 0,02), a u pacjentów nie zażywających aspiryny w okresie przedoperacyjnym współczynnik
korelacji był większy i wynosił: r = –0,30 (p = 0,005) (tab. 3).
Nie zaobserwowano podobnych zależności w grupie chorych
przyjmujących aspirynę. Dla markera aktywacji płytek βTG
niezależnymi predyktorami były współwystępujące: płeć męska oraz odstawienie aspiryny: β = 0,46 (p = 0,01).
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Ryc. 2. Przykładowe zapisy pomiarów
dla próbki z małym (A) i średnim (B)
poziomem generacji trombiny w osoczu przy użyciu metody CAT
A
B
Zależność między czynnikami ryzyka choroby
wieńcowej a generacją trombiny
Uogólniony model regresji liniowej pokazał, że najsilniejszymi predyktorami poziomu TAT w krwi obwodowej były
wiek oraz płeć męska i współwystępowanie cukrzycy, odpowiednio: β = 0,5 (p <0,0001) oraz β = 0,36 (p = 0,02). Duży
poziom CRP i leczenie aspiryną były słabszymi predyktorami,
wykazywały jednak istotność statystyczną, odpowiednio: β =
0,17 (p = 0,04) i β = –0,24 (p = 0,03). U chorych na cukrzycę leczonych insuliną istniała podobna zależność jak dla całej
grupy ze zdiagnozowaną cukrzycą: β = 0,38 (p = 0,03).
W przypadku zastosowania metody CAT niezależnymi
predyktorami dla Cmax były: stężenie fibrynogenu i płeć męska
łącznie z cukrzycą; β-standaryzowane wynosiły odpowiednio:
β = 0,21 (p = 0,039) i β = 0,4 (p = 0,023). W przypadku leczenia insuliną zależność ta traciła istotność: β = 0,02
(NS). Nie stwierdzono zależności między poziomem CRP
a wartością Cmax. W przypadku ETP jako zmiennej zależnej,
niezależnym predyktorem był duży poziom CRP (β = 0,22;
p = 0,029) oraz płeć męska z współwystępującą cukrzycą (β =
0,38; p = 0,035). Po wyróżnieniu leczenia insuliną zależność
między występowaniem cukrzycy a ETP traciła na istotności.
Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów...
301
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Tabela 1. Charakterystyka pacjentów
Zmienna
Grupa
Leczenie aspiryną zakończone
Leczenie aspiryną kontynuowane
n = 135
n = 115
n = 20
wiek, lata (min.–maks.)
66 (42–80)
66 (42–80)
69 (52–79)
mężczyźni, n (%)
104 (77)
90 (78)
14 (70)
cukrzyca, n (%)
w tym leczeni insuliną
43 (32)
37 (32)
6 (32)
22 (16)
20 (17)
2 (10)
palenie papierosów, n (%)
59 (44)
50 (44)
9 (44)
nadciśnienie tętnicze, n (%)
116 (86)
99 (86)
17 (86)
przebyty zawał, n (%)
108 (80)
92 (80)
16 (84)
aspiryna, n (%)
20 (15)
–
–
β-blokery, n (%)
125 (93)
107 (93)
18 (90)
statyny, n (%)
124 (92)
107 (93)
17 (85)
BMI (kg/m2)
27,7 (5,33)
27,6 (4,99)*
30,5 (5,47)*
fibrynogen (g/l)
4,02 (1,62)
4,06 (1,62)
3,70 (1,52)
CRP (mg/l)
2,34 (2,66)
2,42 (2,61)
2,19 (2,51)
cholesterol całkowity (mmol/l)
4,88 (1,32)
4,88 (1,24)
4,85 (1,47)
cholesterol LDL (mmol/l)
3,00 (1,21)
3,00 (1,22)
3,07 (1,11)
cholesterol HDL (mmol/l)
1,30 (0,28)
1,30 (0,26)
1,26 (0,47)
TG (mmol/l)
1,51 (0,55)
1,47 (0,62)
1,55 (0,33)
* p = 0,028
BMI – wskaźnik masy ciała, CRP – białko C-reaktywne, HDL – lipoproteiny o dużej gęstości, LDL – lipoproteiny o małej gęstości,
TG – triglicerydy
Nie stwierdzono związku między nadciśnieniem tętniczym
a procesem aktywacji trombiny w badanej grupie.
