VetExpert IBV Ab ELISA

Test ELISA do wykrywania przeciwciał zakaźnego zapalenia oskrzeli
VetExpert IBV Ab ELISA
• Zasada działania testu
Zakaźne zapalenie oskrzeli (IB) to ostra i wysoce zaraźliwa choroba układu oddechowego kurcząt. Wywołuje ją ptasi wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli, należący do koronawirusów. Charakteryzuje się
objawami ze strony układu oddechowego, w tym dyszenie, kaszel, kichanie, rzężenie tchawiczne oraz
wyciek z nosa. U młodych kurcząt może wystąpić ciężka niewydolność oddechowa. U niosek najczęściej występującymi objawami są: niewydolność oddechowa, zapalenie nerek, spadek nieśności oraz
pogorszenie jakości jaj. VetExpert IBV Ab ELISA jest pośrednim testem immunoenzymatycznym przeznaczonym do jakościowego wykrywania przeciwciał zakaźnego zapalenia oskrzeli w kurzej surowicy.
Test VetExpert IBV Ab ELISA zawiera mikropłytkę, której studzienki opłaszczone są antygenem IBV.
Podczas pierwszej inkubacji obecne w badanej próbce przeciwciała IBV wiążą się z antygenem w studzience. Po tej inkubacji, niezwiązany materiał usunięto poprzez odessanie i wypłukanie. Następnie
dodany koniugat HRP tworzy kompleks z przeciwciałami IBV. Ponownie niezwiązany materiał usunięto poprzez odessanie i wypłukanie, kolejno dodano roztwór substratu. Aktywność pozostałego
w studzience enzymu będzie wprost proporcjonalna do stężenia anty-IBV w próbkach i można ją
zmierzyć poprzez inkubację fazy stałej z roztworem substratu. Reakcja jest zatrzymywana przez
dodanie roztworu hamującego, a uzyskany wynik należy odczytać kolorymetrycznie za pomocą
spektrofotometru przy długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm.
W teście zastosowano specjalnie dobrane antygeny IBV jako materiał wychwytujący. Umożliwiają
one VetExpert IBV Ab ELISA, z wysokim stopniem dokładności, na identyfikację przeciwciał zakaźnego zapalenia oskrzeli w próbkach.
•
Zawartość (480 studzienek/zestaw)
W skład zestawu VetExpert IBV Ab ELISA wchodzą następujące elementy do wykonania testu.
1) 5 mikropłytek opłaszczonych IBV (96 studzienek/płytka) ułożonych w dwanaście pasków 1x8.
2) Rozcieńczalnik do próbek: 2 butelki (250 ml) buforu fosforanowego.
3) Negatywna surowica kontrolna: 1 fiolka (0.2 ml) zwykłej surowicy kurzej SPF zachowanej w
buforze fosforanowym ze stabilizatorem białkowym. Proclin 300 (0.05%) dodany jako środek
konserwujący.
4) Pozytywna surowica kontrolna: 1 fiolka (0.2 ml) anty-IBV dodatniej surowicy kurzej zachowanej w buforze fosforanowym ze stabilizatorem białkowym. Proclin 300 (0.05%) dodany jako
środek konserwujący.
5) Roztwór płuczący (skoncentrowany 20x): 1 butelka (250 ml) PBS-Tween 20. Środek konserwujący: Thimerosal (0.01 %).
6) Koniugat: 1 butelka (60 ml) przeciwciał króliczych anty-kurzych IgY – HRP. Środek konserwujący: Proclin 300 (0.06%).
7) Substrat TMB: 1 butelka (60 ml) roztworu tetrametylobenzydyny (TMB) z buforem cytrynianowo-fosforanowym: PRZECHOWYWAĆ W CIEMNYM OTOCZENIU.
8) Roztwór hamujący: 1 butelka (80 ml) 1N kwasu siarkowego. Gotowy do użycia.
9) Samoprzylepna nakładka uszczelniająca: 10 EA.
10) Instrukcja użycia.
•
Środki ostrożności
W celu uzyskania wiarygodnych wyników należy ściśle przestrzegać poniższych zasad:
1) Do stosowania tylko w diagnostyce in vitro.
