Ćwiczenie 4

Ćwiczenie 4. Wyznaczanie masy cząsteczkowej białek za pomocą
spektrometrii mas.
Spektrometria mas jest narzędziem analitycznym stosowanym między innymi do
pomiaru masy cząsteczkowej analitu. Dla dużych cząsteczek (biomolekuł) masy
cząsteczkowe mogą być mierzone z dokładnością 0,01% całkowitej masy cząsteczkowej, tj. 4
daltonów (Da) lub mas atomowych (UAM) analitu o Mcz 40000 Da.
Spektrometry mas stosowane są w przemyśle i środowiskach naukowych, do badań
zarówno rutynowych i jak i badawczych. Główne zastosowania spektrometrii mas to:
biotechnologia (analiza białek, peptydów, oligonukleotydów, przemysł farmaceutyczny
(odkrywanie nowych leków, farmakokinetyka, metabolizm leków), badania kliniczne
(badania przesiewowe noworodków, analizy hemoglobiny, testy narkotykowe, ochrona
środowiska (WWA, PCB, jakość wody, skażenie żywności), itp.
4.1. Podstawy teoretyczne techniki ESI-MS
Na spektrometr mas składają się następujące elementy: źródło jonizacji, analizator i
detektor (Rysunek 1).
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie spektrometru mas
Próbka musi być wprowadzona najpierw do źródła jonizacji. Wewnątrz źródła
jonizacji, cząsteczki próbki są podawane jonizacji, ponieważ jonami łatwiej jest
„manipulować” niż cząsteczkami obojętnymi. Jony te są wyodrębniane w regionie analizatora
spektrometru masowego gdzie rozdziela się je w zależności od masy (m) i od ładunku (z),
czyli od stosunku wielkości (m/z). Rozdzielone jony są wykrywane i ten sygnał wysłany jest
do systemu danych, gdzie zebrane informacje są prezentowane w postaci zależności
intensywności od wielkości (m/z) czyli widma MS. Analizator i detektor spektrometru mas są
utrzymywane w wysokiej próżni aby umożliwić jonom podróż z jednego końca instrumentu
do drugiego końca bez przeszkód w postaci kolizji z cząsteczkami powietrza.
4.2. Aparatura pomiarowa
Sposoby jonizacji
Sposób wprowadzenia próbki do źródła jonizacji często zależy od metody jonizacji, a
także od rodzaju i złożoności próbki.
Próbkę można wprowadzić do komory, gdzie odbywa się jonizacja bezpośrednio lub
za pomocą technik chromatograficznych. Ta ostatnia metoda wprowadzenia próbki zazwyczaj
wiąże się z połączeniem spektrometru mas z wysokosprawnym chromatografem cieczowym
(HPLC), chromatografem gazowym (GC) lub kapilarną elektroforezą (CE), a więc próbka jest
wstępnie rozdzielana, a poszczególne rozdzielone pasma są wprowadzane do spektrometru
mas.
Istnieje wiele metod jonizacji cząsteczek w spektrometrach mas. Do metod najczęściej
używanych w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i
oligonukleotydy należą:
Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną
substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV) pod ciśnieniem
atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji – zwykle nie powoduje
fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad
wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy.
Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation –
MALDI) – w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie
doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich
"wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która
jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek.
Analizatory mas
W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy:
Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF) – charakteryzują się stosunkowo dużymi
rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są
najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.
Kwadrupol (Quadrupole) - jest to popularny analizator zbudowany z czterech symetrycznie
ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza
tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z).
Pułapka jonowa (Ion trap – IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów.
Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Charakteryzują się one zwykle
dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) Analizator
cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym.
Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Rozdzielczości tych
analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier
Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) Analizator ten działa podobnie jak analizator
cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną
metodę zbierania danych niż w ICR. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku
analizatory ICR.
Orbitrap – zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej
pomiędzy którymi poruszają się jony. Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi
analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap
charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).
Elektrorozpylanie.
Proces jonizacji z zastosowaniem techniki ESI przedstawiono schematycznie na Rysunku 2.
Azot
Kapilara
Komora
Separator
stożkowy
aerozol
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji poprzez elektrorozpylanie (ESI)
Mechanizm jonizacji poprzez elektrorozpylanie nie jest do końca ustalony, jakkolwiek
przyjmuje się, że w zależności od warunków i wielkości jonizowanych cząsteczek proces ten
może przebiegać dwiema drogami; zgodnie z modelem naładowanej pozostałości (CRM)
bądź też modelem odparowania jonu (IEM).
Roztwór próbki jest wprowadzany przez metalową igłę do komory rozpylania. Gaz
rozpylający doprowadzany jest poprzez rurkę, w której umieszczona jest igła. Duże siły
ścinające, wytwarzane przez gaz rozpylający, w połączeniu z silnym polem elektrostatycznym
(2,5 ÷ 6 kV) w komorze rozpylania porywają roztwór składników próbki w fazie ruchomej i
rozbijają go na kropelki. Podczas rozpylania, krople aerozolu zostają naładowane dodatnio
bądź ujemnie w zależności od tego jaki potencjał ma igła rozpylacza względem analizatora
mas. Na skutek odparowywania rozpuszczalnika, objętość kropli aerozolu zmniejsza się
ustawicznie, a tym samym zwiększa się powierzchniowa gęstość ładunku elektrycznego jakim
jest ona obdarzona. Proces ten trwa do chwili gdy siły odpychania ładunków zgromadzonych
na powierzchni kropli przezwyciężą siłę napięcia powierzchniowego utrzymującą kroplę w jej
kształcie. W tym momencie zachodzi zjawisko tak zwanej „eksplozji Coulombowskiej” czyli
rozbicia kropli na kilka mniejszych kropelek, których łączna powierzchnia jest większa od
powierzchni
kropli
macierzystej.
Powoduje
to
zmniejszenie
gęstości
ładunku
powierzchniowego przypadającego na każdą powstałą kropelkę. Proces ten ulega powtórzeniu
w miarę odparowywania rozpuszczalnika.
Zgodnie z modelem CRM tworzenie coraz mniejszych kropli trwa aż do momentu
odparowania ostatniej cząsteczki rozpuszczalnika, podczas gdy model IEM zakłada
możliwość emisji jonów bezpośrednio z powierzchni stosunkowo dużych kropel (o średnicy
około 10 nm).
Mechanizm powstawania jonów w ESI w sposób schematyczny pokazano na Rysunku 3.
Rysun
ek 3.
Schem
atyczn
e
przeds
tawien
ie
mecha
nizmu
joniza
cji za
pomoc
ą techniki ESI
Technika ESI jest szczególnie przydatna do jonizacji cząsteczek o różnej polarności
(nawet bardzo polarnych) oraz dużych cząsteczek biologicznych (białek). Technika
elektrorozpylania wymaga stosowania rozpuszczalników polarnych. Jednakże, po dodaniu
polarnego modyfikatora, rozpuszczalniki niepolarne mogą być również z powodzeniem
stosowane, co oznacza, że technika ESI nadaje się do układów faz odwróconych, w których
wypełnienie kolumny jest mniej polarne od fazy ruchomej.
Tryb jonizacji
W każdym ze wspomnianych wyżej sposobów jonizacji do wyboru są dwa tryby
pracy: tworzenia jonów dodatnich (przyłączanie protonu/protonów do substancji oznaczanej
lub wymiana ładunku między nią a składnikami fazy ruchomej) i tworzenia jonów ujemnych
(odszczepienie protonu/protonów od substancji badanej lub wymiana ładunków).
Uogólniając, w przypadku analitów o charakterze bardziej zasadowym stosuje się tryb
tworzenia jonów naładowanych dodatnio. Cząsteczka próbki (zasada) pobiera proton z
bardziej kwaśnego roztworu rozpuszczalnika. Natomiast anality o charakterze bardziej
kwaśnym można oznaczać stosując tryb tworzenia jonów naładowanych ujemnie. Cząsteczka
próbki (kwas) oddaje proton do zasady w roztworze i staje się naładowana ujemnie.
Istnieją jednak wyjątki o tak zróżnicowanej budowie chemicznej, dla których można
zastosować oba sposoby jonizacji.
Ze względu na fakt, że analizy chromatograficzne mogą być prowadzone przy
zastosowaniu dwóch trybów pracy detektora MS, uzyskiwane są dwa rodzaje jonów
(pseudo)cząsteczkowy: [M+H]+ oraz [M-H]-, chociaż nie można wykluczyć obecności jonów
[M]-. Oprócz jonów (pseudo)cząsteczkowych powstających w wyniku protonowania i
deprotonowania cząsteczki w warunkach jonizacji powstawać mogą także jony będące
produktami przyłączenia np. jonu amonowego lub jonów metali alkalicznych, np: [M+NH4]+,
[M+Na]+, [M+K]+ w warunkach tworzenia jonów dodatnich, zaś w warunkach tworzenia
jonów ujemnych powstawać może [M+HCOO]- (np. w obecności kwasu mrówkowego w
fazie ruchomej). Te tzw. jony addycyjne, z jednej strony komplikują interpretację widma mas,
ale równocześnie mogą pomóc w interpretacji struktury analitu. Wreszcie występowanie
jonów klasterowych, takich jak np. [2M+H]+, [3M+H]+ i jonów fragmentacyjnych może także
utrudnić interpretację widma albo potwierdzić przypuszczenie co do ewentualnej struktury
związku.
Interpretacja widma MS.
Przykładowe widmo MS dla
pentapeptydu leucyny enkefaliny (YGGFL) pokazano na
Rysunku 4. Wzór cząsteczkowy tego związku jest następujący: C28H37N5O7 . Obliczona masa
monoizotopowa wynosi 555.2692 Da.
Rysunek 4. Widmo ESI-MS m/z dla YGGFL.
Na widmie MS widać dominujący jon przy m/z = 556.1, który jest zgodny z
oczekiwanym protonowanym jonem (pseudo)molekularnym [M + H] +. Protonowane jony
powstają, gdyż próbka została zanalizowana w warunkach tworzenia jonów dodatnio
naładowanych (po przyłączeniu protonu). Stąd zmierzona masa cząsteczkowa wynosi:
556.1 – 1 = 555.1 Da
a wynik jest zgodny z masą teoretycznie obliczoną.
Na widmie MS widać również inny jon przy m/z = 557.2 o mniejszym natężeniu
(intensywność jego wynosi ok. 25% jonu m/z = 556.1). Stanowi on sygnał od cząsteczki, w
której atom 12C został zastąpiony przez atom 13C (istnieją trzy naturalnie występujące izotopy
węgla,
12
C oraz
13
C i izotop
14
C ). Intensywność obserwowanych w MS jonów m/z
pochodzących od atomów izotopowych jest skorelowana z ilością naturalnie występującego
izotopu pomnożoną przez całkowitą liczbę atomów węgla w cząsteczce. Dodatkowo fakt, że
widoczny jon pochodzący od izotopu 13C ma masę o jedną jednostkę Da wyższą od jonu m/z
pochodzącego od jonów
12
C sugeruje, że z = 1 (jon pseudomolekularny jest pojedynczo
naładowany). W przypadku, gdyby jon został podwójnie naładowany, a wartości jonów m/z
różniłyby się tylko o 0,5 jednostki Da, wówczas oznaczałoby to, że z = 2.
Na widmie MS zauważyć można także jony przy m/z = 578.1. Skoro oczekiwana
masa wynosi 555.2, to jest to sygnał pochodzący od jonu o 23 jednostki Da wyższy od
oczekiwanej masy cząsteczkowej. Ten jon można rozpoznać jako addukt sodowy [M + Na] +
(dość często spotykany w jonizacji typu elektrorozpylanie). Zamiast jonizacji cząsteczek
próbki przez przyłączenie protonu H +, niektóre cząsteczki są zjonizowane przez przyłączenie
kationów sodu Na +.
Elektrorozpylanie jest techniką znaną jako "miękki" sposób jonizacji jako że anality
ulegają zjonizacji przez przyłączenie lub odszczepienie protonu, z bardzo niewielką
dodatkową energią nie powodującą fragmentacji analitu (zachowana zostaje cała struktura
analitu).
Analiza MS substancji o masach cząsteczkowych większych niż ok. 1200 Da
prowadzi zwykle do powstawania jonów wielokrotnie naładowanych, takich jak [M + nH] n +
w trybie jonizacji dodatniej i [M-nH]
n-
w trybie ujemnej jonizacji. Przykładem takich
analitów są białka.
Białka mają wiele odpowiednich miejsc do protonowania jak wszystkie grupy
amidowe, a także niektóre aminokwasy w łańcuchach bocznych, które zawierają podstawowe
funkcje aminowe.
Przykładowe widmo MS pokazujące jony wielokrotnie naładowane, uzyskane w
trakcie jonizacji za pomocą elektrorozpylania, jest przedstawione na Rysunku 5. Widoczne
jony m/z powstały w pozytywnym trybie jonizacji lizozymu 1 z białka jaja kurzego.
Rysunek 5. Widmo ESI-MS lizozymu z białka kurzego
Próbkę poddano analizie w mieszaninie: acetonitryl i 0,1% wodny roztwór kwasu
mrówkowego, 1:1 (v / v) i na widmie ESI-MS widoczny jest gaussowski rozkład jonów
wielokrotnie naładowanych, począwszy od m/z = 1101.5 do 2044.6.
Wartości poszczególnych jonów m/z można wyrazić za pomocą następującego wzoru:
1 Lizozym jaja kurzego jest zasadowym polipeptydem zawierającym 129 aminokwasów o masie cząsteczkowej 14.4 D.
Jest to naturalny enzym występujący w białku jaja działający przeciwbakteryjnie bezpośrednio na bakterie gram
dodatnie. Najbardziej charakterystyczną właściwością lizozymu jest jego zdolność do tworzenia kompleksów z innymi
biopolimerami ( kompleks z owomucyną nadający żelową strukturę białka będący wskaźnikiem świeżości jaj ). Lizozym
jest białkiem termostabilnym, szczególnie w środowisku kwaśnym i może być ogrzewany nawet do 100ºC. Lizozym ze
względu na swoje właściwości znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym jako biokonserwant wielu produktów
żywnościowych, w tym m.in. mięsa i produktów mięsnych, ryb i ich przetworów, mleka i produktów mleczarskich,
świeżych warzyw, owoców , wina oraz w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym jako naturalny antybiotyk.
Szczególnie duże zastosowanie lizozym ma w technologii serów dojrzewających jako czynnik redukujący bakterie
fermentacji kwasu masłowego, głównie bakterie z grupy Clostridia, Clostridium tyrobutyricum obniżających jakość i
wartość handlową serów. Zastosowanie lizozymu eliminuje konieczność stosowania azotynów czy nadtlenku wodoru
powszechnie stosowanych w serowarstwie, a jedną z jego głównych zalet z punktu widzenia producentów stanowi fakt,
że umożliwia późniejsze wykorzystanie serwatki do celów handlowych.
m/z = (MW + nH +) / n
(1)
gdzie:
m/z
→ stosunek masy do ładunku (zaznaczone na odciętej);
MW
→ masa cząsteczkowa analitu
n
→ całkowita liczba jonów
H
→ masa protonu (1,008 Da).
Jeżeli wielokrotność naładowania cząsteczki jest znana, to jest po prostu kwestia
odczytania wartości m/z dla danego widma i rozwiązania powyższego równania w celu
określenia masy cząsteczkowej analitu. Zazwyczaj jednak liczba ta nie jest znana. Jednakże,
przyjmując założenie, że każde dwa sąsiadujące ze sobą jony w serii wielokrotnie
naładowanych jonów różnią się jednym ładunkiem, to równanie (1) można rozwiązać.
Na przykład, jeśli jony m/z = 1431.6 widoczny na widmie ESI-MS lizozymu z białka
kurzego (Rysunek 5) ma ładunek "n", to poprzedni jony przy m/z = 1301.4 będzie miał
ładunek "n +1" . W związku z tym powyższe równanie (1) można zapisać ponownie na tych
dwóch jonów w następujący sposób:
1431.6 = (MW + nH+) / n
1301.4 = [MW + (n +1) H+] / (n +1)
Rozwiązując te dwa równania z dwoma niewiadomymi (n, MW) otrzymujemy:
n (1431.6) - nH+ = (n +1) 1301.4 - (n +1) H+
a następnie:
n (1431.6) = n (1301.4) +1301.4 - H+
Zatem:
.
i tak:
n = (1301.4 - H+) / (1431.6 - 1301.4)
stąd jon przy m/z = 1431.6 jest dziesięciokrotnie naładowany.
Umieszczenie wartość z powrotem do równania daje:
1431.6 = (MW + nH +) n
a w związku z tym:
1431.6 x 10 = MW + (10 x 1.008)
i tak otrzymujemy:
MW = 14 316 – 10.08
MW = 14 305.9 Da
Zmierzona masa cząsteczkowa jest w dobrej zgodności z teoretyczną masą
cząsteczkową lizozymu z białka kurzego (obliczoną na podstawie średnich mas atomowych)
→ MWteoret = 14305.14 Da.
Obliczenia takie można wykonać automatycznie lub przynajmniej pół-automatycznie.
Technika MALDI
Technika MALDI jest "miękką" metodą jonizacji. Fragmentacja jonów analitu
zazwyczaj nie występuje. Technika ta umożliwia szybki i dokładny pomiar masy
cząsteczkowej w zakresie 1÷400 000 Da, co jest szczególnie cenne dla biochemii – do
pomiaru mas cząsteczkowych peptydów, białek, nukleotydów, a także oligosacharydów i
lipidów. Istnieje możliwość prześledzenia procesu fragmentacji jonu molekularnego i
odtworzenia na tej podstawie np. sekwencji aminokwasów. Tak więc możliwe się stają
badania strukturalne białek (również w poznawaniu kodu DNA). W chemii polimerów
technika MALDI pozwoli prześledzić profil rozkładu mas cząsteczkowych.
Technika MALDI wykorzystuje ideę użycia matrycy pośredniczącej w przekazywaniu
energii do badanej substancji, ułatwiającej jonizację próbki i umożliwiającej badanie
substancji nielotnych, wielkocząsteczkowych, polarnych. Matrycami stosowanymi w technice
MALDI są substancje, które:
− dobrze absorbują promieniowanie z zakresu UV
− łatwo sublimują
− po desorpcji dostarczają dużych ilości jonów (protonów) potrzebnych do jonizacji
badanej substancji
Najczęściej stosowane matryce przedstawiono na Rysunku 6.
Rysunek 6. Matryce najczęściej stosowane w technice MALDI
Analizowaną substancję rozpuszcza się w dowolnym, lotnym rozpuszczalniku.