OMÓWIENIE
W przedstawionej pracy oceniono poziom i kinetykę generacji trombiny in vitro w osoczu pobranym z krwi żylnej
pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową. Zastosowano
2 metody pomiaru generacji trombiny: oznaczanie kompleksów TAT (trombina-antytrombina) i metodę automatycznego
skalibrowanego trombogramu (CAT).
Pomiar TAT w krwi żylnej odzwierciedla poziom wiązania endogennego inhibitora trombiny (antytrombiny) do enzymatycznie czynnej trombiny. Wynik tego pomiaru zależy od
stężenia aktywnej trombiny zdolnej do związania inhibitora
i od dostępności inhibitora w osoczu. Zwiększone poziomy
TAT w krwi obwodowej zaobserwowano u chorych na krytyczne niedotlenienie kończyn [22], przewlekłą niewydolność
serca [23], ze wstrząsem wywołanym posocznicą [24] i z ostrym
niedokrwiennym udarem mózgu [25]. Stwierdzono również,
że zwiększony poziom TAT może być predyktorem zgonu
u chorych na przewlekłą niewydolność serca po uwzględnieniu klasycznych czynników ryzyka [23]. W naszym badaniu
302
poziom TAT w krwi obwodowej pacjentów z zaawansowaną
chorobą naczyń wieńcowych wynosił 3,07 ±1,06 µg/l i nie
różnił się u chorych zażywających aspirynę i u chorych nie
zażywających aspiryny przed zabiegiem CABG. Poziom ten
był porównywalny ze średnim stężeniem TAT obserwowanym
w grupie kontrolnej w badaniu Ono i wsp. [25] (2,94 ±0,42
µg/l), mimo że można było oczekiwać zwiększonych poziomów TAT. Wyrównane stężenie TAT może być powodowane
tym, że w badanej grupie 92% chorych przyjmowało regularnie statyny, w większości simwastatynę w dawce ≥20 mg/d.
Badania Undas i wsp. [26] wykonane na modelu uszkodzenia mikrokrążenia udowodniły, że taka dawka leku wpływa
na zmniejszenie generacji trombiny (mierzonej jako tworzenie
fragmentów F1+2 protrombiny) u pacjentów z zaawansowaną
chorobą naczyń wieńcowych. Zaobserwowano także zmniejszenie stężenia TAT po 3-dniowym zażywaniu simwastatyny
w dawce 40 mg/d [27].
Badana grupa wykazywała zróżnicowanie pod względem
czynników ryzyka takich jak: wiek, płeć, cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, stężenie CRP i fibrynogenu (tab. 1), dlatego
poddano analizie wpływ tych czynników na stężenie TAT
i kinetykę generacji trombiny oznaczaną przy użyciu metody
CAT. Zaobserwowano, że najsilniejszymi predyktorami poziomu TAT były wiek i płeć męska. Wpływ wieku na zwiększoną generację trombiny potwierdza wcześniejsze obserwacje
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Tabela 2. P
orównanie średnich wartości parametrów generacji trombiny i aktywacji płytek u pacjentów poddanych CABG leczonych
aspiryną i z odstawionym leczeniem aspiryną co najmniej 3 dni przed zabiegiem
Zmienna
Grupa
Leczenie aspiryną zakończone
Leczenie aspiryną kontynuowane
n = 135
n = 115
n = 20
TAT żylny (µg/l)
3,07 (1,06)
3,12 (1,05)
2,93 (1,23)
Cmax (µmol/l)
337 (116)
336 (113)
313 (108)
Tlag (min)
1,34 (1)
1,34 (1)
1,67 (0,67)
ETP (mM*min)
1704 (583)
1696 (544)
1712 (722)
βTG (IU/ml)
48 (12)
58,5 (12)
56,5 (14)
βTG – β-tromboglobulina, CABG – zabieg pomostowania aortalno-wieńcowego, Cmax – maksymalne stężenie trombiny, ETP – pole pod krzywą
przyrastania generacji trombiny w czasie, TAT – kompleks trombina-antytrombina, Tlag – czas opóźnienia reakcji generacji trombiny
Tabela 3. W
