ćwiczenie 3 - ATRINBIOTECH

Komentarze

Transkrypt

ćwiczenie 3 - ATRINBIOTECH
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
ĆWICZENIE 3
DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA
DENATURUJĄCEGO
CZĘŚĆ TEORETYCZNA
Metody badań i cechy w oparciu o które przeprowadzana jest klasyfikacja i identyfikacja
mikroorganizmówh
Struktura zespołów bakterii w glebie nieskażonej i skażonej metalami ciężkimi
DGGE- metoda, jej podstawy teoretyczne i praktyczne
Zastosowanie metody PCR-DGGE
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
1. Analiza molekularna DNA bakterii z gleby pozakorzeniowej i ryzosferowej z
wykorzystaniem metody DGGE.
UWAGA!!! AKRYLAMID I FORMAMID TO ZWIĄZKI TOKSYCZNE!!! PODCZAS
KOLEJNYCH CZYNNOŚCI ZAWSZE UŻYWAJ RĘKAWICZEK!!!
a) Odczynniki.
40% Akrylamid/Bis (37:5;1)
Odczynnik
Ilość odczynnika
Akrylamid
38,93 g
Bis-akrylamid
1,07 g
H2O dejonizowana
Dopełnić do 100 ml
Przefiltrować przez filtr 0,45 u i przechowywać w 4oC
Bufor 50x TAE
Odczynnik
Ilość odczynnika
Stężenie końcowe
Tris base
242,0 g
2M
Lodowy kwas octowy
57,1 ml
1M
0,5 M EDTA pH 8,0
100,0 ml
50 mM
H2O dejonizowana
Dopełnić do 1000 ml
Wymieszać, autoklawować przez 20-30 minut, przechowywać w temp. pokojowej
Bufor 1x TAE
Odczynnik
Ilość odczynnika
Bufor 50x TAE
140 ml
H2O dejonizowana
6860 ml
Objętość końcowa
7000 ml
Procentowość żelu
6%
8%
10%
Wielość rozdzielanych cząsteczek
300-1000 bp
200-400 bp
100-300 bp
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
0% roztwór denaturujący
Żel 6% Żel 8% Żel 10% Żel 12%
40% Akrylamid/Bis 15 ml
20 ml
25 ml
30 ml
Bufor 50x TAE
2 ml
H2O dejonizowana 83 ml
78 ml
73 ml
68 ml
Objętość całkowita 100 ml
Odgazuj przez 10-15 min. Przefiltrować przez filtr 0,45 u i
przechowywać w 4oC w brązowej butelce do 1 miesiąca.
100% roztwór denaturujący
Żel 6% Żel 8% Żel 10% Żel 12%
40% Akrylamid/Bis 15 ml
20 ml
25 ml
30 ml
Bufor 50x TAE
2 ml
Formamid
40 ml
(dejonizowany)
Mocznik
42 g
H2O dejonizowana Do 100 ml
Objętość całkowita 100 ml
Odgazuj przez 10-15 min. Przefiltrować przez filtr 0,45 u i
przechowywać w 4oC w brązowej butelce do 1 miesiąca. Po
wyjęciu z lodówki wymaga on rozpuszczenia.
10% nadsiarczan amonu (APS)
Odczynnik
Ilość odczynnika
Nadsiarczan amonu 0,1 g
H2O dejonizowana
1,0 ml
Przechowywać w -20oC do ok. tygodnia.
b) Objętość żelu.
Żel jest nakładany za pomocą dwóch strzykawek (dla niskiego i wysokiego stężenia
czynnika denaturującego). W zależności od wielkości żelu, rozmiaru spacera dobiera się
odpowiednią objętość żelu pobieranego w strzykawkach. Jest ona nieco większa od
właściwej objętości żelu, co umożliwia właściwe wypełnienie przestrzeni między
szybami.
Rozmiar spacera Rozmiar żelu Objętość w strzykawce Miejsce regulacji objętości
1,00 mm
16 x 16 cm
16 ml
14,5
Objętość żelu to 30 ml
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
c) Podgrzewanie buforu do elektroforezy.
Wypełnić urządzenie 7 l buforu 1x TAE. Ustawić temperaturę na 65oC i włączyć
urządzenie. Czas podgrzewania buforu to ok. 1,5-2 godziny.
d) Składanie kanapki i wylewanie żelu z równoległym gradientem czynnika
denaturującego.
Na większą szklaną szybę połóż spacery a następnie
mniejszą szybę. Ustaw klamry strzałkami do siebie,
włóż w nie szyby i dokręć śruby. Sprawdź czy szyby są
ułożone do siebie równolegle.
Zmontowaną kanapkę umieść w statywie. Poluzuj delikatnie
śruby i wsuń między szyby kartę wyrównującą w celu
ustawienia spacerów. Usuń kartę i zakręć śruby, dociśnij
kanapkę do szarej gąbki. Uszczelnij kanapkę w statywie.
Należy wykonać to dokładnie aby żel nie wyciekł podczas
wylewania.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Przygotuj strzykawki, ustaw w urządzeniu do wylewania
gradientu, ustaw pokrętło (pozycja 14,5). Połącz ze sobą
rurki, które po złożeniu utworzą literę Y. Najkrótszą z
nich połącz z igłą i przymocuj taśmą do szczeliny między
szybami.
Przygotuj odpowiednią objętość roztworów o niskiej i
wysokiej gęstości czynnika denaturującego.
Do każdego dodaj APS, a następnie TEMED.
OD MOMENTU DODANIA TEMED’u ŻEL
ZACZYNA POLIMERYZOWAĆ. W CZASIE 7-10
MINUT NALEŻY WYLAĆ ŻEL!!!
Po pobraniu do strzykawek przygotowanych roztworów
usuń pęcherzyki powietrza i umieść strzykawki w
urządzeniu. Połącz rurki. Delikatnie przekręcaj pokrętło
aż do momentu całkowitego usunięcia żelu ze
strzykawek.
Natychmiast umyj strzykawki i rurki aby żel nie
spolimeryzował w tych elementach.
Ostrożnie włóż grzebień między szyby w celu utworzenia
studzienek.
Żel polimeryzuje ok. 60 minut.
e) Elektroforeza.
Po spolimeryzowaniu żelu usuń grzebień.
Kanapkę wyciągnij ze statywu i połącz z
rdzeniem do elektroforezy.
Jeżeli bufor w aparacie jest już nagrzany,
wyłączyć urządzenie i umieścić rdzeń w aparacie.
Ponownie włączyć urządzenie aby została
osiągnięta odpowiednia temperatura.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
Przed nałożeniem prób należy przemyć kieszonki
buforem. Delikatnie nałóż próby DNA do kieszonek.
Załącz urządzenie.
Żel rozwija się ok. 16 godzin.
f) Wyjmowanie żelu.
Wyciąg rdzeń ze zbiornika. Odepnij kanapkę od rdzenia.
Ściągnij klamry. Podważ mniejszą szybę i zrzuć żel.
g) Barwienie żelu.
Przenieś żel z szyby do naczynia zawierającego 250 ml buforu 1x TAE i 25 µl bromku
etydyny (10 mg/ml). Wybarwianie trwa 5-15 minut. Po tym czasie przenieś żel do
czystego buforu. Odbarwianie trwa 5-20 minut.
Zrobić zdjęcie. Przeprowadzić analizę otrzymanych wyników. Wyciągnąć wnioski.
2. Odczyt z izolacji bakterii z gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej, ryzoplanu metalofitów.
a) Po kilkudniowej inkubacji płytek posianych redukcyjnie sprawdzić, czy uzyskana
hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze kolonie mają taką samą morfologię jak
pobrana kolonia wyjściowa, a więc czy rzeczywiście udało się uzyskać czystą kulturę.
Jeżeli tak, to należy przesiać je na skosy z podłożem agarowym aby stworzyć kolekcję
bakterii gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej, ryzoplanu metalofitów.
3. Odczyt z izolacji bakterii endofitycznych z metalofitów.
a) Tak jak w przypadku powyższego podpunktu należy sprawdzić czy na posianych
redukcyjnie płytkach uzyskano pojedyncze kolonie. Jeżeli tak to należy przesiać je na
skosy z podłożem agarowym aby stworzyć kolekcję bakterii endofitycznych metalofitów.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Podobne dokumenty