Ćwiczenie I

ĆWICZENIE I
BADANIE WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI
Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak
Wstęp
Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń
bakteryjnych jest oznaczenie wrażliwości patogenu na leki. Szerokie stosowanie antybiotyków
pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a
także pojawienie się nowych mechanizmów oporności. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych
metod identyfikacji oporności od prostych testów fenotypowych po metody wykorzystujące
techniki biologii molekularnej.
Współczesne laboratorium mikrobiologiczne posiada możliwość oznaczania lekowrażliwości
różnymi metodami fenotypowymi:
1. metoda jakościowa – metoda dyfuzyjno-krążkowa, wykorzystująca zjawisko powstawania w
podłożu gradientu stężeń w trakcie dyfuzji substancji czynnej z krążka antybiogramowego.
2. metodami ilościowymi, pozwalającymi na określenie najmniejszego stężenia hamującego leku
(ang. minimal inhibitory concentration, MIC).
2.1. metoda rozcieńczeń w agarze – antybiotyk obecny w podłożu agarowym w malejących
stężeniach, na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonej j gęstości
2.2. metoda rozcieńczeń w bulionie – antybiotyk obecny w malejących stężeniach w bulionie;
2.3. E-testy – metoda łącząca w sobie cechy metody rozcieńczeniowej i metody dyfuzyjnej,
polegająca na wytwarzaniu stabilnego, ciągłego gradientu stężeń antybiotyku w podłożu agarowym.
Celem ćwiczenia jest oznaczenie wrażliwości szczepów bakteryjnych
antybakteryjne z zastosowaniem metod fenotypowych i molekularnych.
Wykonanie ćwiczenia
Materiały
Szczepy bakteryjne
Staphylococcus aureus ATCC 29231
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Listeria monocytogenes ATCC13932
szczepy L. monocytogenes izolowane z żywności
Antybiotyki
wodny roztwór tetracykliny (10 mg/ml)
wodny roztwór wankomycyny (10 mg/ ml)
wodny roztwór ampicyliny (10 mg/ml)
roztwór cyprofloksacyny w 0.1 M HCl (10 mg/ml)
Podłoża
na
związki
(skład w przeliczeniu na 1 litr)
Antybiogramowe Muellera-Hintona II pH-7,3
wyciąg wołowy
3,0 g
kwaśny hydrolizat kazeiny 17,5 g
skrobia
1,5 g
Antybiogramowe Muellera-Hintona II agar (MHA)
Bulion kazeinowo-sojowy z ekstraktem drożdżowym (TSYEB) pH-7,3
pepton K
17,0 g
pepton SP
3,0 g
glukoza
2,5 g
chlorek sodu
50g
fosforan dwupotasowy
2,5 g
ekstrakt drożdżowy
6,0
1. Badanie wrażliwości szczepów metodą dyfuzyjno-krążkową
Przygotować odpowiednie zawiesiny (gęstość 0,5 w skali McFarlanda) następujących
szczepów: S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa.
Na podłoże antybiogramowe Mueller-Hinton II, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść
zawiesinę bakteryjną. Po upływie 10 min nałożyć krążki bibułowe nasączone
antybiotykiem/chemioterapeutykiem w ściśle określonym stężeniu (Tabela 1). Po inkubacji,
prowadzonej w 35-37 oC przez 18-20 godz., zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu bakterii
wokół krążka antybiotykowego.
Określić wrażliwość badanego szczepy wykorzystując dane z Tabeli 1.
2. Określanie wartości minimalnego stężenia hamującego
2.1.Określanie wartości MIC metodą podwójnych rozcieńczeń antybiotyku/chemioterapeutyku w
podłożu płynnym na płytkach titracyjnych.
2.1.1. Przygotować 5 ml podłoża MH II uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w stężeniu
końcowym: wankomycyna - 16 g/ml; tetracyklina - 16 g/ml; ampicylina – 16 g/ml;
cyprofloksacyna - 16 g/ml.
Stężenie wyjściowe każdego z antybiotyków: 1 mg/ml.
2.1.2. Przygotowanie hodowli bakteryjnej
Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń hodowli nocnych szczepów bakterii z rodzaju
Listeria w roztworze soli fizjologicznej (RF) tak, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie
hodowli 10-5 co odpowiadało 104 jtk/ml.
2.1.3. Przygotowanie rozcieńczeń antybiotyku w podłożu
Na 96 dołkowe płytki titracyjne o końcowej objętości 200 μl, nanieść po 100 μl podłoża MH II
(począwszy od dołka B w każdej kolumnie). Następnie do dołka A w każdej kolumnie nanieść 200
μl podłoża MH II uzupełnionego badaną substancję w odpowiednim stężeniu. Począwszy od dołka
A przenosić po 100 μl roztworu do kolejnych dołków, uzyskując w ten sposób serię dwukrotnych
rozcieńczeń badanej substancji.
Na koniec do każdego dołka dodać po 100 μl hodowli bakteryjnej z rozcieńczenia 10 -5 .
2.1.4 Odczyt wyników
Hodowle bakteryjne na płytkach titracyjnych należy inkubować w temperaturze 35-37 oC przez
18-20 godz. Odczyt będzie polegał na obserwacji zmętnienia podłoża. Za wartość MIC należy
przyjąć najmniejsze stężenie antybiotyku, przy którym nie zaobserwowano wzrostu bakterii.
2.2. Określanie wartości MIC metodą E-testów
Na podłoże antybiogramowe MH II z krwią owczą, za pomocą jałowej wymazówki, nanieść
zawiesinę bakteryjną szczepów Listeria monocytogenes (rozcieńczenie 10 -1). Po upływie 10 min
nałożyć paski testowe (E-testy) ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami antybiotyku. Po
inkubacji przez 20-24 godz. w temp. 37oC na skali testu odczytać wartość MIC.
Za MIC przyjąć wartość w punkcie przecięcia eliptycznej strefy zahamowania wzrostu
utworzonej wokół paska z jego brzegiem.
3. Wykorzystanie metod molekularnych w wyrywaniu oporności bakterii
3.1 Molekularne mechanizmy oporności szczepów Campylobacter
fluorochinolony i tetracykliny
jejuni/coli
na
Mechanizm oporności bakterii z rodzaju Campylobacter (C. jejuni i C. coli) na fluorochinolony
związany jest głównie pojawieniem się mutacji chromosomowych w genie gyrA kodującym
podjednostkę A topoizomerazy II – gyrazy. Mutacje punktowe w genie gyrA zmieniają sekwencję
nukleotydową, co prowadzi do modyfikacji miejsca, które są celem działania dla fluorochinolonów.
Prowadzi to zmniejszenia powinowactwa enzymu do tych chemioterapeutyków. Najczęstszą
mutacją punktową w genie gyrA spotykaną wśród szczepów Campyloabcter opornych na
fluorochinolony jest zamiana kodonu ACA (kodującego treoninę) na ATA (kodującego izoleucynę
) w pozycji 86. Techniką stosowaną do identyfikacji tej mutacji jest metoda MAMA PCR (ang.
mismatch amplification mutation assay PCR). Jest to reakcja amplifikacji ze starterami o
zmodyfikowanej sekwencji. Startery są komplementarne do zmienionej sekwencji w DNA.
Oporność na tetracykliny szczepów Campylobacter związana jest z obecnością genu tet(O). Gen ten
koduje białko chroniące rybosom przed działaniem antybiotyku.
Materiały
DNA genomowy szczepów C. coli i C. jejuni
Startery
Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. jejuni;
gyrA1 5- TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3
gyrA2 5- CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA-3
Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. coli
gyrA3 5- TAT GAG CGT TAT TAT CGG TC -3
gyrA4 5-TAA GGC ATC GTA AAC AGC CA-3
Obecność genu tet(O)
TET1 5- GGC GTT TTG TTT ATG TGC G-3
TET2 5-ATG GAC AAC CCG ACA GAA GC-3
3.1.1 Wykrywanie oporności na fluorochinolony
Wykrywanie mutacji w genie kodującym podjednostkę A gyrazy
Skład mieszaniny reakcyjnej (25 µl)
H2O
bufor do PCR (10 x)
starter A1 (lub A3) (stężenie wyjściowe 10 µM)
starter A2 (lub A4) (stężenie wyjściowe 10 µM)
deoksyrybonukleotydy (10 mM)
polimeraza Taq (1U/µl)
DNA
19 µl
2,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
2 µl
Warunki reakcji - 35 cykli
94oC – 5 min
94oC – 1 min
48oC – 1 min
72oC – 1 min
72oC – 7 min
4oC - 
3.1.2 Wykrywanie oporności na tetracykliny
Wykrywanie obecności genu tet(O)
Startery: TET1 iTET2
Warunki reakcji jak wyżej – jedyna zmiana to temperatura przyłączania starterów (Tm ) 57 oC
Probówki umieścić w termocyklerze
4. Przeprowadzić reakcję PCR.
5. Po zakończeniu reakcji próbki (po dodaniu buforu obciążającego) rozdzielić w 1% żelu
agarozowym.
6. Sporządzić dokumentację fotograficzną rozdziału DNA.
7. Określić, czy badany szczep jest oporny na fluorochinolony i/lub tetracykliny.
Tabela 1. Badanie wrażliwości szczepów bakteryjnych na antybiotyki i chemioterapeutyki*
antybiotyk
krążek (g)
imipenem
ceftriakson
minocyklina
ciprofloksacyna
10
30
30
5
krążek (g)
Pseudomonas aeruginosa
strefa zahamowania wzrostu (mm)
R
I
S
14 – 15
 13
 16
14 - 20
 13
 21
15
-18
 14
 19
16 - 20
 15
 21
Enterococcus feacalis
strefa zahamowania wzrostu (mm)
Wartość MIC (g/ml)
R
S
 16
4
 64
8
 16
4
4
1
Wartość MIC (g/ml)
antybiotyk
tetracyklina
ampicylina
wankomycyna
linezolid
30
10
30
30
antybiotyk
krążek (g)
ampicylina
tikarcylina /
kwas
klawulanowy
cefoksytyna
aztreonam
10
75/10
30
30
I
15 - 18
15 - 16
21 - 22
S
 19
 17
 17
 23
Escherichia coli
strefa zahamowania wzrostu (mm)
R
I
S
14 – 15
 13
 17
15
–
19
 14
 20
 14
 15
15 - 17
16 - 21
 18
 22
Staphylococcus aureus
strefa zahamowania wzrostu (mm)
R
I
S
13-16
12
 17
 19
 20
R
 16
 16
 32
8
S
4
8
4
2
Wartość MIC (g/ml)
R
S
 32
8
 128/2
 16/2
 32
 32
8
8
Wartość MIC (g/ml)
R
S
norfloksacyna
10
16
4
cefoksytyna
30
4
2
(oksacylina)
wankomycyna
30
 15
2
gentamicyna
10
13 - 14
 12
 15
8
4
* kryteria interpretacyjne wg. CLSI. 2006. Performance standards for antimicrobial susceptibility
testing; sixteenth informational supplement. Vol 26 no. 3. M100-S16
antybiotyk
krążek (g)
R
 14
 16
 14
 20