Rozdzia³ mieszaniny wybranych kwasów żółciowych technik¹ TLC

Rozdzia³ mieszaniny wybranych kwasów ¿ó³ciowych
technik¹ TLC na p³ytkach aluminiowych pokrytych
mieszanin¹ ¿elu krzemionkowego 60 i ziemi
okrzemkowej F254 impregnowanych kationami Cu(II),
Ni(II), Fe(II) oraz Mn(II)
Zak³ócenie
Znaczenie analizy
homeostazy
specjacyjnej
oksydacyjnej
dla oceny
hepatocytów...
siedlisk
Elektrogastrografia
roœlinFitoterapia
leczniczych
jako
przeziêbienia
narzêdzie do
ze szczególnym
bezinwazyjnej
Niedociœnienie
uwzglêdnieniem
oceny wp³ywu
ortostatyczne
Nrleków
czosnku
2/2008
...
Separation of selected bile acids by TLC. Separation on mixture of silica gel 60 and
kieselguhr F254 aluminum plates impregnated with Cu (II), Ni(II), Fe(II) and Mn (II) cations
dr n. chem. Ma³gorzata Do³owy
Zak³ad Chemii Analitycznej, Wydzia³ Farmaceutyczny z Oddzia³em Medycyny Laboratoryjnej,
Œl¹ski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Zak³adu: dr hab. n. chem. Alina Pyka, Prof. Œ.U.M.
Streszczenie
Celem badań były następujące kwasy żółciowe:
cholowy (C), glikocholowy (GC), glikolitocholowy
(GLC), deoksycholowy (DC), chenodeoksychlowy
(CDC), glikodeoksycholowy (GDC) i litocholowy
(LC). Do rozdziału w/w kwasów żółciowych techniką adsorpcyjnej chromatografii cienkowarstwowej
w temperaturze 18oC zastosowano płytki aluminiowe do TLC pokryte mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 (#1.05567,
E. Merck) impregnowane 1%, 2,5% oraz 5% wodnymi roztworami następujących soli: CuSO4,
NiSO4, FeSO4 oraz MnSO4. Mieszaninę n-heksan
/octan etylu / kwas octowy w stosunkach objętościowych: 22:20:5, 25:20:2, 25:20:5, 25:20:8 i
22:22:5 zastosowano jako fazy ruchome. Fazy te nie
były optymalne do rozdziału w/w kwasów w temperaturze 18oC na nieimpregnowanym żelu krzemionkowym i jego mieszaninie z ziemią okrzemkową. Za najbardziej efektywne do rozdziału kwasów
żółciowych na impregnowanym nośniku uznano te
fazy ruchome w przypadku których dla wszystkich
par sąsiadujących na chromatogramach kwasów
żółciowych uzyskano DRFł0,05 i RS >1. Na podstawie przeprowadzonych badań zaobserwowano,
że impregnacja mieszaniny żelu krzemionkowego i
ziemi okrzemkowej znacznie poprawia rozdział par
kwasów żółciowych GC/GDC i C/GLC, które słabo
rozdzielały się na nieimpregnowanych płytkach
#1.05567 w temp. 18oC. Ponadto stwierdzono,
!"
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Abstract
The aim of this work was to examine selected
bile acids: cholic acid (C), glycocholic acid (GC),
glycolithocholic acid (GLC), deoxycholic acid (DC),
chenodeoxycholic acid (CDC), glycodeoxycholic acid
(GDC) and lithocholic acid (LC). In the present
study, to separate a/m bile acids using adsorption
thin layer chromatography at 18oC, the aluminum
plates precoated with silica gel 60 and Kieselguhr
F254 mixture (#1.05567, E.Merck), were
impregnated with 1%, 2.5% and 5% aqueous
solutions of the following salts: CuSO4, MnSO4,
NiSO4 and FeSO4. The mixtures of n-hexane/ethyl
acetate/ acetic acid in the volume compositions:
22:20:5, 25:20:2, 25:20:5, 25:20:8 and 22:22:5
were used as mobile phases. These mobile phases
were not effective for the separation of bile acids on
non impregnated chromatographic plates at 18oC.
The plates impregnated with the salts whose
application resulted in DRFł0.05 and RS >1 for all
neighboring pairs of examined bile acids were
considered the most effective for bile acids
separation. It was observed that impregnation of
plates precoated with a mixture of silica gel 60 and
Kieselguhr F254 using aqueous solutions of
CuSO4, MnSO4, NiSO4 and FeSO4 improved the
separation of GC/GDC and C/GLC, which
separated poorly on plates #1.05567 at 18oC.
Moreover, it was stated that impregnation of TLC
plates with the use of some inorganic salts allows
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
Nr 2/2008
ROZDZIA£ MIESZANINY WYBRANYCH KWASÓW ¯Ó£CIOWYCH
iż impregnacja zastosowanych płytek chromatograficznych niektórymi solami umożliwia całkowity
rozdział trudnych do rozdzielenia ze względu podobną strukturę chemiczną kwasów CDC i DC
w porównaniu z ich rozdziałem na nieimpregnowanym nośniku.
for complete separation difficult to resolution
considering similar chemical structure bile acids:
DC and CDC in comparison with the separation
on non impregnated plates.
słowa kluczowe: kwasy żółciowe, adsorpcyjna TLC,
żel krzemionkowy, ziemia okrzemkowa F254, płytki
aluminiowe, impregnacja kationami metali
key words: Bile acids, Adsorption TLC, Silica gel,
Kieselguhr F254, Aluminum plates, Impregnation with
metal cations
WSTÊP
Kwasy żółciowe są związkami o budowie steroidowej powstającymi w wyniku utleniania cholesterolu.
Odgrywają one ogromną rolę w trawieniu tłuszczów
oraz pobudzają wątrobę do tworzenia i wydzielania
żółci [1]. Niektóre kwasy żółciowe jak kwas chenodeoksycholowy, dehydroholowy czy ursodeoksycholowy
stosowane są w postaci odpowiednich preparatów
farmaceutycznych w leczeniu kamicy żółciowej oraz
w celu zwiększenia wydzielania żółci czyli jako środki
żółciotwórcze i żółciopędne. Badania kliniczne dowodzą, że oznaczanie zawartości pierwotnych kwasów
żółciowych w żółci noworodków może być wskaźnikiem zaburzeń rozwoju morfologicznego ich wątroby
oraz przepływu żółci [2]. Stąd też wynika ogromna
potrzeba opracowania skutecznych i szybkich metod
do identyfikacji i ilościowego oznaczania kwasów
żółciowych w próbkach biologicznych (żółci ludzkiej)
i preparatach farmaceutycznych (np. Ursofalk, Chenofalk, Dehydrochol). Wśród metod analitycznych stosowanych do badania tożsamości i jakości preparatów farmaceutycznych oraz próbek biologicznych nadal największym uznaniem cieszy się chromatografia
cienkowarstwowa (TLC), ze względu na niskie koszty
oraz prostotę wykonania takich analiz.
W niniejszej pracy podjęto próbę określenia wpływu modyfikacji fazy stacjonarnej na rozdział mieszaniny wybranych kwasów żółciowych techniką adsorpcyjnej TLC. Najczęściej stosowaną metodą modyfikacji
fazy stacjonarnej jest jej impregnacja przy użyciu odpowiednich soli nieorganicznych lub parafiny [3-5].
W pracy przeprowadzono rozdział mieszaniny następujących kwasów żółciowych: cholowego (C), glikocholowego (GC), glikodeoksycholowego (GDC),
chenodeoksycholowego (CDC), deoksycholowego
(DC), litocholowego (LC) i glikolitocholowego (GLC).
Kwasy żółciowe rozdzielano na płytkach aluminiowych
pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego i ziemi
okrzemkowej i impregnowanych wodnymi roztworami 1%; 2,5 i 5% CuSO4, MnSO4, FeSO4 i NiSO4.
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
Mieszaninę n-heksan/octan etylu/kwas octowy w różnych stosunkach objętościowych (które nie były optymalne do rozdziału w/w kwasów w temperaturze 18oC
na nieimpregnowanym żelu krzemionkowym i jego
mieszaninie z ziemią okrzemkową) zastosowano jako
fazę ruchomą do rozdziału w/w kwasów [6,7].
MATERIA£Y I ODCZYNNIKI
Składniki fazy ruchomej: n-heksan (E. Merck),
octan etylu (POCh, Gliwice), kwas octowy 99,5%
(POCh, Gliwice) zostały zastosowane do rozdziału
mieszaniny kwasów żółciowych techniką adsorpcyjnej TLC. Do badań wykorzystano roztwory metanolowe następujących kwasów żółciowych: C, DC, CDC,
LC, GLC, GDC i GC (St. Louis, Sigma Company,
USA) o stężeniu 50 mg/10 mL. Kwas siarkowy, 95%
(Chempur, Piekary Śląskie) zastosowano do wizualizacji plamek badanych kwasów żółciowych. Wodne
roztwor y następujących soli: CuSO 4 ·5H 2 O,
MnSO4·7H2O, FeSO4 ·7H2O i NiSO4 ·7H2O (POCh,
Gliwice) użyto do impregnacji stosowanych płytek
chromatograficznych.
METODY
Impregnacja fazy stacjonarnej przy użyciu kkaaFee (II) i Ni (II)
tionów Cu (II), Mn (II), F
Aluminiowe płytki do chromatografii cienkowarstwowej pokryte mieszaniną żelu krzemionkowego 60
i ziemi okrzemkowej F254 (#1.05567) zanurzano na
30 sekund w wodnych roztworach następujących soli:
CuSO4, MnSO4, FeSO4 i NiSO4 o stężeniu 1%, 2,5%
oraz 5%. Po impregnacji płytki suszono w temp. pokojowej (18oC) przez 24 h. Zmodyfikowane płytki
zastosowano do rozdziału badanych kwasów żółciowych techniką adsorpcyjnej TLC.
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
!#
ROZDZIA£ MIESZANINY WYBRANYCH KWASÓW ¯Ó£CIOWYCH
Adsorpcyjna chromatografia
cienkowarstwowa
Rozdział siedmiu badanych kwasów żółciowych
przeprowadzano w temp. 18oC na płytkach do TLC
pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego i ziemi
okrzemkowej (E. Merck, # 1.05567). Przed użyciem
płytki aktywowano w temp. 120oC przez 30 minut.
Mikropipeta (5μl, Camag, Szwajcaria) została użyta
Nr 2/2008
do nanoszenia na płytki chromatograficzne badanych
kwasów żółciowych w ilości 15μg każdy w postaci
metanolowych roztworów. Płytki rozwijano w temp.
18 oC w klasycznej komorze chromatograficznej
20cm×20cm (Camag, Szwajcaria) przy użyciu mieszaniny: n-heksan/octan etylu/kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych: 22:20:5;
25:20:2; 25:20:5, 25:20:8 i 22:22:5 jako fazy ru-
Tabela 1. Opis efektów rozdziału poszczególnych par badanych kwasów żółciowych na płytkach aluminiowych pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 (E. Merck, #1.05567) impregnowanych wodnymi roztworami nieorganicznych soli i rozwijanych przy użyciu fazy ruchomej: n-heksan/
octan etylu/kwas octowy w temp. 18oC.
b
W- uzyskano rozdział par sąsiadujących kwasów żółciowych rozdzielanych na mieszaninie żelu krzemionkowego i ziemi okrzemkowej
impregnowanej roztworami wszystkich soli
a
- uzyskano rozdział par sąsiadujących kwasów żółciowych rozdzielanych na mieszaninie żelu krzemionkowego i ziemi okrzemkowej
impregnowanej tylko w/w roztworami soli
!$
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
copyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
Nr 2/2008
ROZDZIA£ MIESZANINY WYBRANYCH KWASÓW ¯Ó£CIOWYCH
chomej. W każdym przypadku użyto 50 ml fazy ruchomej. Płytko rozwijano na wysokość 14cm. Wizualizacji plamek rozdzielanych kwasów żółciowych dokonywano poprzez spryskanie płytek 10% roztworem
H2SO4 i następnie ich ogrzanie w temp. 120oC przez
20 minut. Wartości DRF i RS dla badanych kwasów
żółciowych obliczono według wzorów przedstawionych we wcześniej prezentowanych pracach [6,7].
Obliczone wartości parametrów chromatograficznych
stanowią średnie wartości z pięciu analiz.
WYNIKI I OMÓWIENIE WYNIKÓW
W niniejszej pracy określono wpływ impregnacji
płytek aluminiowych pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 oraz ziemi okrzemkowej F 254
(#1.05567) na rozdział mieszaniny siedmiu wybranych kwasów żółciowych. Jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę n-heksan/octan etylu/kwas octowy
w tych stosunkach objętościowych, które nie były
optymalne do rozdziału mieszaniny kwasów na nieimpregnowanych płytkach #1.05567 w temp. 18oC
czyli 22:20:5, 25:20:2, 25:20:5, 25:20:8 i 22:22:5.
Wcześniejsze badania prowadzone na nieimpregnowanym nośniku pozwoliły zaobserwować szczególne
trudności w uzyskaniu rozdziału kwasów C od GLC
a także GC od GDC i CDC od DC [6,7]. Wymienione
pary kwasów zupełnie nie rozdzielały się na nieimpregnowanych płytkach #1.05567 rozwijanych przy
użyciu fazy ruchomej n-heksan/octan etylu/kwas octowy w stosunku objętościowym 25:20:2. Impregnacja płytek wodnymi roztworami następujących soli:
CuSO4, NiSO4, FeSO4 oraz MnSO4 poprawia rozdział
wszystkich par badanych kwasów żółciowych (Tabela
1). Aczkolwiek rozdział CDC od DC jest możliwy na
płytkach impregnowanych tylko niektórymi solami.
Ponadto stwierdzono że, na płytkach aluminiowych
pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 impregnowanych wodnymi roztworami CuSO4, NiSO4, FeSO4 oraz MnSO4 (1%,
2,5% i 5%) adsorpcja badanych kwasów żółciowych
wzrasta w następującej kolejności: LC, DC, CDC,
GLC, C, GDC, GC w porównaniu z ich rozdziałem
na nieimpregnowanych płytkach, rozwijanych przy
użyciu fazy ruchomej w stosunkach objętościowych:
25:20:2; 22:20:5, 25:20:8 i 25:20:5. Natomiast
wszystkie pary badanych kwasów żółciowych uległy
rozdziałowi na płytkach #1.05567 modyfikowanych
następującymi solami (Tabela 1):
• 2,5% FeSO4 przy użyciu fazy ruchomej 25:20:2
(v/v/v);
• 1% NiSO4 i 1% FeSO4 przy użyciu fazy ruchocopyright © 2008 P.G.K. Media Polska,
ISSN 1425-5073
mej 22:22:5 (v/v/v);
• 2,5% MnSO4, 1% NiSO4, 1% FeSO4 i 2,5%
FeSO4 przy użyciu fazy ruchomej 22:20:5 (v/v/
v);
• 1% CuSO4, 2,5% CuSO4, 1% MnSO4, 2,5%
MnSO4, 5% MnSO4, 1% NiSO4 i 1% FeSO4
przy użyciu fazy ruchomej 25:20:5;(v/v/v);
• 1% FeSO4 i 5% FeSO4 przy użyciu fazy ruchomej 25:20:8 (v/v/v).
WNIOSKI
Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że impregnacja mieszaniny żelu krzemionkowego 60 i ziemi okrzemkowej F254 poprawia i umożliwia rozdział kwasów żółciowych, które nie rozdzielały się na nieimpregnowanym nośniku. Modyfikacja
fazy stacjonarnej na drodze jej impregnacji przy użyciu wodnych roztworów soli nieorganicznych może
być wykorzystywana w diagnostyce laboratoryjnej do
analizy próbek biologicznych np. żółci ludzkiej pacjentów cierpiących na schorzenia wątroby i dróg
żółciowych.
PIŒMIENNICTWO
1. Kostkowski W.: Farmakologia, PZWL, 1998.
2. Lorenc J.: Diagn. Lab. 1996, 32: 285-295.
3. Bhushan R., Parshad V.: Separation of vitamin B
complex and folic acid using TLC plates impregnated with some transition metal ion. Biomed
Chromatogr. 1994, 8 (4): 196-198.
4. Flieger J., Szumiło H., Giełzak-Koćwin K., Matosiuk D.: Effect of impregnation conditions on the
structure and chromatographic behavior of TLC
adsorbents modified with Cu(II) and Ni (II) salts.
J. Planar Chromatogr. - Mod. TLC. 2003, 15: 354360.
5. Grygierczyk G., Wasilewski J., Witkowska M.,
Kowalska T.: Use of complexation TLC to investigate selected monosulfides. Part. I. Silica gel impregnated with Cu (II), Co (II), Ni (II), Mn (II),
Al (II), Cr (III) and Fe (III) cations as stationary
phase. J. Planar Chromatogr. – Mod. TLC. 2003,
16: 11-14.
6. Pyka A., Dołowy M.: Separation of Selected Bile
Acids by TLC. III. Separation on various stationary phases. J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 2004,
27 (16): 2613-2623.
7. Pyka, A., Dołowy M.: Separation of Selected Bile
Acids by TLC. IV. Comparison of Separation of
Studied Bile Acids by the Use of Cluster Analysis.
J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 2004, 27 (19):
2987-2995.
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
!%