QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA
708755
(ludzka transglutaminaza tkankowa)
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
QUANTA LiteTM tTG IgG to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgG
przeciwko transglutaminazie tkankowej (endomysium) w surowicy człowieka. Wykrywanie tych przeciwciał,
wraz z przeciwciałami IgA, stanowi pomoc w diagnozowaniu określonych enteropatii związanych z
nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry. Test ten ma za zadanie
zapewnienie dodatkowej czułości badania próbek pochodzących od pacjentów z niedoborem IgA.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Celiakia i opryszczkowe zapalenie skóry, dwie rozpoznane formy enteropatii związanej z nadwrażliwością na
gluten (GSE) charakteryzują się przewlekłym zapaleniem błony śluzowej przewodu pokarmowego oraz
spłaszczeniem nabłonka lub pozytywną „atrofią mikrokosmków”.1,2 Nadwrażliwość na gluten spowodowana
jest nietolerancją glutenu - białka występującego w pszenicy, ryżu i jęczmieniu. Pacjenci z celiakią mogą
cierpieć na biegunkę, dolegliwości układu pokarmowego, niedokrwistość, zmęczenie, problemy psychiczne
oraz mogą u nich występować inne skutki uboczne lub mogą nie wykazywać żadnych objawów.2
Opryszczkowe zapalenie skóry jest chorobą skóry związaną z GSE. Wszyscy pacjenci GSE mają
podwyższony poziom ryzyka zachorowania na chłoniaka.3 Dieta bezglutenowa kontroluje GSE i związane z
nią ryzyko.
Odkrycie w 1950 roku faktu, że gluten wywołuje celiakię umożliwiło leczenie tej choroby, dzięki zastosowaniu
w przypadku pacjentów diety bezglutenowej. Po opracowaniu metody polegającej na wykonywaniu biopsji
jelita przez jamę ustną, lekarze byli w stanie określić, czy u pacjenta występuje atrofia mikrokosmków. Atrofia
mikrokosmków z pozytywnymi wynikami testów serologicznych może występować w przypadku innych
chorób, jednak GSE można wykazać na podstawie pierwotnych kryteriów Europejskiego Towarzystwa
Gastroenterologii Pediatrycznej i Żywienia (ESPGAN). Te kryteria wymagają około roku żmudnych badań z:
a) pierwszą biopsją jelit dającą wynik pozytywny, b) 6 miesiącami na diecie bezglutenowej, c) drugą biopsją
jelit z wynikiem negatywnym, d) 6-miesięcznym testem prowokacji glutenem e) trzecią biopsją jelit z wynikiem
pozytywnym.
Opracowanie testów surowicy dla trzech różnych przeciwciał izotypu IgA3 umożliwiło przygotowanie
szybszych, poprawionych kryteriów ESPGAN dotyczących celiakii, zgodnie z opracowaniem z 1990 r.2 Te
testy obejmują testy na obecność przeciwciał IgA przeciw endomysium (EMA),4 przeciwciała IgA przeciwko
gliadynie (AGA) i przeciwciał IgA przeciwko retikulinie R1 (ARA). Zmodyfikowane kryteria ESPGAN
wymagają: a) pojedynczej biopsji jelita z wynikiem pozytywnym oraz b) wykazania przynajmniej dwóch z
trzech przeciwciał klasy IgA wymienionych powyżej. Od tamtego czasu wiele badań wykazało, że testy IgA
EMA mają swoistość na poziomie powyżej 99% dla GSE oraz wyższą czułość niż badania ARA lub AGA.5-13
W związku z tym, że przeciwciała IgA EMA znikają, gdy pacjenci z celiakią lub opryszczkowym zapaleniem
skóry stosują się do diety bezglutenowej, testy na te przeciwciała również pomagają w sprawdzaniu
przestrzegania diety przez pacjentów.4,5,12
Ostatnio zidentyfikowano, że antygenem endomysialnym jest enzym sieciujący białka, znany pod nazwą
transglutaminazy tkankowej (tTG).14,15 Swoiste dla antygenów procedury ELISA z zastosowaniem tTG
stanowią rzetelną i obiektywną metodę stanowiącą alternatywę dla tradycyjnych immunofluorescencyjnych
badań z użyciem jako podłoża cienkich skrawków przełyku naczelnych.14-19 Badanie ELISA może być
przystosowane do dużych jak i małych ilości próbek od pacjentów. W ciągu ostatnich dwóch lat przy użyciu
techniki rekombinacji wytworzono antygen ludzkiego tTG. Rekombinowany antygen ludzki może mieć pewne
zalety w porównaniu do bardziej tradycyjnego antygenu wątroby świnki morskiej.16,17,20
Dwiema kolejnymi innowacjami w zakresie serologii celiakii jest użycie natywnej ludzkiej transglutaminazy
tkankowej wyizolowanej z krwinek czerwonych oraz użycie testów umożliwiających wykrywanie przeciwciał
klasy IgG przeciwko transglutaminazie tkankowej. Użycie tTG natywnych ludzkich krwinek czerwonych
zamiast antygenu świnki morskiej lub rekombinowanego antygenu ludzkiego zapewnia korzyści związane z
ułatwieniem oczyszczania oraz umożliwia uzyskanie preparatów pozbawionych białek bakteryjnych, owadzich
i innych zanieczyszczających białek.21, 22, 23, 24 Testy ELISA z zastosowaniem ludzkiego antygenu tTG, które
są przedstawiane w literaturze, cieszą się dobrą opinią w porównaniu z bardziej tradycyjnymi testami
bazującymi na antygenie świnki morskiej.16, 17, 20-23
Typowym problemem w przypadku badań pacjentów cierpiących na celiakię jest występujący u nich niedobór
przeciwciał IgA. Niedobór przeciwciał IgA jest prawdopodobnie czynnikiem, który sam w największym stopniu
przyczynia się do uzyskania fałszywie negatywnego wyniku serologicznego u pacjentów z celiakią
potwierdzoną biopsją.25 Aby to skompensować, wiele laboratoriów przeprowadza oznaczenia poziomu IgG
przy wykorzystaniu kilku typowych antygenów stosowanych do wykrywania przeciwciał charakteryzujących
celiakię, takich jak retikulina i gliadyna.25 U większości cierpiących na celiakię pacjentów z niedoborem IgA
występują przeciwciała klasy IgG przeciwko retikulinie i gliadynie.18 Wiele grup badawczych opublikowało
informacje o stosowaniu testu tTG w wersji IgG do wykrywania pacjentów z niedoborem IgA.17,18,20,21 W
jednym z tych badań, wrażliwość testu wzrosła z 91,5% dla samego przeciwciała IgA do 98,5%, gdy
rozpatrywano wyniki zarówno dla IgA jak i IgG.18
1
Zasada badania
Antygen natywnej ludzkiej transglutaminazy tkankowej (h-tTG) izolowany ze świeżo pobranych erytrocytów
wiąże się z dołkami płytki polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym
stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków,
umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał IgG przeciwko h-tTG z unieruchomionym
antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego
enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG
znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do
mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych
enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc
intensywność powstałej barwy. Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i
porównanie intensywności barwy, która powstaje w dołkach z próbką od pacjenta z barwą dołków
kontrolnych.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta oczyszczonym antygenem h-tTG (12-1 x 8
dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze
Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich
przeciwciał IgG przeciwko h-tTG, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Słabo pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i
przeciwciała surowicy ludzkiej IgG przeciwko h-tTG, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Silnie pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i
przeciwciała surowicy ludzkiej IgG przeciwko h-tTG, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną
TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć
w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie niebieskie, zawiera
bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają
przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie
zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego powodu
słabo pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA, silnie pozytywna kontrola h-tTG IgG ELISA i kontrola
negatywna testu ELISA powinny być użytkowane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie
zakaźny.26
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli
do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych,
należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub
kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z
kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych
przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
2
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w
akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność
płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy
trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i
osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może dać
niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest
przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem
lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych,
takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację
koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie
wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek
analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące
warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin.
2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli
badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w
temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze
wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami testu h-tTG IgG ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu przeciwciała IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 - 26oC) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do
płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie
przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml
koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte.
Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
3
3.
4.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pochodzącej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od
przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA, silnie
pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA i kontroli negatywnej testu ELISA.
Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał IgG przeciwko tTG, z zastosowaniem jednostek
umownych wymaga dwóch dołków dla każdej z trzech kontroli i jednego lub dwóch dołków dla każdej
próbki pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE
DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w
uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i
dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA,
wysoko pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA oraz kontroli negatywnej ELISA i rozcieńczonych
próbek pochodzących od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze
pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze
dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale
pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie
opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w
przypadku dodawania próbki.
Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z
zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych.
Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ
POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO
WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30
minut jak w etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w
temperaturze pokojowej.
Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas
dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać
płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu jednej
godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością
fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
4.
Z każdą serią próbek należy przebadać słabo pozytywną kontrolę testu h-tTG IgG ELISA, silnie
pozytywną kontrolę testu h-tTG IgG ELISA i kontrolę negatywną testu ELISA, aby upewnić się, że
wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo.
Uwaga: w związku z tym, że słabo pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA, silnie pozytywna
kontrola testu h-tTG IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są wstępnie rozcieńczone, nie mają one
zastosowania w metodach badań związanych z rozcieńczeniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub
krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne
można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze
≤ - 20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA musi
być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG
ELISA, która musi być wyższa od absorbancji wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej
testu ELISA.
b.
Wstępnie rozcieńczona silnie pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA musi mieć
absorbancję wyższą niż 0,7, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli
negatywnej nie może przekraczać 0,2.
c.
Absorbancja słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA musi być przynajmniej
dwukrotnie wyższa od absorbancji kontroli negatywnej testu ELISA lub przekraczać 0,25.
d.
Kontrola negatywna testu ELISA oraz silnie pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA mają
monitorować występowanie poważnych nieprawidłowości związanych z odczynnikami. Silnie
pozytywna kontrola testu h-tTG IgG ELISA nie zapewni precyzji na poziomie wartości
granicznej testu.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie
NCCLS C24-A.
4
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność
dla każdej próbki można następnie obliczyć dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość
optyczną słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA. Wynik jest mnożony przez liczbę jednostek
przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA występującej na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
(jednostki)
gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu h-tTG IgG ELISA
x Słabo pozytywna kontrola testu
h-tTG IgG ELISA
(jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał
u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie
jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli
wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie
seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z
wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w
populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami.
Próbka następnie może być sklasyfikowana jako negatywna, słabo pozytywna, średnio pozytywna lub silnie
pozytywna, zgodnie z poniższą tabelą.
Jednostki
<20
20 – 30
>30
Negatywny
Słabo pozytywna
Od średnio do silnie pozytywnego
1.
2.
3.
Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko h-tTG i sugeruje możliwość
występowania pewnych enteropatii związanych z nadwrażliwością na gluten, takich jak celiakia i
opryszczkowe zapalenie skóry.
Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko h-tTG, lub że ich
poziom jest poniżej dolnej wartości granicznej badania.
Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: „Poniższe wyniki
zostały uzyskane przy użyciu zestawu INOVA QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA. Wartości IgG
przeciwko h-tTG uzyskane przy użyciu analiz innych producentów nie mogą być używane zamiennie.
„Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu
końcowego”.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
Obecność kompleksów immunologicznych lub innych agregatów immunoglobuliny w próbce
pochodzącej od pacjenta może powodować podwyższony poziom nieswoistego wiązania i wytwarzać
fałszywe pozytywne wyniki w tym badaniu.
Wynik negatywny przeciwciał IgG przeciwko h-tTG u nieleczonego pacjenta nie wyklucza całkowicie
enteropatii związanej z nadwrażliwością na gluten. U pacjenta występować mogą przeciwciała IgA lub
może nie posiadać on przeciwciał przeciwko tTG.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
Spodziewane wartości
Zdolność testu QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA do wykrywania przeciwciał IgG przeciwko transglutaminazie
tkankowej został oceniony poprzez porównanie z innym testem wykrywającym przeciwciała IgG przeciwko
tTG, jak również przez porównanie wyników z rzeczywistą diagnozą kliniczną w ramach dwóch zewnętrznych
badań klinicznych i jednego badania wewnętrznego.
Normalny zakres
To badanie obejmujące zakres normalny przeprowadzono w laboratorium badawczym firmy INOVA
Diagnostics. Przebadano łącznie 185 próbek. Przebadano łącznie 102 próbki pochodzące od mężczyzn. Wiek
dawców mieścił się w zakresie od 6 do 60 lat, ze średnią wieku wynoszącą 34 lata. Przebadano łącznie 83
próbek pochodzących od kobiet w wieku od 7 do 63 lat ze średnią wieku wynoszącą 31 lat.
Gdy 185 wspomnianych próbek badano przy zastosowaniu zestawu QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA jedynie
jedna próbka (0,5%) dała wynik pozytywny. Wynik tej jednej próbki (21 jednostek) mieścił się tuż nad
wartością graniczną. Poza tą jedną słabo pozytywną próbką, kolejna próbka o największej reaktywności dała
wynik 8 jednostek. Średnia wartość we wspomnianej grupie próbek pochodzących od osób zdrowych
wynosiła 3,7 jednostki.
5
Swoistość i wrażliwość kliniczna
Zestaw QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA poddano ocenie wewnętrznej z zastosowaniem klinicznie
zdefiniowanych próbek. Wyniki podsumowano w poniższej tabeli.
Grupa pacjentów
Nr Liczba pozytywnych
(%)
Normalne
185
1*
(0,5%)
Próbka od pacjenta z celiakią
24
15
(62,5%)
Próbka od pacjenta z celiakią (dziecko)
11
1
(9%)
Próbka od cierpiącego na celiakię pacjenta z
niedoborem przeciwciał IgA
16
15** (94%)
Wrzodziejące zapalenie okrężnicy
14
0
Choroba Leśniowskiego-Crohna
6
0
Niedokrwistość złośliwa
6
0
Przewlekłe aktywne zapalenie wątroby
9
0
Próbka od pacjentów cierpiących na mieszaną chorobę tkanki łącznej z autoprzeciwciałami 55 0
*
Ta 1 próbka dała wynik słabo pozytywny (21 jednostek).
**
Jedna próbka pochodziła od pacjenta na diecie bezglutenowej. W próbce tej nie wykazano również
przeciwciał IgG przeciwko endomysium.
Reaktywność krzyżowa
W celu dokonania dalszej oceny swoistości zestawu QUANTA Lite® h-tTG IgG ELISA przebadano próbki
pochodzące od ogółem 90 pacjentów z problemami ze strony przewodu pokarmowego jak również od
pacjentów o wysokich mianach autoprzeciwciał powiązanych z chorobami tkanki łącznej. Ogółem przebadano
14 próbek surowic pochodzących od pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy, 6 od pacjentów z
chorobą Leśniowskiego-Crohna, 6 od pacjentów z niedokrwistością złośliwą oraz 9 od pacjentów z aktywnym
zapaleniem wątroby. Przebadano również grupę surowic pochodzącą z kolekcji surowic wykorzystywanych do
wytwarzania innych zestawów ELISA do oznaczania autoprzeciwciał firmy INOVA. Przebadano ogółem 55
surowic, w tym 8 SS-A-pozytywnych, 6 SS-B-pozytywnych, 9 Sm-pozytywnych, 11 RNP-pozytywnych, 13 Scl70-pozytywnych i 8 Jo-1-pozytywnych.
Z tych 90 próbek, żadna nie wykazała obecności przeciwciał IgG przeciwko ludzkiej tTG. W rzeczywistości dla
żadnej próbki nie uzyskano wyniku wyższego niż 7 jednostek, z wyjątkiem jednej próbki pochodzącej od
pacjenta z chorobą Leśniewskiego-Crohna dla której uzyskano wynik 15 jednostek, który nadal mieścił się
poniżej wartości granicznej wynoszącej 20 jednostek.
Precyzja i powtarzalność
Precyzja i powtarzalność badania zostały przebadane przez przeprowadzenie sześciu powtórzeń każdej silnie
pozytywnej, słabo pozytywnej i negatywnej próbki w sześciu oddzielnych badaniach. Średnia reakcyjność
wyników silnie pozytywnych wyniosła 85, słabo pozytywnych wyniosła 25,0, a średnia wartość negatywnych
wyników wyniosła 14,7 jednostki. Poniżej znajduje się podsumowanie odchylenia standardowego oraz
współczynnika zmienności dla każdej próbki.
Negatywny
Silnie pozytywna
Słabo pozytywna
SD
CV
SD
CV
SD
CV
Łącznie
0,40
2,7%
2,16
2,5%
0,63
2,5%
W ramach serii
0,37
2,5%
1,75
2,1%
0,67
2,7%
Pomiędzy seriami
0,28
1,9%
1,59
1,9%
0,32
1,3%
6
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celiac disease. Acta Paediatr Scand 59: 461, 1970.
Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis
of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and
Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: 909-911, 1990.
Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca
Raton (FL): CRC Press, 1990.
Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis
herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: 325-334, 1983.
Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and
subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: 298-301, 1992.
Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in
adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive
value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, 1996.
Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: 704-711, 1996.
Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step
forward in celiac disease screening. Digestive Diseases & Science 36: 752-756, 1991.
Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: 639-645,
1992.
Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease.
Acta Gastro-Enterologica Belgica 55:200-208, 1992.
Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac
disease in asymptomatic patients. Allergy 49: 593-597, 1994.
Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as
a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17:
123-127, 1993.
Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease.
Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p. 23-33, 1997.
Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of
celiac disease. Nature Medicine 3: 797-801, 1997.
Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue
transglutaminase – guilt by association? Gut 41: 851-852, 1997.
Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative
direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, 2000.
Sardy M, et al. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of glutensensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, 1999.
Sblattero D, et al. Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative diagnostic assay
for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, 2000.
Sugai E, et al. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit.
Am J Gastro 95: 2318-2322, 2000.
Lampasona V, et al. Tissue transglutaminase and combined screening for coeliac disease and type 1
diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352:1192-1193, 1998.
Hansson T, et al. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children
with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, 2000.
Andersson AS, et al. Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth
International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000.
Axiö-Frekricksson UB, et al. Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth
International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000.
Signorini M, et al. Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization.
Biological Chemistry 369: 275, 1988.
Collin P, Mäki M, et al. Selective IgA deficiency and Coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: 367,
1992.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute
of Health, 2007, Fifth Edition.
7
Wyprodukowano przez:
QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych):
00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628755POL
Czerwiec 2011
Wersja 0
8