UPLC-MS - Katedra Technologii Chemicznej Organicznej i

Politechnika Śląska
Wydział Chemiczny
Katedra Technologii Chemicznej Organicznej i Petrochemii
INSTRUKCJA
Metody analizy związków chemicznych:
UPLC-MS
U/HPLC
Wprowadzenie
Chromatografia cieczowa, w swoich wielu postaciach, jest szeroko stosowana jako metoda
preparatywna i analityczna. Służy ona do rozdziału mieszanin związków pomiędzy dwie nie
mieszające się ze sobą fazy. Jedna z tych faz jest ciekłą fazą ruchomą, druga natomiast fazą
nieruchomą (stacjonarną). Składniki próbki poruszają się w układzie chromatograficznym tylko wtedy,
gdy znajdują się w fazie ruchomej. Składniki wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej
poruszają się wolniej niż składniki, które mają większe powinowactwo do fazy ruchomej. Rozdział jest
wynikiem różnic w szybkości migracji składników, który jest rezultatem różnic w podziale składników
między dwie fazy.
Faza stacjonarna, którą może być ciało stałe, jak np. silikażel, ciecz osadzona na nośniku,
żywica jonowymienna, znajduje się w kolumnie wykonanej ze stali nierdzewnej, przez którą
przepływa ciekła faza ruchoma.
Ultra lub wysokosprawna chromatografia cieczowa (U/HPLC) ma szerokie zastosowanie,
w szczególności służy do analizy związków mało lotnych lub nietrwałych termicznie.
Główne dziedziny zastosowań chromatografii cieczowej to: chemia farmaceutyków, środków
żywności, biochemia oraz chemia związków stosowanych w przemyśle ciężkim.
Techniki w chromatografii cieczowej
1. Chromatografia ciecz-ciecz (podziałowa)
W chromatografii ciecz-ciecz stosuje się ciekłe fazy stacjonarne, które albo osadzone są na
drobnoziarnistym obojętnym nośniku, albo też są chemicznie związane z jego powierzchnią.
Rozpuszczona w fazie ruchomej analizowana próbka ulega podziałowi pomiędzy fazą stacjonarną a
fazą ruchomą. Stopień podziału pomiędzy obie fazy zależy od jej współczynnika podziału. W wyniku
zróżnicowanych wartości współczynników podziału składników próbki i wynikających z tego ich
różnych prędkości migracji wzdłuż kolumny, następuje rozdział mieszaniny.
Istnieją dwa rodzaje technik chromatograficznych: normalna (NP – z ang.normal phase) i z
odwróconymi fazami (RP – z ang.reversed phase). W normalnej chromatografii ciecz-ciecz, fazą
stacjonarną jest polarna ciecz, np. glikol, natomiast fazą ruchomą jest stosunkowo mało polarna
ciecz, np. heksan. Technika ta jest wykorzystywana do rozdzielania polarnych związków, które mają
większe powinowactwo do polarnej fazy stacjonarnej. Jeżeli faza stacjonarna jest niepolarna, np.
węglowodór alifatyczny przyłączony do stałego nośnika, to technikę tę określa się mianem
chromatografii z odwróconymi fazami, które jest dominująca w UPLC i HPLC.
Ze względu na możliwość zastosowania różnorodnych faz stacjonarnych, chromatografia cieczciecz jest najbardziej uniwersalną techniką chromatografii cieczowej. Wykorzystuje się ją zarówno do
rozdzielania związków polarnych, jak i niepolarnych. Podstawą rozdziału jest rodzaj i liczba obecnych
w cząsteczce podstawników oraz różnice mas cząsteczkowych.
2. Chromatografia ciecz-ciało stałe (adsorpcyjna)
W chromatografii ciecz-ciało stałe rozdział następuje pomiędzy ciekłą fazą ruchomą a stałą fazą
ruchomą a stacjonarną, na której odwracalnie adsorbują się cząsteczki rozdzielanych substancji.
Zaletą chromatografii ciecz-ciało stałe jest wysoki stopień selektywności, jaki można za pomocą
tej techniki uzyskać np. rozdzielenie izomerów m- i p-dibromobenzenu. Metoda ta umożliwia
rozdzielenie mieszanin na klasy związków mające te same grupy funkcyjne. Substancje różniące się
tylko długością łańcucha alkilowego będą słabo rozdzielane.
Technika ta jest stosowana do analiz związków niejonowych, o średniej masie cząsteczkowej od
200 do 2000 u, rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych. Daje ona dobre wyniki w
analizach związków różniących się rodzajem i liczbą grup funkcyjnych, np. barwników, witamin, amin,
fenoli, amidów, kwasów tłuszczowych, alkoholi.
3. Chromatografia jonitowa
Chromatografia jonitowa jest pewną formą chromatografii adsorpcyjnej. Wymiana jonów polega
na zastąpieniu jednego jonu jonem innego rodzaju. Faza stacjonarna składa się ze sztywnego
podłoża, na którego powierzchni rozmieszczone są ładunki dodatnie, będące centrami
jonowymiennymi. Podstawą rozdziału są różnice w sile oddziaływań międzycząsteczkowych
pomiędzy jonami próbki a centrami wymiany.
Chromatografia jonitowa stosowana jest przede wszystkim w analizach związków zjonizowanych
lub ulegających jonizacji. Jej główną dziedziną zastosowań jest biochemia.
4. Chromatografia żelowa (sączenie molekularne, GPC – z ang. Gel Permeation
Chromatography albo SEC- z ang.SizeExclusinChromatography)
Rozdział substancji w tej technice następuje w zależności od wielkości i kształtu ich cząsteczek.
Większe cząsteczki migrują przez kolumnę szybciej niż mniejsze i są eluowane jako pierwsze. Wynika
to z faktu, że cząsteczki o rozmiarach odpowiadających rozmiarom porów fazy stacjonarnej dyfundują
w głąb ziaren żelu.
W chromatografii żelowej stosuje się różnego rodzaju żele jako fazy stacjonarne np.
dekstranowe, silikażele, agarozowe, polistyrenowo - diwinylobenzenowe (PS-DVB).
Chromatografia żelowa stosowana jest głównie do analiz związków o dużych masach
cząsteczkowych (>2000 u). Za pomocą tej techniki można analizować polimery organiczne,
biopolimery.
Teoretyczne podstawy chromatografii
Chromatograficzny rozdział składników mieszaniny następuje wskutek różnic w ich
współczynnikach podziału (K) pomiędzy fazą ruchomą a stacjonarną:
𝐶
K = 𝐶𝑠
(1)
𝑚
gdzie:
Cs to równowagowe stężenie składnika w fazie stacjonarnej
Cm to równowagowestężenie składnika w fazie ruchomej
Czas, jaki upływa między zadozowaniem próbki a pojawieniem się maksimum piku
rozpatrywanego składnika próbki, nazywa się czasem retencji tR.
Czas retencji jest funkcją prędkości fazy ruchomej i objętości eluentu potrzebnego do
wymycia składnika z kolumny, tzw. objętości retencji (VR), zdefiniowanej jako:
VR =FtR
(2)
gdzie:
F to objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej
Objętość fazy ruchomej (objętość martwa) w kolumnie wynosi:
Vm = Ftm
(3)
Podstawowe równanie dla chromatografii ma postać:
VR = Vm + KVS
(4)
gdzie:
Vm to objętość fazy ruchomej w kolumnie
VS to objętość fazy stacjonarnej w kolumnie
Ważnym parametrem w chromatografii jest współczynnik retencji:
𝑛
𝐶𝑠 ∙𝑉𝑠
𝑚 ∙ 𝑉𝑚
k = 𝑛𝑠= 𝐶
𝑚
=𝐾∙
𝑉𝑠
(5)
𝑉𝑚
gdzie:
ns to liczba moli substancji rozpuszczonej w fazie stancjonarnej
nm, to liczba moli substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej
lub po przekształceniu, podstawiając do równania (5) równania (2), (3) i (4), otrzymuje się:
𝑘=
𝑡𝑅 − 𝑡𝑚
𝑡𝑚
(6)
k – współczynnik retencji (kiedyś współczynnik pojemnościowy):

