NMR - BIOL

Zastosowanie spektroskopii NMR do określania struktury związków organicznych
Atomy zbudowane są z jąder atomowych i powłok elektronowych. Modelowo można
stwierdzić, że jądro atomowe jest kulą, w której ładunek dodatni jest
rozmieszczony równomiernie. Kula ta wiruje wokół swojej osi, czyli ma
moment pędu zwany także spinem jądrowym i ładunek jej porusza się po
torach kołowych wokół osi rotacji. Każdy prąd elektryczny związany jest z
polem magnetycznym. A zatem wirujące jądro atomowe wytwarza pole
magnetyczne, które ilościowo opisywane jest wektorem magnetycznego
momentu pędu, umieszczonym na osi obrotu jądra.
Gdy nie ma pola magnetycznego wektory te ustawione są w
przestrzeni chaotycznie i jądra te mają identyczną wartość energii. Pod wpływem przyłożonego
stałego pola magnetycznego jądra atomowe i przypisane im wektory magnetycznego momentu
pędu ulegają uporządkowaniu. Część z nich ustawia się równolegle (zwrot zgodny ze zwrotem
przyłożonego pola magnetycznego), a część antyrównolegle (zwroty przeciwne). Jądra atomowe
ustawione równolegle mają niższą energię.
Ilościowe obsadzenie poziomów wyznaczane
jest przez rozkład Boltzmanna. Z uwagi na to,
że różnica energii pomiędzy tymi poziomami
jest niewielka, nadmiar jąder atomowych w
niższym stanie energetycznym też jest
niewielka. Zgodnie z teorią nadmiar ten jest
miarą prawdopodobieństwa wzbudzenia a tym
samym miara czułości eksperymentu. Stąd też
należy używać możliwie silnego pola
magnetycznego, gdyż różnica energetyczna
pomiędzy poziomami rośnie proporcjonalnie do
wzrostu natężenia pola magnetycznego. Są
jednak pewne ograniczenia konstrukcyjne, gdyż do uzyskania prawidłowego widma NMR
wymagane jest nie tylko silne, lecz także maksymalnie stabilne i jednorodne pole magnetyczne.
Gdy próbkę zawierającą jądra magnetyczne (np. protony) i umieszczoną w stałym polu
magnetycznym naświetlimy promieniowaniem elektromagnetycznym o odpowiedniej
częstotliwości, to nastąpi absorpcja tego promieniowania czyli zajdzie zjawisko magnetycznego
rezonansu jądrowego (NMR – Nuclear Magnetic Resonance).
Częstotliwość rezonansowa jest określona wzorem na tzw. warunek
rezonansu, gdzie γ oznacza współczynnik żyromagnetyczny, który
charakteryzuje poszczególne jądra magnetyczne i decyduje o ich
podstawowej częstotliwości rezonansowej. Fakt absorpcji
promieniowania można zarejestrować, co obserwujemy jako sygnał w widmie NMR.
Widmo NMR jest obiektem dość skomplikowanym i aby je właściwie zinterpretować należy
„rozłożyć” na mniejsze elementy składowe, które można analizować praktycznie niezależnie.
Podstawowymi elementami widma protonowego (1H NMR), charakteryzującymi występujące w
nim sygnały, są: a) ilość b) położenie c) intensywność i d) rozszczepienie sygnałów.
Ilość sygnałów w widmie informuje o ilości nierównocennych grup protonów. Pod
względem magnetycznym protony w cząsteczkach związków chemicznych tworzą grupy. Protony
w grupie mają te same otoczenie czyli są identyczne (równocenne), natomiast, jeśli rozpatrujemy
protony pomiędzy grupami, to mają one inne otoczenie czyli są różne (nierównocenne). Wszystkie
równocenne protony (w grupie) dają jeden sygnał, natomiast protony nierównocenne dają oddzielne
sygnały. Stąd też ilość sygnałów w widmie jest równa ilości nierównocennych grup protonów.
Bardzo często wykorzystuje się widma NMR w celu weryfikacji przypuszczeń co do
struktury produktów reakcji, a pierwszym kryterium tej weryfikacji jest ilość sygnałów w widmie.
