Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w - Eko-DOk

Komentarze

Transkrypt

Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w - Eko-DOk
Biofilm, sieć wodociągowa, sekwencjonowanie, MIDI-FAME,
Izabela BIEDROŃ*, Daniel WASILKOWSKI**, Teodora M. TRACZEWSKA*
METODY IDENTYFIKACJI MIKROORGANIZMÓW
BYTUJĄCYCH W BIOFILMACH SIECI WODOCIĄGOWEJ
Błona biologiczna jest obecna w każdym systemie dystrybucji wody do picia. Jej obecność ma istotne
znaczenie dla zdrowia publicznego, ponieważ może być ona siedliskiem wielu potencjalnie chorobotwórczych organizmów. Klasyczna metoda płytkowa daje bardzo ograniczone informacje na temat
struktury gatunkowej organizmów zasiedlających sieć wodociągową. Zaletą zastosowania metod molekularnych jest możliwość wykrycia niechorobotwórczych gatunków, które mogą się rozmnażać
w systemie dystrybucji wody. Praca przedstawia porównanie efektów identyfikacji wyizolowanego
szczepu bakteryjnego z systemu dystrybucji wody do picia metodami klasycznymi, molekularnymi
i biochemicznymi.
1. WSTĘP
Mikroorganizmy są zdolne do życia i rozwoju w systemach dystrybucji wody.
Tworzą skupiska na wewnętrznych powierzchniach rur- tak zwaną błonę biologiczną
(biofilm) [4]. Macierz biofilmu stworzona jest przez wydzieliny komórek bakteryjnych, w skład których wchodzą polisacharydy, białka, tłuszcze, kwasy nukleinowe,
enzymy oraz liczne metabolity. Kompleks składający się z mieszaniny tych substancji
otrzymał nazwę zewnątrzkomórkowych polimerycznych substancji (EPS-extracellular
polymeric substances). Mikroorganizmy zatopione w EPS mają łatwiejszy dostęp do
substancji odżywczych i są chronione przed środkami dezynfekującymi. W obrębie
__________
*
Politechnika Wrocławska, Instytut Inżynierii i Ochrony Środowiska, Zakład Biologii Sanitarnej
i Ekotechniki, ul. Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław..
**
Uniwersytet Śląski, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Biochemii, ul. Jagiellońska
28, 40-032 Katowice.
52
I. BIEDROŃ i in.
błony biologicznej tworzą się lokalne gradienty pH i tlenu, dzięki czemu bytują tam
mikroorganizmy o różnych preferencjach oddechowych i siedliskowych [4,
16].Obecność błony biologicznej może wpływać na pogorszenie jakości wody (smak,
zapach) oraz być źródłem wtórnego skażenia mikrobiologicznego [6]. W błonie biologicznej rozwijają się mikroorganizmy psychrofilne- tworzące główny zrąb tej struktury, organizmy patogenne i potencjalnie patogenne oraz organizmy odpowiedzialne za
intensyfikację procesów biokorozji [4, 5, 9].
Wyniki licznych badań wskazują, że około 95% wszystkich mikroorganizmów
w systemach dystrybucji wody jest obecnych w postaci błony biologicznej [9]. Jednak
dane na temat bioróżnorodności mikrobiologicznej biofilmu są znikome. Niewiele
badań koncentruje się na identyfikacji bakterii w systemach wodociągowych. Monitoring i identyfikacja mikroorganizmów w tym środowisku opiera się głównie na izolacji drobnoustrojów metodą pośrednią- hodowla na podłożach mikrobiologicznych
[11]. Stosowane metody mikrobiologii klasycznej pozwalają określić ogólną liczbę
mikroorganizmów planktonicznych oraz skupiają się na organizmach wskaźnikowych,
takich jak np. E.coli [6, 2]. Metody molekularne również nie są powszechnie stosowane w tej dziedzinie, przede wszystkim ze względu na problemy z pozyskaniem materiału badawczego [1]. Większość rozpoznanych do tej pory bakterii należy do typu
Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes i Bacteroidetes [9, 11]. Stwierdzono również, że wśród organizmów obecnych w sieci wodociągowej, zarówno wolno pływających jak i tworzących biofilm dominują przedstawiciele rodzaju Pseudomonas [4].
Analiza sekwencji 16S rDNA zwiększa wiedzę o bioróżnorodności mikroorganizmów w sieci wodociągowej. Badania oparte na reakcji PCR wykazały również obecność licznych sekwencji, związanych z nowymi grupami bakterii [13]. Zaletą zastosowania metod molekularnych do analizy gatunkowej biofilmu jest możliwość
wykrycia niechorobotwórczych gatunków, które mogą się rozmnażać w systemie dystrybucji wody [7].