2) Nie stosować zamiennie odczynników pochodzących z różnych serii. Nie należy mieszać, aby nie
uzyskać błędnych wyników.
3) Nie należy wystawiać substratu TMB na działanie silnego światła lub jakiegokolwiek czynnika
utleniającego. Używać do substratu TMB jednorazowych naczyń plastikowych.
4) Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2~8°C, przed użyciem ogrzać do
temperatury otoczenia (18~25°C), po użyciu ponownie schłodzić do 2~8°C.
5) Należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu elementów zestawu.
6) Stosować rękawice jednorazowego użytku w trakcie obchodzenia się z potencjalnie zakaźnym
materiałem oraz w trakcie wykonywania testu.
7) Należy obchodzić się ostrożnie z substratem TMB i roztworem hamującym. Unikać kontaktu ze
skórą, oczami i błonami śluzowymi. W sytuacji wypadku przemyć starannie pod bieżącą wodą.
•
Pobranie próbek i przygotowanie
Przygotowanie surowicy:
1) Krew należy pobrać za pomocą jednorazowej strzykawki i dodać do probówki (bez antykoagulantu).
2) Pobraną krew pozostawić w temperaturze otoczenia przez 30 minut w celu koagulacji a następnie oddzielić surowicę poprzez wirowanie.
3) Surowica powinna być przechowywana w temperaturze 2~8°C do 2 tygodni. W przypadku dłuższego przechowywania (1rok) należy zamrozić w temperaturze -20°C.
• Przygotowanie odczynników
1) Przed użyciem wszystkie odczynniki należy ogrzać do temperatury otoczenia (18~25°C).
2) Roztwór płuczący (skoncentrowany 20x): przed użyciem skoncentrowany roztwór płuczący
należy rozcieńczyć w proporcji 1:19 z wodą destylowaną/dejonizowaną, np. 50 ml roztworu
płuczącego dodać do 950 ml wody destylowanej i dobrze wymieszać. W przypadku obecności
nierozpuszczonych kryształków, roztwór należy ponownie zawiesić poprzez podgrzanie przez
kilka minut w temperaturze 37°C.
• Wykonanie testu
1) Przygotować płytkę dla dwóch studzienek negatywnej surowicy kontrolnej, dwóch studzienek
pozytywnej surowicy kontrolnej oraz niezbędnych studzienek dla próbek badanych.
2) Rozcieńczyć 1: 500 kontrolę negatywną i pozytywną oraz próbkę surowicy w rozcieńczalniku do
próbek, np. 2 µl próbki + 1000 µl rozcieńczalnika do próbek.
Producent: BioNote, Inc.
2-9 Seogu-dong
Hwaseong-si
Gyeonggi-do
Republic of Korea 445-170
inserty_IBV Ab_20130618.indd 1
Importer na Europę Środkowo-Wschodnią
Vet Planet Sp. z o.o.
Biuro Handlowe
ul. Elżbiety Drużbackiej 7/3, 01-622 Warszawa
tel. +48 662 216 773
3) Dodać 100 µl rozcieńczonych surowic kontrolnych i próbek badanych do każdej studzienki.
4) Przykryć mikropłytkę samoprzylepną nakładką uszczelniającą i dokładnie wymieszać w mieszadle wibracyjnym. Mieszanie jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych rezultatów.
5) Inkubować studzienki w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 30 minut.
6) Wypłukać studzienki 5 razy używając 350 µl rozcieńczonego roztworu płuczącego. Odessać cały
płyn ze studzienek.
7) Dodać 100 µl koniugatu do każdej studzienki.
8) Przykryć mikropłytkę samoprzylepną nakładką uszczelniającą i inkubować w temperaturze
otoczenia (18~25°C) przez 30 minut.
9) Wypłukać studzienki 5 razy używając 350 µl rozcieńczonego roztworu płuczącego. Odessać cały
płyn ze studzienek.
10) Dodać 100 µl substratu do każdej studzienki.
11) Inkubować studzienki w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 15 minut.
12) Dodać 100 µl roztworu hamującego do każdej studzienki.
13) Odczytać gęstość optyczną (OD) studzienek przy użyciu spektrofotometru bichromatycznego
o długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm. Odczyt musi zostać ukończony w przeciągu 30
minut od zakończenia testu.
•
Interpretacja wyniku
1) Walidacja testu
[Surowica]
1. Jeżeli OD próbki badanej jest mniejsze niż średnie OD kontroli negatywnej (NC), S/P
może być interpretowane jako 0.
2. Średnia kontroli pozytywnej minus średnia kontroli negatywnej musi być większa lub
równa 0.200.
3. Średnia kontroli negatywnej musi być mniejsza lub równa 0.200.
4. Wartości OD powinny być zgodne z powyższą specyfikacją. Jeśli określone wymagania
nie są spełnione, badanie należy powtórzyć postępując zgodnie z procedurą wykonania.
2) Obliczanie wyników
1. Obliczanie średniego OD kontroli negatywnej (NCx):
NC1 + NC2
2
2. Obliczanie średniego OD kontroli pozytywnej (PCx):
OD NCx =
PC1 + PC2
2
3. Kryteria oparte na formule:
OD PCx =
ODsample – ODNCx
S/P =
ODPCx – ODNCx
¤
obliczanie logarytmu miana: Log10 miana = 1.074(Log10S/P) + 3.29
3) Wynik dodatni:
Jeżeli wartość S/P jest większa lub równa 0.2 próbka jest traktowana jako pozytywna dla
przeciwciał IBV.
4) Wynik ujemny:
Jeżeli wartość S/P jest mniejsza niż 0.2 próbka jest traktowana jako negatywna dla przeciwciał IBV.
i zakłócenia
• Ograniczenia
1) Podczas wykonywania testu należy ściśle przestrzegać procedury wykonania testu, zachować środki ostrożności i odpowiednio zinterpretować wyniki niniejszego testu.
2) Próbki
1. Próbki zawierające azydek sodu nie mają wpływu na wynik testu.
2. Próbki surowic inaktywowane termicznie (1 godzina w 56°C) nie wpływają ujemnie na test.
3. Antykoagulanty takie jak heparyna, EDTA i cytrynian nie mają wpływu na wynik testu.
4. Próbki hemolityczne należy przed wykorzystaniem poddać odwirowaniu celem uniknięcia zakłóceń składników komórkowych.
5. Niedodanie materiału badanego w trakcie procedury wykonania testu może spowodować uzyskanie wyniku fałszywie ujemnego. W przypadku podejrzenia klinicznej
infekcji, należy rozważyć powtórne wykonanie testu.
i stabilność
• Przechowywanie
1) Test VetExpert IBV Ab ELISA należy przechowywać w temperaturze 2~8°C. Niniejszy zestaw
pozostaje stabilny do terminu ważności wydrukowanego na opakowaniu oraz na etykiecie
każdego materiału / odczynnika.
2) Stabilność przygotowanych odczynników.
Materiał / odczynnik
Stan
Przechowywanie
Stabilność
Rozcieńczony roztwór
płuczący
Przygotowany
temp. otoczenia
(18~25°C)
1 tydzień
•480Opakowanie:
testów/zestaw
Precyzja
•Precyzję
pomiarów określono wykonując 10 powtórzeń dwóch próbek kontrolnych: surowicy negatywnej i surowicy pozytywnej. Współczynnik zmienności CV (%) wartości ujemnych i dodatnich
kontroli mieścił się w przedziale 10%.
Podmiot odpowiedzialny
Vet Planet Sp z o.o.
ul. Staszica 20A/3
05-092 Łomianki
tel. +48 662 204 328
www.vetexpert.pl
13-06-18 22:14
Infectious bronchitis Antibody ELISA
VetExpert IBV Ab ELISA
• Explanation of the Test
Infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious respiratory disease of chickens. It is
caused by avian infectious bronchitis virus, a coronavirus. The disease is characterized by respiratory signs including gasping, coughing, sneezing, tracheal rales, and nasal discharge.[1] In young
chickens, severe respiratory distress may occur. In layers, respiratory distress, nephritis, decrease
in egg production, and loss of internal egg quality and egg shell quality are reported. The VetExpert
IBV Ab ELISA is a indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay for the qualitative detection of
Infectious bronchitis antibody in chicken serum.
The VetExpert IBV Ab ELISA contains a microplate, which is pre‐coated with IBV antigen on the well.
During first incubation, if antibodies present in the test sample, IBV antibodies bind to the antigens
in the well. Following this incubation, all unbound materials are removed by aspiration and washing. HRP conjugate added subsequently forms a complex with the IBV antibodies. Unbound materials are removed by aspiration and washing before the addition of a substrate solution. The residual
enzyme activity found in the well will thus be directly proportional to the anti‐ IBV concentration
in specimens and evidenced by incubating the solid‐phase with a substrate solution. The reaction
is stopped by addition of the stopping solution and colorimetric reading will be performed by using
a spectrophotometer at 450 nm with reference wavelength at 620 nm.
The specially selected IBV antigens are used as capture material in test. These enable the VetExpert
IBV Ab ELISA to identify to Infectious bronchitis antibodies in specimens, with a high degree of
accuracy.
•
Materials Provided (480Tests/Kit)
VetExpert IBV Ab ELISA contains following items to perform the assay.
1) 5 Microplate coated IBV (96wells/plate) configured in twelve 1x8 strips.
2) Sample diluent: 2 bottle (250ml) of phosphate buffer
3) Negative control serum: 1 vial (0.2 mℓ/vial) of normal SPF chicken serum preserved in phosphate buffer with protein stabilizer. Proclin 300 (0.05%) is added as a preservative.
4) Positive control serum: 1 vial (0.2 mℓ/vial) of anti‐IBV positive chicken serum preserved in
phosphate buffer with protein stabilizer. Proclin 300 (0.05%) is added as a preservative.
5) Washing solution (20X concentrated): 1 bottle (250 mℓ/bottle) of PBS‐Tween 20. Preservative:
Thimerosal (0.01%)
6) Enzyme conjugate: 1 bottle (60 mℓ/bottle) of rabbit anti chicken IgY‐ HRP. Preservative: Proclin
300 (0.06%)
7) TMB Substrate: 1 bottle (60 mℓ/bottle) of tetramethyl‐benzidine (TMB) with citrate‐phosphate buffer: STORE IN THE DARK.
8) Stop solution: 1 bottle (80 mℓ/bottle) of 1N sulfuric acid. Ready to use.
9) Adhesive plate sealer: 10 EA
10) Instructions for use.
•
Precautions
In order to obtain reproducible results, the following rules must be observed:
1) For in vitro diagnostic use only.
2) The components from different serials are not interchangeable. Do not mix or substrate so as
not to get wrong results.
3) Do not expose TMB substrate to strong light or any oxidizing agents, Handle all TMB substrate
with disposable plastic ware.
4) Store all reagents at 2~8°C bring to room temperature prior to use and return to 2~8°C following use.
5) Care should be taken to prevent contamination of kit components.
6) Use disposable gloves while handling potentially infectious material and performing the assay.
7) TMB Substrate and stopping solution should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes
and mucous membranes. In case of accident, rinse thoroughly with running water.
• Specimen Collection and Storage
[Preparation of serum]
1) Blood should be collected with a disposable syringe and added to a serum collection tube (no
anticoagulant).
2) Collected blood should be left at room temperature for 30 minutes to coagulate and separate
serum by centrifugation.
3) Serum should be stored at 2~8°C for up to 2 weeks. For longer storage(1 year), freeze at or
below ‐ 20°C.
• Reagent preparation
1) Allow all reagents to come to room temperature (18~25°C) before use.
2) Washing solution (20X concentrated): The concentrated washing solution must be diluted 1:
19 with distilled/deionized water before use. i.e. add 50 mℓ of Washing solution to 950 mℓ
of distilled water and mix well. If undissolved crystals are present, resuspend the solution by
warming the bottle at 37°C for a few minutes.
• Procedure of the Test
and necessary testing sample wells.
2) Dilute the negative, positive control and the serum sample to 1:500 with sample diluent.