artości współczynników korelacji (r) między parametrami opisującymi poziom generacji trombiny i aktywacji płytek
w osoczu krwi żylnej u pacjentów poddanych CABG leczonych aspiryną i z odstawionym leczeniem aspiryną co najmniej
3 dni przed zabiegiem. Model regresji liniowej Spearmana
Leczenie aspiryną zakończone
Leczenie aspiryną kontynuowane
Cmax (µmol/l)
Tlag (min)
ETP (mM*min)
Cmax (µmol/l)
Tlag (min)
ETP (mM*min)
TAT (µg/l)
0
0,07
–0,07
–0,18
0,11
–0,36
Cmax (µmol/l)
–
–0,22*
0,74*
–
–0,38
0,75*
Tlag (min)
–0,22*
–
0,12
–0,38
–
–0,18
ETP (mM*min)
0,74*
0,12
–
0,75*
–0,18
–
βTG (IU/ml)
0,07
–0,30*
–0,07
0,06
0,09
–0,25
* p <0,05
Skróty jak w tabeli 2
dokonane na grupie kontrolnej [15] i na grupie chorych z udarem niedokrwiennym mózgu [25]. Brak jest danych na temat
znaczenia, jakie może mieć płeć w procesie generacji trombiny
u pacjentów kierowanych do CABG. Być może większe znaczenie mają tutaj czynniki współistniejące z płcią, takie jak
styl życia, palenie papierosów czy otyłość. Nie zaobserwowano
silnej zależności między wiekiem a parametrami oznaczanymi
metodą CAT. Jedynymi niezależnymi predyktorami dla Cmax
były: stężenie fibrynogenu i płeć męska. W literaturze nie ma
doniesień na temat związku stężenia fibrynogenu z generacją
trombiny – poza jedną pracą, w której wykazano, że zmniejszenie poziomu generacji trombiny (mniejsze Cmax i ETP) uzyskane po spożywaniu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych
omega-3 korelowało ze zmniejszeniem poziomu fibrynogenu
w osoczu [28]. Efekt ten był determinowany występowaniem
polimorfizmu genu α-fibrynogenu (Thr312Ala).
W badanej grupie stężenie CRP okazało się niezależnym
predyktorem poziomu TAT oraz ETP. Wcześniej zaobserwowano, że CRP wpływa na proces generacji trombiny i funkcję
fibrynogenu [29], a także na fibrynolizę [30]. Nasza obserwacja sugeruje, że CRP ogrywa rolę w procesie formowania
skrzepu na wielu poziomach: aktywności trombiny i być może
dostępności substratu lub inhibitora trombiny. Może to mieć
wpływ na strukturę skrzepu: podatność na lizę i przepuszczalność [31].
Nie stwierdzono korelacji między poziomem TAT a parametrami Cmax i ETP, co powodowane jest zapewne różnicami
w metodyce pomiarów. Jedyne obserwowane korelacje wynikają z oczywistych zależności miedzy Cmax a ETP i Tlag (tab. 3).
W przypadku metody CAT mierzony jest przyrost produktów konwersji egzogennego drobnocząsteczkowego substratu
trombiny po aktywacji TF. Technologia ta opiera się na kinetycznych pomiarach sygnału pochodzącego od endogennej
trombiny osocza i kalibratora, względem którego dokonuje się
przeliczenia stężenia trombiny. Zatem zmierzona tą metodą
ilość trombiny w osoczu jest pewną estymacją, wynikającą
z tego, że obecne w osoczu endogenne substraty dla trombiny
(w tym i sama protrombina) konkurują z substratem egzogennym o aktywne miejsce w cząsteczce enzymu. Tym samym,
wraz ze wzrostem stężenia substratu, czas opóźnienia generacji
trombiny wydłuża się, a wyliczone pod krzywą przyrostu stężenia trombiny ETP zwiększa się [32]. Gdy ma się na uwadze
wymienione różnice pomiędzy obiema metodami, nie dziwi,
że oznaczenia uzyskane w wyniku pomiaru TAT nie korelują
w sposób znamienny z pomiarami wykonanymi przy użyciu
Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów...
303
ARTYKUŁY ORYGINALNE
metody CAT. Nie można zatem stosować tych metod zamiennie, a wprowadzenie CAT do rutynowej diagnostyki wymaga
walidacji także na grupach zróżnicowanych pod względem
chorób obciążających.
Mała liczebność poddanych badaniu grup (115 chorych
z odstawionym leczeniem aspiryną przed zabiegiem i 20 chorych kontynuujących leczenie aspiryną) nie pozwala na ocenę,
czy różnią się one między sobą pod względem zależności od
parametrów opisujących proces generacji trombiny (porównanie współczynników korelacji). Można wnioskować jedynie
o istotności statystycznej wyliczonych współczynników korelacji dla poszczególnych grup. W badaniu uzyskano istotne
korelacje między Tlag a Cmax dla grupy z odstawioną aspiryną
(mimo małej wartości współczynnika korelacji: r = –0,22)
oraz duże i istotne wartości współczynników korelacji między
EPT a Cmax dla obu grup. Sugeruje to, że w obu grupach proces
generacji trombiny in vitro przebiega z jednakową kinetyką,
nie można natomiast ocenić, czy odstawienie aspiryny na okres
3 dni może na tę kinetykę wpłynąć. Przy normalnym obrocie
płytek nawet po 3 dniach od odstawienia aspiryny przynajmniej 50% płytek (jeśli nie więcej) ma osłabioną aktywację na
skutek działania leku. Można się zatem spodziewać, że mimo
odstawienia aspiryny proces aktywacji i generacji trombiny jest
osłabiony. Utrzymanie się stężenia kompleksu TAT w grupie
z odstawioną aspiryną na poziomie porównywalnym z grupą
kontynuującą leczenie może być zatem spowodowane procesem „aspirynizacji”. Innym procesem, jaki może wpływać na
poziom TAT w sposób niezależny od hamowania COX-1, jest
specyficzna acetylacja białek osocza, w tym AT [33].
Zaobserwowano istotną statystycznie zależność między
poziomem βTG (markera degranulacji płytek), a czasem
opóźnienia mierzonym metodą CAT (r = –0,30; p = 0,005)
u chorych z odstawioną aspiryną. Zależność tę można uzasadnić efektem zablokowania aktywności COX-1 (a tym samym
– zahamowania degranulacji płytek) u pacjentów leczonych
aspiryną. Może to mieć wpływ na zniesienie efektu korelacji
między aktywacją płytek a czasem opóźnienia generacji trombiny. W przypadku odstawienia aspiryny proces aktywacji nie
jest regulowany przez obecność kwasu acetylosalicylowego,
stąd obserwowana zależność.
W naszej pracy zaobserwowano, że współistniejąca cukrzyca stanowi jeden z predyktorów generacji trombiny wyrażonej jako tworzenie kompleksów TAT oraz przyrost stężenia
trombiny w czasie. Cukrzyca wpływa na wzmocnienie procesów zapalnych, które towarzyszą miażdżycy: zwiększa się między innymi produkcja reaktywnych form tlenu, a zmniejsza
zdolność tworzenia tlenku azotu w płytkach [34,35]. U pacjentów z cukrzycą ta wzmocniona aktywność płytek objawia
się zwiększoną generacją trombiny [17], co może być jedną
z przyczyn powikłań zakrzepowo-zatorowych u chorych poddawanych zabiegowi CABG. Wiadomo też, że insulinooporność wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny [14].
W naszej pracy zaobserwowaliśmy, że leczenie insuliną ma
związek ze zwiększonym poziomem TAT, natomiast nie ma
wpływu na parametry mierzone metodą CAT. W zastosowa304
nym uogólnionym modelu regresji liniowej o udziale czynnika
jakościowego (w tym przypadku jest to leczenie insuliną) decyduje siła oddziaływania pozostałych predyktorów ciągłych
(fibrynogen, CRP). Zdaniem autorów, ich udział mógł wpłynąć na osłabienie zależności między leczeniem cukrzycy insuliną a Cmax i ETP w porównaniu do występowania cukrzycy.
Podsumowując, w naszej pracy wykazaliśmy, że czynniki
takie jak wiek, zwiększony poziom fibrynogenu i CRP (białka
ostrej fazy), współwystępowanie cukrzycy i płeć męska wiążą się z ze zwiększeniem generacji lub aktywnością trombiny
u chorych z zaawansowaną miażdżycą naczyń wieńcowych podanych zabiegowi CABG. Wykazaliśmy również, że pomiary generacji trombiny za pomocą metody CAT i oznaczenia
stężenia kompleksu trombina-antytrombina u pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową nie korelują ze sobą. Wynika
to z odmiennych technik pomiaru i z różnic w parametrach
opisujących proces generacji trombiny.
PODZIĘKOWANIA
Autorzy wyrażają podziękowanie dr. Timowi van Astenowi
z Thrombinoscope BV w Holandii za użyczenie odczynników
i aparatury, niezbędnych do wykonania pomiarów skalibrowanego automatycznego trombogramu (CAT) oraz za cenne
uwagi dotyczące metody. Badanie sfinansowano z umowy Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na wykonanie projektu badawczego nr N403 037 31/2198.
PIŚMIENNICTWO
1. Meade TW, Mellows S, Miller GJ, et al. Haemostatic function and ischaemic heart
disease: principal results of the Northwick Park Hart Study. Lancet. 1986; 2: 533-538.
2. Folsom AR, Wu KK, Rosamond WD, et al. Prospective study of hemostatic factors
and incidence of coronary heart disease: the Atherosclerosis Risk in Communities
(ARIC) study. Circulation. 1997; 96: 1102-1108.
3. Marmur JD, Thiruvikraman SV, Fyfe BS, et al. Identification of active tissue factor in
human coronary atheroma. Circulation. 1996; 94: 1226-1232.
4. Ardissino D, Merlini PA, Bauer KA, et al. Thrombogenic potential of human coronary
atherosclerotic plaques. Blood. 2001; 98: 2726-2729.
5. Páramo JA, Orbe J, Beloqui O, et al. Prothrombin fragment 1+2 is associated with
carotid intima-media thickness in subjects free of clinical cardiovascular disease.
Stroke. 2004; 35: 1085-1089.
6. Aleil B, Meyer N, Wolff V, et al. Plasma glycoprotein V levels in the general population: normal distribution, associated parameters and implications for clinical studies. Thromb Haemost. 2006; 96: 505-511.
7. Stępień E, Szułdrzyński K, Branicka A, et al. Allel PlA1/A2 beta3 integryny wiąże się
ze zwiększoną generacją trombiny u pacjentów z chorobą wieńcową leczonych
aspiryną – wpływ leczenia statynami. Pol Arch Med Wewn. 2007; 1-2: 33-40.
8. Aronson DL, Stevan L, Ball AP, et al. Generation of the combined prothrombin activation peptide (F1-2) during the clotting of blood and plasma. J Clin Invest. 1977;
60: 1410-1418.
9. Hoek JA, Sturk A, Cats JW, et al. Laboratory and clinical evaluation of an assay of
thrombin-antithrombin III complexes in plasma. Clin Chem. 1988; 34: 2058-2062.
10. Chuang YJ, Swanson R, Raja SM, et al. Heparin enhances the specificity of antithrombin for thrombin and factor Xa independent of the reactive center loop sequence. Evidence for an exosite determinant of factor Xa specificity in heparin-activated antithrombin. J Biol Chem. 2001; 276: 14961-14971.
11. de Bosch NB, Mosesson MW, Ruiz-Sáez A, et al. Inhibition of thrombin generation in
plasma by fibrin formation (Antithrombin I). Thromb Haemost. 2002; 88: 253-258.
12. Bajzar L, Nesheim M, Morser J, et al. Both cellular and soluble forms of thrombomodulin inhibit fibrinolysis by potentiating the activation of thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem. 1998; 273: 2792-2798.
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (7)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
13. Undas A, Brummel-Ziedins KE, Mann KG. Antithrombotic properties of aspirin and
resistance to aspirin: beyond strictly antiplatelet actions. Blood. 2007; 109: 22852292.
14. Romano M, Guagnano MT, Pacini G, et al. Association of inflammation markers with
impaired insulin sensitivity and coagulative activation in obese healthy women.
J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88: 5321-5326.
15. Bauer KA, Weiss LM, Sparrow D, et al. Aging-associated changes in indices of
thrombin generation and protein C activation in humans. J Clin Invest. 1987; 80:
1527-1534.
