enzymatyczna degradacja skrobi

Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Enzymatyczna hydroliza skrobi
Enzymy hydrolizujące skrobie
Oprócz celulozy skrobia jest głównym polisacharydem pochodzenia roślinnego. Z przemysłowego punktu widzenia istotne
znaczenie maja przede wszystkim produkty jej hydrolizy umożliwiające produkcje syropów glukozowych, dekstryn, cyklodekstryn,
glukozy (krystalicznej i zestalonej) i innych produktów wykorzystywanych głównie w przemyśle spożywczym. Stosowana do
niedawna kwasowa hydroliza skrobi wraz z postępem w dziedzinie biotechnologii coraz częściej ustępuje miejsca procesom
enzymatycznym. Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi podzielić można na 5 grup: endoamylazy, egzoamylazy, enzymy usuwające
rozgałęzienia,
izomerazy
oraz
glikozylotransferazy cyklodekstryn (Rysunek 2).
Endoamylazy
α-amylaza
Enzymy z tej grupy umożliwiają hydrolizę wiązań
α-1,4-glikozydowych zarówno w amylozie jak
amylopektynie a nie są aktywne w stosunku do
wiązań α-1,6- (np. w amylopektynie).
Produktami hydrolizy w tym przypadku są
oligosacharydy posiadające konfiguracje α przy
węglu C1. Enzymy te działają w środku łańcucha
polimerowego co powoduje gwałtowny spadek
lepkości hydrolizowanego kleiku skrobiowego.
Znane są dwa rodzaje α-amylazy: termostabilna
i termolabilna. α-amylaza termostabilna jest
enzymem pochodzenia bakteryjnego. Enzym ten
w przypadku pochodzenia ze szczepu Bacillus
subtilis wykazuje optimum temperaturowe
pomiędzy 65 a 70oC w obecności jonów wapnia,
i ze względu na swoja niska stabilność nie jest
stosowana w zastosowaniach komercyjnych. α-amylaza pochodząca ze szczepu Bacillus licheniformis (Rysunek 3.) jest natomiast
aktywna i stabilna w temperaturach powyżej 90oC, a dodatkowo jej aktywność w znacznie
mniejszym stopniu zależny od obecności jonów Ca2+ oraz stosowanego pH. Działanie
opisywanego enzymu sprowadza się głównie do generowania z łańcucha polisacharydowego
jednostek zawierających 5 jednostek glukozowych. Powoduje to, ze szybkość hydrolizy jest
bardzo wysoka na początku procesu a potem wraz z postępem reakcji spada. Na dalszych
etapach procesu generowane są jednostki o mniejszej liczbie merów. Termolabilne α-amylazy
są enzymami pochodzenia grzybowego. Produktami hydrolizy skrobi w tym przypadku są:
maltoza i maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazują większa w porównaniu do
swoich bakteryjnych odpowiedników odporność na zmiany pH środowiska reakcji.
Egzoamylazy
Enzymy z grupy egzoamylaz dzielą się na układy działające z wytworzeniem glukozy lub maltozy.
γ-amylaza
Glukoamylaza zwana także γ-amylazą umożliwia wysoce efektywna reakcje hydrolizy wiązań α1,4-glikozydowych z wytworzeniem glukozy jako produktu końcowego. Atak enzymu
rozpoczyna się na nieredukującym końcu łańcucha polimerowego a powstająca glukoza posiada
konfigurację β. Enzym ten działa na skrobie odcinając po jednej jednostce glukozowej, aż do
miejsca rozgałęzienia. Hydroliza wiązań 1,6-glikozydowych z udziałem glukoamylazy również
jest możliwa choć proces ten przebiega z bardzo niską szybkością. W przypadku wysokich stężeń
glukozy lub enzymu możliwa jest także podobnie jak w przypadku hydrolizy kwasowej reakcja
repolimeryzacji (rewersji) glukozy z wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza
charakteryzuje się dużą odpornością na zmiany pH (stabilność w zakresie 1,8-8,8 dla enzymu z
Aspergillus niger oraz 1,8-10,5 dla układu pochodzącego z Aspergillus awamori) (Rysunek 4).
