Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita

Transkrypt

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biochemia i biofizyka, kierunek: Pielęgniarstwo
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa
im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
Biochemia
ćwiczenia laboratoryjne dla kierunku: Pielęgniarstwo
Prowadząca:
dr Beata Dudzińska-Bajorek
Spis treści:
1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym
2. Część praktyczna
 Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki – aminokwasy, peptydy i białka
 Ćwiczenie 2 - Biocząsteczki – węglowodany proste i złożone
 Ćwiczenie 3 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – chromatografia
cienkowarstwowa (TLC)
 Ćwiczenie 4 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – elektroforeza
w żelu agarozowym
3. Literatura
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek
1
1. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium biochemicznym
Aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu oraz uniknąć zranień lub oparzeń w trakcie
wykonywania poszczególnych czynności w laboratorium wymaga się stosowania właściwych
warunków pracy. W tym celu przed rozpoczęciem ćwiczeń studenci są zobowiązani do zapoznania
się z następującymi zasadami bezpiecznej pracy:
1.
W laboratorium biochemicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym uszytym
z naturalnego materiału oraz okularach ochronnych. Ubrania wierzchnie (płaszcze) zostawiać
w szatni uczelni.
2.
Na sali ćwiczeń nie wolno pić, jeść, palić, a także żuć gumy.
3.
Przed przystąpieniem do ćwiczeń należy zapoznać się z metodyką ćwiczeń oraz przestrzegać
wskazówek dotyczących ich wykonania.
4.
Wszystkie czynności, przy których następuje wydzielanie się trujących (szkodliwych) par
i gazów, należy wykonywać pod wyciągiem.
5.
Nie zostawiać bez nadzoru palących się palników, włączonych przyrządów grzejnych
i zwracać uwagę, czy w laboratorium nie ulatnia się gaz. W tym ostatnim przypadku należy
zamknąć dopływ gazu, zgasić wszystkie palniki, uruchomić wentylację i otworzyć okna.
6.
Nie zasysać ustami do pipet jakichkolwiek roztworów odczynników. Czynność tę należy
wykonywać przy pomocy specjalnych końcówek do pipet lub gumowych gruszek.
7.
Roztwory stężonych kwasów lub stężonych zasad pobierać do swoich probówek lub innych
naczyń w miejscu ustawienia tych stężonych roztworów, nad szklanymi, porcelanowymi lub
plastikowymi tacami.
8.
Zabrania się przenoszenia naczyń ze stężonymi kwasami i zasadami na inne miejsca niż dla
nich przewidziano.
9.
Do probówek których zawartość ma być ogrzewana nad płomieniem palnika wlewać jedynie
kilka cm3 roztworu i ogrzewać je, trzymając probówki w drewnianych szczypcach. Podczas
ogrzewania stale wstrząsać zawartością probówek, a ich wyloty kierować w miejsce, gdzie nie
przebywa żadna osoba.
10. Przy wszystkich czynnościach laboratoryjnych zachować ostrożność i pamiętać, że brak
dokładności, nieuwaga, niedostateczne zaznajomienie się ze sprzętem i odczynnikami – może
spowodować nieszczęśliwy wypadek.
11. Po wykonaniu doświadczeń zawartość probówek wlać do pojemników do tego
przeznaczonych , odpowiednio opisanych. Nie wolno niczego wlewać do zlewu!
12. Używane szkło, szkiełka, pipety odkładać do wyznaczonych przez prowadzącego pojemników.
13. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy dokładnie przemyć środkiem
dezynfekcyjnym.
14. Kilkakrotnie w czasie pracy i po jej zakończeniu myć ręce, stosując do ich mycia środki
dezynfekcyjne.
15. Po zakończeniu zajęć uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki. Schować
używane przedmioty do szafek. Przemyć stoły środkiem odkażającym, umyć ręce.
2
2. Część praktyczna
Ćwiczenie 1 - Biocząsteczki – aminokwasy, peptydy i białka
1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów – wykrywanie obecności aminokwasów
Aminokwasy są związkami chemicznymi budującymi peptydy i białka. W swojej cząsteczce
mają co najmniej dwie grupy funkcyjne: grupę aminową NH2 i grupę karboksylową COOH. Wzór
ogólny aminokwasów to:
1.1. Reakcja z ninhydryną
Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu, dekarboksylacji, a później
deaminacji. Przejściowo powstaje iminokwas i zredukowana ninhydryna. Następnie iminokwas
przekształca się w aldehyd uboższy o jeden atom węgla, uwalnia się CO2 oraz amoniak.
W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega reakcji kondensacji
z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje fioletowo niebieski produkt kondensacji zwany
purpurą Ruhemanna.
iminokwas
ninhydryna
aldehyd
zredukowana
ninhydryna
purpura Ruhemanna
(fioletowo niebieska)
Zależnie od rodzaju aminokwasu różna jest intensywność i odcień powstającego
zabarwienia. Reakcja ninhydrynowa jest czuła i dokładna - dodatni jej wynik dają wszystkie wolne
3
aminokwasy w środowisku o pH>4. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia
-aminokwasów. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają również inne związki, które zawierają grupę
-aminową, czyli sole amonowe, aminocukry, amoniak. Peptydy i białka również mogą dawać
dodatni odczyn ninhydrynowy, jednak tylko w nieznacznym stopniu.
Iminokwasy, prolina i hydroksyprolina, które nie zawierają grupy -aminowej, dają w reakcji
z ninhydryną produkt o barwie żółtej lub różowej.
prolina
1.2. Reakcja z kwasem azotowym
Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się wg reakcji pierwszej,
ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie
gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja -aminokwasu przebiega zgodnie z drugą
reakcją:
Reakcja 1:
NaNO2 + HCl
HNO2 + NaCl
kwas
azotowy (III)
Reakcja 2:
hydroksykwas
1.3. Reakcja z siarczanem miedzi (II)
Jony metali dwuwartościowych tworzą z -aminokwasami związki kompleksowe. Dotyczy
to głównie jonu miedzi (II), który reagując z dwiema cząsteczkami aminokwasu daje barwny
(niebieski), chelatowy związek kompleksowy. Jon miedzi (II) łączy się wiązaniami jonowymi
z grupami karboksylowymi oraz wiązaniami koordynacyjnymi z atomami azotu grup -aminowych
dwóch cząsteczek aminokwasu.
2 H2N-CH2-COOH + CuSO4
związek kompleksowy
(niebieski)
4
Wykonanie doświadczenia:
Przygotować
3
serie
po
3
probówki,
każdą
serię
napełnić
odpowiednio
cm3:
3
- 1% roztworu glicyny
- 1% roztworu fenyloalaniny
- 0,2% roztworu tryptofanu.
Podziałać na nie odpowiednio roztworami ninhydryny, kwasu azotowego (III) i siarczanu miedzi (II),
do każdej probówki dodać tylko jeden odczynnik.
Zaobserwować i opisać w tabeli zmiany zachodzące w probówkach po dodaniu odczynników.
Odczynnik
Aminokwas
Ninhydryna
(3cm3 2% roztworu
alkoholowego)
Kwas azotowy (III)
(3cm3 10% roztworu NaNO2
i kilka kropli 5% HCl)
Siarczan miedzi (II)
(3cm3 5% roztworu w
buforze octanowym)
Glicyna*
Fenyloalanina
Tryptofan
Narysować wzory strukturalne użytych aminokwasów i na ich podstawie napisać wnioski
z przeprowadzonych reakcji.
Glicyna
Fenyloalanina
Tryptofan
5
2. Reakcje charakterystyczne dla białek - wykrywanie obecności białka
2.1. Test biuretowy – charakterystyczny dla wszystkich substancji zawierających dwa
wiązania peptydowe
Nazwa metody pochodzi od biuretu (bimocznika), najprostszego związku zawierającego
dwa wiązania peptydowe, a powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180°C.
mocznik
biuret
(bimocznik)
Reakcja biuretowa polega na tworzeniu barwnego kompleksu z jonami miedzi(II)
w środowisku zasadowym, w którym zachodzi tautomeryzacja ugrupowania przy wiązaniu
peptydowym, z utworzeniem formy enolowej, w której grupa hydroksylowa zdolna jest
do dysocjacji. Z sąsiadującymi ze sobą wiązaniami tego typu jon miedzi (II) tworzy dwa wiązania
jonowe (z grupami enolowymi) oraz cztery wiązania koordynacyjne (z atomami azotu). Stężenie
powstającego kompleksu barwnego (nasilenie barwy fioletowo niebieskiej) jest proporcjonalne
do liczby wiązań peptydowych zawartych w badanym roztworze.
forma ketonowe
forma enolowa
(fioletowo niebieski)
Do 2cm3 roztworu białka dodać 5cm3 10% roztworu NaOH i 2-3 krople 1% roztworu CuSO4.
Dokładnie wstrząsnąć probówką. Zapisać zaobserwowane zmiany.
6
2.2.