Ex) Sample 2ul + Sample diluents 1000ul
3) Add the 100 μℓ of diluted control sera and testing samples to each well.
4) Cover the microplate with adhesive plate sealer and mix well on vibrating mixer. Mixing is very
important to get the reproducible results.
5) Incubate the wells at 18~25°C(Room Temperature) for 30 minutes.
6) Wash the wells at 5 times with 350 μℓ of diluted washing solution. Aspirate all liquid from the
wells completely.
7) Add 100 μℓ of enzyme conjugate to each well.
8) Cover the microplate with adhesive plate sealer and incubate the wells at 18~25°C(Room Temperature) for 30 minutes.
9) Wash the wells 5 times with 350 μℓ of diluted washing solution. Aspirate all liquid from the
wells completely.
10)Add 100 μℓ of substrate solution to each well.
11)Incubate the wells for 15minutes at room temperature (18~25°C).
12)Add 100 μℓ of stopping solution to each well.
13)Read the absorbance of the wells with a bichromatic spectrophotometer at 450 nm with reference wavelength of 620 nm. Reading must be completed within 30 minutes from the end of
assay.
of the Test
•1) Interpretation
Test validation
[Serum]
(1) If the OD450 of a test sample is lower than the mean OD450 negative, the S/P ratio can be
interpreted as 0.
(2) The positive control mean minus the negative control mean must be higher than or equal
to 0.2.
(3) The negative control mean must be lower than or equal to 0.200.
(4) The OD value should be met with above specification. If the specified requirement are not
met, the test must be repeated following proper test procedures.
2) Results calculation
(1) Calculation of NC mean: (NC1 +NC2)/2
(2) Calculation of PC mean: (PC1+PC2)/2
(3) Criteria: The criteria is based on following formula.
S/P ratio = (OD450 sample – OD450 mean NCx)/ (OD450 mean PCx – OD450 mean NCx)
¤ calculation of Log titer: Log10 Titer = 1.074(Log10 S/P) + 3.29
3)Positive
If the S/P ratio is higher than or equal to 0.2, the sample is regarded as positive for IBV antibodies.
4)Negative
If the S/P ratio is lower than 0.2, the sample is regarded as negative for IBV antibodies.
and Interferences
•1) Limitations
The test procedure, precautions and interpretation of results sections for this test kit must be
followed closely when testing..
2)Samples
(1) Samples containing sodium azide do not affect the test results.
(2) Heat‐inactivated sera samples (1 hour at 56°C) do not impair the test.
(3) Anticoagulants such as heparin, EDTA, and citrate do not affect the test results.
(4) Haemolytic samples should be centrifuged before use to avoid interference by cellular
constituents.
(5) Failure to add specimen in the procedure can result in a false negative result. Repeating
test should be considered if there is clinical suspicion of infection.
and stability
•1) Storage
The VetExpert IBV Ab ELISA kit should be stored at 2~8°C. This test kit is stable through the
expiration date printed on the package and on the label of each material / reagent as unopened
state.
2) Stability of prepared reagents.
Material/Reagent
Diluted washing
solution
State
Storage
Stability
prepared
Room temp
(18~25°C).
1 weeks
Packaging Unit :
•480Tests/kit
Precision
•Within‐run
and between‐run precisions have been determined by testing 10 replicates of two
specimens: a negative serum, a positive serum. The C.V(%) of negative , positive values were within
10% of the time.
1) Prepare the plate for two wells of negative control serum, two wells of positive control serum,
Producent: BioNote, Inc.
2-9 Seogu-dong
Hwaseong-si
Gyeonggi-do
Republic of Korea 445-170
inserty_IBV Ab_20130618.indd 2
Importer na Europę Środkowo-Wschodnią
Vet Planet Sp. z o.o.
Biuro Handlowe
ul. Elżbiety Drużbackiej 7/3, 01-622 Warszawa
tel. +48 662 216 773
Podmiot odpowiedzialny
Vet Planet Sp z o.o.
ul. Staszica 20A/3
05-092 Łomianki
tel. +48 662 204 328
www.vetexpert.pl
13-06-18 22:14