Miara siły oddziaływania danego związku z systemem chromatograficznym

Określa jak długo dany związek przebywa w fazie stacjonarnej w porównaniu z fazą ruchomą

k nie zależy od wielkości kolumny, szybkości przepływu fazy ruchomej

Zależy od tzw. „chemii”: rodzaju fazy stacjonarnej, rodzaju fazy ruchomej, temperatury
tm – czas martwy – czas przebywania związku inertnego na kolumnie

Zależy od tzw. „fizycznych”, „mechanicznych” parametrów: długości, średnicy kolumny,
gęstości upakowania fazy stacjonarnej, szybkości przepływu.
Aparatura:
Typowy schemat blokowy układu do chromatografii cieczowej U/HPLC wygląda następująco:
1
2
3
4
6
7
5
1 – zbiornik, 2 – pompa, 3 – system dozowania próbek, 4 – kolumna chromatograficzna, 6 – detektor,
7 – rejestrator (komputer)
U/HPLC/MS
Spektrometr masowy (MS) w sprzężeniu z chromatografią cieczową znajdują szerokie
zastosowanie w szerokim zakresie badań, np. chemii organicznej, chemii analitycznej, biochemii,
farmacji, diagnostyki medycznej, ochronie środowiska, geochemii, mineralogii, geochronologii. Mogą
być zastosowane np. do pomiaru wieku skał i szkieletów, identyfikacji zakazanych farmaceutyków
zażywanych
przez
sportowców,
do
oznaczania
ilościowego
śladowych
składników
w
półprzewodnikach, do pomiaru mas białek.
Połączenie chromatografii ze spektrometrią mas jest ważne w chemii analitycznej ze względu
na uzupełniające się cechy obu technik. Sprzężenie chromatografii ze spektrometrią mas dostarcza
bardzo skutecznego narzędzia do jakościowej, jak i również ilościowej charakterystyki złożonych
mieszanin przez wykorzystanie najpierw zdolności rozdzielczej chromatografii w celu otrzymania
czystych składników, a następnie zdolności spektrometrii mas do identyfikacji rozdzielonych
związków.
Problemem przy połączeniu chromatografu cieczowego i spektrometru mas (LC/MS) jest to,
że wylot chromatografu znajduje się pod ciśnieniem atmosferycznym, podczas gdy źródła jonów
typowych spektrometrów mas działają pod niskim ciśnieniem. Powoduje to, że wprowadzenie
wycieku z chromatografu do spektrometru mas musi być na ogół połączone z jednoczesnym
usuwaniem większości eluentu. Substancja rozpuszczona wychodząca z cieczowej kolumny
chromatograficznej jest bardzo rozcieńczona. Przepływ wody 1 mlmin-1 odpowiada w przybliżeniu
1250 mlmin-1 par. Nadmiar eluatu nie tylko tworzyłby nie tylko niepożądane tło w widmie masowym,
lecz także utrudniałoby utrzymanie odpowiedniej próżni w spektrometrze masowym.W eluacie
występować mogą również nielotne związki nieorganiczne, np. w przypadku stosowania buforów.
Ponadto, jeśli w chromatografii cieczowej stosuje się elucję gradientową, to skład rozpuszczalnika
zmienia się podczas analizy. Z tych względów trudności techniczne wynikające z połączenia
(interfejsowania) chromatografii cieczowej i spektrometrii mas przewyższają te dla połączenia
GC/MS. Mimo to LC/MS jest metodą o potencjalnie większych możliwościach zastosowania niż
GC/MS. Chromatografia cieczowa jest odpowiednią techniką dla dużych, polarnych, jonowych,
termicznie nietrwałych i nielotnych związków.
Spektrometr masowy można zmierzyć masę cząsteczki dopiero przekształca cząsteczki z
jonów w fazie gazowej. Aby to zrobić, to przekazuje ładunek elektryczny do cząsteczek i przetwarza
strumień wynikowy jonów naładowanych na proporcjonalny prąd elektryczny, który następnie
odczytuje dane systemu. System danych konwertuje prąd do informacji cyfrowej, wyświetlając je
jako widmo masowe.
MS
Na widmie MS mogą pojawiają się charakterystyczne sygnały w postaci pików. Wyróżnia się
pik o największej intensywności, tzw. pik podstawowy. Względem tego piku oznacza się abundancję
względną pozostałych sygnałów. Ponadto, wyróżnia się szereg typów pików:

molekularny – pik odpowiedzialny za masę analizowanego związku. U podstaw jego
otrzymania leży wybicie elektronu z cząsteczki. Masa elektronu jest znikoma i
nierozpatrywana.

pseudomolekularny – pik jonu, który otrzymuje się w momencie przyłączenia się lub ubytku
w analizowanym związku cząsteczki niosącej ładunek, np. protonu.

fragmentacyjny
–
pik
posiadający
masę
mniejszą
niż
pik
molekularny
czy
pseudomolekularny, powstający na wskutek ich rozpadu dzięki nadmiarowi energii
dostarczonemu w toku jonizacji

izotopowy – pik, którego występowanie uwarunkowane jest obecnością izotopów
pierwiastków. Wykorzystuje się te piki do ustalania wzoru sumarycznego nieznanych
substancji.
Obecność opisanych powyżej typów sygnałów zależna jest nie tylko od samej budowy analitu,
ale przede wszystkim od rodzaju źródła jonizacji. Co za tym bezpośrednio idzie sposobu i ilości
dostarczonej energii w samym procesie.
Wybrane metody jonizacji próbki
Tabela 1. Czynniki wywołujące jonizację
Czynnik
Przykład metody jonizacji
Elektrony
EI (jonizacja elektronami)
Reakcje jonów
CI
Pola elektryczne
chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym)
Pola elektryczne w połączeniu z rozpylaniem
FI (jonizacja polem), FD (desorpcja polem), EHI
(jonizacja
chemiczna),
APCI
(jonizacja
(jonizacja elektrohydrodynamiczna)
Termosprej, elektrosprej
Szybko poruszające się atomy
FAB (bombardowanie szybkimi atomami)
Szybko poruszające się jony
SIMS (spektrometria mas jonów wtórnych)
Fotony
Desorpcja laserowa, MPI
Produkty rozszczepienia jądrowego
Desorpcja plazmowa
Jonizacja elektronami (EI – z ang. Elektron Impact Ionization)
Jest to pierwsza z metoda jonizacji stosowanych w spektrometrii masowej. Metodę tę można
stosować jedynie dla substancji wykazujących pewną minimalną lotność w temperaturze, w której są
one jeszcze stabilne. Elektrony energetyczne z rozgrzanego filamentu (włókna żarowego)
przyspieszane są w polu elektrycznym i przechodzą przez komorę jonową o małej objętości, która
zawiera próbkę gazową. Taki elektron ora cząsteczka (M) z odparowanej próbki reagują ze sobą, jeśli
znajdą się dostatecznie blisko, aby elektron mógł przekazać wystarczającą ilość swojej energii
cząsteczce obojętnej, co może spowodować oderwanie elektronu z cząsteczki i utworzenie jonu
molekularnego:
M + e- -> M+* + 2eNadmiar energii przekazany cząsteczce jest wykorzystywany na zrywanie wiązań, dzięki
czemu powstają piki pochodzące od jonów molekularnych, w zależności od struktury chemicznej
związku.
Jonizacja chemiczna (CI – z ang. Chemical Ionization)
W metodzie jonizacji chemicznej wykorzystuje się tzw. jony pierwotne, powstające w wyniku
bombardowania elektronami cząsteczek gazu reagującego. Gazem reagującym jest najczęściej metan,
izobutan, amoniak, woda lub gazy szlachetne. Należy do metod łagodnej jonizacji, ponieważ
przyspieszone elektrony nie ulegają bezpośredniej kolizji z cząsteczką analitu, a z gazem (metanem)
wypełniającym komorę jonizatora. Następnie cząsteczki metanu oddają energię na badany związek
powodując jego wtórną jonizację. Otrzymuje się jony pseudomolekularne poprzez addycję
elektrofilową. Metodę tą charakteryzuje mniejszy stopień fragmentacji niż w przypadku EI.
Aparatura:
Typowy schemat blokowy spektrometru mas wygląda następująco:
1
2
3
4
5
1 – układ wprowadzający próbkę, 2 – źródło jonów, 3 – analizator (rozdział jonów), 4 – detektor, 5 –
rejestrator (komputer)
Przygotowano na podstawie:
1. R. A. W. Johnstone, M. E. Rose, Spektrometria mas, PWN, Warszawa 2001
2. Metod spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych. WNT,
Warszawa, 1995