Reakcja
ksantoproteinowa
–
reakcja
charakterystyczna
białek
zawierających
aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi
Aminokwasy aromatyczne – zarówno wolne, jak i związane w białku – podczas ogrzewania
ze stężonym HNO3 ulegają nitrowaniu, tworząc nitrowe pochodne o barwie żółtej. Czynnikiem
nitrującym jest jon nitroniowy NO2+, powstający w wyniku katalitycznego uprotonowania kwasu
azotowego kwasem siarkowym, a następnie odszczepienia cząsteczki wody.
Mieszanina nitrująca, zawierająca stężone kwasy azotowy (V) i siarkowy (VI) (w stosunku
objętościowym 1:3), nitruje wszystkie aminokwasy, natomiast stężony kwas azotowy na zdolność
nitrowanie związków zawierających aromatyczne pierścienie skondensowane (np. tryptofan) oraz
fenyloalaninę.
tyrozyna
dinitrotyrozyna
(żółta)
Do 2cm3 1% roztworu białka dodać 1cm3 stężonego HNO3 i ogrzać. Zapisać zaobserwowane
zmiany.
7
2.3. Próba Millona - reakcja charakterystyczna białek zawierających aminokwasy
z grupą fenolową
Reakcja charakterystyczna dla fenoli, o co najmniej jednej niepodstawionej pozycji orto.
Monofenole z odczynnikiem Millona ulegają reakcji nitrozowania w pozycji orto, której produkt –
o-nitrozopochodna – tworzy barwny (czerwony) kompleks z jonami Hg2+. Odczynnik Millona –
1g rtęci w 1cm3 dymiącego HNO3 rozcienczony 2cm3 H2O.
fenol
o-nitrofenol
(czerwony)
Do 5cm3 1% roztworu białka dodać 6-8 kropli odczynnika Millona i ogrzać do wrzenia. Zapisać
zaobserwowane zmiany.
3. Reakcje denaturacji białka
Koagulacja to proces, w którym białka przechodzą ze stanu rozpuszczalnego do stanu
nierozpuszczalnego. Koagulacja może być procesem odwracalnym, jeśli jednak podczas
koagulacji białka utraciły nieodwracalnie swoje specyficzne właściwości wtedy proces ten nazywa
się denaturacją. Białka są związkami wrażliwymi na wpływ wielu czynników, które mogą
spowodować nieodwracalne zmiany w ich strukturze i utratę właściwości biologicznych czyli
denaturację cząsteczki. W wyniku denaturacji zniszczona zostaje drugo-, trzecio- i czwartorzędowa
struktura białka, natomiast pierwszorzędowa struktura nie ulega zmianie. Zachowane pozostają
mocne wiązania peptydowe, a zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe, oddziaływania
elektrostatyczne, hydrofobowe oraz mostki dwusiarczkowe.
8
Denaturacja białka może nastąpić pod wpływem podwyższonej temperatury, działania
kwasów i zasad, wysokich stężeń soli metali ciężkich, rozpuszczalników organicznych, takich jak
alkohol lub aceton. W wyniku denaturacji białko wytrąca się z roztworu w postaci osadu.
3.1. Denaturacja termiczna
Ogrzewać 5cm3 1% roztworu białka przez kilka minut. Zapisać zaobserwowane zmiany.
3.2. Denaturacja alkoholem
Do 5cm3 1% roztworu białka dodać 5 cm3 alkoholu etylowego. Zapisać zaobserwowane zmiany.
3.3. Test Hellera (denaturacja stężonym kwasem)
Do 5cm3 1% roztworu białka dodać ostrożnie po ściance probówki 3cm3 stężonego HNO3. Zapisać
zaobserwowane zmiany.
9
Ćwiczenie 2 - Biocząsteczki – węglowodany proste i złożone
1. Wykrywanie obecności węglowodanów
W cząsteczkach cukrów występują grupy funkcyjne aldehydowa (
) i ketonowa
) jako grupy główne oraz grupy hydroksylowe (-OH). Wszystkie monosacharydy możemy
(
podzielić: ze względu na obecność grupy funkcyjnej na aldozy (grupa aldehydowa) lub ketozy
(grupa ketonowa) oraz ze względu na liczę atomów węgla w cząsteczce: triozy, tetrozy, pentozy,
heksozy.
Dla otrzymanych roztworów cukrów należy wykonać testy Molischa, Fehlinga, Benedicta, Tollensa,
próbę jodową i próbę zasadową.
