Dako Autostainer/Autostainer Plus

0843
FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Cytomegalovirus
Klony CCH2 + DDG9
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS752
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytomegalovirus, klony CCH2 + DDG9, Ready-to-Use (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako
Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciało to jest przydatne do identyfikacji ludzkich tkanek zakaŜonych ludzkim
wirusem cytomegalii (HCMV) (1, 2). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona
przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana
przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Ludzki wirus cytomegalii jest powszechnie występującym wirusem opryszczki (herpes). Infekcja pierwotna występuje
zazwyczaj w dzieciństwie i najczęściej przebiega bezobjawowo. U noworodków oraz osobników z obniŜoną
odpornością, takich jak chorzy na AIDS lub odbiorcy przeszczepów, wirus HCMV moŜe powodować cięŜkie,
zagraŜające Ŝyciu infekcje i stanowi on najczęstszą przyczynę wirusowych wad wrodzonych (5, 6).
Przeciwciało CCH2 (1) reaguje z wczesnym białkiem jądrowym identycznym z białkiem p52, wiąŜącym
nieustrukturyzowane DNA (7). Przeciwciało DDG9 reaguje z najbliŜszym wczesnym białkiem jądrowym o masie
około 76 kDa (3). W przypadku obu przeciwciał reaktywność utrzymuje się równieŜ na późniejszych etapach
podczas infekcji HCMV, gdzie lokalizacja przestaje mieć charakter wyłącznie jądrowy i wydaje się występować w
cytoplazmie. JednakŜe laserowa mikroskopia konfokalna wykazuje, Ŝe reakcja jest ograniczona do błony jądrowej (3).
Przeciwciała nie reagują krzyŜowo z adenowirusem, wirusem opryszczki pospolitej oraz wirusem varicella zoster
(ospy wietrznej) (3).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowa do uŜyci mieszanina dwóch monoklonalnych mysich przeciwciał w postaci ciekłej jako nadsącz hodowli
tkankowej dializowany wobec buforu Tris/HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L, o pH 7,2, zawierającego NaN3 w stęŜeniu
0,015 mol/L.
Klony: CCH2 + DDG9 (3). Izotyp: IgG1, kappa (CCH2) i IgG2a, kappa (DDG9).
Immunogen
Surowe lizaty komórkowe ludzkich fibroblastów płodowych zakaŜonych wirusem cytomegalii szczep Ad169 (3).
Swoistość
Przeciwciało CCH2 reaguje z wczesnym białkiem jądrowym identycznym z białkiem p52, wiąŜącym
nieustrukturyzowane DNA (7). Przeciwciałem skutecznie oznaczono ponad 200 izolatów ludzkiego CMV, które, w
związku z tym, wydaje się rozpoznawać epitop wysoce konserwatywny w szczepach HCMV (3, 4).
Przeciwciało DDG9 reaguje z najbliŜszym wczesnym białkiem jądrowym o masie około 76 kDa (3).
W przypadku obu przeciwciał reaktywność utrzymuje się równieŜ na późniejszych etapach podczas infekcji HCMV,
gdzie lokalizacja przestaje mieć charakter wyłącznie jądrowy i wydaje się występować w cytoplazmie. JednakŜe
laserowa mikroskopia konfokalna wykazuje, Ŝe reakcja jest ograniczona do błony jądrowej (3).
Przeciwciała nie reagują krzyŜowo z adenowirusem, wirusem opryszczki pospolitej oraz wirusem varicella zoster
(ospy wietrznej) (3).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł‚ biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
(118545-003)
Dako Denmark A/S
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
IS752/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako
Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych
odczynników)
Autoprogram: CMV (bez barwienia kontrastowego) lub CMVH (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy
płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować tkankę zakaŜoną
wirusem HCMV, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn
reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750).
Interpretacja
wybarwienia
Odczyn komórkowy reprezentuje silną reakcję wewnątrzjądrową. MoŜliwe jest wystąpienie odczynu cytoplazmatycznego.
Charakterystyka
działania
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn jądrowy na wczesnym stadium infekcji HCMV.
Na późniejszych etapach moŜliwe jest zaobserwowanie pozornego odczynu cytoplazmatycznego (3).
Tkanki normalne: Badanie przesiewowe przeciwciałem CCH2 prawidłowych tkanek ludzkich pochodzących od
dawców niezainfekowanych HCMV wykazało brak reakcji z sercem, płucem, wątrobą, nerką, śledzioną, węzłem
chłonnym, migdałkiem, szpikiem kości, mięśniem szkieletowym, mózgiem, tarczycą i przytarczycą (1).
Tkanki patologiczne: W tkankach zainfekowanych wirusem HCMV przeciwciało CCH2 znakowało komórki w
płucach, wątrobie, węźle chłonnym, mózgu, tarczycy i przytarczycy (1). Przeciwciała CCH2 i DDG9 razem
znakowały zainfekowaną HCMV tkankę przełyku, Ŝołądka, jelita cienkiego, okręŜnicy, pęcherzyka Ŝółciowego, płuca,
nadnerczy, jajników i tkankę nerwową (2).
Piśmiennictwo
1.
2.
(118545-003)
Dako Denmark A/S
Niedobitek G, Finn T, Herbst H, Gerdes J, Grillner L, Landqvist M, et al. Detection of cytomegalovirus by in situ
hybridization and immunohistochemistry using new monoclonal antibody CCH2: a comparison of methods.
J Clin Pathol 1988; 41:1005-9.
Saiz E, Lubin J, Robinson MJ. The modified Steiner stain: a new use for an old stain? Staining cytomegalovirusinfected cells in gastrointestinal biopsies. Histochem J 1998; 30:549-52.
3.
Wirgart BZ. Development of rapid methods for early diagnosis of cytomegalovirus infections [dissertation].
Stockholm: Karolinska Hospital; 1991.
4.
Wirgart BZ, Landqvist M, Hökeberg I, Eriksson B-M, Olding-Stenkvist E, Grillner L. Early detection of
cytomegalovirus in cell culture by a new monoclonal antibody, CCH2. J Virol Methods 1990; 27:211-20.
5.
Doniger J, Muralidhar S, Rosenthal LJ. Human cytomegalovirus and human herpes virus 6 genes that transform
and transactivate. Clin Microbiol Rev 1999; 12:367-82.
6.
Jarvis MA, Nelson JA. Human cytomegalovirus persistence and latency in endothelial cells and macrophages.
Curr Opin Microbiol 2002; 5:403-7.
7.
Plachter B, Nordin M, Wirgart BZ, Mach M, Stein H, Grillner L, et al. The DNA-binding protein P52 of human
cytomegalovirus reacts with monoclonal antibody CCH2 and associates with the nuclear membrane at late times
after infection. Virus Res 1992;24: 265-76.
IS752/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(118545-003)
Dako Denmark A/S
IS752/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17