Następnie roztwór próbki miesza się z roztworem matrycy (użytym w nadmiarze),
ewentualnie dodając niewielkie ilości substancji ułatwiających powstawanie jonów (np. kwas
trifluorooctowy, sole litowców i miedziowców). Mieszaninę, w ilości ok. 1 ml, nanosi się na
płytkę ze stali nierdzewnej (slider) i pozwala odparować rozpuszczalnikowi w strumieniu
powietrza. Celem jest doprowadzenie do wspólnego, jednorodnego wykrystalizowania
mieszaniny badanej substancji i matrycy. Ponieważ jakość widma uwarunkowana jest
równomiernym rozproszeniem badanej substancji w materiale matrycy, jest to etap niezwykle
istotny dla jakości widma. Po dokładnym wysuszeniu próbkę wprowadza się do komory
pomiarowej aparatu i usuwa powietrze (średnia droga swobodna jonów ~1 m wymaga próżni
10–6 ÷ 10–7 Torr). Po uzyskaniu dostatecznej próżni wykonuje się właściwy pomiar. W
aparacie wykorzystuje się laser gazowy N2 , pracujący impulsowo w zakresie nadfioletu (l =
337 nm). Skoncentrowany na powierzchni o średnicy 80–100 mm impuls laserowy trwający
ok. 3 ns wywołuje ciąg następujących po sobie reakcji:
− Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy.
− Odparowanie próbki na głębokość 2–3 l, czyli 0,5–1 mm i wyrzucenie strumienia
gazów prostopadle do jej powierzchni.
− Dysocjacja termiczna matrycy.
− Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).
− Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą (→ dysocjacja termiczna z utworzeniem
pary kation–anion, → oderwanie elektronu, → oderwanie bądź przyłączenie protonu,
→ przyłączenie kationu bądź anionu).
Wytworzone w ten sposób jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do
detektora.
Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji za pomocą techniki MALDI
pokazano na Rysunku 7.
Rysunek 7. Schematyczne przedstawienie mechanizmu jonizacji za pomocą techniki MALDI
4.3. Zastosowania pomiarów w badaniach biologicznych/biochemicznych/biofizycznych
Spektrometria mas jest narzędziem analitycznym stosowanym między innymi do
pomiaru masy cząsteczkowej analitu. Dla dużych cząsteczek (biomolekuł) masy
cząsteczkowe mogą być mierzone z dokładnością 0,01% całkowitej masy cząsteczkowej, tj. 4
daltonów (Da) lub mas atomowych (UAM) analitu o Mcz 40000 Da. Jest to wystarczające,
aby zaobserwować (zmierzyć) drobne zmiany w masie cząsteczkowej wynikające na przykład
z
zamiany
jednego
aminokwasu
na
inny,
lub
post-translacyjnej
modyfikacji.
Dla małych cząsteczek organicznych masa cząsteczkowa może być mierzona z dokładnością
do 5 ppm lub mniej, co jest często wystarczające, aby potwierdzić wzór sumaryczny związku,
a także jest standardowym wymogiem do publikacji w czasopiśmie chemicznym.
Spektrometry mas mogą także dostarczać informacji na temat struktury związku. W tym celu
stosuje się tzw tandemowe spektrometry mas. Cząsteczki badanej substancji poddaje się
fragmentacji i detekcji podlegają właśnie te fragmenty. Ten sposób jest przydatny do badania
sekwencji peptydów lub oligonukleotydów.
Technika MALDI jest szczególnie przydatna do wyznaczania masy cząsteczkowej
następujących związków: Peptydy, Białka (M < 200 000 Da), Oligonukleotydy,
Oligosacharydy, Polimery polarne zawierające heteroatom: poliwęglany, politlenki olefin i
cykloolefin (M < 20 000 Da), Kaliksareny. Zadowalający efekt można uzyskać w przypadku
analizy lipidów, związków metaloorganicznych, poliestrów, polimerów słabo polarnych (np.
polistyren). Jednakże technika ta nie nadaje się do badania polisacharydów czy poliolefin
(polietylen, polipropylen).
4.4. Eksperymenty
Wersja 1
W celu wyznaczenia masy cząsteczkowej białka za pomocą spektrometru mas należy
przygotować (Tabela 1):
Tabela 1. Warunki oznaczania masy cząsteczkowej białka w warunkach denaturujących)
Aparat
Spektrometr mas MSD z pojedynczym
kwadrupolem i spektrometr mas QTOF
Źródło jonizacji
elektrorozpylanie
Sposób gromadzenia danych z MS
SCAN
Tryb jonizacji
dodatni
Zakres mas
m/z = 100-1500
Fragmentor
50-150 (należy optymalizować dla próbki)
Napięcie na kapilarze
5000V
Przepływ gazu suszącego
12 L/min
Temperatura gazu suszącego
300oC
Pompa do HPLC
Umożliwia wprowadzenie roztworu białka do
komory jonizacyjnej
Faza ruchoma – warunki denaturujące
Mieszanina (50:50) acetonitrylu i wody
zawierających 0.1% kwasu mrówkowego
Roztwór białka (np. mioglobina)
Białko (np. mioglobina) w ilości 0.1 – 0.5 mg
rozpuścić w fazie ruchomej
Objętość wprowadzanego roztworu (dla
automatycznego podajnika próbek)
5 µL
Procedura wyznaczania masy cząsteczkowej białka:
1. Włączyć spektrometr mas z pojedynczym kwadrupolem i ustawić parametry zgodnie z
zaleceniami przedstawionymi w Tabeli 1.
2. Przygotować 100 mL fazy ruchomej.
3. Przemyć pompę przygotowaną fazą ruchomą.
4. Przygotować 0.5 – 1 mL roztworu białka rozpuszczonego w fazie ruchomej.
5. Przenieść roztwór do naczynia i umieścić w pozycji 1 automatycznego podajnika
próbek.
6. Przeprowadzić analizy przygotowanego roztworu białka w warunkach różnego
napięcia przyłożonego do kapilary (wartość fragmentora należy zmieniać w zakresie
od 50 do 200 jednostek, co 25 jednostek) i wyznaczyć wartość optymalną
(rozmieszczenie jonów wielokrotnie naładowanych na widmie MS musi mieć rozkład
zbliżony do gaussowskiego).
7. Na podstawie widma MS uzyskanego dla optymalnych parametrów pracy
spektrometru mas należy:
◦
wybrać dwa sąsiadujące ze sobą jony (najlepiej te o najwyższej intensywności)
◦
obliczyć wielokrotność naładowania wybranego jonu stosując równanie (1)
◦
znając wielokrotność naładowania jonu, obliczyć masę cząsteczkową białka
8. Powtórzyć analizy MS stosując analizator czasu przelotu mas (QTOF).
9. Wyznaczyć rozdzielczość użytych w trakcie ćwiczenia spektrometrów mas. Miarą
rozdzielczości spektrometru jest zdolność do rozróżnienia dwóch jonów o pewnej
różnicy stosunku masy do liczby ładunków elementarnych jonów (m/z) → m i m+∆m.
Rozdzielczość można wyliczyć ze wzoru: R = m / ∆m. Spektrometr o rozdzielczości
1000 będzie umożliwiał rozróżnienie dwóch cząsteczek o m/z równym 1000 i 1001.
Najczęściej uznaje się, że jeśli na widmie m/z dolina pomiędzy pikami dwóch jonów
jest głębsza niż 50% wysokości pików, to są one rozróżnione.
10. Określić dokładność wyznaczenia masy cząsteczkowej dla obu aparatów stosując
roztwór tetracykliny o stężeniu 0.5 mg/mL. Dokładność wyznaczenia masy
cząsteczkowej jest zdefiniowana jako różnica pomiędzy zmierzoną i obliczoną masą
dla danego jonu. Jest ona podawana w % zmierzonej masy (np. 10 000 ± 0.01%) lub w
ppm (np. 10 000 ± 100 ppm).
11. Dokonać interpretacji otrzymanych danych porównując informacje uzyskane podczas
ćwiczenia (wyznaczona masa cząsteczkowa białka, dokładność i rozdzielczość) z
użyciem różnych spektrometrów mas.