Przegląd metod laboratoryjnych stosowanych w diagnostyce

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(2): 147-152
Praca poglądowa • Review Article
Przegląd metod laboratoryjnych
stosowanych w diagnostyce inwazyjnych zakażeń grzybiczych
A review of laboratory methods for diagnosis of invasive fungal infections
Beata Sulik-Tyszka 1, Marta Wróblewska1,2,3
Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny w Warszawie
2
Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
3
Zespół Kontroli Zakażeń Szpitalnych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
1
Streszczenie
Uogólnione zakażenia grzybicze cechują się dużą śmiertelnością pacjentów i są rozpoznawane za życia chorego tylko w 20 – 30% przypadków. Obraz kliniczny tych schorzeń jest zwykle mało charakterystyczny i może przypominać objawy infekcji o etiologii wirusowej
lub bakteryjnej. Do najczęstszych objawów klinicznych inwazyjnych zakażeń grzybiczych należy gorączka, natomiast objawy ze strony
zajętego narządu często nie są swoiste, toteż istotną rolę w potwierdzeniu etiologii grzybiczej tych infekcji i zastosowaniu skutecznej
terapii przeciwgrzybiczej, często ratującej życie pacjenta, odgrywa wczesne wdrożenie diagnostyki laboratoryjnej i właściwa interpretacja wyników zastosowanych testów.
Summary
Systemic fungal infections are characterised by a high mortality rate of patients and are diagnosed before death in only 20 – 30% of
cases. A clinical picture of these diseases is usually not characteristic and may resemble symptoms of a viral or bacterial infection. The
most common clinical presentation of invasive fungal infections is fever, while symptoms of the affected internal organs are often
nonspecific. Therefore, early implementation of laboratory diagnostic tests and proper interpretation of their results are crucial for
confirmation of fungal etiology and administration of effective – often life-saving – antifungal therapy.
Słowa kluczowe: inwazyjne zakażenia grzybicze, lekowrażliwość grzybów, PCR, rozpuszczalne antygeny, zaburzenia odporności
Key words:
antibiotic susceptibility of fungi, immunosuppression, invasive fungal infections, PCR, soluble antigens
Wstęp
Inwazyjne zakażenia grzybicze należą do typowych infekcji
oportunistycznych. Wywoływane są zarówno przez grzyby drożdżopodobne, jak również pleśniowe. Zakażenia grzybami drożdżopodobnymi (obecnymi najczęściej na błonach śluzowych) są
częściej endogenne, zaś grzybami pleśniowymi – egzogenne (ze
środowiska). Czynnikami predysponującymi do zakażeń grzybiczych jest neutropenia (<500 granulocytów/mm3) oraz limfopenia, w tym głównie dotycząca limfocytów CD4+. Duże ryzyko
układowej grzybicy występuje u chorych poddanych chemio– i/
lub radioterapii, leczonych glikokortykosteroidami i lekami immunosupresyjnymi. Grupę ryzyka stanowią też chorzy z nabytym
zespołem upośledzenia odporności i z wrodzonymi niedoborami układu odpornościowego. Skrajne grupy wiekowe (>60 r.ż.
i noworodki) oraz osoby przewlekle niedożywione są również
obarczone dużym ryzykiem rozwoju zakażeń grzybiczych. Pacjenci poddani zabiegom przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych stanowią grupę chorych najwyższego
ryzyka rozwoju grzybicy układowej. Uszkodzenie funkcjonowania
i struktury narządów, a zwłaszcza skóry i błon śluzowych, jest
kolejnym ważnym czynnikiem sprzyjającym zakażeniom grzybiczym. Jest to wynikiem zabiegów chirurgicznych, stosowania
cewników centralnych, dializacyjnych, zabiegów w obrębie klatki
piersiowej, jamy brzusznej. Do zakażeń grzybiczych usposabia
niewydolność nerek, wątroby, przewlekła obturacyjna choroba
płuc (POChP), a także uszkodzenie i zaburzenie funkcji narządów
spowodowane cukrzycą.
Czynnikami warunkującymi rozwój inwazyjnej grzybicy są m.in.
ekspozycja na dany szczep grzyba, stopień jego wirulencji, dawka
zakażająca, wcześniej przebyte zakażenie grzybicze. Układowe
zakażenia wywoływane są najczęściej przez grzyby z rodzaju Candida i Aspergillus, jednak w ostatnich latach rośnie liczba inwazyjnych zakażeń wywołanych przez inne grzyby, zwłaszcza z rodzaju
Fusarium, Trichosporon i Scedosporium [1, 2, 3, 4, 5, 6].
Uogólnione zakażenia grzybicze cechują się dużą śmiertelnością
pacjentów i są rozpoznawane za życia chorego tylko w 20 – 30%
147
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
przypadków. Objawy kliniczne grzybic układowych są zwykle
nieswoiste, mało charakterystyczne (najczęściej gorączka) i mogą
przypominać objawy infekcji o innej etiologii – wirusowej lub
bakteryjnej. Zakażenia grzybicze są szczególnie niebezpieczne
dla chorych z zaburzeniami odporności, zwłaszcza onkohematologicznych, i to w tych grupach pacjentów badania mikologiczne
są najczęściej wykonywane [1, 2, 3, 4].
W diagnostyce laboratoryjnej inwazyjnych zakażeń grzybiczych
– podobnie jak w przypadku infekcji bakteryjnych – stosowane
są badania mikroskopowe, metody hodowlane z identyfikacją
i oznaczeniem lekowrażliwości wyizolowanego szczepu, metody
serologiczne (wykrywanie zarówno antygenów, jak i przeciwciał)
oraz metody molekularne. Próbki do badań mikologicznych należy
pobrać z miejsca toczącego się zakażenia, uwzględniając objawy kliniczne pacjenta. Do badań mikologicznych pobierane są
takie materiały, jak krew, płyny ustrojowe, plwocina, popłuczyny
oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL; bronchoalveolar lavage), aspiraty,
płyn mózgowo-rdzeniowy, bioptaty, materiały śródoperacyjne,
końcówki cewników naczyniowych lub mocz [5, 6, 7]. Zależność
rodzaju pobieranego materiału diagnostycznego od postaci klinicznej grzybicy przedstawiono w tabeli 1.
Należy podkreślić, iż w diagnostyce grzybic inwazyjnych – obok
badań mikologicznych – szczególnie ważną rolę odgrywają
badania obrazowe (np. rtg płuc, tomografia komputerowa) [4].
W aspergilozie płucnej dużo czulszą metodą diagnostyczną jest
tomografia komputerowa, gdyż w 50% przypadków badanych
chorych mimo prawidłowego obrazu radiologicznego klatki piersiowej, w tomografii komputerowej można uwidocznić zmiany
miąższowe typowe dla zakażeń grzybiczych [5].
Badanie mikroskopowe
Ocena mikroskopowa preparatów bezpośrednich ma szczególne
znaczenie w diagnostyce mikologicznej, gdyż umożliwia szybkie stwierdzenie infekcji grzybiczej, a niekiedy nawet wstępną
identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia i tym samym
pomoc w wyborze terapii przeciwgrzybiczej [1, 2, 7]. W wielu
przypadkach technika ta pozwala też ocenić orientacyjnie ilość
grzybów w badanych próbkach materiału klinicznego. Badanie
mikroskopowe preparatu bezpośredniego jest też pomocne w interpretacji dodatniego wyniku hodowli, zwłaszcza w przypadku
izolacji grzyba pleśniowego.
Preparaty bezpośrednie można przygotować z wszystkich rodzajów próbek materiałów klinicznych z wyjątkiem kału. Preparaty
z płynów ustrojowych wykonuje się zawsze z osadu uzyskanego
po odwirowaniu próbki. Bardzo ważna jest właściwa objętość
uzyskanej próbki klinicznej, odpowiedniej dla danego rodzaju
i lokalizacji zakażenia [7].
W diagnostyce mikologicznej stosowane są następujące techniki:
preparaty niebarwione, preparaty rozjaśnione wodorotlenkiem
potasu (KOH) oraz preparaty barwione – metodą Grama (wykrywanie drożdżaków), metodą immunofluorescencji bezpośredniej
lub tuszem chińskim (w przypadku podejrzenia zakażenia Cryptococcus neoformans), a także barwienia histopatologiczne – metodą
PAS (ang. periodic acid-Schiff), Gomoriego w modyfikacji Grocotta
(ang. Grocott-Gomori methenamine-silver stain) lub Giemzy [4, 8].
Dodatni wynik mikroskopowego badania (mikologicznego i/lub
histopatologicznego) materiału biopsyjnego jest pewnym dowodem na rozpoznanie zakażenia grzybiczego [2, 9, 10]. Diagnostyka
grzybic z użyciem badań histopatologicznych omówiona jest
szczegółowo w obszernej pracy poglądowej autorstwa Guarner
i Brandt [11].
Hodowla i identyfikacja szczepów grzybów
Hodowla i identyfikacja szczepu grzyba wyizolowanego z materiału klinicznego nadal stanowi tzw. złoty standard w diagnostyce
grzybic inwazyjnych [7, 11]. Metoda ta pozwala na identyfikację
wyhodowanego grzyba do gatunku i umożliwia ocenę lekowrażliwości danego szczepu. Podobnie jak w przypadku badania
Tabela 1. Materiał diagnostyczny w zależności od postaci klinicznej grzybicy
zakażenie przewodu pokarmowego
przełyk
wątroba, śledziona
żołądek
drogi żółciowe
jama otrzewna
grzybica układu oddechowego
fungemia
fungemia odcewnikowa
grzybica ośrodkowego układu nerwowego
grzybicze zapalenie zatok
grzybicze zapalenie struktur wewnętrznych oka
grzybica układu moczowego
148
wycinek błony śluzowej
bioptat tkanki
sok żołądkowy, wycinek błony śluzowej
żółć
wysięk otrzewnowy
plwocina
popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe
materiał pobrany przez szczoteczkowanie chronione oskrzeli
bioptaty
krew
krew
krew
krew z cewnika naczyniowego
końcówka cewnika naczyniowego
płyn-mózgowo-rdzeniowy
krew
aspirat z zatok lub materiał pobrany endoskopowo
próbka ciała szklistego
mocz
Diagn Lab 2015; 51(2): 147-152
mikroskopowego, czułość tej metody zależy od pobrania próbki
właściwej dla danego rodzaju i lokalizacji zakażenia oraz o odpowiedniej objętości. Mikologiczne hodowle krwi są dodatnie
w 50 – 70% przypadków (drożdżaki), i taki wynik wskazuje na
inwazyjne zakażenie o tej etiologii. W przeciwieństwie do tego
fungemia w przebiegu aspergilozy jest rzadko wykrywana [10, 11].
Wadą metod hodowlanych jest stosunkowo długi okres czasu potrzebny do uzyskania wzrostu i oceny morfologii kolonii, zwłaszcza
w przypadku grzybów pleśniowych. Niestety, brak jest ujednoliconych kryteriów ilościowych, które pozwoliłby na odróżnienie
kontaminacji lub kolonizacji od infekcji [2].
Uniwersalnym podłożem do hodowli grzybów jest agar Sabourauda. W hodowli grzybów zaleca się stosowanie szalek Petriego,
ponieważ zapewniają one odpowiednią powierzchnię izolacyjną i łatwy dostęp do wyrosłych kolonii. Spodziewany czynnik
etiologiczny zakażenia ma wpływ na dobór rodzaju podłoża
hodowlanego (stałe, płynne, suplementowane antybiotykami,
suplementowane lipidami) do izolacji grzybów z materiałów klinicznych, a także na czas i temperaturę inkubacji. Jeśli materiał został pobrany z miejsc pierwotnie niejałowych, należy zastosować
podłoże Sabourauda z dodatkiem chloramfenikolu i gentamycyny
w celu zahamowania wzrostu bakterii [4, 9].
Identyfikacji grzybów dokonuje się na podstawie cech morfologicznych – wyglądu kolonii (awers, rewers), szybkości wzrostu,
preferencji temperaturowych wzrostu, obecności zapachu, gutacji
oraz cech biochemicznych [12]. Do wstępnej identyfikacji grzybów
z rodzaju Candida dostępne są podłoża chromogenne, pozwalające wykryć aktywność enzymatyczną poszczególnych gatunków,
co odzwierciedla się w różnym zabarwieniu kolonii rosnących
na takim podłożu. Do identyfikacji grzybów drożdżopodobnych
stosuje się testy biochemiczne, a obecnie również technikę MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight
mass spectrometry) [13]. Otrzymane widma masowe MALDI-TOF są
analizowane przez program i porównywane z widmami referencyjnymi przechowywanymi w bazie aparatu. Pozwala to na szybkie
zidentyfikowanie (w ciągu kilku minut) czynnika etiologicznego
infekcji, co ma szczególne znaczenie w diagnostyce inwazyjnych
zakażeń grzybiczych u pacjentów z głębokimi zaburzeniami odporności [12, 13, 14].
Ocena lekowrażliwości wyizolowanych szczepów grzybów
Ocena wrażliwości wyizolowanego szczepu na leki przeciwgrzybicze pozwala na dobór prawidłowej terapii [12]. Badanie wrażliwości na antymikotyki przeprowadza się za pomocą komercyjnych
zestawów diagnostycznych lub pasków z gradientem stężeń leku
przeciwgrzybiczego, umożliwiających ocenę wartości najmniejszego stężenia hamującego wzrost grzybów (MIC; minimal inhibitory concentration).
Metoda rozcieńczeniowa – uznawana za „złoty standard” w diagnostyce mikologicznej – jest najbardziej wiarygodna i powtarzalna, jest jednak bardzo pracochłonna i kosztowna. Można stosować
zarówno metodę probówkową, jak i płytkową, wykonując seryjne
rozcieńczenia leku odpowiednio w podłożu płynnym lub stałym.
Wartość MIC wyrażana jest liczbowo w mg/l lub µg/ml.
Badania serologiczne
Testy serologiczne służą do wykrywania rozpuszczalnych antygenów grzybiczych i/lub przeciwciał krążących w surowicy krwi
lub w płynach ustrojowych (tab. 2) [4]. Odczyny serologiczne
odgrywają jednak tylko pomocniczą rolę w wykrywaniu grzybic
Tabela 2. Wybrane testy serologiczne stosowane w rutynowej diagnostyce grzybic inwazyjnych [2, 11, 16, 21, 22, 23]
Antygen / przeciwciało
1,3-beta-D-glukan (BG)
mannan (Mn)
– EIA
mannan (Mn)
– aglutynacja lateksowa
Czynnik etiologiczny zakażenia
Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon
spp.,
Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides
immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii,
Pneumocystis jirovecii.
Test nie wykrywa: Cryptococcus spp., Zygomycetes (rodzaj
Absidia, Mucor, Rhizopus) oraz Blastomyces dermatitidis
(forma drożdżakowa)
Candida spp.
przeciwciała antymannanowe (A-Mn)
mannan (Mn) + przeciwciała antymannanowe (A-Mn)
galaktomannan (GM)
– ELISA
galaktomannan (GM)
– aglutynacja lateksowa
Aspergillus spp.
glukuronoksylomannan (GXM) – ELISA
glukuronoksylomannan (GXM) – aglutynacja lateksowa
Czułość
50 – 100%
(1 pg/ml)
40 – 62%
(0,5 ng/ml)
28%
(2,5 ng/ml)
Swoistość
44 – 98%
98%
86 – 100%
53 – 62,5%
65 – 94%
89,3 – 100%
63 – 100%
90 – 93%
(< 1 ng/ml)
80 – 90%
(15 ng/ml)
60 – 95%
40 – 90%
95,6 – 100%
96 – 100%
100%
95,7 – 99,8%
Cryptococcus spp.
149
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
inwazyjnych, ponieważ istnieje podobieństwo antygenowe między bakteriami a grzybami, co może powodować wystąpienie
wyników fałszywie dodatnich [5]. Z drugiej strony u osób z obniżoną odpornością organizm może nie wytworzyć wykrywalnej
odpowiedzi immunologicznej, tak więc ujemny wynik odczynu
serologicznego nie wyklucza inwazyjnego zakażenia grzybiczego.
Należy podkreślić, iż antygeny krążące grzybów występują w płynach ustrojowych w małych ilościach i są szybko eliminowane,
dlatego testy te nie powinny być wykonywane jednorazowo.
Mannan
Do wykrywania rozpuszczalnego antygenu mannanowego grzybów z rodzaju Candida w surowicy krwi stosuje się testy lateksowe
i odczyny immunoenzymatyczne. Testy lateksowe umożliwiają
szybkie uzyskanie wyniku, swoistość metody wynosi 86 – 100%,
wielocukier mannan wykrywany jest w ilości 2,5 ng/ml. Dużo czulszy jest test immunoenzymatyczny, przy użyciu którego można
wykryć mannan w ilości 0,5 ng/ml.
Galaktomannan
Do wykrywania antygenu krążącego grzybów z rodzaju Aspergillus
– galaktomannanu – również stosuje się testy lateksowe i immunoenzymatyczne. Odczyn lateksowy wykrywa galaktomannan
w ilości 15 ng/ml, natomiast test immunoenzymatyczny – 1 ng/
ml, czułość tej metody jest więc zdecydowanie większa. Dostępny
jest też test do wykrywania składnika ściany komórkowej grzybów – ß-(1,3)-D-glukanu. Czułość (1 pg/ml) i swoistość tego testu
jest wysoka.
Glukuronoksylomannan
Do wykrywania antygenu krążącego grzybów z rodzaju Cryptococcus – glukuronoksylomannanu (GXM) – stosuje się testy lateksowe
i immunoenzymatyczne. Test lateksowy wykrywa glukuronoksylomannan w ilości 7,6 ng/ml. Odczyn immunoenzymatyczny
charakteryzuje się więc dużo większą czułością, gdyż przy jego
użyciu można wykryć 0,63 ng GXM/ml.
Interpretacja wyników badań oznaczania antygenów
grzybiczych
Należy pamiętać, że wykonując te badania często uzyskuje się
wyniki fałszywie dodatnie, np. w przypadku używania błon celulozowych w hemodializie, wacików z gazy podczas zabiegów
operacyjnych lub leczenia pacjenta preparatami immunologicznymi (albuminy, globuliny). Wyniki fałszywie ujemne mogą być
z kolei związane z obecnością w płynach ustrojowych enzymu
– glukanazy – powodującego rozkład ß-(1,3)-D-glukanu, a także
wskutek obecności przeciwciał przeciw galaktomannanowi [2].
Badania serologiczne pozwalają na monitorowanie przebiegu
zakażenia grzybiczego. U chorych z udowodnioną kandydozą
inwazyjną obecność mannanu stwierdzono tylko w 40% przypadków, a przeciwciał – u 53% pacjentów. Przy wykryciu obu
markerów czułość wynosi 80%, a swoistość 93%. Monitorowanie
poziomu tych markerów może przyczynić się do potwierdzenia
fungemii we wczesnym etapie. Obserwacja dynamiki wzrostu
miana przeciwciał anty-mannanowych nie pozwala jednak na
150
rozróżnienie pomiędzy inwazyjną a powierzchniową postacią
kandydozy, a ujemny wynik na obecność przeciwciał anty-mannanowych nie wyklucza inwazyjnej kandydozy [12, 13]. Konieczne
jest każdorazowo połączenie wyników tych testów z obrazem
klinicznym i z wynikami innych badań przeprowadzonych u danego pacjenta.
Badania molekularne
Badania molekularne stosowane są do szybkiej diagnostyki
zakażeń grzybiczych i polegają na wykryciu grzybiczego DNA
w surowicy, płynach ustrojowych (otrzewnowym, opłucnowym,
mózgowo-rdzeniowym, osierdziowym) i/lub w tkankach [13, 15].
Zaletą tych metod jest wysoka czułość i swoistość oraz możliwość
wykonania oznaczeń ilościowych, wadą – brak standaryzacji na
poziomie izolacji DNA i możliwość kontaminacji próbki. Pojedynczy wynik PCR nie świadczy więc o zakażeniu grzybiczym – wskazane jest powtórzenie badania. Należy podkreślić, iż nie zaleca się
stosowania tej techniki w rutynowej diagnostyce mikologicznej,
a jedynie jako metody uzupełniającej [3, 5, 16]. Obecnie trwają
prace nad wdrożeniem w mikologii klinicznej nowych metod
diagnostycznych opartych na badaniach molekularnych [13, 17].
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR; polymerase chain reaction)
polega na powielaniu (amplifikacji) selektywnego odcinka materiału genetycznego – DNA lub RNA – przy użyciu enzymu polimerazy. W metodzie PCR mogą być stosowane startery o sekwencji
charakterystycznej dla danego rodzaju lub gatunku drobnoustroju
[18].
Powielona próbka zawiera taką ilość materiału genetycznego,
która może być łatwo wykryta. Produkty reakcji rozdziela się
w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, a następnie barwi
bromkiem etydyny. Odczyt wykonywany jest za pomocą sond
molekularnych znakowanych biotyną i awidyną lub pierwiastkami
radioaktywnymi. Odczytu końcowego dokonuje się za pomocą
przeciwciał przeciw biotynie znakowanych fluoresceiną.
Technika RAPD (ang. randomly amplified polymorphic DNA) jest
metodą PCR opartą na reakcji z zastosowaniem krótkich starterów
składających się z kilku do kilkunastu (5 – 15) nukleotydów, w których kolejność zasad jest przypadkowa. Temperatura przyłączania
starterów może mieścić się w zakresie 25 – 45°C i jest optymalnie
dostosowana do każdej przeprowadzanej reakcji. Startery przyłączają się w komplementarnym miejscu genomu w zależności od
szczepu. Metoda ta została opisana w 1990 r. przez Williamsa i wsp.
i określa genetyczne pokrewieństwo między szczepami, toteż
znalazła zastosowanie w dochodzeniach epidemiologicznych.
Technikę tę można stosować w typowaniu grzybów z rodzaju
Candida, Aspergillus oraz Trichophyton [4, 18, 19, 20].
Podsumowanie
Diagnostyka grzybic wymaga ścisłej współpracy diagnosty laboratoryjnego z lekarzem klinicystą opiekującym się chorym, gdyż
badania mikologiczne często nie są wystarczające do postawienia ostatecznej diagnozy inwazyjnego zakażenia grzybiczego,
bez uwzględnienia danych klinicznych i wyników innych badań,
Diagn Lab 2015; 51(2): 147-152
zwłaszcza obrazowych. W zaplanowaniu badań laboratoryjnych
oraz właściwej interpretacji ich wyników ważna jest informacja
o objawach klinicznych chorego, stanie jego układu odpornościowego oraz – w wywiadzie – o odbytej przez pacjenta podróży
do innych regionów świata. Należy podkreślić, iż mikologiczne
badania laboratoryjne służą nie tylko do rozpoznania grzybic,
lecz także pomagają w doborze właściwego leczenia, ocenie jego
skuteczności, jak również mogą mieć wartość prognostyczną [2, 3].
useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J Clin Microbiol
1999; 37(5): 1510-1517.
Adres do korespondencji:
dr hab. n. med. Marta Wróblewska
Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej
Warszawski Uniwersytet Medyczny
02-097 Warszawa, ul. Banacha 1a
Tel. +48 22 5991777
e-mail: [email protected]
Piśmiennictwo
1.
Arendrup MC, Bille J, Dannaoui E, et al. ECIL-3 classical diagnostic procedures
for the diagnosis of invasive fungal diseases in patients with leukemia. Bone
Zaakceptowano do publikacji: 18.04.2015
Marrow Transplant 2012; 47: 1030-1045.
2.
Barton RC. Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis: from diagnosis to prediction of outcome. Scientifica 2013; http://dx.doi.org/10.1155/2013/459405.
3.
Oz Y, Kiraz N. Diagnostic methods for fungal infections in pediatric patients:
microbiological, serological and molecular methods. Expert Rev Anti Infect
Ther 2011; 9(3): 289-298.
4.
Malhotra S, Sharma S, Bhatia NJK, et al. Recent diagnostic techniques in mycology. J Med Microb Diagn 2014; 3: 3.
5.
Seferyńska I, Pałynyczko G, Warzocha K, Układowe zakażenia grzybicze: etiologia, rozpoznanie i nowe możliwości lecznicze. Acta Haematol Pol 2005; 36(1):
45-54.
6.
Biliński P, Seferyńska I, Warzocha K. Diagnostyka i leczenie układowych zakażeń
grzybiczych w onkohematologii. Onkol Prakt Klin 2008; 4(1): 15-24.
7.
Reiss E, Tanaka K, Bruker G, et al. Molecular diagnosis and epidemiology of
fungal infections. Med Mycol 1998; 36(Suppl 1): 249-257.
8.
Haque A. Special stains use in fungal infections. Connection 2010; 187-194.
9.
Krzyściak P, Skóra M, Macura AB. Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka,
2011.
10. Cuenca-Estrella M, Verweij PE, Arendrup MC, et al. ESCMID* guideline for the
diagnosis and management of Candida diseases 2012: diagnostic procedures.
Clin Microbiol Infect 2012; 18(Suppl. 7): 9-18.
11. Guarner J, Brandt ME. Histopathologic diagnosis of fungal infections in the 21st
century. Clin Microbiol Rev 2011; 24(2): 247-280.
12. Dzierżanowska D. Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń grzybiczych. Med
Prakt 2009, 119: 35-39.
13. Kozel TR, Wickes B. Fungal diagnostics. Cold Spring Harb Perspect Med 2014;
4: a019299.
14. Farmakiotis D, Kontoyiannis DP. Emerging issues with diagnosis and management of fungal infections in solid organ transplant recipients. Am J Transplant
2015 (in print).
15. Kędzierska A, Pietrzyk A, Kędzierska J, i wsp. Immunodiagnostyka inwazyjnych
zakażeń grzybiczych o etiologii Aspergillus Candida w chorobach rozrostowych
układu krwiotwórczego, Acta Haematol Polonica 2006; 2: 539-551.
16. Atkins SD, Clark IM. Fungal molecular diagnostics: a mini review. J Appl Genet
2004; 45(1): 3-15.
17. Seweryn M, Hołowiecki J, Wojnar J, i wsp. Aktualne rekomendacje w leczeniu
infekcji grzybiczych u pacjentów w neutropenii i w nowotworowych zaburzeniach odporności. Acta Haematol Pol 2006; 2: 167-183.
18. Procop GW. Molecular diagnostics for invasive fungal infections. A call for refinement and implementation. J Mol Diagn 2010; 12: 17-19.
19. Birmingham N, Luettich K. Polymerase chain reaction and its applications. Curr
Diagn Pathol, 2003; 9: 159-164.
20. Garczewska B, Dzierżanowska D. Zastosowanie metod biologii molekularnej
w rozpoznawaniu zakażeń grzybiczych. Med Dośw Microbiol 2002; 34: 157-165.
21. Vijayan T, Chiller T, Klausner JD. Sensitivity and specificity of a new cryptococcal
antigen lateral flow assay in serum and cerebrospinal fluid. MLO Med Lab Obs
2013; 45(3): 16-20.
22. Held J, Kohlberger I, Rappold E, et al. Comparison of (1->3)-β-D-glucan, mannan/
anti-mannan antibodies, and Cand-Tec Candida antigen as serum biomarkers
for candidemia. J Clin Microbiol 2013; 51(4): 1158-1164.
23. Sendid B, Tabouret M, Poirot JL, et al. New enzyme immunoassays for sensitive
detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies:
151
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
152