Enzym ten najwyższą aktywność przejawia przy pH z zakresu 4,0-5,6 w temperaturze 40-65oC.
Odwrotnie niż w przypadku α-amylazy jony Ca2+ wykazują inhibicyjne działanie na proces
enzymatycznej hydrolizy z udziałem glukoamylazy.
β-amylaza
β-amylaza jest enzymem działającym na skrobię z wytworzeniem maltozy jako produktu
finalnego. Głównym źródłem tego enzymu są zboża takie jak: pszenica i jęczmień oraz soja.
Znane są jednak także bakteryjne źródła β-amylazy. β-amylaza umożliwia degradacje łańcuchów amylozy i amylopektyny poprzez
hydrolizę wiązań α-1-4- glikozydowych pomiędzy drugą a trzecią jednostką glukozową licząc od nieredukującego końca łańcucha.
Wytworzona w ten sposób maltoza jest beta-anomerem. Ponieważ enzym ten nie umożliwia hydrolizy wiązań 1,6-glikozydowych
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Enzymatyczna hydroliza skrobi
produktami hydrolizy skrobi z jego udziałem są maltoza (w przypadku amylozy) oraz mieszanina oligosacharydów o różnym stopniu
rozgałęzienia, tzw. dekstryny graniczne (dla amylopektyny). Optimum kwasowości środowiska reakcji dla tego enzymu wynosi
około 5 a optymalna temperatura działania 55 – 60oC. Jeśli chodzi o budowę enzymu to w odróżnieniu od innych enzymów
hydrolitycznych skrobi beta-amylaza nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali a jedynie grupy merkaptanowe (-SH).
Wszystkie beta-amylazy tracą swoja aktywność w obecności takich
związków jak HgCl2, AgNO3 oraz jodu.
Enzymy usuwające rozgałęzienia
α, β i γ-amylazy to enzymy które bądź to są nieaktywne w stosunku do wiązań 1,6-glikozydowych bądź tez reakcja hydrolizy tych
wiązań zachodzi przy ich udziale z niezadawalającą szybkością. Enzymy usuwające rozgałęzienia działają natomiast selektywnie
właśnie na wiązania α-1,6-glikozydowe w łańcuchach polisacharydowych, umożliwiając pełniejsza hydrolizę skrobi.
Najważniejszymi przedstawicielami tej grupy są pullulanaza oraz izoamylaza.
Izoamylaza, glikogen 6-glukanohydrolaza.
Izoamylaza podobnie jak opisywana wyżej pullulanaza jest enzymem umożliwiającym
hydrolizę rozgałęzień łańcuchów polisacharydowych oraz dekstryn granicznych wszędzie tam,
gdzie występują wiązania 1,6-glikozydowe. W odróżnieniu od pullulanazy izoamylaza nie
hydrolizuje jednak wiązań 1,6- w pullulanie lecz w glikogenie. Enzym ten nie jest aktywny w
stosunku do polisacharydów liniowych, nierozgałęzionych. Najczęściej enzym ten pozyskuje
się z takich szczepów bakterii jak: Bacillius amyloliquefaciens, Escherichia coli, Flavobacterium
odoratum, Pectobacterium chrysanthemi, Pseudomonas amylodermosa (Rysunek 6).
Pullulanaza, pullulan-6-glukanohydrolaza.
Enzym ten umożliwia usuniecie rozgałęzień zarówno amylopektyny jak i amylozy. Efektem
finalnym jego działania są oligo- i poli- sacharydy o stopniu polimeryzacji z zakresu 115-2300.
