Rozdział barwników fotosyntetycznych przy pomocy TLC i RP

Wstęp do biologii z genetyką
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
Ćwiczenie nr 3: Rozdział barwników fotosyntetycznych przy pomocy TLC i RP-HPLC.
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału barwników fotosyntetycznych (chlorofili
i karotenoidów) występujących w natce pietruszki i zapoznanie z widmami UV-Vis tych
związków. Ćwiczenie ma na celu również zapoznanie z dwiema technikami
chromatograficznymi: chromatografią cienkowarstwową (TLC) oraz wysokosprawną
chromatografią cieczową w odwróconym układzie faz (RP-HPLC).
Wstęp:
Barwne związki chemiczne odgrywające kluczową rolę w procesie fotosyntezy
nazywa się barwnikami fotosyntetycznymi lub asymilacyjnymi. Wśród tych związków można
wyróżnić trzy główne grupy: chlorofile, karotenoidy i fikobiliny.
Chlorofile to związki wyłapujące energię świetlną w trakcie fotosyntezy. Absorbują
one światło o długości fali poniżej 480 nm oraz w zakresie 550-700 nm. Światło pomiędzy
tymi zakresami (zielone) nie jest absorbowane przez chlorofile i właśnie z tego powodu części
roślin zawierające te barwniki mają zieloną barwę. Chlorofile zostały odkryte na początku
XX wieku przez Richarda Willstättera i jego współpracowników, a w 1915 roku przyznano
im za to odkrycie Nagrodę Nobla w dziedzinie Chemii. U roślin wyższych można wyróżnić
dwa rodzaje chlorofilu o bardzo zbliżonej budowie, nazwane a i b. Chlorofil a jest głównym
elementem składowym centrów reakcji fotosystemu pierwszego i drugiego, a chlorofil b
wchodzi w skład systemów antenowych, czyli kompleksów zbierających energię świetlną.
Dla roślin wyższych stosunek chlorofilu a do chlorofilu b wynosi zazwyczaj około 3:1.
Inną grupą barwników fotosyntetycznych uczestniczących w procesie fotosyntezy
i występujących w organizmach roślin są karotenoidy. Związki te są zintegrowane z białkami
zbierającymi energię podczas fotosyntezy. Do karotenoidów należą ksantofile, np. luteina,
oraz karoteny, w tym głównie β-karoten. Główną funkcją tych związków jest absorbowanie
energii świetlnej z zakresu, w jakim nie mogą tego robić chlorofile. Co więcej karotenoidy
chronią chloroplasty przed nadmiarem energii, rozpraszając ją, i zabezpieczają przed
reaktywnymi formami tlenu powstającymi podczas fotosyntezy, czyli wykazują aktywność
przeciwutleniającą. W liściach drzew barwa karotenoidów jest maskowana przez zieloną
barwę chlorofili, uwidacznia się to jesienią, kiedy chlorofile są degradowane przez
odpowiednie enzymy. Karotenoidy występują w komórkach roślin wyższych w zdecydowanie
mniejszych stężeniach niż chlorofile.
Odmienną grupę stanowią fikobiliny, które są chromoforami występującymi
w komórkach takich organizmów jak sinice, czy krasnorosty i nieobecne w komórkach roślin
wyższych. Jako jedyne barwniki fotosyntetyczne, wiążą się z białkami rozpuszczalnymi
w wodzie (fikobiloproteinami), które przekazują energię na cząsteczki chlorofili
z pochłoniętych kwantów energii świetlnej. Fikobiliny wykazują fluorescencję i są często
1
Wstęp do biologii z genetyką
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
wykorzystywane w technikach immunofluorescencyjnych jako znaczniki fluorescencyjne
przyłączone do przeciwciał.
Zarówno chlorofile jak i karotenoidy są związkami źle rozpuszczalnymi w wodzie,
co wynika z ich hydrofobowego charakteru. Z tego powodu do ekstrakcji tych związków
z materiału roślinnego stosuje się takie rozpuszczalniki jak aceton, etanol czy chloroform.
Do rozdziału barwników fotosyntetycznych (chlorofili i karotenoidów) można zastosować
chromatografię cienkowarstwową (TLC, ang. Thin Layer Chromatography). Do rozdziału
stosuje się płytki pokryte tlenkiem krzemu (SiO2) lub tlenkiem glinu (Al2O3), które mogą
adsorbować na swojej powierzchni różne cząsteczki. Im dany związek jest bardziej polarny,
tym silniej będzie się wiązał z polarnymi ziarnami tlenku krzemu lub glinu. Natomiast
związki hydrofobowe, czyli mało polarne, słabo oddziałują ze złożem płytki i poruszają się
szybciej wzdłuż niej razem ze stosowanym rozpuszczalnikiem.
Inną techniką umożliwiającą rozdział barwników fotosyntetycznych jest
wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC, ang. High Performance Liquid
Chromatography). Jest to rodzaj chromatografii kolumnowej, w której na skutek oddziaływań
międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi będącymi składnikami analizowanej
próbki a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. HPLC różni się od zwykłej
chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim wprowadzany jest eluent na kolumnę.
Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 barów. Wysokie ciśnienie w takim układzie
jest wynikiem budowy pomp HPLC i wąskich przekrojów stosowanych kapilar, uziarnienia
wypełnienia kolumn (zazwyczaj kilka mikrometrów) i przepływu fazy ruchomej (od ułamków
ml/min w chromatografii analitycznej do nawet kilkudziesięciu ml/min w przypadku
chromatografii preparatywnej). W chromatografii cieczowej bardzo duże znaczenie
dla przeprowadzanego rozdziału ma polarność zastosowanej fazy ruchomej.
Aparatura:
Przygotowanie materiału roślinnego:
Homogenizator mechaniczny, homogenizator ultradźwiękowy, wirówka, filtry strzykawkowe
0,20 μm z membraną RC (regenerowana celuloza), wirówka próżniowa, Vortex, waga
techniczna.
Rozdział TLC:
Arkusz aluminiowy z żelem krzemionkowym 60 (SiO2) do TLC, kapilary szklane
50×1,3 mm, komora chromatograficzna.
Rozdział RP-HPLC:
Chromatograf HPLC Shimadzu (pompy tłokowe, detektor DAD, panel sterujący), kolumna
chromatograficzna Luna (Phenomenex) ze złożem typu C18 (długość 2 cm, średnica
wewnętrzna 2 mm, średnica ziaren złoża 3 μm).
2
Wstęp do biologii z genetyką
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
Odczynniki:
Aceton (F, Xi), eter naftowy tw. 40-600C (F, Xn), toluen (F, Xn), bezwodny etanol (F), octan
amonu, metanol (F, T), woda.
Wykonanie ćwiczenia:
Przygotowanie materiału roślinnego:
1. Posiekać natkę pietruszki na drobne kawałeczki mniejsze niż 1 mm długości. Odważyć
2 g posiekanej natki i przenieść do zlewki pojemności 50 ml.
2. Odmierzyć 25 ml 90% acetonu w wodzie schłodzonego do temperatury -200C i przelać
do zlewki z natką pietruszki.
3. Natkę pietruszki homogenizować w 90% acetonie przez kilka minut przy pomocy
homogenizatora mechanicznego stosując maksymalną moc urządzenia.
4. Następnie
przeprowadzić
homogenizację
przy
pomocy
homogenizatora
ultradźwiękowego przez 2 minuty ustawiając cykl równy 1 i amplitudę 80%.
5. 10 ml otrzymanego ekstraktu barwników przenieść do probówki typu Falkon pojemności
15 ml i wirować przez 10 minut (6000 RPM) w temp. 40C.
UWAGA: W
ROTORZE WIRÓWKI NALEŻY UMIEŚCIĆ DRUGĄ PROBÓWKĘ Z WODĄ W CELU
ZRÓWNOWAŻENIA!
6. Do strzykawki pojemności 2 ml pobrać 1 ml supernatantu barwników w 90% acetonie
i przefiltrować przy pomocy filtru strzykawkowego 0,20 μm z membraną RC
do probówki 1,5 ml typu Eppendorf (roztwór przeznaczony do rozdziału RP-HPLC).
7. Pozostałą część supernatantu po wirowaniu należy rozpipetować po 1 ml do 4 probówek
1,5 ml typu Eppendorf i osuszyć przy pomocy wirówki próżniowej w ciągu 1 godziny
(temp. 500C). Następnie osuszone barwniki w każdej z probówek należy rozpuścić
w 100 μl mieszaniny elucyjnej do rozdziału TLC (patrz poniżej) i krótko wymieszać
przy pomocy Vortexu do całkowitego rozpuszczenia osadu barwników (roztwory
przeznaczone do rozdziału TLC).
Rozdział TLC:
8. Na płytce TLC zaznaczyć ołówkiem linię startu (1 cm od dolnej krawędzi).
9. Próbkę badanego ekstraktu należy nanieść kilkakrotnie przy pomocy bardzo cienkiej
szklanej kapilary na płytkę w miejscu zaznaczonej ołówkiem linii startu, do uzyskania
plamki o małej średnicy i intensywnej barwie.
10. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej zawierającej odpowiedni eluent
(mieszanina eteru naftowego tw. 40-600C, toluenu, bezwodnego etanolu w stosunku
objętościowym 8:3:2). Chromatogram należy rozwijać do czasu, gdy eluent znajdzie się
w odległości 0,5 cm od górnej krawędzi płytki. Należy ją wyjąć za pomocy pęsety
oraz zaznaczyć przy pomocy ołówka czoło rozpuszczalnika i obrysować poszczególne
plamki.
3
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
Wstęp do biologii z genetyką
11. Po wysuszeniu płytki obliczyć Rf dla poszczególnych barwników. Wiedząc, że w tych
warunkach wartości Rf wynoszą odpowiednio: β-karoten: 0,80 – 0,95; feofityna: 0,65 –
0,70 chlorofil a: 0,60 – 0,70; chlorofil b: 0,50 – 0,60; ksantofile: 0,20 – 0,50 należy
zidentyfikować barwniki w badanej roślinie.
Rozdział RP-HPLC:
12. Zapoznać się z budową stosowanej aparatury chromatograficznej i porównać
ze schematem przedstawionym na rys. 1.
13. Otworzyć aplikację Shimadzu Class-VP (ikona Class-VP na pulpicie) i wybrać
‘Instrument1’.
Rys. 1. Schemat przedstawiający system chromatograficzny stosowany podczas rozdziału barwników
fotosyntetycznych.
14. Wybrać File / Method / Open, a następnie otworzyć folder i wybrać odpowiednią metodę:
(C:) / Class-vp / biologia i genetyka / Metoda1. Metoda ta zawiera informacje
o stosowanym gradiencie fazy ruchomej podczas rozdziału chromatograficznego.
Stosowane są dwa roztwory: Faza A o składzie: 0,5 M octan amonu w wodzie : metanol
(20:80 v/v) oraz Faza B: aceton : metanol (20:80 v/v). W trakcie analizy stężenie
poszczególnych faz zmienia się jak na rys. 2. Szybkość przepływu fazy ruchomej
podczas całego rozdziału wynosi 500 μl/min.
Procent fazy B [%]
100
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Czas [min]
Rys. 2. Wykres przedstawiający skład fazy ruchomej podczas rozdziału chromatograficznego.
15. Należy upewnić się, że lampa wolframowa detektora jest włączona (świeci się kontrolka
‘W’ na module detektora). Jeśli nie, należy ją włączyć wybierając ikonę
w górnym
menu programu. Na kontrolerze systemu (górny moduł HPLC) wcisnąć przycisk ‘act’
(ang. active). Zaświeci się zielona kontrolka sygnalizująca rozpoczęcie pracy systemu
oraz automatycznie zostaną uruchomione pompy.
4
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
Wstęp do biologii z genetyką
650
466
b) Chlorofil b
665
432
a) Chlorofil a
417
469
(418)
409
h) Feofityna
665
412
437
466
g) Neoksantyna
446
474
(423)
f) Zeaksantyna
440
470
e) Wiolaksantyna
d) Luteina
441
450
478
c) β-Karoten
Rys. 3. Widma absorpcyjne barwników roślinnych w zakresie 370 - 800 nm: a) chlorofil a, b) chlorofil b,
c) β-karoten, d) luteina, e) wiolaksantyna, f) zeaksantyna, g) neoksantyna, h) feofityna.
5
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
Wstęp do biologii z genetyką
16. Przepłukać pięciokrotnie pętlę wstrzykową 90% acetonem przy pomocy strzykawki,
a następnie wprowadzić badaną próbkę (przygotowany wcześniej ekstrakt barwników
roślinnych) do pętli wstrzykowej pojemności 5 μl (zawór w pozycji Load).
UWAGA: PODCZAS
WPROWADZANIA PRÓBKI DO PĘTLI WSTRZYKOWEJ W STRZYKAWCE NIE
MOGĄ ZNAJDOWAĆ SIĘ ŻADNE PĘCHERZYKI POWIETRZA!
17. Wybrać w górnym pasku menu ikonę
(Single Run) i wprowadzić następujące dane:
Sample ID: analiza_’numer grupy ćwiczeniowej’
Method:
C:\CLASS-VP\biologia i genetyka\Metoda1.met
Data path: C:\CLASS-VP\biologia i genetyka
Data file: analiza_’numer grupy ćwiczeniowej’
Czynności te należy zakończyć wybierając ‘Start’.
18. Na pytanie czy rozpocząć zapis danych (Start Acquisition) wybrać ‘tak’ i równocześnie
przekręcić zawór wstrzykowy w pozycję ‘Inject’. Następnie można wyjąć strzykawkę
z zaworu wstrzykowego.
19. Po zakończeniu analizy na kontrolerze systemu ponownie wcisnąć przycisk ‘act’
oraz przestawić zawór wstrzykowy w pozycję ‘Load’ i przepłukać pięciokrotnie pętlę
wstrzykową 90% acetonem.
20. Dla każdego piku widocznego na chromatogramie wykreślonym dla fali o długości
440 nm odczytać czas retencji. Następnie wyświetlić widma absorpcyjne dla wszystkich
obserwowanych związków i dokonać analizy jakościowej porównując uzyskane widma
absorpcyjne z widmami przedstawionymi na rys. 3. Dlaczego dla neoksantyny
i wiolaksantyny widoczne są po dwa oddzielne piki różniące się czasami retencji?
Czy na chromatogramie wykreślonym dla fali o długości 440 nm można zaobserwować
pik pochodzący od feofityny? Uzasadnij odpowiedź.
21. Uzyskane wyniki należy porównać z wynikami otrzymanymi z TLC.
Zagadnienia do opracowania:
Zagadnienia dotyczące fotosyntezy i barwników fotosyntetycznych oraz chromatografii
cieczowej.
Przykładowe pytania:
1. Jakie jest sumaryczne równanie fotosyntezy i jaki barwnik odgrywa kluczową rolę w tym
procesie?
2. Co to jest siła asymilacyjna i do czego jest wykorzystywana?
3. W jakich komórkach i jakich przedziałach komórkowych zlokalizowane są barwniki
fotosyntetyczne?
4. Jaką rolę pełnią w roślinach wyższych karotenoidy i które elementy struktury tych
cząsteczek są odpowiedzialne za te właściwości?
5. Jakie jest ewolucyjne pochodzenie chloroplastów i co tego dowodzi?
6
Wstęp do biologii z genetyką
Katedra Biochemii i Neurobiologii
Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki AGH
6. Jaka jest różnica w strukturze cząsteczek chlorofilu a i b?
7. Jak rozdzielone są faza jasna i ciemna fotosyntezy u roślin C4 i CAM. Z czym związane
są te przystosowana?
8. Niektóre bakterie mogą pochłaniać promieniowanie o długości fali 1000 nm.
a) Jaka jest energia (w kJ) mola fotonów o tej długości fali?
b) Podaj maksymalny wzrost potencjału utleniająco-redukcyjnego (ΔE) na skutek
indukcji fotonem o długości fali 1000 nm.
c) Jaka jest minimalna liczna fotonów o tej długości fali, potrzebna do powstania ATP
z ADP i Pi, zakładając, że ΔG dla fosforylacji wynosi 50,2 kJ·mol-1.
9. Zdefiniuj pojęcia: transmitancja, absorbancja, widmo absorpcyjne, molowy współczynnik
absorpcji (ekstynkcji).
10. Czym różni się chromatografia w odwróconym układzie faz od chromatografii
w normalnym układzie faz? Który rodzaj chromatografii jest stosowany podczas
ćwiczenia i na którym etapie?
Literatura:
1. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer, Biochemia, Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa 2005, Rozdział 19 i 20, str. 527-576
2. Peter Williams Atkins, Chemia fizyczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa
2007, Rozdział 17 (Charakterystyka przejść elektronowych), str. 479-486
3. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), Katedra Analizy Środowiska,
Uniwersytet Gdański, Gdańsk 2007 (opracownie dostępne na stronie internetowej:
http://www.chem.ug.edu.pl/analiza/dydaktyka/slady_hplc.pdf)
7