Klasyczne metody hodowli mikroorganizmów pozwalają na izolację tylko 1-10 %
wszystkich mikroorganizmów ze środowiska [12]. Takie mikroorganizmy znajdują się
w stadium VBNC (ang. viable but nonculturable) czyli są żywe, ale niehodowlane
[8 10; 18]. Jedną z metod pozwalającą na szczegółową analizę i określenie składu
gatunkowego jest metoda MIDI-FAME opracowana przez firmę Microbial ID (Newark, USA) wdrożona do praktyki laboratoryjnej w 1985 roku [14]. Podstawą tej analizy jest założenie, że skład komórkowych kwasów tłuszczowych jest cechą charakterystyczną dla danego gatunku/rodzaju [17]. Analiza kwasów tłuszczowych znalazła
swoje zastosowanie w charakterystyce mikroorganizmów zasiedlających różnorodne
środowiska, jak: gleba, wody słodkie, morskie osady, ale również środowiska działalności urbanistycznej: takie jak sieci wodociągowe i systemy oczyszczania ścieków
[15]. Obecnie istnieją komercyjne bazy danych, które zawierają listę ponad 300 różnych kwasów tłuszczowych i ich pochodnych. Obecnie biblioteka systemu MIDI
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej
53
Sherlock® pozwala na identyfikację około 1500 gatunków bakterii i 200 gatunków
drożdży [19].
W pracy przedstawiono próbę identyfikacji jednego szczepu wyizolowanego
z biofilmu sieci wodociągowej przy zastosowaniu różnych metod analitycznych.
2. MATERIAŁY I METODY
2.1. IDENTYFIKACJA WYBRANEGO SZCZEPU METODAMI KLASYCZNYMI I TESTAMI
BIOCHEMICZNYMI
Badany szczep został wyizolowany z błony biologicznej wrocławskiej sieci wodociągowej i wysiany na następujące podłoża mikrobiologiczne: SS (Salmonella, Shigella), ENDO (drobnoustroje fermentujące laktozę) i , MacConkey (bakterie gramujemne
fermentujące laktozę), BCYE (bakterie z rodzaju Legionella), King B (wstępna identyfikacja Pseudomonas aeruginosa), Kalinienko (mikroorganizmy heterotroficzne
żelaziste), Jacobsen (bakterie tionowe), Tauson (bakterie desulfurykacyjne), Scotten
(bezbarwne bakterie siarkowe), Winogradski (bakterie żelaziste) oraz podłoże do hodowli mikroorganizmów manganowych. Dodatkowo przeprowadzono barwienie Grama oraz analizę testem Enterotest16. Zestaw umożliwia przeprowadzenie identyfikacji
szczepów za pomocą szesnastu testów biochemicznych .Dodatkowo oznaczono betagalaktozydazę i oksydazę.
2.2. IDENTYFIKACJA WYBRANEGO SZCZEPU METODAMI MOLEKULARNYMI
Izolacja genomowego DNA została przeprowadzona z użyciem zestawu Extractme
DNA Bacteria z zastosowaniem odrębnych protokołów dla bakterii gramujemnych
i gramdodatnich. Kontrola jakości wyizolowanego DNA została przeprowadzona
w 1% żelu agarozowym. Następnie otrzymany produkt poddano amplifikacji ze starterami 9F 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′; 1512R 5′-ACG GCT ACC TTG
TTA CGA CTT-3′. 25 µl mieszaniny reakcyjnej zawierało 0,5 µl wyizolowanego
DNA, 2,5 µl 10xbuforu PCR (100mM Tris-HCl, pH = 9, 15 mM MgCl2 i 500 mM
KCl), po 1 µl każdego startera (10 µM), 1 µl dNTP, 0,25 U polimerazy TaqI i sterylną
wodę dejonizowaną. Reakcja PCR została przeprowadzona według poniższego schematu (Tab.1):
54
I. BIEDROŃ i in.
Tab.1. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej badanego szczepu
Etap
Początkowa
denaturacja
Denaturacja
Hybrydyzacja
Elongacja
Elongacja
Temperatura [⁰C]
Czas trwania [s]
95
300
95
52
72
72
60
60
120
240
Liczba cykli
1
30
1
Otrzymany fragment o wielkości około 1500 pz mieści się w rejonie genu kodującego podjednostkę rybosomalną 16S. Mieszaninę reakcyjną rozdzielono w 1,5% żelu
agarozowym, w celu kontroli jakości amplifikowanego produktu. Następnie produkt
PCR został wycięty z żelu i oczyszczony zestawem ExtractMe DNA Gel-Out. Otrzymane produkty PCR zostały zsekwencjonowane przy użyciu analizera 3730 XL DNA
. Uzyskane wyniki zostały analizowane z wykorzystaniem bazy danych NCBI oraz
programu BLAST i CLC DNA Workbench 6.
2.3. IDENTYFIKACJA METODĄ MIDI-FAME
W celu izolacji kwasów tłuszczowych odważano 40-45 mg hodowli bakteryjnej
w probówkach firmy Pyrex o objętości 30 ml. Do próbki wprowadzano 1 ml odczynnika R1 (mieszanina 45 g NaOH, 150 ml wody destylowanej, 150 ml CH3OH), a następnie mieszano przez 10-20 sekund. Saponifikacja, prowadzi do lizy komórek bakteryjnych i uwolnienia z lipidów kwasów tłuszczowych oraz przekształcenia ich w sole
sodowe. Następnie zawartość probówek ogrzewano w łaźni wodnej o temperaturze
100⁰C przez 30 minut. Po tym czasie próbki ochładzano, a następnie dodano 2 ml
odczynnika R2 (325 ml 6 N HCl, 275 ml CH3OH), co prowadziło do powstania lotnych pochodnych estrów metylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych (FAMEs).
Po dodaniu odczynnika R2 próby mieszano przez 10-20 sekund i inkubowano ponownie w łaźni wodnej o temperaturze 80⁰C przez 10 minut. Ekstrakcji dokonano przez
wprowadzenie do probówek 1,25 ml odczynnika R3 (200 ml C6H14, 200 ml
CH3OC(CH3)3) i delikatne mieszanie ich zawartości przez 10 minut. Na tym etapie
następuje przeniesienie FAMEs z fazy wodnej (dolnej) do organicznej (górnej). Po
rozdzieleniu się faz zbierano górną fazę organiczną i przenoszono do nowych probówek. Próbki przemywano 3 ml odczynnika R4 (10,8 g NaOH, 900 ml H2O(d)), w celu
usunięcia wolnych, niezmetylowanych kwasów tłuszczowych i delikatnie mieszano
przez 5 minut. Kiedy pojawiała się emulsja dodawano kilka kropli nasyconego roztworu chlorku sodu i ponownie delikatnie mieszano. Górną fazę organiczną, zawierającą ekstrakt kwasów tłuszczowych, przenoszono do szklanych naczynek chromatograficznych o objętości 2 ml.
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej
55
Otrzymaną mieszaninę estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAMEs) rozdzielano z użyciem chromatografu gazowego Hawlett-Packard 6890, z kapilarną kolumną fenylo-metylo-krzemionkową i detektorem płomieniowo-jonizacyjnym FID.
Do identyfikacji kwasów wykorzystano oprogramowanie Sherlock firmy MIDI Inc.
w wersji 6.1.
3. WYNIKI BADAŃ
3.1. IDENTYFIKACJA METODAMI KLASYCZNYMI
W wyniku barwienia Grama, badany szczep został określony jako gramujemna pałeczka, posiadająca zdolność fermentacji laktozy Wyniki posiewów na podłoża różnicujące i wybiórcze zebrano w tabeli 2. Na podłożu ENDO zaobserwowano wzrost
metalicznych kolonii, morfologicznie podobnych do kolonii E.coli. Odnotowano również wzrost badanego szczepu na podłożu BCYE, co może wskazywać, że badany
organizm należy do rodzaju Legionella. Badany szczep utlenia mangan oraz wykazuje
cechy żelazistych heterotrofów.
-
-
Bakterie manganowe
-
Bakterie żelaziste
si-
+
Bezbarwne bakterie
arkowe
-
Bakterie desulfurykacyjne
+
Bakterie tionowe
+
Bakterie żelaziste - heterotrofy
Pseudomonas aeruginosa
+
Bakterie z rodzaju Legionella
-
Gramujemne drobnoustroje
fermentujące laktozę
Badany
szczep
Bakterie fermentujące laktoze
Salmonella, Shigella
Tab.2. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej badanego szczepu
-
+
Na podstawie testu biochemicznego stwierdzono, że badany szczep przeprowadza
dekarboksylację lizyny i ornityny oraz rozkłada mocznik. Ponadto wykorzystuje cytrynian sodu jako jedyne źródło węgla, wykazuje również aktywność oksydazową.
Zastosowana tradycyjna metoda hodowli i identyfikacji na podłożach mikrobiologicznych oraz podstawowe testy biochemiczne nie pozwoliły na określenie gatunku ani
rodzaju badanego szczepu.
56
I. BIEDROŃ i in.
3.2. IDENTYFIKACJA METODAMI MOLEKULARNYMI
Na podstawie otrzymanych sekwencji produktu PCR, została przeprowadzona analiza przy użyciu bazy danych NCBI. Najwyższą punktację trafności dopasowania sekwencji miały szczepy Tetrathiobacter kashmirensis, Advenella incenata i Alcaligenes
sp (Rys.1, 2). z podobieństwem sekwencji 99%. Niejednoznaczność przyporządkowania gatunkowego wynika z bardzo wysokiego stopnia podobieństwa genu 16S tych
gatunków.
Rys.1. Wyniki analizy programem NCBI BLAST dla badanego szczepu zamplifikowanego w rejonie 16S
z wykorzystaniem startera ‘forward’.
Rys.2. Wyniki analizy programem NCBI BLAST dla badanego szczepu zamplifikowanego w rejonie 16S
z wykorzystaniem startera ‘reverse’.
Ze względów na brak jednoznacznego przyporządkowania gatunkowego, otrzymane sekwencje zostały porównane z sekwencjami regionu 16S rDNA gatunków wskazanych przez NCBI przy użyciu programu CLC DNA Workbench 6. W wyniku analizy porównawczej wyszczególniono różnice w sekwencji wykluczające Alcaligenes sp.
(niezgodność w obrębie 3 nukleotydów) i T. kachmirensis (niezgodność w obrębie
2 nukleotydów) (Rys.3).
Rys.3. Przykładowy fragment analizy programem CLC Workbench 6 z zaznaczoną jedną różnicą w
sekwencji regionu 16S rDNA między gatunkiem T. kachmirensis. a badanym szczepem.
Badany szczep można przypisać do gatunku A. incenata. Należy jednak pamiętać,
że różnica kilkunukleotydowa nie daje 100% pewności przyporządkowania gatunkowego, gdyż może ona wynikać ze zmienności genetycznej w tym regionie typowej dla
danego gatunku.
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej
57
3.3. IDENTYFIKACJA METODĄ MIDI-FAME
Zawartość kwasów tłuszczowych [%]
100
90
80
70
60
Nienasycone
50
Prostołancuchowe
40
Inne
30
20
10
0
Komórkowe kwasy tłuszczowe
Wyk. 1. Zawartość komórkowych kwasów tłuszczowych.
Stwierdzono, iż największy procent komórkowych kwasów tłuszczowych stanowiły kwasy nienasycone (61,20 %), spośród nich najwięcej wyizolowano16:1 ω7c/16:1
ω6c(33,76 %) i 18:1 ω7c (24,19 %). Natomiast wśród nasyconych kwasów tłuszczowych dominował prostołańcuchowy kwas 16:0 (25,48 %) (Wyk.1.).Analiza porównawcza wyizolowanych FAMEs z bazą Sherlock przypisała badany szczep do gatunku
Pectobacterium-carotovorum-carotovorum z pradopodobieństwem równym 0,5659
lub do Pantoea-agglomerans-GC subgroup C (indeks prawdopodobieństwa =0,4791).
4. WNIOSKI
Szczep Advenella incenata jest stosunkowo słabo poznanym gatunkiem bakterii.
Szczep ten należy do rodziny Alcaligenacea, subklasy ẞ-Proteobacteria. Analiza
kwasów tłuszczowych, jak również testy biochemiczne pokrywają się z danymi literaturowymi, [3]. Jednak brak danych odnośnie tego mikroorganizmu w bazie danych
Sherlock jak i również w książce kodów uniemożliwiło jego bezpośrednią identyfikację tymi metodami. Przeprowadzone analizy potwierdzają założenia Kormasa [7]
i Martiny’ego [11], że na dzień dzisiejszy posiadamy bardzo ograniczoną wiedzę odnośnie ekosystemów tworzących się w sieciach wodociągowych.
Praca wykonana w ramach projektu MNiSW pt. „Bioróżnorodność i kinetyka tworzenia obrostów biologicznych na materiałach technicznych” nr rej.: NN523 751004.
58
I. BIEDROŃ i in.
LITERATURA
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
BERRY D., XI C., RASKIN L., Microbial ecology of drinking water distribution system, Current
Opinion in Biotechnology, 2006, Vol. 17, 297-302.
BURTSCHER M., ZIBUSCHKA F., MACH R., LINDER G., FARNLEITNER A., Heterotrophic
plate count vs. in situ bacterial 16S rRNA gene amplicon profiles from drinking water reveal completely different communities with distinct spatial and temporal allocations in a distribution net,
Water SA, 2009, Vol. 35, 495-504.
COEYNE T., VANLAERE E., SAMYN E., FALSEN E., LARSSON P., VANDEMME P.,
Advenella incenata gen. nov., sp. nov., a novel member of the Alcaligenaceae, isolated from varius
clinical samples, IJSEM, 2005, Vol. 55, 251-256.
DOUTERELO I., SHARPE R., BOXALL J., Influence of hydraulic regimes on bacterial community structure and composition in an experimental drinking water distribution system, Water Research, 2013, Vol. 47, 503-506.
ELHARIRY H., GHERBAWY Y., EL-DEEB B., ALTALHI A., Molecular Identification and
Biofilm-Forming Ability of Culturable Aquatic Bacteria in Microbial Biofilms Formed in Drinking
Water Distribution Networks, Geomicrobiology Journal, 2012, Vol. 29, 561-569.
HENNE K., KAHLISCH L., BRETTAR I., HOFLE M., Analysis of structure and composition of
bacterial core communities in mature drinking water biofilms and bulk water of citywide network in
germany, Applied and Environmental Microbiology, 2012, Vol. 78, 3529-3538.
KORMAS K., NEOFITON C., PACHIADAKI M., KOUFOSTATHI E., Changes of the bacerial
assemblages throughout an urban drinking water distribution system, Environ. Monit. Assess,
2010, Vol. 165, 27-38.
KOZDRÓJ J., Microflora of technogenous wastes characterized by fatty acid analysis, Appl. Environ. Microbiol., 2000, Vol. 60, 149-156.
LIN W., YU Z., CHEN X., LIU R., ZHANG H., Molecular characterization of natural biofilms
from household taps with different materials: PVC, stainless steel, and cast iron in drinking water
distribution system., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, published online.
LITTLEFIELD-WYER J.G., BROOKS P., KATOULI M., Application of biochemical fingerprinting and fatty acid methyl ester profiling to assess the effect of the pesticide Atradex on aquatic microbial communities, Environ. Pollut., 2008, Vol. 153, 393-400.
MARTINY A., ALBRECHTSEN H., ARVIN E., MOLIN S., Identification of Bacteria in Biofilm
and Bulk Water Samples from a Nonchlorinated Model Drinking Water Distribution System: Detection of a Large Nitrite – Oxidizing Population Associated with Nitrospira spp., Applied and Environmental Microbiology, 2005, Vol. 71, No. 12, 8611-8617.
PIOTROWSKA-SEGET Z., MROZIK A., Signature lipid biomarker (SLB) analysis in determining
changes in community structure of soil microorganisms, Pol. J. Environ. Stud., 2003, Vol. 12, 669675.
REVETTA R., MATLIB R., SANTO DOMINGO J., 16S rRNA gene sequence analysis of drinking
water using RNA and DNA extracts as targets for clone library development, Curr. Microbiol.,
2011, Vol. 63, 50-59.
SASSER M., Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids, MIDI Technical Note 101 Microbial ID, Inc., Newark, DE. USA, 1990.
TIMKE M., WANG-LIEU N., ALTENDORF K., LIPSKI A., Fatty acid analysis and spoilage
potential of biofilms from two breweries, Journal of Applied Microbiology, 2005, Vol. 99, 11081122.
WINGENDER J., FLEMMING H., Biofilms in drinking water and their role as reservoir for pathogen, International Journal of Hygiene and Environmental Health., 2011, Vol. 214, 417-423.
Metody identyfikacji mikroorganizmów bytujących w biofilmach sieci wodociągowej
59
[17] ZELLES L., Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization
of microbial communities in soil: a review, Biol. Fertil. Soils, 1999, Vol. 29, 111-129.
[18] ZHANG S .,YU X., SHI X., WEI B., YE L.,., PLFA profiles of drinking water biofilters with different acetate and glucose loadings, Ecotoxicology, 2009, Vol. 18, 700-706.
[19] www.midi-inc.com
METHODS FOR IDENTIFICATION OF BACTERIA FOUND IN BIOFILMS FROM DRINKING
WATER DISTRIBUTION SYSTEM
Biofilms exist in every drinking water distribution system. Its presence is important for public health,
because it can be habitat for many of potentially pathogenic microorganisms. Classic plate count method
gives very limited information about biodiversity of microorganisms inhabiting water supply network.
The use of more advanced techniques (molecular identification, MIDI-FAME) give ability to detect nonpathogenic species which can reproduce in the water distribution system. This paper presents a comparison of the effects of the different identification methods (classical, molecular and biochemical) of the
microorganism isolated from the drinking water distribution system.

Podobne dokumenty