Dlatego też niezbędne jest prawidłowe określenie ile sygnałów powinno być w widmie badanego
związku. Są dwie metody służące temu celowi. Pierwszą z nich można nazwać metodą symetrii.
Polega ona na tym, ze dla wzoru strukturalnego rozpatrywanego związku należy znaleźć wszystkie
występujące w nim elementy symetrii (płaszczyzny, osie, punkty). Protony lub grupy protonów
OH
H3C
C
CH2
O
H2C
O
C
N
H3C
CH3
Cl
CH3
H3C
Cl
OH
leżące symetrycznie względem znalezionych elementów symetrii są równocenne.
Druga metoda jest nazwana metodą podstawienia. Aby sprawdzić równocenność wybranych
dwóch grup protonów wykonujemy kolejno myślowe operacje zastąpienia (podstawienia) protonów
w tych grupach umowną grupą Z. Następnie należy rozważyć w jakiej relacji są względem siebie
H
H
Z
C
C
Ha
Hb
C
H3 C
H3 C
C H3
identyczne
C H3
Z
homotopowe
H
H
H3C
Ha
C
H3C
H
CH3b
H
diastereotopowe
H3C
C H3
Hb
C
H3C
H3C
COOH
enancjotopowe
Z
H
H3C
produkty podstawienia. Jeżeli są one identyczne, to
rozpatrywane protony są homotopowe czyli
równocenne. Gdy zaś są to enancjomery, to protony
są enancjotopowe. Są one równocenne w
środowisku niechiralnym, lecz nierównocenne w
środowisku chiralnym. Gdy z kolei są to
diastereoizomery to protony są diastereotopowe
czyli nierównocenne. Protony
związane z tym samym
CH3
atomem zazwyczaj są
H
Z
równocenne. Gdy jednak
sąsiedni atom węgla jest
centrum stereogenicznym, to
HO
H
wtedy stają się nierównocenne.
COOH
Szczególnie wyraźnie widać to
HO
COOH
H
HO
C
C
COOH
H
H
C
H3C
H
C
C
enancjomery
COOH
CH2Z
Z
C
Ha
H
C
Z
H3C
CH3
diastereoizomery
C
H 3C
Z
diastereoizomery
COOH
Z
H
H3C
H
diastereotopowe
C
C
HO
COOH
H
H
OH
H
Z
H
CH3
COOH
H
H3C
Z
OH
COOH
na wzorach Newmana, które pokazują, że obrót wokół wiązania C-C nie ujednolica otoczenia
rozpatrywanych protonów.
Położenie sygnałów w widmie jest ściśle związane z pojęciem przesunięcia chemicznego.
Jest to przesunięcie położenia sygnału absorpcji w widmie NMR spowodowane przesłanianiem lub
odsłanianiem protonów przez elektrony. Najbliższym otoczeniem elektronowym protonów są ich
własne elektrony. Podstawowy mechanizm powstawania zjawiska przesunięcia chemicznego
polega na przesłanianiu (ekranowaniu) protonów właśnie przez te
elektrony. Ogólny wzór na warunek rezonansu należy zmodyfikować
wprowadzając stałą ekranowania σ. Ekranowanie protonów przez elektrony
wynika z tego, że elektrony również oddziałują z przyłożonym polem magnetycznym tworząc tzw.
indukowane pole magnetyczne, które jest skierowane
przeciwnie do pola przyłożonego. O sile ekranowania decyduje
gęstość elektronowa (wielkość ładunku w jednostce objętości).
Gdy gęstość elektronowa jest większa natężenie indukowanego
pola magnetycznego tez jest większe czyli proton jest silniej
ekranowany (przesłaniany). Gdy z kolei gęstość elektronowa
jest mniejsza , to natężenie indukowanego pola magnetycznego jest mniejsze czyli proton jest
słabiej ekranowany, a zatem względnie odsłaniany.
Przechodząc do opisu bardziej ilościowego
stwierdzamy, że częstotliwość rezonansowa
wyznaczana jest wielkością efektywnego pola
H
H
H0
magnetycznego działającego bezpośrednio na proton.
C2H5 O C
Beff = B0 + Bind
H eff = H 0 - Hind
Hind
H
C H
H
Hind
Efektywne pole magnetyczne jest sumą wektorową a
różnicą skalarną pola magnetycznego przyłożonego i
indukowanego. Gdy w cząsteczce są atomy o
Heff
Heff
elektroujemności większej niż elektroujemność węgla,
to wskutek efektu indukcyjnego następuje wyciąganie
elektronów z atomów bezpośrednio z nim związanych, przez co zmniejsza się gęstość elektronowa
wokół tych atomów. W efekcie tego protony są względnie odsłaniane. Istnieją jednak przypadki,
kiedy protony są odsłaniane bezwzględnie. Dzieje się to wtedy, gdy w cząsteczce są wiązania
wielokrotne. Elektrony π wiązań wielokrotnych
oddziałują z przyłożonym polem magnetycznym
tworząc pole indukowane, którego linie sił
układają się tak, że wzmacniają pole przyłożone
jak to się dzieje np. w benzenie i grupie
aldehydowej, czyli jest to rzeczywiste
odsłanianie. Natomiast w etynie linie sił
indukowanego pola magnetycznego układają się tak, że obserwujemy przesłanianie występujących
w nim protonów.
Wartości przesunięcia chemicznego nie podaje się w bezwzględnych jednostkach
częstotliwości (Hz), lecz w skali względnej i bezwymiarowej definiowanej następująco:
δ=ν νν
0
H
-
wz .
=
0 ÷ 3000 Hz
200 MHz
= 0 ÷ 15·10-6 = 0 ÷ 15 ppm
gdzie νH to częstotliwość rezonansowa danej grupy protonów
νwz. częstotliwość rezonansowa wzorca (najczęściej jest to TMS - tetrametylosilan)
ν0 częstotliwość podstawowa aparatu.
Przyczyny stosowania bezwymiarowej skali względnej:
a) aparaty o różnej częstotliwości podstawowej
b) duże liczby bezwzględne
c) różne rozpuszczalniki
d) różne stężenie i temperatura próbek
Po zbadaniu wielu związków organicznych ujęto w tablicach podstawowe zakresy przesunięć
chemicznych wielu charakterystycznych grup protonów, co umożliwia ich identyfikację.
Intensywność sygnałów rozumiana jako pole powierzchni pod sygnałami jest wprost
proporcjonalna do ilości protonów, od których pochodzi sygnał. Jednak na współczynnik
proporcjonalności wpływa wiele czynników i jego wartość jest praktycznie przypadkowa, lecz
identyczna dla wszystkich sygnałów w każdym jednostkowo zarejestrowanym widmie. Z wartości
tych pól powierzchni (integracji, całkowania) można uzyskać informację o proporcji ilości
protonów, od których pochodzą poszczególne sygnały. Np. jeśli w widmie są trzy sygnały o
proporcji pól powierzchni 12:8:16 to po sprowadzeniu do najmniejszych liczb naturalnych
uzyskujemy proporcję 3:2:4. Rzeczywista ilość protonów jest jednym z wariantów wielokrotności
podstawowej proporcji: 3:2:4; 6:4:8; 9:6:12; 12:8:16; 15:10:20 itd. Jeśli znamy wzór sumaryczny
i tym samym całkowitą liczbę protonów w cząsteczce to korzystając z uzyskanej z widma proporcji
można łatwo obliczyć rzeczywiste ilości protonów odpowiadające poszczególnym sygnałom. Jeśli
natomiast w cząsteczce występuje specyficzna grupa funkcyjna, dająca widmie charakterystyczny
sygnał np. grupa aldehydowa (-CHO) lub karboksylowa (-COOH), to wartość pola powierzchni pod
tym sygnałem może służyć jako punkt wyjścia do dalszych obliczeń.
Wcześniej stwierdzono, że liczba
sygnałów w widmie jest określona ilością grup
protonów nierównocennych. Jednakże nawet
pobieżna obserwacja widm zdaje się
wskazywać, że sygnałów tych jest więcej.