Węglowodan
Próba
Molischa
Próba
Fehlinga
Próba
Tollensa
Próba
Benedicta
Próba
zasadowa
Próba
jodowa
Glukoza
Sacharoza
Skrobia
1.1. Próba Molischa
Najbardziej ogólna reakcja charakterystyczna służąca do wykrywania cukrów wolnych
i związanych oraz ich pochodnych: aldehydów, acetonu, kwasu szczawiowego, kwasu
cytrynowego - ujemny jej wynik wyklucza obecność cukrowca, dodatni natomiast nie wystarcza do
stwierdzenia jego obecności.
W wyniku działania stężonego kwasu siarkowego (VI) na cukry powstaje furfural
(w przypadku pentoz), hydroksymetylofurfural (w przypadku heksoz) lub inne pochodne furfuralu,
w zależności od rodzaju cukru.
D-glukoza
5-hydroksymetylofurfural
10
Grupa aldehydowa powstałego furfuralu reaguje z dwiema cząsteczkami -naftolu
z odczynnika Molischa (roztwór -naftolu w etanolu), tworząc wielopierścieniowe produkty o
barwie czerwono fioletowej.
5-hydroksymetylofurfural
naftol
związek
wielopierścieniowy
(czerwono fioletowy)
Do probówki zawierającej 2cm3 wody dodać 5 kropli roztworu badanego cukru i 2 krople reagentu
Molischa, wymieszać i dodać 2cm3 stężonego H2SO4 wlewając go ostrożnie po ściance probówki,
tak aby warstwy się nie mieszały. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące
w probówkach po przeprowadzeniu testów.
1.2. Próba Fehlinga
Reakcja chemiczna, stosowana do jakościowego oznaczania aldehydów. Przeprowadza się
ją przy użyciu odczynnika Fehlinga (alkaliczny roztwór jonów miedzi (II) skompleksowanych jonami
winianowymi o zabarwieniu ciemnoniebieskim). Pozytywny wynik próby uwidacznia się przez
pojawienie się czerwonego osadu tlenku miedzi (I) (Cu2O). Próba Fehlinga to reakcja redoks.
Aldehydy ulegają utlenieniu do kwasów karboksylowych, miedź ze stopnia utlenienia II redukuje
się do I, zgodnie z zapisem:
2Cu2+ + R-CHO + NaOH + H2O → Cu2O↓ + R-COONa + 4H+
roztwór
Fehlinga
aldehyd
tlenek miedzi (I)
(czerwony)
Wytrącający się tlenek miedzi (I) Cu2O jest produktem szybkiej reakcji powstających jonów Cu+ z
jonami hydroksylowymi:
2Cu+ + 2OH− → Cu2O + H2O
11
Nie jest możliwe odróżnienie aldoz, które zawierają aldehydową grupę funkcyjną od ketoz,
które zawierają grupę ketonową. Niektóre ketozy, jak np. fruktoza, ulegają bowiem tautomerii ketoenolowej, a wynikiem tej izomeryzacji jest forma aldehydowa cukru.
Monosacharydy i disacharydy (np. maltoza, celobioza lub laktoza) w większości dają
pozytywny wynik próby, ponieważ są cukrami redukującymi, tzn. takimi, które nie mają związanego
(np. wiązaniem glikozydowym) anomerycznego atomu węgla (pierwszy atom węgla w cząsteczce
cukru). Do wyjątków należy sacharoza, która anomeryczny atom węgla ma związany wiązaniem
glikozydowym z drugą cząsteczką węglowodanu i jest cukrem nierudukującym. Negatywny wynik
próby dają też polisacharydy ze względu na zbyt małą liczbę reszt redukujących (jedna grupa
aldehydowa w całym polimerze).
W probówce zmieszać po 1cm3 roztworu Fehlinga A i roztworu Fehlinga B i dodać 5 kropli
badanego cukru. Próbkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli
powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.
1.3. Próba Tollensa (próba lustra srebrowego)
Reakcja chemiczna służąca do wykrywania aldehydów. Próba Tollensa jest prowadzona w
lekko zasadowym środowisku, w którym ketozy ulegają epimeryzacji do aldoz, dzięki czemu
metodą tą można wykrywać też cukry nie zawierające początkowo grup aldehydowych.
Przykładem jest fruktoza (ketoza), przekształcająca się w trakcie próby w aldozy: glukozę i
mannozę. Jednym z niewielu cukrów, które nie dają pozytywnego wyniku próby Tollensa jest
sacharoza (cukier nieredukujący).
Do wykonania próby Tollensa wykorzystuje się odczynnik Tollensa, czyli roztwór
zawierający jony diaminosrebra (I) [Ag(NH3)2]+. Odczynnik Tollensa otrzymuje się dodając wody
amoniakalnej do roztworu azotanu srebra. W pierwszym etapie wytrąca się brunatny osad tlenku
srebra (I):
2 AgNO3 + 2 NH3 + H2O → Ag2O↓ + 2 NH4NO3
Osad ten rozpuszcza się w nadmiarze amoniaku:
Ag2O + 4 NH3 + H2O → 2 [Ag(NH3)2]+ + 2 OH−
Powstaje
jon kompleksowy diaminosrebra
(I)
([Ag(NH3)2]+).
Roztworu
tego
nie
wolno
przechowywać, ze względu na powstawanie tzw. srebra piorunującego o właściwościach
wybuchowych.
12
Po wprowadzeniu do odczynnika Tollensa aldehydu, jon diaminosrebra (I) redukuje się do
metalicznego srebra. Jeżeli reakcja przeprowadzana jest w czystej probówce (najlepiej
odtłuszczonej wodorotlenkiem sodu) na jej ściankach powstanie "lustro srebrowe". Jeżeli
probówka będzie brudna wytrąci się czarny osad srebra.
2 [Ag(NH3)2]+ + RCHO + 3 OH− → 2 Ag↓ + RCOO− + 2 H2O + 4 NH3
odczynnik
Tollensa
aldehyd
srebro
metaliczne
Do probówki wlać 1cm3 odczynnika Tollensa A i 1cm3 odczynnika Tollensa B, wymieszać
i dodawać rozcieńczony roztwór amoniaku, aż do rozpuszczenia powstającego w pierwszym
momencie tlenku srebra. Do tak przygotowanego roztworu dodać 5 kropli badanego cukru
i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany
zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.
1.4. Próba Benedicta
Reakcja chemiczna, która służy do wykrywania większości cukrów (oprócz cukrów
nieredukujących, np. sacharozy) i aldehydów. Odczynnik Benedicta to ciemnoniebieski
cytrynianowy kompleks miedzi (II) sporządzany przez rozpuszczenie w wodzie siarczanu miedzi
(II), cytrynianu sodu i węglanu sodu. Po dodaniu odczynnika do badanej próby i doprowadzeniu do
wrzenia duże stężenie cukrów redukujących lub aldehydu powoduje powstanie czerwonego osadu
tlenku miedzi (I), mniejsze żółtego osadu.
2 Cu2+ + RCHO + OH− → Cu2O↓ + RCOO− + 3 H2O
odczynnik
Benedicta
aldehyd
tlenek miedzi (I)
(czerwony)
Do probówki zawierającej 2cm3 roztworu Benedicta, dodać 5 kropli badanego cukru. Probówkę
umieścić we wrzącej łaźni wodnej. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w
probówkach po przeprowadzeniu testów.
1.5. Próba zasadowa
Wszystkie cukry redukujące w czasie ogrzewania w środowisku zasadowym ulegają
rozpadowi na szereg związków o różnych właściwościach. Tworzą się dwu- i trójwęglowe
fragmenty o właściwościach silnie redukujących oraz produkty ich polimeryzacji (ciała żywicowate).
13
Oligo- i polisacharydy, w których grupy aldehydowe są zablokowane wiązaniami glikozydowymi
charakteryzują się dużą opornością na działanie zasad.
Do probówki zawierającej 5cm3 badanego roztworu cukru dodać 1cm3 25% roztworu wodnego
NaOH i umieścić probówkę we wrzącej łaźni wodnej na około 5 min. Zaobserwować i opisać w
tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po przeprowadzeniu testów.
1.6. Próba jodowa (odróżniająca polisacharydy od innych cukrów)
Reakcja polisacharydu z jodem polega na adsorpcji jodu, który wnika do struktury spiralnie
skręconego łańcucha polisacharydowego i zostaje uwięziony przez tlen przy pierwszym i czwartym
atomie węgla każdej cząsteczki glukozy. Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu, wzdłuż którego
mogą przemieszczać się elektrony, co powoduje pochłanianie światła przez układ. Skrobia po
adsorpcji cząsteczek jodu barwi się na kolor ciemnoniebiesko fioletowy. Obserwowana barwa
zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu: reakcja jodu z amylozą
powoduje powstanie niebieskiego produktu, z amylopektyną – fioletowo czerwonego, a glikogen
barwi się z jodem na czerwono.
W
probówce
umieścić
1cm3
badanego
roztworu
cukru,
dodać kroplę
roztworu
jodu
(J2 w KJ w wodzie). W razie potrzeby intensywnie zabarwiony roztwór można rozcieńczyć wodą
3-10-krotnie. Zaobserwować i opisać w tabeli powyżej zmiany zachodzące w probówkach po
przeprowadzeniu testów.
14
Ćwiczenie 3 – Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – chromatografia
cienkowarstwowa (TLC)
1. Rozdział chromatograficzny mieszaniny produktów
Chromatografia jest metodą służącą do rozdzielania mieszanin substancji, w której
wykorzystywane są różne fizykochemiczne oddziaływania rozdzielanych substancji z dwoma
fazami: ruchomą i nieruchomą. Fazą nieruchomą może być ciało stałe (w chromatografii
adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w stałym nośniku (w chromatografii podziałowej), fazą
ruchomą bywa ciecz lub gaz. Technikę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) wyróżnia kształt
i rodzaj fazy stacjonarnej, uformowanej w postaci cienkiej warstwy nałożonej na płaskie podłoże,
zapewniające dostateczną wytrzymałość mechaniczną. Płaskim podłożem zwykle są płytki
szklane, płytki z folii aluminiowej lub plastykowej. Cienką warstwę złoża mogą stanowić: żel
krzemionkowy, ziemia okrzemkowa, niezmodyfikowana lub zmodyfikowana chemicznie celuloza,
tlenek glinu (Al2O3), podłoża jonowymienne lub inne. Technikę chromatografii cienkowarstwowej
stosuje się do rozdziału niemal wszystkich grup związków ważnych biologicznie.
Technika
chromatografii
cienkowarstwowej
polega
na
poruszaniu
się
substancji
chromatografowanych z różną prędkością wraz z ciekłą fazą ruchomą przez cienką warstwę
stałego adsorbenta naniesionego na płytkę. Towarzyszą temu procesy adsorpcji i desorpcji oraz
podział między ciekłą fazą organiczną i wodą, która w niewielkich ilościach znajduje się na
nośniku. Rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa się głównie dzięki różnicom w ich adsorpcji
przez adsorbent. Substancje słabiej adsorbowane przez adsorbent są wymywane przez
rozpuszczalnik wcześniej. Natomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostają z nim
związane.
faza
stacjonarna
czoło fazy
ruchomej
rozdzielone
związki
linia startu
faza ruchoma
Proces separacji składników próbki naniesionej na płytkę TLC nazywa się rozwijaniem.
Oddziaływanie substancji znajdujących się w próbce z adsorbentem oraz z poruszającym się
rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie się składników próbki na płytce i poszczególne składniki
tworzą oddzielne plamki. Plami rozdzielanych składników należy z kolei uwidocznić, czyli wywołać.
15
Chromatogramy wywołuje się najczęściej odczynnikami chemicznymi, które tworzą barwne związki
z analitami. Często ogląda się chromatogramy oświetlane lampą wytwarzającą promieniowanie
UV,
aby
zobaczyć
substancji
wykazujące
właściwości
fluorescencyjne
pod
wpływem
promieniowania UV. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania przez niektóre związki chemiczne
światła pod wpływem naświetlania zewnętrznym promieniowaniem.
Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który określa położenie
substancji na chromatografie, jest współczynnik opóźnienia RF. Jest to stosunek drogi migracji
substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b):
RF = a/b
Współczynnik opóźnienia przyjmuje wartości od 0 do 1. Jeśli RF = 0 oznacza to,
że chromatografowana substancja w danym układzie chromatograficznym pozostaje na starcie,
gdyż zbyt silnie oddziałuje z fazą stacjonarną i nie ma oddziaływań z fazą ruchomą. Z kolej RF = 1
świadczy o tym, że substancja nie oddziałuje z fazą stacjonarną i wędruje z czołem
rozpuszczalnika. Optymalna wartość współczynnika RF powinna zawierać się w przedziale
0,2 – 0,8. Wówczas warunki chromatograficzne są najbardziej stabilne. Współczynnik opóźnienia
jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych i może
służyć do jej identyfikacji. Wartość współczynnika RF, podobnie jak innych parametrów retencji,
zależy od rodzaju analitu, rodzaju fazy ruchomej i fazy stacjonarnej, a także nasycenia komory
i temperatury.
czoło fazy ruchomej
linia startu
Jeżeli dana substancja ma tą samą wartość współczynnika opóźnienia, jaką ma wzorzec,
wyznaczoną w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna
ze wzorcem. Najczęściej analizę jakościową wykonuje się w ten sposób, że na jedną płytkę TLC
16
nanosi się badaną próbkę oraz obok nanosi się również wzorzec. Po rozwinięciu płytki sprawdza
się, która plamka badanej próbki ma taką samą wartość współczynnika opóźnienia jak wzorzec.
Roztarte w moździerzu tabletki o znanym składzie i otrzymaną od prowadzącego substancję
o nieznanym składzie rozpuścić każdą z osobna w etanolu w kolbkach miarowych 25 ml.
Zawartość kolbek przesączyć przez bibułę na lejku do fiolek. Przesączone roztwory nanieść przy
pomocy kapilary na dwie płytki chromatograficzne z żelem krzemionkowym. Przygotować eluent A
o składzie: octan etylu : heksan : kwas octowy (8 : 2 : 0,1 ml) oraz eleunt B o składzie: octan etylu :
heksan : kwas octowy (5 : 5 : 0,1 ml).
Wlać eluent A i eluent B do dwóch komór chromatograficznych i zamknąć je na chwilę, aby komora
równomiernie wysyciła się parami rozpuszczalnika. Płytki z naniesionymi substancjami wstawić do
komór chromatograficznych (każdą płytkę do innej komory) i poczekać aż czoło rozpuszczalnika
dojdzie do wyznaczonej linii końcowej. Wysuszoną płytkę obserwować w świetle UV. Narysować
poniżej wzór plamek substancji wzorcowych i analizowanych, wyznaczyć RF, opisać skład
substancji analizowanej na podstawie przeprowadzonego doświadczenia.
17
Ćwiczenie 4 - Techniki rozdziału substancji biologicznie aktywnych – elektroforeza w żelu
agarozowym
1. Rozdział elektroforetyczny substancji biologicznie aktywnych
Elektroforeza jest techniką rozdzielania
związków obdarzonych ładunkiem,
która
wykorzystuje zjawisko ruchu cząstek w polu elektrycznym. Pod wpływem pola elektrycznego
cząstki obdarzone ładunkiem dodatnim, czyli kationy, wędrują do katody, tzn. elektrody ujemnej.
Cząstki obdarzone ładunkiem ujemnym – aniony – wędrują w polu elektrycznym do anody,
tj. elektrody dodatniej. Podstawą rozdziału elektroforetycznego cząstek jest ich zróżnicowana
szybkość wędrówki w polu elektrycznym, tzn. w jednakowym czasie odmienne cząstki przewędrują
różne odległości. Szybkość przemieszczania cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym
zależy od trzech zasadniczych grup czynników: 1) własności cząstek wędrujących; 2) własności
środowiska, w którym cząstki wędrują; 3) od parametrów charakteryzujących przepływający prąd.
Własności cząstek wędrujących w polu elektrycznym, które mają największy wpływ na szybkość
przemieszczania, to wielkość wypadkowego ładunku elektrycznego, masa i kształt cząstek.
Wielkość masy i wypadkowego ładunku cząstek działają przeciwstawnie na szybkość wędrówki.
Im większy wypadkowy ładunek cząstek, tym szybciej się poruszają, ale im większa masa, tym
wolniejsza wędrówka cząstek. Zatem szybkość migracji cząstek w polu elektrycznym zależy
od stosunku ładunek/masa. Kształt cząstek wpływa na szybkość ich przemieszczania, dzięki
obniżaniu lub wzmaganiu oporu środowiska, który przeciwdziała ruchowi cząstek. Opór środowiska
dla cząstek o kształcie bliskim kuli (globularnym) będzie mniejszy (dzięki czemu ruch tych cząstek
jest szybszy) niż tych o rozpostartej konformacji przestrzennej. Środowisko, w którym cząstki
wędrują, rodzaj użytego buforu i jego właściwości, takie jak lepkość, siła jonowa, pH i temperatura,
wpływają na rozdział elektroforetyczny. Im większa lepkość, tym większy opór środowiska
ma do pokonania przemieszczająca się cząstka. Natomiast od siły jonowej i pH buforu
elektroforetycznego może zależeć wielkość ładunku rozdzielanej cząstki.
Zastosowanie buforu o wartości pH odpowiadającej wartości pI (punkt izoelektryczny (pI) wartość pH, w którym suma ładunków elektrostatycznych cząsteczki wynosi zero) rozdzielanych
cząstek uniemożliwi ich rozdział, ponieważ w tych warunkach cząstki występują w formie jonu
obojnaczego i nie poruszają się w polu elektrycznym. Dla cząstek rozpuszczalnych w środowisku
zasadowym najwłaściwszy będzie bufor o pH wyższym od pI każdej rozdzielanej cząstki
mieszaniny.
Nośnikiem do elektroforezy może być bibuła, inny nośnik celulozowy, w tym octan celulozy
oraz obecnie powszechnie stosowane różne żele obojętne (agarozowy, poliakrylamidowy)
w przypadku elektroforezy żelowej. Bibuła jest nośnikiem o dużej oporności, natomiast żele
cechuje mała oporność oraz niska adsorpcja cząstek. Dodatkowo, żele są sitami molekularnymi,
w związku z tym przez kanaliki w żelu małe cząstki przechodzą swobodnie, natomiast większe
18
są zatrzymywane. Usieciowanie żelu decydujące o wielkości kanalików w żelu, które można
kontrolować przez wybór odpowiednich stężeń substancji tworzących żel. W żelu będą tym
mniejsze kanaliki, im większe zastosuje się stężenie substancji sieciujących.
mieszanina
makrocząsteczek
pory z żelu
elektroforeza
Rozdział substancji podczas elektroforezy zależy od przepływającego prądu, czyli wielkości
przyłożonego napięcia. Przyłożenie niskiego napięcia prądu sprawia, że niskie jest jego natężenie
i wydzielanie ciepła, a szybkość wędrówki cząstek wolna. W takich warunkach wydłuża się czas
potrzebny do osiągnięcia rozdziału elektroforetycznego. Zbyt długi czas trwania rozdziału może
być niepożądany ze względu na towarzyszące niekorzystne procesy, m.in. dyfuzję, która powoduje
rozmycie brzegów rozdzielonych stref. Przyłożenie za wysokiego napięcia prądu może
spowodować zbyt szybką migrację rozdzielanych składników i ich niecałkowity rozdział oraz
podwyższenie temperatury i denaturację badanych cząsteczek.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) charakteryzuje się szczególnie dużą
rozdzielczością, która w połączeniu z wysoką czułością metod detekcji rozdzielanych substancji
pozwala na analizowanie mikrogramowych ilości rozdzielanych mieszanin. Powszechnie stosuje
się ją do rozdzielania i oczyszczania białek oraz kwasów nukleinowych.
Żel agarozowy jako nośnik w elektroforezie charakteryzuje się dużą zdolnością rozdzielczą,
nieznaczną adsorpcją i niskim efektem elektroosmozy. Elektroforeza agarozowa jest powszechnie
stosowana w metodyce izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych, identyfikacji produktów
amplifikacji (reakcji łańcuchowej polimerazy PCR), jak również w specyficznych technikach analizy
DNA, np. w SSCP (polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów) i w RLFP (polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych). Optymalne stężenie agarozy dopasowuje się do wielkości
rozdzielanych fragmentów DNA. Rozdział DNA przeprowadza się w żelu, zazwyczaj o grubości
około 5 mm w specjalnym aparacie do elektroforezy agarozowej. W celu określenia wielkości
19
rozdzielanych fragmentów DNA, obok analizowanych próbek na żelu, umieszcza się wzorzec
masowy. Dla uwidocznienia rozdzielonych frakcji można dodać bromku etydyny podczas
sporządzania żelu lub dopiero po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić roztworem tego bromku.
Bromek etydyny wnika pomiędzy zasady azotowe w DNA i pod wpływem ultrafioletu emituje
światło o zabarwieniu pomarańczowym. Po umieszczeniu wybarwionego żelu w transiluminatorze
w świetle UV można oglądać świecące prążki.
W celu wykonania 1% żelu agarozowego należy 2g agarozy rozpuścić w 200ml buforu TBE
(45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA) i podgrzewać do wysokiej temp. ciągle mieszając.
Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 5l bromku etydyny. Tak przygotowany żel wylać do formy
(20 x 20 cm), włożyć grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Po spolimeryzowaniu żelu umieścić
go w temp. +4°C na 30 min. Schłodzoną formę z żelem włożyć do aparatu do elektroforezy
z buforem. Na gotowy żel nakładać próbki kwasów nukleinowych wraz z barwnikiem obciążającym.
Prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu ok. 100V w obecności markera wielkości,
aż do rozdziału produktów reakcji. Po zakończonej elektroforezie żel obejrzeć w świetle UV
w zestawie do wizualizacjo zdjęć i opisać wnioski z przeprowadzonego eksperymentu.
20
3. Literatura
1. Żak I. (red): Chemia medyczna. Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001
2. Żak I. (red): Praktikum z chemii medycznej. Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001
3. Skrypt „Techniki separacyjne” UG
4. Z. Witkiewicz, „Podstawy chromatografii:, WNT, Warszawa 2000
21

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita

Transkrypt

Podobne dokumenty

karta przedmiotu - Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im

ZARZĄDZANIE ŚRODOWISKOWE W

Inwestycja w kadry - Powiatowy Urząd Pracy w Gnieźnie

karta przedmiotu

Plan egzaminów na 2017 rok

Regulamin Mikołajkowego konkursu