16. Rosendaal FR, van Hylckama Vlieg HA, et al. Estrogens, progestogens and thrombosis. J Thromb Haemost. 2003; 1: 1371-1380.
17. Aoki I, Shimoyama K, Aoki N, et al. Platelet-dependent thrombin generation in patients with diabetes mellitus: effects of glycemic control on coagulability in diabetes. J Am Coll Cardiol. 1996; 27: 560-566.
18. Corseaux D, Ollivier V, Fontaine V, et al. Hemostasis imbalance in experimental hypertension. Mol Med. 2002; 8: 169-178.
19. Musiał‚ J, Pająk A, Undas A, et al. Thrombin generation markers and coronary heart
disease risk factors in a Polish population sample. Thromb Haemost. 1997; 77: 697700.
20. Hemker HC, Wielders S, Kessels H, et al. Continuous registration of thrombingeneration in plasma, its use for the determination of the thrombin potential.
Thromb Haemost. 1993; 70: 617-624.
21. Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, et al. The calibrated automated thrombogram
(CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol
Haemost Thromb. 2002; 32: 249-253.
22. Cassar K, Bachoo P, Ford I, et al. Markers of coagulation activation, endothelial
stimulation and inflammation in patients with peripheral arterial disease. Eur J Vasc
Endovasc Surg. 2005; 29: 171-176.
23. Marcucci R, Gori AM, Giannotti F, et al. Markers of hypercoagulability and inflammation predict mortality in patients with heart failure. J Thromb Haemost. 2006; 4:
1017-1022.
24. Psuja P, Zozulinska M, Turowiecka Z, et al. Plasma markers of hypercoagulability in
patients with serious infections and risk of septic shock. Clin Appl Thromb Hemost.
2002; 8: 225-230.
25. Ono N, Koyama T, Suehiro A, et al. Clinical significance of new coagulation and fibrinolytic markers in ischemic stroke patients. Stroke. 1991; 22: 1369-1373.
26. Undas A, Brummel K, Musial J. Simvastatin depresses blood clotting by inhibiting
activation of prothrombin, factor V, and factor XIII and by enhancing factor Va inactivation. Circulation. 2001; 103: 2248-2253.
27. Undas A, Celinska-Löwenhoff M, Brummel-Ziedins KE, et al. Simvastatin given for
3 days can inhibit thrombin generation and activation of factor V, and enhance factor Va inactivation in hypercholesterolemic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol.
2005; 25: 1524-1525.
28. Vanschoonbeek K, Feijge MAH, Paquay M, et al. Variable hypocoagulant effect of
fish oilintake in humans: modulation of fibrinogen level and thrombin generation.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 1734-1740.
29. Reganon E, Vila V, Marti­nez-Sales V, et al. Inflammation, fibrinogen and thrombin
generation in patients with previous myocardial infarction. Haematologica. 2002;
87: 740-745.
30. Niccoli G, Biasucci LM, Biscione C, et al. Instability mechanisms in unstable angina
according to baseline serum levels of C-reactive protein: The role of thrombosis,
fibrinolysis and atherosclerotic burden. Int J Cardiol. 2007 Jan 29; [Epub ahead of
print].
31. Undas A, Plicner D, Stępień E, et al. Altered fibrin clot structure in patients with
advanced coronary artery disease: a role of C-reactive protein, lipoprotein(a) and
homocysteine. J Thromb Haemost. 2007; 5: 1988-1990.
32. Butenas S, Mann KG. Caution in the interpretation of continuous thrombin generation assays. J Thromb Haemost. 2007; 5: 1084-1085.
33. Villanueva GB, Allen N. Acetylation of antithrombin III by aspirin. Semin Thromb
Hemost. 1986; 12: 213-215.
34. Schaeffer G, Wascher TC, Kostner GM, et al. Alterations in platelet Ca2+ signalling
in diabetic patients is due to increased formation of superoxide anions and reduced
nitric oxide production. Diabetologia. 1999; 42: 167-176.
35. Rabini RA, Staffolani R, Fumelli P, et al. Decreased nitric oxide synthase activity in
platelets from IDDM and NIDDM patients. Diabetologia. 1998; 41: 101-104.
Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów...
305