Enzym ten jest z reguły stosowany w kombinacji z α, β lub γ- amylazami. Optimum
temperaturowe dla pullulanazy wynosi ok 60oC. Chociaż enzym ten zidentyfikowano w takich
roślinach jak: bawełna, ryż i szpinak to jednak w celach przemysłowych izoluje się go głównie
ze szczepów bakterii (np. Bacillus stearothermophilus). Pullulanaza umożliwia hydrolizę wiązań 1,6- glikozydowych jedynie gdy
wiązanie to scala łańcuchy polisacharydowe połączone wiązaniem 1,4-glikozydowym (np. w pullulanie stąd nazwa). W zależności
od zdolności pollulanazy do hydrolizy oprócz wiązań 1,6-, takze układów 1,4- rozróżnia się dwa typy pollulanaz: I (nieaktywne w
hydrolizie wiązań 1,4-) i II (aktywne w hydrolizie wiązań 1,4-). Działanie obu wymienionych enzymów na skrobie (amylopektyne)
jest natomiast zbliżone. Opisane enzymy nie wyczerpują wszystkich możliwości enzymatycznej hydrolizy skrobi. Jednak to α, β i γamylaza wraz z pullulanaza i izoamylaza maja największe znaczenie przemysłowe.
Przemysłowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi.
Metoda enzymatycznej hydrolizy skrobi umożliwia otrzymywanie szerokiej gamy modyfikator skrobiowych z dużą wydajnością i
efektywnością. Spośród produktów o największym tonażu wyróżnia się produkcję: syropów skrobiowych, maltodekstryn, syropu
glukozowego i glukozy krystalicznej oraz syropów maltozowych a po dalszej przeróbce także takich nowoczesnych produktów jak
syropy o wysokiej zawartości fruktozy.
Produkcja maltodekstryn.
Produkcja maltodekstryn przebiega zgodnie ze Rysunkiem 7. Przygotowana
suspensja skrobi w wodzie jest zakwaszana do pH odpowiedniego dla
zastosowanego enzymu a następnie uzupełniana o jony wapnia oraz pierwsza
porcje enzymu. Tak otrzymana zawiesina poddawana jest działaniu wysokiej
temperatury, co z jednej strony ułatwia szybkie skleikowanie skrobi z drugiej
jednak powoduje inaktywacje części dodanego enzymu. Po skleikowaniu
mieszanina reakcyjna jest ochładzana do właściwej temperatury pracy
enzymu oraz uzupełniana o kolejną jego porcje. Po zakończeniu procesu, czyli
osiągnieciu wartości DE 20-40 w zależności od zakładanego stopnia hydrolizy
enzym jest inaktywowany poprzez zakwaszenie środowiska oraz
podwyższenie temperatury a otrzymany syrop poddawany filtracji i
oczyszczaniu na węglu aktywnym. Maltodekstryny charakteryzują się miedzy
innymi takimi właściwościami jak: niska higroskopijność, wysoka lepkość, a
także bardzo niska słodkość (w sensie sensorycznym) oraz własności
hamujące wzrost kryształów w takich substancjach spożywczych jak lody.
Implikuje to ich szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym (produkcja
lodów i cukierków) i farmaceutycznym (powlekanie tabletek i produkcja
syropów). Ponadto ze względu na skłonność do kapsułkowania aromatów wykorzystywane być mogą do ochrony związków
małocząsteczkowych (np. aromatów żywności, składników leków itp.) przed utlenianiem. Nowoczesne zastosowania
maltodekstryn w przemyśle spożywczym skupiają się na stosowaniu ich jako zamienników tłuszczy, odzywkach dla sportowców
oraz środkach spożywczych dla niemowląt.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Enzymatyczna hydroliza skrobi
Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej.