Spowodowane jest to rozszczepieniem
sygnałów wyniku występowania zjawiska
sprzężenia spinowo-spinowego. Zjawisku temu
ulegają nierównocenne protony najczęściej
usytuowane przy
sąsiadujących atomach węgla. Rozszczepienie sygnałów informuje nas o
liczebności sąsiadujących protonów względem grupy rozpatrywanych
protonów.
Rozpatrzymy sygnał pochodzący od protonów drugorzędowych we
następującym fragmencie cząsteczki: -CH-CH2- . Pole magnetyczne, jakie
„odczuwają” protony drugorzędowe jest nieco silniejsze (jeśli orientacja
protonu trzeciorzędowego jest zgodna z kierunkiem linii sił przyłożonego
pola) lub nieco słabsze (jeśli orientacja jest przeciwna do linii sił
przyłożonego pola. A zatem w przypadku jednej połowy cząsteczek następuje nieznaczne
zwiększenie częstotliwości rezonansowej, a w przypadku drugiej połowy – nieznaczne
zmniejszenie tej częstotliwości. Sygnał zostaje rozszczepiony na dwie składowe o równej
intensywności, czyli dublet. Jeśli idzie
o sygnał protonu trzeciorzędowego, to
należy uwzględnić wpływ obu
protonów drugorzędowych. Istnieją
cztery równie prawdopodobne
kombinacje ustawienia spinów dwóch
protonów, z których dwie są
równocenne energetycznie.
Trzeciorzędowy proton „odczuwa”
obecność każdego z tych trzech pól i
jego sygnał zostaje rozszczepiony na
trzy składowe znajdujące się w równej
odległości od siebie, czyli tryplet o
względnej intensywności składowych
1:2:1. Podwojona intensywność
środkowej linii wynika z podwójnego
udziału obu równocennych kombinacji
spinów. Proporcje intensywności składowych w multipletach powstałych w wyniku oddziaływania
większej liczby spinów można wyliczyć z tzw. trójkąta Pascala.
Odległość między liniami multipletu jest miarą efektywności sprzężenia spinowospinowego (większa odległość – silniejsze sprzężenie, mniejsza odległość – słabsze sprzężenie) i
nazywa się stałą sprzężenia, J. Multiplety pochodzące od grup protonów sprzęgających się
charakteryzują się identyczną wartością stałej sprzężenia i stąd można je rozpoznać. Wartość stałej
sprzężenia, mierzona w hercach [Hz = s-1], pozostaje taka sama bez względu na przyłożone pole
magnetyczne, czym się różni od przesunięcia chemicznego. Gdy jest to konieczne, można te
wielkości rozróżnić rejestrując widma przy dwóch różnych natężeniach pola magnetycznego.
Mierzone w hercach odstępy między sygnałami, wynikające ze sprzężenia, pozostają takie same, a
zmieniają się odstępy między sygnałami związane z przesunięciem chemicznym wyrażonym w
hercach (wartość przesunięcia chemicznego w skali δ pozostaję stała.
Wartość stałej sprzężenia zależy w dużym stopniu od zależności strukturalnych między
sprzężonymi protonami, co jest powszechnie wykorzystywane do rozróżniania izomerów
geometrycznych.
J = 2 - 6 Hz
J = 5 - 14 Hz
H
H
Protony wicynalne
J zmienia się ze zmianą kąta
dwuściennego
H
H
konformacja
antyperiplanarna
konformacja
synklinalna
J = 2 - 15 Hz
H
H
H
C
C
J = 0 - 7 Hz
H
J = 10 - 21 Hz
C
C H
J = 2 - 13 Hz
Protony winylowe
Na podstawie wartości J łatwo rozróżnić
izomery E i Z
Literatura:
1.
2.
3.
4.
R.T. Morrison, R.N. Boyd, Chemia organiczna, tom I, PWN 1985, s.487-511.
W. Zieliński, A . Rajca - Metody spektroskopowe
A. Zschunke - Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w chemii organicznej.
H. Günther - Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego.