Cel ćwiczenia: Opis stanowiska - MEMS lab

ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE
LABORATORIUM
Ćwiczenie nr 4
MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i warunkami działania mikrocytometru typu
„T” z detekcją fluorymetryczną. W ćwiczeniu badany będzie poziom sygnału
fluorescencyjnego pochodzącego od mikrokulek fluorescencyjnych, które stanowią model dla
oocytu/zarodka bydła lub trzody chlewnej.
Opis stanowiska:
1.
2.
3.
4.
5.
Krzemowo-szklany mikrocytometr typu „T”
Źródło światła: laser o długości fali emisji 532 nm i mocy 5 mW
Kamera CCD z filtrem optycznym górnoprzepustowym FEL600 nm oraz kartą TV
Zasilacz do kamery (12 V) oraz lasera (3V)
Komputer z oprogramowaniem
Rys. 1. Schemat budowy mikrocytometru
Rys. 3. Idea pracy mikrocytometru
Rys. 2. Obszar detekcji fluorymetrycznej
Rys. 4. Schemat układu pomiarowego
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
1
Przebieg ćwiczenia:
1. Zaznajomienie się z układem pomiarowym
2. Pomiary sygnału fluorescencyjnego:
Włączyć zasilacz
Sprawdzić, czy są podłączone laser oraz kamera CCD do zasilacza
Włączyć komputer i zalogować się na konto Student (hasło: Student)
Odsunąć kamerę CCD, tak aby widoczny był cały chip
Pobrać kulki zawieszone w roztworze za pomocą pipety
Wprowadzić kulki do kanału cieczowego
Umieścić kamerę CCD nad chipem, tak aby jeden otwór wylotowy nie został
przykryty przez kamerę
8. W programie VirtualDub wybrać opcję nagrywania (File→ Capture AVI)
9. Określić ścieżkę zapisu filmu (File→ Set Capture File)
10. Sprawdzić, czy jest widoczna na ekranie komputera strefa detekcji fluorescencji
(skrzyżowanie „T”)
11. Przez otwór wylotowy nieprzykryty przez kamerę bardzo powoli zasysać ciecz z
kulkami
12. Rozpocząć proces nagrywania filmu (Capture → Capture Video)
13. Film powinien trwać ok. 4-8s.
14. W czasie nagrywania filmu jedna kulka powinna przepłynąć przez skrzyżowanie „T”
tak, aby dobrze widoczny był sygnał fluorescencji
15. Wyłączyć nagrywanie filmu poprzez wybranie Capture → Stop Capture
16. Procedurę powtórzyć dla 10 kulek
17. Po wykonaniu pomiaru należy przepłukać chipa w wodą dejonizowanej
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
3. Analiza wyników pomiarów:
Wszelkich analiz dokonuje się na podstawie obrazów graficznych zarejestrowanych kamerą
cyfrową.
Zmiana rozmiaru filmu
1. Uruchomić program VirtualDub.
2. Wczytać plik z filmem (File → Open video file). Pojawią się dwa okna z wczytanym
filmem.
3. Następnie zmienić rozmiar analizowanego pliku (Video → Filters → Add…; pojawi
się dodatkowe okienko, w którym wybieramy filtr resize i zadajemy szerokość 320 i
wysokość 240 pikseli po czym zatwierdzamy przyciskiem OK. dwukrotnie).
4. Kolejnym krokiem jest zapisanie filmu w formacie .avi (File → Save as AVI).
5. Czynność tą wykonujemy dla każdego z nagranych filmów.
Analiza sygnału fluorescencji
1. Uruchomić program OPTOLABCARD software.
2. Wybrać ścieżkę zapisu wygenerowanego po analizie pliku xls oraz zdjęcia (Change
dir).
________________________________________________________________________ 2
___
www.memslab.pl
3. Wczytać wybrany film do analizy (Select movie).
4. Po wczytaniu pliku w oknie po prawej stronie pojawi się obraz do analizy.
Analizowany obraz
5. W celu dokładnego zaznaczenia analizowanych punktów należy powiększyć
analizowany obszar poprzez naciśnięcie Enlarge area i zakreślenie tylko obszar kanału
oświetlanego.
6. Należy wybrać obszary, które będą poddane analizie. W tym celu należy wybrać 2
pola do analizy (1 - czerwone i 2 - zielone). Jedno z nich powinno znajdować się w
obszarze świecenia wiązki światła (sygnał fluorescencji kulki), a drugie poza nim
(sygnał tła), ale w obszarze kanału. Pola do analizy nie powinny przekraczać
wymiarów 2×2. W celu dokładnego narysowania pola do analizy można się
posługiwać precyzyjnymi strzałkami.
Analizowane
pola
Rozmiar
analizowanych
pól
Precyzyjne
strzałki
7. W celu dokonania analizy zaznaczonych pól należy wcisnąć przycisk Measure.
Spowoduje to pojawienie się krzywych pomiarowych w lewej części programu
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
3
(Rys. 5) oraz automatycznie zostaną wygenerowane pliki xls oraz bmp do katalogu,
który był wskazany na początku.
Krzywe pomiarowe
8. Powyższe czynności należy wykonać dla co najmniej 10 kulek.
4. Opracowanie wyników:
1. Wygenerowany w trakcie analizy plik xls zawiera trzy kolumny: 1 – czas, 2 – sygnał
fluorescencji z pola czerwonego, 3 – sygnał fluorescencji z pola zielonego
2. Dla pojedynczej kulki należy odjąć maksymalny sygnał tła od maksymalnego sygnału
fluorescencji w programie Excel lub Origin. Z uzyskanej różnicy należy wybrać
maksimum.
3. Czynności te należy powtórzyć dla każdej kulki.
4. Końcowym wynikiem analizy danych pomiarowych jest wykres intensywności
fluorescencji w zależności od numeru kulki.
UWAGA !!!
Po przeprowadzeniu serii pomiarów należy mikrocytometr przepłukać wodą dejonizowaną.
Przykładowe pytania:
 Gdzie znajdują zastosowanie urządzenia typu Lab-on-a-Chip?
 Przedstawić schemat budowy mikrocytometru wraz z opisem funkcji poszczególnych
elementów.
 Jakie rodzaje detekcji oraz jakie detektory stosuje się w mikrocytometrach?
 Jakie metody są wykorzystywane do oceny jakości komórek rozrodczych?
Przed wykonaniem ćwiczenia proszę zapoznać się z materiałami pomocniczymi
przygotowanymi do ćwiczenia.
________________________________________________________________________
___
www.memslab.pl
4