Produkcja syropów glukozowych metoda enzymatyczna jest
procesem wielostopniowym (Rysunek 8). Etapy wstępne, a wiec
otrzymywanie suspensji skrobi oraz jej kleikowanie są
identyczne z procesem otrzymywania maltodekstryn podobnie
jak wstępne upłynnienie kleiku skrobiowego przy użyciu αamylazy. Kolejnym etapem procesu jest w przypadku syropów
glukozowych scukrzanie upłynnionej skrobi aż do wartości DE ok
95 w celu otrzymania maksymalnej wydajności glukozy. Wartość
graniczna DE = ok. 95 wynika z możliwej reakcji repolimeryzacji
glukozy przy wysokich jej stężeniach w obecności
amyloglukozydazy. Kolejne etapy procesu obejmują
oczyszczanie produktu (usuwanie białek i tłuszczy),
dekoloryzacje (na węglu aktywnym) oraz usuwanie składników
mineralnych (kolumny jonowymienne). Syropy glukozowe
produkowane metoda enzymatyczna zawierają 94-98% glukozy, 1-3% maltozy, 0,3-0,5% maltotriozy i do 2% wyższych
polisacharydów. Syropy te wykorzystywane są w procesach biotechnologicznych bez udziału drożdży (produkty farmaceutyczne,
synteza organiczna, produkcja witamin), do produkcji glukozy krystalicznej oraz syropów fruktozowych (np. HFCS). Z glukozy
otrzymuje się tez tzw. polidekstrozę o niskiej kaloryczności oraz sorbitol.
Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego.
Zarówno syropy maltozowe jak i syrop wysokoscukrzony produkowane są metodą enzymatyczą dwustopniową. W pierwszym
etapie po otrzymaniu suspensji skrobiowej poddaje się ją kleikowaniu a następnie upłynnieniu (do DE max. 10 w przypadku
syropów maltozowych i DE = 38-40 w przypadku syropu wysokoscukrzonego). Drugi etap procesu polega zwykle na procesie
scukrzania enzymatycznego i de facto prowadzi do otrzymania właściwego końcowego produktu. W przypadku syropów
maltozowych proces ten prowadzić można na dwa sposoby stosując różne enzymy i warunki prowadzenia procesu otrzymując
syropy o różnej zawartości maltozy. Zastosowanie enzymów usuwających rozgałęzienia (pullulanaza lub izoamylaza) umożliwia
pełna hydrolizę zarówno amylozy jak i amylopektyny, co skutkuje wysoką zawartością związków niskocząsteczkowych (zwłaszcza
maltozy). W produkcji syropu wysokoscukrzonego również stosuje się mieszaninę enzymów (α-amylaza i amyloglukozydaza) w
celu zwiększenia stopnia konwersji. Syropy maltozowe otrzymywane metoda enzymatyczna znajdują zastosowanie w
piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do żywności ułatwia kontrole wodochłonności.
Syropy te stosuje się także jako wypełniacze i stabilizatory żywności przetworzonej. Można je, podobnie jak maltodekstryny,
stosować do opóźniania wzrostu kryształów. Dodatkowo z syropu o wysokiej zawartości maltozy produkuje się maltozę
krystaliczna wykorzystywana do w produkcji leków jako zamiennik glukozy dla diabetyków, maltitolu, maltulozy. Syropy te
charakteryzują się niską lepkością w roztworach, niska higroskopijnością oraz stabilnością w podwyższonych temperaturach.
Inne zastosowania
Wytwarzanie polialkoholi. Cukry otrzymywane w syropiarniach mogą być poddawane katalicznemu uwodornieniu, połączonemu
z rozdziałem chromatograficznym. Umożliwia to w miarę efektywna produkcje polialkoholi, takich jak sorbitol, ksylitol, maltitol i
erytritol.
Produkcja kwasów organicznych
Kwas cytrynowy jest najważniejszym kwasem organicznym, produkowanym w dużych ilościach i wykorzystywanym w przemyśle
spożywczym i farmaceutycznym. Większa cześć produkcji opiera się na Aspergillus niger. Źródłem węgla mogą być miedzy innymi
hydrolizaty skrobiowe i inne pożywki oparte na skrobi.
Kwas mlekowy produkowany jest głównie w oparciu o maltozę i glukozę. Bezpośrednia hydroliza skrobi jest możliwa przy udziale
bakterii kwasu mlekowego: Lactobacillus thermophillus oraz Lactobacillus amylophillus.
