Ćwiczenie 8

Ćwiczenie
Ilościowe oznaczanie glutationu i witaminy C
A. Ilościowe oznaczanie glutationu (GSH) metodą Ellmana
Wzór chemiczny glutationu (γ-glutamylocysteinyloglicyna)
Glutation (GSH) jest tiolowym tripeptydem o powyższym wzorze strukturalnym, występującym w
komórce zwierzęcej w ilości 1-10 mmol. Jego aktywność biologiczna wynika z obecności grupy
sulfhydrylowej (-SH), która uczestniczy w reakcjach antyoksydacyjnych oraz detoksykacyjnych.
Nukleofilowa grupa –SH glutationu może reagować z elektrofilowymi substancjami pochodzenia zarówno
endogennego, jak i egzogennego (ksenobiotyki), tworząc koniugaty. Skutkuje to tworzeniem związków o
większej rozpuszczalności i mniejszej toksyczności, a tym samym łatwiej wydalanych z organizmu.
Glutation odgrywa istotną rolę w metabolizmie i detoksykacji leków, a także przeciwdziała ubocznym
skutkom radio- i chemioterapii. obniżenie poziomu glutationu w komórkach towarzyszy takim stanom
patologicznym jak niedożywienie, choroba Parkinsona lub AIDS. Często terapia związana jest z reakcjami
oksydacyjnymi powodującymi zakłócenie w komórkach fizjologicznej równowagi pomiędzy
prooksydantami i antyoksydantami.
GSH jest również istotnym antyoksydantem komórkowym. Reaguje z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami
organicznymi w procesie katalizowanym przez peroksydazę glutationową:
GSH + HSG +H2O2 → GS-SG + 2H2O
GSH + HSG +ROOH → GS-SG + ROH + H2O
Regeneracja zredukowanej formy glutationu zachodzi w obecności reduktazy glutationowej zgodnie z
równaniem reakcji:
GS-SG + NADPH+H+ → 2GSH + NADP+
Antyutleniające działanie glutationu przejawia się również w odtwarzaniu w białkach grup tiolowych,
które uległy utlenieniu do grup disiarczkowych lub sulfonowych. Dzięki temu utrzymuje grupy –SH
białek w formie zredukowanej, co jest niezbędne dla ich aktywności biologicznej. W krwinkach
czerwonych zredukowany glutation (GSH) pełni funkcję buforu hydrosulfidowego, utrzymującego reszty
cysteinowe hemoglobiny i innych białek w formie zredukowanej. Erytrocyty, które nie zawierają
dostatecznej ilość tej formy glutationu ulegają hemolizie.
1
Glutation uczestniczy ponadto w redukcji rybonukleotydów z utworzeniem deoksyrybonukleotydów, czyli
bezpośrednio wpływa na biosyntezę DNA.
Glutation utrzymuje także sprawność układu odpornościowego poprzez udział w powstawaniu i
funkcjonowaniu limfocytów (zwłaszcza grasicozależnych T niszczących obce komórki) oraz ochrania
witaminy E i C przed utlenianiem, utrzymując ich prawidłowy poziom w organizmie.
Glutation uczestniczy również w syntezie leukotrienów LTC4 i LTD4, którym przypisuje się zdolność do
powolnego kurczenia mięśni gładkich dróg oddechowych i przewodu pokarmowego oraz zwiększenia
przepuszczalności naczyń włosowatych, co sprzyja powstawaniu obrzęków zapalnych. Wspomniany
tripeptyd uczestniczy w przekształceniu prostaglandyny PGG2 w PGH2 na etapie katalizowanym przez
hydroperoksydazę prostaglandynową, czyli syntazę PGH2.
W komórkach zwierzęcych zredukowany glutation uczestniczy również w transporcie aminokwasów do
komórki drogą cyklu γ-glutamylowego. Po zewnętrznej stronie błony komórkowej dowolny aminokwas (z
wyjątkiem proliny) wiąże się z przenośnikiem, czyli γ-glutamylotranspeptydazą, która jest integralnym
składnikiem błony komórkowej. Podczas przemieszczania się przez błonę aminokwas wytwarza wiązanie
izopeptydowe z grupą γ-karboksylową glutaminianu pochodzącego z glutationu i powstaje γglutamyloaminokwas. Ten dipeptyd nie wykazuje powinowactwa do przenośnika, uwalniany jest do
cytozolu, gdzie pod wpływem γ-glutamylocyklotransferazy następuje jego rozpad do pierwotnej formy
aminokwasu. Natomiast reszta glutaminianu przekształca się w 5-oksoprolinę, która w obecności 5oksoprolinazy tworzy glutaminian. Pozostały fragment glutationu, czyli cysteinyloglicyna ulega hydrolizie
do cysteiny i glicyny. Tym samym aminokwas został przetransportowany do komórki, a glutation rozpadł
się na elementy składowe – Glu, Cys, Gly mogące uczestniczyć w odtworzeniu glutationu. Glutaminian
reaguje bowiem z cysteiną tworząc γ-glutamylocysteinę, która przyłącza glicynę odtwarzając strukturę
glutationu mogącego ponownie włączyć sie w kolejny obrót cyklu γ-glutamylowego. Transport jednej
cząsteczki aminokwasu drogą cyklu γ-glutamylowego jest kosztowny energetycznie, wymaga bowiem
2
wykorzystania aż 3 cząsteczek ATP, czyli jest 9 razy więcej niż transport tego związku z wykorzystaniem
symportowego przenośnika zależnego od Na+. Cykl γ-glutamylowy funkcjonuje w wielu narządach,
szczególnie w jelitach i kanalikach nerkowych. Jednak dysfunkcje związane na przykład z wrodzonym
brakiem γ-glutamylotranspeptydazy nie powodują żadnych zaburzeń w transporcie aminokwasów.
prawdopodobnie komórki dysponują kilkoma alternatywnymi mechanizmami transportu aminokwasów.
3
Zasada oznaczenia ilości glutationu metodą Ellmana
Glutation stanowi prawie 97% niebiałkowych związków tiolowych i dlatego oznaczając niebiałkowe grupy
–SH w odbiałczonym przy użyciu kwasu trichlorooctowego (TCA) homogenacie wątroby glutation
oznaczany jest praktycznie ilościowo. Ten tripeptyd oznacza się technika spektrofotometryczną z
wykorzystaniem metody Ellmana, która polega na redukcji kwasu 5,5-ditiobis-(2-nitrobenzoesowego),
czyli DNTB przez związki tiolowe do barwnego kwasu 2-nitro-5-merkaptobenzoesowego, wykazującego
maksimum absorbancji przy długości fali λ = 412 nm.
4
Odczynniki:
1) 0,1M bufor fosfornowy ph=7,25
2) 0,2M bufor fosforanowy pH=7,8
3) 0,006M roztworu DTNB
4) 50% roztwór TCA
5) 2,5% roztwór TCA
6) 1mM roztwór glutationu w 2,5% roztworze TCA
Wykonanie:
I.
Sporządzić krzywą wzorcową dla glutationu. W tym celu sporządzić szereg rozcieńczeń 1 mM
roztworu GSH postępując zgodnie ze wskazówkami umieszczonymi w poniższej tabeli.
objętość roztworów [µl]
próba 1 próba 2 próba 3 próba 4 próba 5
Odnośnik
1 mM GSH
25
50
100
150
175
X
0,2M bufor fosfor. pH 8,2
875
850
800
750
725
800
0,006M DNTB
100
100
100
100
100
100
2,5 % TCA
X
X
X
X
X
100
końcowe stęż.
r-ru GSH [mM]
Aλ=412nm
1. 10,0 g tkanki wątrobowej homogenizować w 40 ml 0,1 M buforu fosforanowego, uzupełnić
buforem homogenat do 50 ml, a następnie w celu odbiałczenia do 1 ml homogenatu dodać 75
µl 50% TCA.
2. Homogenaty mieszać przez 30 s na vorteksie, a następnie wirować 10 min (12 700 obr./min).
3. Supernatant przenieść do oddzielnej probówki chłodzonej lodem.
4. Próbę badaną przygotować według poniższych zaleceń.
próba badana [µl]
0,2M bufor
fosfor. pH 8,2
800
0,006M
DNTB
100
5
supernatant
100
2,5 % TCA
Aλ=412nm
odnośnik [µl]
800
100
X
100
5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 412 nm względem próby ślepej dokładnie po
2 min. od wprowadzenia supernatantu.
6. Na podstawie krzywej wzorcowej oblicz stężenie glutationu w µmolach na gram tkanki
wątrobowej przyjmując, że 100 µl supernatantu odpowiada 19 mg mokrej masy wątroby.
Stężenie glutationu w wątrobie waha sie dobowo, zależy od diety i wieku zwierząt i wynosi
od 4 do 8 µmoli/g mokrej masy tkanki.
Zagadnienia do przygotowania
1. Struktura chemiczna i funkcje glutationu (rola w detoksykacji wolnych rodników tlenowych i
organicznych oraz nadtlenku wodoru i nadtlenków organicznych)
2. Znaczenie i przebieg cyklu γ-glutamylowego
3. Zasada oznaczenia glutationu metodą Ellmana
B. Oznaczanie witaminy C
Kwas L-askorbinowy (witamina C) jest
związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym
w wodzie a jego roztwory mają kwaśny smak.
Wykazuje właściwości redukujące. Jego forma
utleniona to kwas dehydroaskorbinowy.
Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy ↔ kwas dehydroaskorbinowy może uczestniczyć
w regulowaniu potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i brać udział w transporcie elektronów.
Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się, że
uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C uczestniczy w produkcji kolagenu
i podstawowych białek w całym organizmie (kości, chrząstki, ścięgna, więzadła). Jako jeden
z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności
organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu
i kwasów żółciowych.
Wśród metod oznaczania witaminy C można wyróżnić metody fizykochemiczne: chromatografia
cieczowa, metoda spektrofotometryczna i metoda potencjometryczna oraz metody chemiczne.
Odczynniki:
-
r-r 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP)
-
1% FeCl3
6
-
1% K3Fe(CN)6
-
1% witamina C
-
1% i 2% kwas szczawiowy
-
10% kwas trichlorooctowy (TCA)
-
2% H2SO4
-
10% NaOH
-
odczynnik Folina
-
10% HCl
1. Reakcja z żelazicyjankiem potasu
Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5 kropli
wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1% żelazicyjanku potasu.
Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1 kroplę 1% FeCl 3. Obserwacje
zanotować w zeszycie.
2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina
Zasada oznaczenia
W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do mieszaniny
niższych tlenków molibdenu – błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również specyficznie
redukowany przez kwas askorbinowy w pH 1-7. W tym zakresie pH i poza witaminą C inne reduktory
obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują go.
Wykonanie
1. Otrzymanie homogenatu
Każdy 1 g tkanki zalać 1 cm3 10% TCA, a następnie homogenizować przez 5 minut. Osad
odwirować przy 3000 obr./min
2. Przygotowanie krzywej wzorcowej
Przygotować krzywą standardową poprzez wykonanie szeregu rozcieńczeń roztworu wzorcowego
kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1mg / cm3 według tabeli :
Stężenie kwasu
0 g/ml
2,5 g/ml
5 g/ml
12,5 g/ml
25 g/ml
35 g/ml
R-r wzorcowy [ml]
0
0,05
0,1
0,25
0,5
0,7
10% TCA [ml]
2,0
1,95
1,9
1,75
1,5
1,3
askorbinowego
Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu energicznie
zamieszać.
3. Oznaczenie witaminy C w materiale biologicznym
Do oznaczeń pobrać 0,2-0,5 ml supernatantu. Objętość prób uzupełnić do 2 ml 10% TCA,
a następnie dodać 0,2 ml odczynnika Folina i energicznie zamieszać
7
Absorbancję mierzyć przy długości fali 750 nm względem próby zerowej. Obliczyć ilość witaminy C
w badanym materiale biologicznym. Obliczyć ilość materiału biologicznego, który zaspokajałby
dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na tę witaminę.
Badany materiał biologiczny
Ilość zaspokajająca dzienne zapotrzebowanie na wit. C
dorosłego człowieka [g]
3. Oznaczanie witaminy C metodą Tillmansa
Zasada oznaczenia
Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji barwnika 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas
askorbinowy. Utleniony DCIP jest niebieski, zredukowany bezbarwny. Reakcja przebiega według
równania:
Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na miareczkowaniu próby badanej w kwaśnym
środowisku (zapobiega to samoutlenieniu kwasu askorbinowego tlenem z powietrza oraz chroni przed
działaniem oksydaz). Barwnik jest zarazem indykatorem, po wyczerpaniu kwasu askorbinowego zabarwia
on próbę miareczkowaną na kolor różowy. Wiadomo, że większość surowców roślinnych zawiera
barwniki antocyjanowe, które nadają ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają
właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę C, występują inne
związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą do nich reduktony
– związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać obecności
ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich
przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy
sulfhydrylowe, które są utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi
(pochodne cukrów, które powstają podczas obróbki termicznej).
Wykonanie
1. Wyznaczanie miana roztworu 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP)
Pobrać 25 ml wzorcowego roztworu kwasu askorbinowego (4 mg kwasu w 100 ml 2% kwasu
siarkowego) i zmiareczkować roztworem 2,6-dichlorofenolindofenolu do jasnoróżowego
zabarwienia utrzymującego się przez 30 sek.
8
2. Oznaczanie zawartości witaminy C w badanych próbkach
2-3 g jabłka, zhomogenizować z 20 ml 1% kwasu szczawiowego. Po homogenizacji roztwór
uzupełnić do objętości 100 ml 1% kwasem szczawiowymi przesączyć. 25 ml klarownego
przesączu
miareczkować
w
kolbie
stożkowej
mianowanym
roztworem
2,6-
dichlorofenoloindofenolu do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez 30 sekund.
Z równania reakcji kwasu askorbinowego z 2,6-DPIP wynika, że 1 ml roztworu barwnika odpowiada
0,5 μmola kwasu tj, 0,088 mg. Korzystając z tej zależności oraz znając dokładne stężenie roztworu
barwnika należy wyliczyć ilość witaminy C w badanej próbce. Wynik podać w miligramach
przypadających na 100 g materiału roślinnego. Otrzymane dane porównać z wartościami literaturowymi.
9