Inne kwasy organiczne produkowane w syropiarniach to kwas itakonowy (do produkcji tworzyw sztucznych, farb i lakierów) i
glukonowy (preparaty do czyszczenia, glukoniany wapnia, magnezu i żelaza wykorzystywane są jako dodatki wzbogacające
produkty spożywcze w odpowiednie sole mineralne).
Piekarstwo Preparaty amylolityczne są wykorzystywane przy produkcji pieczywa w celu zwiększenia zawartości cukrów w cieście,
zintensyfikowania fermentacji, a co za tym idzie zwiększenia objętości miękiszu i porowatości, poprawy koloru skórki, oraz
polepszenia smaku i zapachu pieczywa. Powstające w wyniku działania α-amylazy niskocząsteczkowe dekstryny wpływają na
przedłużenie trwałości pieczywa, gdyż utrudniają powstawanie połączeń pomiędzy skrobią i glutenem oraz spowalniają
retrogradacje skrobi.
Gorzelnictwo i browarnictwo Źródłem skrobi do produkcji etanolu mogą być różne rośliny, np. kukurydza, pszenica, ziemniaki,
maniok. Ponieważ drodze zazwyczaj nie są zdolne do hydrolizy skrobi, używa się do tego celu preparatów enzymatycznych. Duże
ilości preparatów amylolitycznych zużywane są także przez browary, przy produkcji piwa, podczas zacierania (przy stosowaniu
surowców niesłodowanych) i klarowania. Zastosowanie w browarnictwie surowców niesłodowanych i preparatów
enzymatycznych zwiększa wydajność warzelni i obniża koszty związane z budową i eksploatacją słodowni.
Produkcja acetonu i butanolu W roku 1914 Chaim Weizmann wyizolował Clostridium acetobutylicum, bakterie zdolna do
przetwarzania skrobi w aceton i butanol. Ze względu na znaczenie militarne (produkcja nitrocelulozy) proces Weizmanna został
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Enzymatyczna hydroliza skrobi
szybko wdrożony i był powszechnie wykorzystywany do końca drugiej wojny światowej. Ze względów ekologicznych technologia
ta ma pewne szanse na powtórne wprowadzenie w innych krajach.
Produkcja pasz Dodatek odpowiednich enzymów do pasz może poprawiać ich przyswajalność, co obniża wskaźnik zużycia pasz na
przyrost ciężaru ciała. Do produkcji preparatów dla celów paszowych szczególnie nadaje się Aspergillus oryzae, wytwarzający
enzymy amylolityczne i proteolityczne. Preparaty enzymatyczne mogą być stosowane w procesie ich produkcji lub jako
bezpośredni dodatek do gotowych mieszanek paszowych.
Biodegradacja
α-amylaza jest wykorzystywana jako dodatek przyspieszający biodegradację na składowiskach odpadów oraz w oczyszczalniach
ścieków.
Usuwanie zanieczyszczeń skrobiowych Zanieczyszczenia skrobiowe mogą być usuwane z różnego rodzaju produktów spożywczych
i niespożywczych. Glukoamylaza jest wykorzystywana do klarowania wina i soków owocowych. Wytłoki jabłkowe, używane jako
surowiec w produkcji pektyny zawierają pewne ilości skrobi. Ich obecność powoduje silne zmętnienie soku pektynowego i
wpływają niekorzystnie na proces filtracji. Usuwanie skrobi można przeprowadzać różnymi metodami, (samosklarowanie, dodatek
taniny, oziębianie, filtracja), jednak najkorzystniejsze jest użycie do tego celu α-amylazy o optimum pH 3–4. W przemyśle
włókienniczym używa się substancji sklejających osnowę zawierzających skrobię lub jej hydrolizaty. W procesie odklejania tkanin
konieczne jest dokładne usuniecie klejonki, która przeszkadza w dalszych etapach technologicznych (bielenie, farbowanie,
tłoczenie). W tym celu używa się preparatów α-amylazy. Podobne preparaty mogą być używane także do innych celów
(oczyszczanie papieru, mycie naczyń, proszki do prania itp.).
Wybrane metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych.
Metody wykorzystujące przyrost redukcyjności w mieszaninie reakcyjnej.
Metoda z heksascyjanożelazianem (III) potasu. W tej metodzie wykorzystuje się właściwości redukujące cukrów powstałych w
trakcie enzymatycznej hydrolizy polisacharydów. Te uwolnione mono-, di- i oligosacharydy reagują z alkalicznym roztworem
heksascyjanożelazianu (III) potasu- K3Fe(CN)6. Roztwór heksascyjanożelazianu (III) potasu posiada żółty kolor, który po
zredukowaniu przez uwalniane w trakcie hydrolizy skrobi cukry redukujące przekształca się w bezbarwny heksascyjanożelazian (II)
potasu – K4Fe(CN)6. Stopień osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu (III) potasu jest
zależny od ilości uwalnianych cukrów redukujących i może być miarą aktywności enzymów amylolitycznych.
Metoda Bernfelda. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku
zasadowym redukują grupę nitrową soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 do grupy aminowej. Powstałe
pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują świtało przy długości fali w zakresie od 450-540 nm.
Intensywność powstałej barwy zależy od ilości w próbie cukrów redukujących uwalnianych podczas działania enzymów, dlatego
reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego.
Metoda Somogyi i Nelsona. W tej metodzie podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, wykorzystuje się właściwości
redukujące sacharydów (głównie mono- i disacharydów), które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi (II) do jonów
miedzi (I) w obecności winianu sodowopotasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego
osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego
kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali
od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych.
Metoda wykorzystująca zdolność skrobi do tworzenia kompleksu z jodem.
Cząsteczki skrobi zależnie od ilości zawartej w nich amylozy i amylopektyny adsorbują jod na swojej powierzchni, dając zabarwienie
niebieskie lub niebieskofioletowe. Natomiast produkty częściowej degradacji skrobi zależnie od wielkości ich cząsteczek dają
zabarwienie fioletowe (dekstryny wysokocząsteczkowe), czerwone i czerwonobrunatne (dekstryny o średniej masie
cząsteczkowej). Z kolei dekstryny niskocząsteczkowe nie dają zabarwienia z jodem.
Metoda Sandstedta, Kneena i Blisha oznaczania aktywności amylaz polega na pomiarze ilości rozłożonej skrobi, na podstawie
zmiany intensywności zabarwienia w mieszaninie reakcyjnej z jodem po określonym czasie działania enzymu w optymalnym pH i
temperaturze. Stosowana w ćwiczeniu jako substrat skrobia ziemniaczana barwi się z jodem na niebiesko (ze względu na znaczną
– ok. 20% zawartość amylozy). Po przerwaniu reakcji enzymatycznej i wprowadzeniu jodu w próbie materiałowej (bez enzymu)
oznacza się pochłanianie barwnego kompleksu powstałego z całą ilością skrobi wprowadzonej do reakcji, natomiast w próbie z
udziałem enzymu oznacza się absorbancję kompleksu skrobi nie rozłożonej i dekstryn. Ilość rozłożonej skrobi znajduje się z różnicy
pomiarów tych dwóch prób.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia będzie enzymatyczna hydroliza surowców skrobiowych przy wykorzystaniu α- i β-amylazy, w zależności od
warunków reakcji (temperatura lub pH)
Wykonanie ćwiczenia
1.
Odczynniki używane w doświadczeniu:
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Enzymatyczna hydroliza skrobi
1.1. Bufor fosforanowy pH 6,0
1.2. 10 mM roztwór maltozy
1.3. Preparaty amylaz: α-amylazy i β-amylazy
1.4. 1% kleik skrobiowy: odważyć 1 g skrobi i przygotować zawiesinę w ok. 10 ml wody. Zagotować ok. 90 ml wody i do wrzątku
wlać zawiesinę skrobiową, zagotować i szybko schłodzić
1.5. 1% roztwór DNS (najpierw przygotowano roztwory: 1 g DNS w 20 ml H2O – roztwór A i 1,6 g NaOH w 15 ml H2O – roztwór
B; do roztworu A powoli wkroplono roztwór B i ogrzano mieszaniną na łaźni wodnej, aż do całkowitego rozpuszczenia
osadu; następnie, ciągle mieszając dodano 30 g winianu sodowo-potasowego; roztwór uzupełniono do objętości 200 ml
wodą i w razie potrzeby przefiltrowano)
2.
Przeprowadzenie hydrolizy skrobi
2.1. Do 7 probówek dodajemy 0,5 ml 1% kleiku skrobiowego oraz 0,5 ml buforu fosforanowego, całość mieszamy.
2.2. Probówki inkubujemy w odpowiedniej temperaturze zgodnie z tabelą, przez 5 minut:
Seria z α-amylazą Seria z β-amylazą temperatura
Probówka nr 1
Probówka nr 4
20
Probówka nr 2
Probówka nr 5
55
Probówka nr 3
Probówka nr 6
80
2.3. Do ogrzanych probówek nr 1, 2 i 3 dodajemy 0,2 ml roztworu α-amylazy, do kolejnych trzech 0,2 ml roztworu β-amylazy,
mieszamy, ostatnia - 7 probówka stanowi próbę kontrolną w której enzym zastępujemy wodą.
2.4. Po wprowadzeniu enzymów probówki ponownie inkubujemy w odpowiednich temperaturach, zgodnie z tabelą, przez 5
minut (próbę kontrolną – w temperaturze pokojowej).
2.5. Po upływie 5 minut przerywamy reakcję dodając 1 ml kwasu 3,5-dinitrosalicynowego do wszystkich 7 probówek,
ponownie mieszamy.
2.6. Następnie wstawiamy probówki do zlewki z wrzącą wodą na kolejne 5 minut.
2.7. Po tym czasie wyjmujemy probówki z wrzątku i ochładzamy je do temperatury pokojowej.
2.8. Po ochłodzeniu wszystkich probówek wprowadzamy do każdej 10 ml wody destylowanej i po wymieszaniu dokonujemy
pomiaru absorbancji przy długości fali 530 nm (lub 470 nm – konsultacja z prowadzącym) wobec próby kontrolnej.
3.
Wykonanie krzywej wzorcowej dla maltozy
3.1. Do 6 probówek wprowadzić roztwór maltozy i bufor fosforanowy według tabeli, całość wymieszać.
Nr probówki
Ilość roztworu maltozy
Ilość buforu fosforanowego Stężenie maltozy [µM/l]
1
0,0
10,0
0
2
1,0
9,0
1000
3
2,0
8,0
2000
4
4,0
6,0
4000
5
6,0
4,0
6000
6
8,0
2,0
8000
3.2. Do kolejnych 6 probówek pobrać po 0,5 ml przygotowanych wcześniej roztworów maltozy i buforu, dodać po 0,5 ml
buforu fosforanowego i 1 ml DNS, całość wymieszać.
3.3. Mieszaninę ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut i po schłodzeniu dodać 10 ml wody, wymieszać.
3.4. Zmierzyć absorbancję roztworów przy długości fali 530 nm (lub 470 nm – konsultacja z prowadzącym) wobec próby
kontrolnej (roztwór bez maltozy).
4. Opracowanie wyników
4.1. Wykreślić krzywą wzorcową zależności absorbancji od stężenia maltozy z roztworze.
4.2. Wyznaczyć aktywność α-amylazy i β-amylazy, przyjmując jako jednostkę aktywności (JAA) ilość maltozy (µM) uwolnionej
przez 1 ml enzymu podczas 1 minutowej hydrolizy skrobi:
𝑆𝑚 ∙ 6
JAA =
5
gdzie:
Sm – stężenie maltozy odczytane z krzywej wzorcowej [µM/l]
4.3. Wyznaczyć zależność JAA – f(temp.) dla obu amylaz. Określić wpływa temperatury na aktywność zastosowanych
enzymów.
5. Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
- Klimiuk E., Łebkowska M., Biotechnologia w ochronie środowiska. PWN, 2008.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba