Skuteczne i nieskuteczne preparaty mikrobiologiczne stosowane w

Skuteczne i nieskuteczne preparaty mikrobiologiczne stosowane w

W h > / < : പ D dK z  E പ / പ ^ d E Z z
POST. MIKROBIOL.,
2011, 50, 4, 321–328
http://www.pm.microbiology.pl
SKUTECZNE I NIESKUTECZNE
PREPARATY MIKROBIOLOGICZNE STOSOWANE
W OCHRONIE I UPRAWIE ROŚLIN
ORAZ RZETELNE I NIERZETELNE METODY ICH OCENY
Stefan Martyniuk
Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa
– Państwowy Instytut Badawczy, ul. Czartoryskich 8, 24-100 Puławy
Wpłynęło w maju 2011 r.
1. Wstęp. 2. Charakterystyka biopreparatów stosowanych w ochronie roślin. 3. Charakterystyka preparatów mikrobiologicznych oddziaływujących na plonowanie roślin i właściwości gleb. 4. Podsumowanie
Effective and ineffective microbial preparations used in plant protection and production and methods of their evaluation
Abstract: Main principles of production and evaluation of microbial bio-preparations (inoculants) used in plant protection to control
pathogens and pests (biological control) and in plant production to stimulate growth and yields of crops are discussed in this article. The
registration procedure of biological control agents (b.c.a.), which for many producers of b.c.a. is too costly and too restrictive, however
this procedure ensures that the commercial use of b.c.a. is safe for the people and for the environment and also that these products
are fair with respect to their quality. With respect to microbial preparation and other bio-products used to improve soil properties,
particularly those designated for ecological (organic) crop production, the registration procedure is mild. This enables selling microbial
bio-preparations whose quality and effectiveness have not been proven. More critical assessment of experimental results of studies on
these products would result in spreading of more reliable information on the real quality and usefulness of such bio-preparations.
1. Introduction. 2. Characteristics of bio-preparations used in plant protection. 3. Characteristics of microbial preparations affecting crop
yields and soil properties. 4. Summary
Słowa kluczowe: biopreparaty, biologiczna ochrona roślin, produkcja roślinna
Key words:
bio-preparations, biological plant protection, plant production
1. Wstęp
W praktyce rolniczej preparaty mikrobiologiczne
stosowane są przede wszystkim w ochronie roślin do
ograniczania rozwoju patogenów i szkodników (biologiczna ochrona), zwłaszcza w rolnictwie integrowanym
i ekologicznym [1, 3, 8, 10, 11, 14, 21, 25, 29, 45–47,
50]. Dostępne są również preparaty mikrobiologiczne
wykorzystywane do stymulowania wzrostu i plonowania
niektórych roślin uprawnych, a przykładami takich biopreparatów są szczepionki zawierające bakterie symbiotyczne roślin bobowatych (motylkowatych) oraz szczepionki stosowane w leśnictwie do mikoryzacji sadzonek
w szkółkach drzew [2–6, 14, 19, 26, 28, 39, 40–43, 52].
W ostatnim dziesięcioleciu znalazły się w handlu także
preparaty pseudo-mikrobiologiczne, które reklamowane
są jako środki poprawiające rzekomo nie tylko mikrobiologiczne właściwości gleb, ale także ich właściwości
chemiczne i fizyczne, oraz podnoszące w niewiarygodnie dużym stopniu plonowanie roślin [9, 16, 54, 55].
W odniesieniu do tych produktów stwierdzić można
wiele nierzetelności, a ich jakość z mikrobiologicznego
punktu widzenia pozostawia także wiele do życzenia.
Zanim omówione zostaną dokładniej wymienione
wyżej grupy biopreparatów, warto przypomnieć jak
ważną rolę odgrywają mikroorganizmy w środowisku
glebowym. Liczne badania wykazały, że biomasa mikroorganizmów w glebach stanowi około 85% całej biomasy
wszystkich organizmów żyjących w tym środowisku i aż
90% ditlenku węgla (CO2) powstającego w glebach ma
pochodzenie drobnoustrojowe [3, 8, 35, 37, 50]. Dane te
świadczą o dużej aktywności metabolicznej i ogromnym
znaczeniu mikroorganizmów dla większości procesów
zachodzących w środowisku glebowym. Do najważniejszych funkcji organizmów glebowych należą:
1. Rozkład i mineralizacja materii organicznej (resztki pozbiorowe, obornik i inne nawozy naturalne, komposty, poplony) [3, 14, 18, 20, 23, 35, 39]. W procesach
tych oprócz mikroorganizmów istotną rolę odgrywa
także fauna glebowa (dżdżownice, roztocza), która
* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa – Państwowy Instytut
Badawczy, ul. Czartoryskich 8, 24-100 Puławy; e-mail: [email protected]
322
STEFAN MARTYNIUK
przyczynia się do rozdrabniania i mieszania materii
organicznej z glebą, w wyniku czego ułatwiany jest jej
rozkład i mineralizacja przez mikroorganizmy, czyli
bakterie i grzyby glebowe. Rozkład resztek organicznych
jest bardzo ważny nie tylko ze względu na uwalnianie
mineralnych form składników odżywczych, które stanowią źródło pokarmu dla roślin uprawnych, ale również dlatego że, w wyniku procesów mikrobiologicznej
transformacji materii organicznej powstaje próchnica
glebowa, której zawartość w glebie jest jednym z najważniejszych czynników decydujących o zdolności gleby
do magazynowania wody i składników pokarmowych,
a także o fizycznej strukturze (gruzełkowatość, wymiana
gazowa) gleby. Ponadto, różne produkty przemiany
materii, np. śluzy bakteryjne czy glomaliny (substancje
produkowane przez strzępki grzybów endomikoryzowych) wytwarzane przez drobnoustroje w czasie rozkładu materii organicznej, również przyczyniają się do
kształtowania fizycznych właściwości gleb poprzez zlepianie cząstek glebowych w gruzełki, zwiększając w ten
sposób odporność gleb na erozją wodno-powietrzną.
2. Rozkład i detoksykacja różnych substancji zanieczyszczających gleby (ksenobiotyków) [7, 12, 27, 35, 37].
Udział w procesach detoksykacji mają przede wszystkim
mikroorganizmy glebowe. Ich niezwykłe bogactwo, duża
aktywność i zdolności przystosowawcze powodują, że
nie tylko środki ochrony roślin, powszechnie stosowane
w nowoczesnym, intensywnym rolnictwie, ale również
inne substancje, np. zanieczyszczenia przemysłowe,
ulegają mikrobiologicznemu rozkładowi do związków
prostszych, na ogół mniej aktywnych biologicznie.
3. Ograniczanie rozwoju szkodników i patogenów
roślin [1, 8, 10, 11, 21, 25, 29, 45–47, 50]. Ta aktywność mikroorganizmów związana jest przede wszystkim
z występowaniem w glebie konkurencji, m.in. o pokarm,
pomiędzy jej mieszkańcami, a także zjawiskom antagonizmu i nadpasożytnictwa. Na przykład, wiele bakterii
glebowych hamuje rozwój grzybów fitopatogenicznych
produkując różnego rodzaju substancje antybiotyczne
lub enzymy rozkładające strzępki grzybów. Z kolei niektóre grzyby glebowe mają zdolność pasożytowania na
nicieniach i owadach.
4. Tworzenie układów symbiotycznych z roślinami
[4–6, 26, 31, 32, 40, 48, 52]. Najlepiej znanym przykładem symbiozy mikroorganizmów glebowych z roślinami jest współżycie bakterii brodawkowych (rizobiów)
z roślinami motylkowatymi. Wymiana składników odżywczych pomiędzy partnerami tej symbiozy odbywa
się w brodawkach korzeniowych, w których bytujące
tam rizobia przekazują roślinie motylkowatej azot (który
pobrały z atmosfery) w zamian za węglowodany jako
źródło energii niezbędnej bakteriom do przeprowadzania procesu redukcji azotu atmosferycznego. Proces ten
jest więc bardzo korzystny zarówno z ekologicznego jak
i rolniczego punktu widzenia. Uprawa roślin motylko-
watych nie wymaga bowiem na ogół stosowania nawożenia azotowego. Innym rodzajem symbiozy jest mikoryza, czyli symbioza wielu gatunków grzybów glebowych
z korzeniami roślin. W tym przypadku grzyb mikoryzowy nie ma zdolności do asymilacji azotu atmosferycznego, a jego współpraca z rośliną polega przede
wszystkim na ułatwianiu partnerowi pobierania wody
i soli mineralnych, a także na ochronie korzeni przed
grzybami chorobotwórczymi. Mikoryza jest szeroko
rozpowszechniona w przyrodzie; tworzą ją zarówno
drzewa leśne (ekto-mikoryza) jak i rośliny zielne (endo-mikoryza), w tym większość roślin uprawnych.
Wraz z rozwojem badań podstawowych z zakresu
mikrobiologii gleby, których efektem było m.in. wyodrębnienie i zidentyfikowanie w XX wieku wielu ważnych grup mikroorganizmów glebowych, a także coraz
dokładniejsze poznawanie ich biologii, ekologii, fizjologii i kluczowej roli w przeprowadzaniu wyżej wymienionych procesów, rozwijały się również badania
utylitarne nad wykorzystywaniem różnych grup pożytecznych drobnoustrojów w praktyce rolniczej. W efekcie tych badań opracowano i wdrożono do produkcji
w różnych krajach liczne biopreparaty, wśród których
dominują preparaty wykorzystywane w biologicznej
ochronie roślin, czyli preparaty zawierające w swoim
składzie mikroorganizmy antagonistyczne lub pasożytnicze w stosunku do patogenów i szkodników roślin,
oraz mniej liczne szczepionki stymulujące aktywność
mikrobiologiczną gleb lub korzystnie oddziaływujące na
wzrost i plonowanie roślin, np. biopreparaty zawierające
mikroorganizmy symbiotyczne (bakterie brodawkowe
roślin motylkowatych, grzyby mikoryzowe).
2. Charakterystyka biopreparatów stosowanych
w biologicznej ochronie roślin
W 2005 roku w krajach członkowskich OECD zarejestrowanych było około 214 biologicznych środków
ochrony roślin (biopestycydów) [17]. Jest to dość liczna
grupa biopreparatów wskazująca na to, że badania prowadzone w wielu ośrodkach naukowych zakończyły się
sukcesem, a więc wdrożeniem do produkcji biopestycydów, zawierających różne grupy mikroorganizmów
(wirusy, bakterie i grzyby) oraz mikroskopijne nicienie
(Tabela I). Jest to również niewątpliwy sukces producentów tych środków, często niewielkich firm, którzy
podjęli trud, także finansowy, związany z rejestracją
swoich produktów. Trzeba w tym miejscu zaznaczyć, że
rejestracja biologicznych środków ochrony (b.ś.o.) roślin
odbywa się na podobnych zasadach jak chemicznych
środków ochrony [45–47], czyli jest to proces nie tylko
rygorystyczny ale także bardzo kosztowny. T o m a l a k
w swoim opracowaniu [45] podaje przykład szwedzkiej
firmy Bioagri, która na zarejestrowanie na terenie UE
SKUTECZNE I NIESKUTECZNE PREPARATY MIKROBIOLOGICZNE STOSOWANE W OCHRONIE I UPRAWIE ROŚLIN
Tabela I
Biologiczne środki ochrony roślin zawierające mikroorganizmy
zarejestrowane w krajach OECD [16]
Grupa
biopestycydów
Liczba
zarejestrowanych
preparatów
Najważniejsze organizmy
jako aktywne składniki
(Liczba preparatów)
Bioherbicydy
1
Alternaria destruens
Biobakteriocydy
5
Agrobacterium (3),
Pseudomonas, Bacillus
Biofungicydy
60
Trichoderma (25), Gliocladium,
Pythium, Coniothyrium,
Bacillus, Pseudomonas,
Streptomyces
Bioinsektycydy
83
Bacillus thuringiensis (72),
Baeuveria basiana (10)
Bionematocydy
64
Metharhizium (8),
Peacilomyces, Verticillium,
Bacillus (8), wirusy (14),
Heterorahabditis (10),
Steinernema (20)
dwóch biopreparatów zawierających bakterię Pseudomonas chlororaphis wydała 4,3 miliona Euro. Trudna i kosztowna procedura rejestracyjna b.ś.o. roślin powoduje, że
część producentów rezygnuje z wytwarzania biopreparatów, co niewątpliwie zmniejsza ich asortyment i ogranicza zakres stosowania biologicznej ochrony w rolnictwie
i ogrodnictwie. Z tego m.in. powodu od kilku lat trwają
w UE prace zmierzające do zmiany (złagodzenia) zasad
rejestracji b.ś.o. roślin [25, 46]. Choć proces rejestracyjny
tych środków jest dość kłopotliwy dla producentów
i niewątpliwie wymaga zmian, to jednak należy podkreślić, że zapewnia on nie tylko bezpieczeństwo ich stosowania (dla ludzi i środowiska), ale także powoduje, że
b.ś.o. są produktami o dobrej jakości. Przy czym w przypadku tych środków chodzi zwłaszcza o jakość procesu
ich wytwarzania i czystości produktu końcowego. Jest
to szczególnie ważne w odniesieniu do preparatów
mikrobiologicznych, bowiem ich proces produkcyjny
obejmuje m.in. kilkuetapowe rozmnażanie czystej kultury mikroorganizmu, który jest aktywnym czynnikiem
preparatu [26, 33, 40, 41, 48]. Proces ten rozpoczyna się
od przygotowania czystej „kultury matecznej”, a w kolejnych etapach dochodzi do dalszego rozmnożenie mikroorganizmów w wyniku ich przenoszenia do urządzeń
hodowlanych (fermentorów) zawierających coraz większe objętości sterylnych pożywek, najczęściej płynnych.
Liczba tych etapów uzależniona jest oczywiście od skali
produkcji. W przypadku niektórych biopreparatów, np.
zwierających Bacillus thuringienis, skala produkcji jest
bardzo duża i prowadzona jest ona z wykorzystaniem
fermentorów o objętości nawet 100 000 litrów [41, 47].
Fermentory są urządzeniami, w którym rozmnażanie
mikroorganizmów odbywa się w sposób kontrolowany,
323
jałowy i optymalny. Częścią centralną fermentora jest
zbiornik, najczęściej wykonanymi ze stali nierdzewnej,
który wyposażony jest w agregaty umożliwiające wyjaławianie wprowadzanej do niego pożywki płynnej oraz
jej napowietrzanie i utrzymywanie w stałej (optymalnej) temperaturze w czasie całego procesu hodowlanego. Rozmnażanie mikroorganizmów w fermentorach
trwa zwykle kilka dni i kończy się gdy gęstość hodowli
osiąga wymagany poziom. Bardzo ważną czynnością, od
której zależy finalna jakość wytwarzanego biopreparatu,
jest kontrolowanie czystości hodowli mikroorganizmu
na każdym z ww. etapów przenoszenia i powiększania objętości hodowli. Zakażenie hodowli, np. kultury
matecznej, rozmnażanego drobnoustroju innymi mikroorganizmami może bowiem doprowadzić do zdominowania, a nawet całkowitego wyeliminowania z hodowli
właściwego drobnoustroju w dalszych etapach tego procesu. Jest to szczególnie ważne w przypadku bakterii,
które charakteryzują się znacznie wolniejszym tempem
namnażania (podziału komórek), jak np. rizobia, niż
inne bakterie, np. z rodzaju Pseudomonas lub Bacillus
[33, 48]. W zależności od przyjętej technologii produkcji
biopreparatu, uzyskana w fermentorze biomasa mikroorganizmów jest odseparowywana od płynu pohodowlanego lub, jak to ma miejsce w przypadku szczepionek
rizobiowych, cała hodowla wykorzystywana jest w dalszym etapie produkcji, w którym następuje dokładne
wymieszanie zawiesiny bakterii z nośnikiem. Większość
biopreparatów mikrobiologicznych produkowana jest
w postaci preparatów stałych, suchych (liofilizowanych)
lub wilgotnych. Tylko nieliczne mają postać płynną.
W obydwu przypadkach mikroorganizmy wymieszane
są z jałowym nośnikiem (talk, pył torfu lub węgla brunatnego, minerały ilaste), którego rolą jest zapewnienie
możliwie jak najlepszych warunków do przeżywania
mikroorganizmów w preparacie handlowym oraz jak
najefektywniejszego sposobu jego aplikacji [32, 40, 47].
Ponadto, procedura rejestracyjna wymaga od producentów podania wielu innych ważnych informacji [10,
45–47], m.in. takich jak:
– dokładna nazwa i charakterystyka mikroorganizmu (makroorganizmu),
– dane dotyczące kolekcji, w której czysta kultura
mikroorganizmu została zdeponowana,
– ilościowy skład preparatu (aktywna forma mikroorganizmu i jego zawartość, a także innych składników, np. nośnika),
– metoda oznaczania (identyfikacji) składu produktu,
– warunki przechowywania i okres przydatności,
– zakres (cel) i zasady stosowania,
– wynik badań potwierdzających skuteczność biopreparatu.
Wszystko to powoduje, że b.ś.o. roślin są bez wątpienia produktami bezpiecznymi i solidnymi pod względem
324
STEFAN MARTYNIUK
jakości, znany jest bowiem ich dokładny skład, konkretny cel i zakres ich stosowania, oraz – co jest bardzo ważne – znana jest metoda badania i identyfikacji,
a więc także kontrolowania, ich składu i zawartości
czynnika aktywnego.
Dokładniejsze omawianie skuteczności biologicznych środków ochrony roślin w praktyce rolniczej nie
jest celem tego artykułu. Trzeba jednak stwierdzić, że
skuteczność ta jest w przypadku wielu b.ś.o. niewątpliwie mniejsza niż środków chemicznych. Dotyczy to
zwłaszcza biopreparatów opartych na mikroorganizmach (bakteriach i grzybach), które aplikowane są do
gleby, czyli do środowiska charakteryzującego się bardzo
dużą złożonością różnego rodzaju oddziaływań, w tym
antagonistycznych, oraz ogromną konkurencyjnością
o energię i składniki odżywcze pomiędzy drobnoustrojami glebowymi i innymi mieszkańcami gleby. Gleba
jest także środowiskiem o dużej zmienności czynników abiotycznych (wilgotność, temperatura, odczyn
(pH), zabiegi agrotechniczne), które bardzo istotnie
wpływają na przeżywalność i skuteczność organizmów
wprowadzanych do gleby [1, 5, 8, 9, 14, 28, 35, 37, 50].
Być może jest to jeden z ważniejszych czynników powodujących, że w ostatnim dziesięcioleciu sprzedaż preparatów zawierających makroorganizmy (pasożytnicze
i drapieżne owady, drapieżne roztocza), czyli środków
stosowanych w bardziej kontrolowanych i mniej złożonych warunkach (szklarnie, części nadziemne roślin)
jest znacznie większa niż biopreparatów opartych na
mikroorganizmach – odpowiednio 55–60% i 26% ogólnej sprzedaży b.ś.o. roślin [45, 46]. Warto też dodać, że
choć zakres praktycznego wykorzystywania biopreparatów w ochronie roślin jest ciągle mały, ma on jednak
tendencje wzrostowe. Na przykład, Tomalak [45] podaje,
że w 2004 roku wartość rynku preparatów biologicznych
(opartych na makroorganizmach i mikroorganizmach)
stosowanych w ochronie roślin wyniosła około 2,5%
ogólnej wartości rynku środków ochrony roślin, a obecnie udział ten prognozowany jest na 4,2–4,5%. Wzrastające zapotrzebowanie na biopreparaty związane jest
prawdopodobnie głównie z rozwojem proekologicznych
metod uprawy roślin, w tym rolnictwa ekologicznego
[5, 8, 24, 29, 47].
3. Charakterystyka preparatów mikrobiologicznych
oddziaływujących na plonowanie roślin
i właściwości gleb
W tej grupie biopreparatów najbardziej znane na
świecie i najszerzej stosowane w praktyce rolniczej,
także w naszym kraju, są wspomniane już wcześniej
szczepionki zawierające bakterie (rizobia), które wiążą
azot atmosferyczny w symbiozie z korzeniami roślin
(bobowatych) motylkowatych. Podobnie jak w przy-
padku b.ś.o. technologia wytwarzania tych szczepionek
obejmuje następujące etapy:
– zgromadzenie kolekcji różnych szczepów drobnoustrojów,
– kontrolowanie czystości i jakości (efektywności
symbiotycznej) tych szczepów,
– wieloetapowe rozmnażanie mikroorganizmów i kontrolowanie czystości uzyskiwanej biomasy,
– przygotowywanie jałowego nośnika (drobno zmielony torf lub węgiel brunatny),
– mieszanie biomasy bakterii z nośnikiem i konfekcjonowanie szczepionki [26, 33, 40, 48].
W naszym kraju szczepionki rizobiowe, a także inne
preparaty mikrobiologiczne, dopuszczane są do obrotu
przez MRiRW po spełnieniu wymogów stosownej
procedury rejestracyjnej. Procedura ta, choć znacznie
łagodniejsza niż w przypadku rejestracji b.ś.o. roślin, jest
wystarczająco szczegółowa, ponieważ, oprócz danych na
temat składu, opisu procesu produkcyjnego i sposobu
stosowania produktu, wymaga także przedstawienia
wyników doświadczeń potwierdzających skuteczność
rejestrowanego biopreparatu w praktyce. Z tego powodu
szczepionki zawierające bakterie symbiotyczne roślin
motylkowatych są biopreparatami o sprawdzonej efektywności i dobrej jakości po względem mikrobiologicznym [33, 41].
W odniesieniu do preparatów mikrobiologicznych,
a także innych produktów określanych jako środki
poprawiające właściwości gleby, rejestrowanych na
potrzeby rolnictwa ekologicznego, procedura rejestracyjna jest jeszcze bardziej łagodna, ponieważ nie stawia
ona wymogu prowadzenia badań potwierdzających skuteczność rolniczą tych produktów. Wykorzystują to niektórzy producenci lub dystrybutorzy różnych biopreparatów wprowadzając na rynek w naszym kraju produkty,
których efektywność i jakość z mikrobiologicznego
punktu widzenia są bardzo wątpliwe. Najbardziej znanym produktem w tej grupie jest preparat pochodzenia
japońskiego – tzw. Efektywne Mikroorganizmy (EM) i
różne jego modyfikacje (EM1, EM5, Ema) [16, 53, 54].
Pod względem mikrobiologicznym biopreparaty te nie
spełniają większości z wymienionych w tym artykule
wymogów stawianych rzetelnym produktom wykorzystywanym w ochronie i uprawie roślin. Na przykład,
nieznany jest skład gatunkowy drobnoustrojów wchodzących w skład EM-ów. Najczęściej podaje się tylko,
że składają się one z 80 gatunków mikroorganizmów
beztlenowych i tlenowych reprezentowanych przez
bakterie fermentacji mlekowej, bakterie fototroficzne,
promieniowce, drożdże i inne grzyby, ale brak jest jakiejkolwiek informacji na temat liczebności wymienionych
grup drobnoustrojów [16, 53]. Ponadto nieznane są
żadne oryginalne prace naukowe, w których opisano
pochodzenie mikroorganizmów wchodzących w skład
tych szczepionek, metody ich identyfikacji i namnażania
SKUTECZNE I NIESKUTECZNE PREPARATY MIKROBIOLOGICZNE STOSOWANE W OCHRONIE I UPRAWIE ROŚLIN
oraz wyniki badań wykazujących przydatność i skuteczność omawianych biopreparatów w praktyce. Preparaty EM produkowane są głównie w formie płynnych
zawiesin, o kwaśnym odczynie pH < 4,0) i rozprowadzane w szczelnie zamkniętych pojemnikach plastikowych o różnej objętości. Nie ulega wątpliwości, że
są to warunki niesprzyjające dłuższemu przeżywaniu
mikroorganizmów, zwłaszcza tlenowych. Potwierdzają
to wyniki badań autorów holenderskich, którzy stosując analizy DNA metodą PCR-DGGE stwierdzili niskie
liczebności bakterii w handlowym preparacie EM1, ale
po aktywacji tego preparatu liczebność bakterii wzrosła [51]. Autorzy ci stwierdzili ponadto, że różne serie
zarówno nieaktywowanych jak i aktywowanych produktów EM charakteryzowały się dużą zmiennością
pod względem zawartości w nich bakteryjnego DNA,
co świadczy o bardzo małej powtarzalności (stabilności)
tych preparatów. A oto w jaki sposób producenci i dystrybutorzy preparatu EM1 zalecają rolnikom uaktywnienie tego środka: do plastikowego pojemnika należy wlać
1 część (np. 1 litr) EM1, 1 część melasy trzcinowej jako
pożywki, oraz 23 części niechlorowanej wody, wymieszać, szczelnie zamknąć pojemnik i inkubować przez
około 7 dni. Jest rzeczą oczywistą, że w tych warunkach powtarzalność uzyskiwanych hodowli musi być
niska, a ponadto rolnicy używając niejałowej wody
i melasy oraz niejałowego pojemnika rozmnażają nie
tylko nieznane mikroorganizmy znajdujące się w EM-ach, ale także te które zawarte były w niejałowej wodzie,
w pojemniku, czy w powietrzu – a przecież mogą to być
nawet drobnoustroje szkodliwe.
Jeszcze więcej nierzetelności można stwierdzić odnośnie skuteczności EM-ów w praktyce rolniczej. Twórcy
i dystrybutorzy tych produktów prezentują je jako środki
o wręcz cudownych właściwościach (np. zawarte w nich
mikroorganizmy przeżywają w temp. ponad 700°C)
i skutecznych nie tylko w stymulowaniu wielu procesów mikrobiologicznych w glebach, ale także korzystnie
oddziaływających na wzrost i zdrowotność roślin oraz
poprawiających chemiczne i fizyczne właściwości gleb
[16, 53, 54]. A ponadto EM-y redukują emisję amoniaku
i innych odorów z obór i chlewni, przyspieszają proces
kompostowania nawozów naturalnych i resztek roślinnych oraz korzystnie wpływają na jakość uzyskiwanych
z tych materiałów kompostów. Niestety nie przedstawiają na to żadnych naukowo udokumentowanych,
rzetelnych i wiarygodnych wyników badań. Brak takich
publikacji doskonale ilustruje i potwierdza praca przeglądowa C o n d o r i wsp. [9]. Autorzy ci dokonując
przeglądu literatury światowej dotyczącej oddziaływania
EM-ów na plonowanie różnych roślin i właściwości gleb,
stwierdzili, że większość doświadczeń z pozytywnymi
wynikami badań przeprowadzono w krajach orientalnych (Pakistan, Indonezja, Thailandia), a wyniki tych
badań publikowano najczęściej w nierecenzowanych
325
materiałach z konferencji sponsorowanych przed producentów i dystrybutorów, a tylko nieliczne w czasopismach o niskim IF (Impact Factor). Natomiast żadne
z renomowanych czasopism naukowych o tematyce gleboznawczej, takich jak: European Journal of Soil Biology,
Geoderma, Soil Biology and Biochemistry, Soil Sc. Soc.
Am. Journal, czy Agriculture Ecosystems & Environment,
nie zamieściło na swoich łamach jakiejkolwiek pracy na
temat EM-ów. Bardzo ważna, krytyczna praca badaczy
holenderskich opublikowana w dobrym czasopiśmie
[51] wykazała nieskuteczność użytych w tych badaniach
preparatów EM.
Warto też dodać, że większość analizowanych przez
C o n d o r i wsp. [9] badań charakteryzowała się błędami metodycznymi (m.in. niewłaściwy obiekt kontrolny), przyczynkowością i brakiem analiz statystycznych.
Prawidłowe obiekty kontrolne zastosowano w badaniach polowych przeprowadzonych w Szwajcarii [34].
Wspomniano już wcześniej, że EM-y produkowane są
z wykorzystaniem melasy trzcinowej (jako pożywki dla
drobnoustrojów), która jest bogata w liczne składniki,
m.in. mikroelementy, mogące korzystnie oddziaływać
na wzrost roślin. Ponadto, preparat EM-ów to bardzo
kwaśna zawiesina. Dlatego w badaniach nad tym biopreparatem stosować należy dwa obiekty kontrolne; jeden
„zerowy” – bez EM-ów, a w drugim do opryskiwania
gleby lub roślin należy używać takiego samego płynu
(rozcieńczona zawiesina EM-ów) jak we właściwym
obiekcie badawczym, ale po zabiciu w nim mikroorganizmów lub po usunięciu mikroorganizmów w inny
sposób, np. przez filtrowanie. W 4-letnim doświadczeniu
polowym przeprowadzonym w warunkach szwajcarskich
zastosowano takie właśnie dwa obiekty kontrolne. We
wnioskach końcowych autorzy tego doświadczenia jednoznacznie stwierdzają, że preparaty EM-ów nie miały
istotnego wpływu ani na plony badanych roślin ani na
właściwości mikrobiologiczne gleby [34]. Podobne,
negatywne wyniki można znaleźć w większości (bardzo licznych) publikacji polskich autorów, pomimo że
w badaniach tych stosowano na ogół tylko jeden obiekt
kontrolny (bez EM-ów lub oprysk wodą). Na przykład,
D a c h i wsp. [13] nie stwierdzili żadnego wpływu
dodatku preparatu EM na proces kompostowania osadu
ściekowego, jakość uzyskanego kompostu obornikowego
czy na emisję gazów (CO2, amoniak). Także na podstawie
wyników innych badań krajowych, zarówno laboratoryjnych jak i polowych, można stwierdzić, że EM-y oraz
takie preparaty jak użyźniacz glebowy, Bactofil A czy
Phylozonit, stosowane doglebowo lub jako opryski na
liście, nie powodują istotnych przyrostów plonów badanych roślin uprawnych (kukurydza, pszenica, sałata) oraz
nie mają wpływu na właściwości mikrobiologiczno-biochemicznych gleby [22, 38, 44, 49, 53]. Na koniec warto
podkreślić, że autorzy ww. publikacji zagranicznych krytycznie analizują wyniki uzyskane przez innych badaczy
326
STEFAN MARTYNIUK
[9], a badania własne podsumowują jednoznacznymi
wnioskami, w tym przypadku wyraźnie podkreślają
w nich nieskuteczność preparatów EM [34, 51]. Czytając
publikacje krajowe dotyczące EM-ów i innych biopreparatów mikrobiologicznych ma się natomiast wrażenie, że
autorzy tych badań z góry zakładają pozytywne oddziaływania testowanych produktów i „na siłę” doszukują
się tych pozytywów. Na przykład, jeden z autorów napisał w streszczeniu (brak wniosków) swoich badań, że
EM-y (oraz inny preparat) spowodowały wzrost różnych
cech o taki a taki procent i dopiero w ostatnim zdaniu
dodał, że różnice te nie były istotnie statystycznie [38].
W podsumowaniu innych badań, przeprowadzonych
bez powtórzeń i bez analiz statystycznych, można przeczytać, że „Preparat mikrobiologiczny EM wykazywał
nieznaczny wpływ na różnorodność mikoflory nasion
grochu” [36], lub „Zastosowany oprysk biopreparatem
EM początkowo powodował spadek liczebności większości badanych grup fizjologicznych drobnoustrojów
oraz obniżenie aktywności badanych enzymów w glebie
a następnie obserwowano tendencje wzrostowe” [53].
I jeszcze jeden wniosek z kolejnych badań – „Zaprawianie ziarna pszenicy jarej preparatem EMR nie wpłynęło na wyższą procentową zawartość suchej masy
w korzeniach” [15]. Wyniki badań przeprowadzonych
przez autorów cytowanych publikacji świadczą, że ww.
preparaty mikrobiologiczne nie wykazują istotnego
wpływu ani na plonowanie roślin ani na właściwości
gleby. Badania nad wykorzystaniem różnych grup mikroorganizmów glebowych w praktyce rolniczej do podnoszenia żyzności gleb i plonowania roślin prowadzono już
od zarania rozwoju mikrobiologii glebowej. Na przykład, szczepionki zawierające bakterie symbiotyczne
roślin motylkowatych (bobowatych) stosowano już po
koniec XIX wieku [3, 5, 52]. Szczepionki te produkowane i stosowane są w wielu krajach także obecnie i jest
to właściwie jedyny przykład tak szerokiego wykorzystywania preparatów mikrobiologicznych w praktyce
rolniczej. Sukces ten związany jest m.in. z tym, że
szczepionki z bakteriami symbiotycznymi (rizobiami)
stosowane są najczęściej do otoczkowanie nimi nasion
roślin bobowatych. Taki sposób aplikacji ułatwia wprowadzenie dużej liczebności bakterii (103–106 komórek
na każde nasionko) bezpośrednio do strefy korzeniowej siewek roślin, zwiększając w efekcie szanse (konkurencyjność) bakterii szczepionkowych na zawiązanie
efektywnej symbiozy (brodawek) z korzeniami roślin.
Wprowadzanie biopreparatów mikrobiologicznych do
całej masy gleby na polu nie daje najczęściej żadnych
efektów. Próby takie prowadzono z wieloma grupami
drobnoustrojów glebowych, m.in. z bakteriami fosforolitycznymi, wolno żyjącymi w glebie asymilatorami N2
(Azotobacter spp.) i innymi [3, 5, 28, 39, 52]. Niska skuteczność szczepionek doglebowych związana jest, jak
już wspomniano w rozdziale 2, ze skomplikowanymi
interakcjami pomiędzy organizmami glebowymi, oraz
z oddziaływaniem bardzo zmiennych warunków pogodowych i abiotycznych właściwości gleb. Na przykład,
bakterie należące do rodzaju Azotobacter charakteryzują
się dużą wrażliwością na kwaśny odczyn gleby. Bakterie
te nie występują zwykle, lub ich liczebności są bardzo
niskie w glebach o pH poniżej 6,0 [28, 31]. Szczepienie
gleb kwaśnych nawet dużą masą preparatów zawierających omawiane bakterie nie może dać jakichkolwiek
efektów, ponieważ nie zasiedlą one tych gleb, a staną
się jedynie pożywieniem dla innych organizmów glebowych. Także szczepienie azotobakterem gleb o odczynie
sprzyjającym rozwojowi tych bakterii nie daje w warunkach produkcyjnych istotnych efektów pozytywnych, np.
w postaci przyrostu w glebach zawartości azotu czy plonów roślin, m.in. dlatego, że proces wiązania N2 wymaga
dużych ilości energii, której w glebie na ogół brakuje,
a jeśli jest to toczy się o nią intensywna konkurencja
[3, 20, 28, 31, 35]. Ponadto, należy pamiętać, że każda
gleba w warunkach naturalnych zasiedlona jest przez
mikroorganizmy, które w toku wielowiekowego procesu
glebotwórczego najlepiej przystosowały się do życia
w danej glebie i skolonizowały w niej wszystkie dostępne
i umożliwiające egzystencję „nisze” ekologiczne [9, 35,
51]. Drobnoustroje wprowadzane do gleby w postaci
szczepionek są zwykle eliminowane lub ich liczebność
redukowana jest do poziomu naturalnego. Trudności
w uzyskaniu istotnych efektów ze stosowania biopreparatów doglebowych wynikają także z prostych proporcji ilościowych. Na przykład, w jednym gramie gleby
można znaleźć od kilkudziesięciu milionów do miliarda komórek bakteryjnych, a w nawozach naturalnych
(gnojowica, obornik) ich liczebność przekracza nawet
1011 komórek w 1 gramie [30, 37, 51]. W przeliczeniu
na hektar biomasa mikroorganizmów waha się od kilku
do kilkunastu ton. Aby mikroorganizmy wprowadzane
do gleby w biopreparacie mogły rozwijać się i konkurować z tak ogromną biomasą drobnoustrojów glebowych,
należałoby stosować bardzo duże, nieopłacalne w praktyce, ilości biopreparatów oraz zmienić środowisko glebowe tak, aby faworyzowało ono rozwój wprowadzanego
organizmu. Oznaczając liczebność mikroorganizmów
w jednym z ww. biopreparatów stwierdziliśmy (dane
nieopublikowane), że w zalecanej dawce (1 l) na hektar
zawiera on mniej bakterii niż można znaleźć w 100 gramach gleby. Odpowiedź na pytanie, czy tak niewielka
zawartość drobnoustrojów w tym preparacie, w dodatku
nieprzystosowanych do życia w środowisku glebowym,
może w jakikolwiek sposób wpłynąć na właściwości
gleby i plonowanie roślin – wydaje się oczywista.
4. Podsumowanie
W pracy omówiono ogólne zasady produkcji i
oceny preparatów (szczepionek) mikrobiologicznych
stosowanych w ochronie roślin do ograniczania roz-
SKUTECZNE I NIESKUTECZNE PREPARATY MIKROBIOLOGICZNE STOSOWANE W OCHRONIE I UPRAWIE ROŚLIN
woju patogenów i szkodników (biologiczna ochrona),
zwłaszcza w rolnictwie integrowanym i ekologicznym,
oraz do stymulowania wzrostu i plonowania roślin.
Proces rejestracyjny biologicznych środków ochrony,
który jest dla wielu producentów tych środków zbyt
kosztowny i restrykcyjny, to jednak należy pamiętać, że
zapewnia on nie tylko bezpieczeństwo ich stosowania
(dla ludzi i środowiska), ale także powoduje, że b.ś.o.
są produktami rzetelnymi pod względem ich jakości
i zastosowania. W odniesieniu do preparatów mikrobiologicznych, a także innych produktów określanych
jako środki poprawiające właściwości gleby, przeznaczonych do stosowania w ekologicznej produkcji roślinnej,
procedura rejestracyjna jest bardzo łagodna. Wykorzystują to niektórzy producenci i dystrybutorzy różnych
biopreparatów wprowadzając na rynek w naszym kraju
produkty, których skuteczność i jakość z mikrobiologicznego punktu widzenia są bardzo wątpliwe. Bardziej
krytyczna ocena wyników badań nad tymi preparatami przyczyniałaby się do upowszechniania wśród ich
potencjalnych użytkowników rzeczywistej wartości tego
rodzaju produktów.
Piśmiennictwo
1. Alabouvette C.: Biological control of plant disease. (w) Biological Resource Management, red. E. Balazs, E. Galante, J.M. Lynch,
J.S. Schepers, D. Werner, J-P. Toutant , P.A. Werry, Springer,
Germany, 2000, s. 257–264
2. Al-Taweil H.I., Bin Osman M., Hamid A.A., Yusoff W.M.:
Development of microbial inoculants and the impact of soil
application on rice seedlings growth. Am. J. Agric. Biol. Sc. 4,
79–82 (2009)
3. Banerjee M.R., Yesmin L., Vessey J.K.: Plant growth-promoting
rhizobacteria as biofertilizers and biopesticides (w) Handbook
of Microbial Biofertilizers red. M.K. Rai, The Haworth Press
Inc., New York, 2006, s. 137–182
4. Barea J.M.: Rhizosphere and mycorrhiza of field crops. (w)
Biological Resource Management, red. E. Balazs, E. Galante,
J.M. Lynch, J.S. Schepers, D. Werner, J-P. Toutant , P.A. Werry,
Springer, Germany, 2000, s. 81–92
5. Bashan Y.: Inoculants of plant growth-promoting bacteria for
use in agriculture. Biotechnol. Adv. 16, 729–770 (1998)
6. Bethlenfalvay G.J.: Mycorrhizae in the agricultural plant-soil
system. Symbiosis, 14, 413–425 (1993)
7. Burd G.I., Dixon D.G., Glick B.R.: A plant growth-promoting
bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings. Appl.
Environ. Microbiol. 64, 3663–3668 (1998)
8. Compant S., Duffy B., Nowak J., Clement Ch., Barka A.: Use of
plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects.
Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951–4959 (2005)
9. Condor A.F., Perez P.G., Lokare Ch.: Effective Microorganisms:
Myth or reality Rev. Peru. Biol., 315–320 (2006) http//sisbib.
unmsm.edu.pe/BVrevistas/ biologia/14n2/pdf
10. Cook R.J.: Assuring the safe use of microbial biocontrol agents:
a need for policy based on real rather than perceived risk. Can.
J. Pl. Pathol. 18, 439–445 (1996)
327
11. Czaban J., Księżniak A., Paszkowski W.: An attempt to protect
winter wheat against Fusarium culmorum by the use of rhizobacteria Pseudomonas fluorescens and Bacillus mycoides. Pol.
J. Microbiol. 53, 175–182 (2004)
12. Czaban J., Wróblewska B.: Microbial transformation of cadmium in two soils differing in organic matter content and
texture. Pol. J. Environ. Stud. 14, 727–737 (2005)
13. Dach J., Wolna-Murawka A., Zbytek Z.: Wpływ dodatku efektywnych mikroorganizmów (EM) na przebieg procesu kompostowania i wielkość emisji gazowych. J. Res. Appl. Agrict. Eng.
54, 49–54 (2009)
14. Dahm H., Wrótniak-Drzewiecka W., Pauter A.: Microbial biofertilizers. (w) Physical, chemical and biological processes in
soils, red. L.W. Szajdak, A.K. Karabanow, Prodruk, Poznań,
2010, s. 537–547
15. Fałtyn U., Miszkieło T.: Wpływ efektywnych mikroorganizmów
(EMR) na zdolność kiełkowania ziarna pszenicy jarej. Zesz.
Nauk. Uniw. Przyrod. Wrocław, Rolnictwo, 568, 31–35 (2008)
16. Higa T.: Rewolucja w ochronie naszej planety. Fundacja – Rozwój SGGW, Warszawa, 2003, s. 1–152
17. Kabaluk T., Gazdik K.: Directory of Microbial Pesticides for
Agricultural Crops in OECD Countries. Agriculture and Agri-Food, Canada 2005, s. 242. http://dsp-psd.pwgsc.gc.ca/collection_2009/agr/A42-107-2007E.pdf
18. Kandele E., Murer E.: Aggregate stability and soil microbial
processes in a soil with different cultivation. Geoderma, 56,
503–513 (1993)
19. Kloepper J.W., Schroth M.N., Miller T.P.: Effects of rhizosphere colonization by plant growth-promoting rhizobacteria
on potato plant development and yield. Phytopathology, 70,
1078–1082 (1980)
20. Kobus J., Czaban J., Gajda A., Masiak D., Księżniak A.: Wheat
rhizosphere microflora and its effect on plant nutrition and
some pathogenic fungi. Part I. Changes of rhizobacterial populations with development of winter wheat. Rocz. Glebozn. 44,
45–53 (1993)
21. Kohl J., Fokkema N.: Strategies for biological control of necrotrophic fungal foliar pathogens. (w) Plant-microbe interactions
and biological control, red. G.J. Boland, L.D. Kuykendall, Marcel Dekker, Inc. New York, 1998, s. 49–88
22. Kucharski J., Jastrzębska E.: Rola efektywnych mikroorganizmów w kształtowaniu właściwości mikrobiologicznych gleby.
Inżynieria Ekologiczna, 12, 295–296 (2005)
23. Kurek E., Kobus J.: Korzystne i szkodliwe oddziaływanie mikroflory ryzosferowej na wzrost roślin. Post. Mikrobiol. 29, 103–123
(1990)
24. Kuś J., Jończyk K.: Rozwój rolnictwa ekologicznego w Polsce.
J. Res. Applic. Agricult. Eng. 54, 178–182 (2009)
25. Lipa J., Pruszyński S.: Stan wykorzystania metod biologicznych
w ochronie roślin w Polsce i na świecie. Prog. Pl. Prot./Post.
Ochr. Roślin, 50, 1033–1043 (2010)
26. Lupwayi N.Z., Olsen P.E., Sande E.S., Keyser H.H., Collins M.M.,
Singleton P.W., Rice W.A.: Inoculant quality and its evaluation.
Field Crops Res. 65, 259–270 (2000)
27. Lynch J.M.: Resilience of the rhizosphere to anthropogenic
disturbance. Biodegradation, 13, 21–27 (2002)
28. Maliszewska W.: Szczepienie roślin azotobakterem. Rocz. Nauk
Roln. 68, 3–51 (1953)
29. Mańka M.: Stan i perspektywy biologicznej ochrony drzew
przed chorobami w leśnictwie. Prog. Pl. Prot./Post. Ochr. Roślin,
50, 1089–1094 (2010)
30. Martyniuk S., Myśków W.: Development of some groups of
microorganisms in liquid cattle manure and farmyard manure
during their fermentation. Acta Microbiol. Polon. 26, 213–220
(1977)
328
STEFAN MARTYNIUK
31. Martyniuk S.: Systemy biologicznego wiązania azotu. Nawozy
i Nawożenie/Fertilizers and Fertilization, 1, 264–277 ( 2002)
32. Martyniuk S., Oroń J., Martyniuk M.: Diversity and numbers of
root-nodule bacteria (rhizobia) in Polish soils. Acta. Soc. Bot.
Polon. 74, 83–86 (2005)
33. Martyniuk S.: Wytwarzanie preparatów mikrobiologicznych
na przykładzie bakterii symbiotycznych roślin motylkowatych.
J. Res. Appl. Agrict. Eng. 55, 20–23 (2009)
34. Mayer J., Scheid S., Oberholzer H-R.: How effective are “Effective
microorganisms”? Results from an organic farming field experiment. (w) 16th JFOAM Organic World Congress, Modena,
Italy, 2008, s. 40–43. http//orgprints.org/14838
35. Nannipieri P., Falchini L., Landi L., Pietramellara G.: Management of soil microbiota (w) Biological Resource Management,
red. E. Balazs, E. Galante, J.M. Lynch, J.S. Schepers, D. Werner,
J-P. Toutant, P.A. Werry, Springer, Germany, 2000, s. 237–255
36. Okorski A., Majchrzak B.: Grzyby zasiedlające nasiona grochu
siewnego po zastosowaniu preparatu mikrobiologicznego EM
1. Prog. Pl. Prot./Post. Ochr. Roślin, 48, 1315–1318 (2008)
37. Panhurst C.E., Rogers S.L., Gupta V.S.R.: Microbial parameters
for monitoring soil pollution. (w) Environmental Biomonitoring, red. J.M. Lynch, A. Wiseman, Cambridge Univ. Press, UK,
1998, s. 46–69
38. Piskier T.: Reakcja pszenicy jarej na stosowanie biostymulatorów i absorbentów glebowych. J. Res. Appl. Agrict. Eng. 51,
136–138 (2006)
39. Rodriguez H., Fraga R.: Phosphate solubilizing bacteria and
their role in plant growth promotion. Biotech. Adv. 17, 319–339
(1999)
40. Smith R.S.: Legume inoculant formulation and application.
Can. J. Microbiol. 38, 485–492 (1992)
41. Sobiczewski P.: Bakterie wykorzystywane w produkcji roślinnej.
(w) Biotechnologia roślin, red. S. Malepszy, PWN Warszawa,
2009, s. 172–213
42. Strzelec A.: Symbiotyczne wiązanie azotu. Cz. I. Znaczenie bakterii symbiotycznych, ich występowanie w glebach i szczepionki
Rhizobium dla roślin motylkowatych. Post. Nauk Roln. 4, 17–30
(1988)
43. Stephens J.H.G., Rask H.M.: Inoculant production and formulation. Field Crop Res. 65, 249–258 (2000)
44. Sulewska H., Ptaszyńska G.: Reakcja kukurydzy uprawianej na
ziarno na stosowanie preparatów mikrobiologicznych. Pam.
Puł. 140, 271–285 (2005)
45. Tomalak M.: Rejestracja biologicznych środków ochrony roślin
w Europie – nowe perspektywy. Prog. Pl. Prot./Post. Ochr.
Roślin, 47, 233–240 (2007)
46. Tomalak M.: Rynek biologicznych środków ochrony roślin
i przepisy legislacyjne. Prog. Pl. Prot./Post. Ochr. Roślin, 50,
1053–1063 (2010)
47. Tomalak M., Sosnowska D., Lipa J.J.: Tendencje rozwoju metod
biologicznych w ochronie roślin. Prog. Pl. Prot./Post. Ochr.
Roślin, 50, 1650–1660 (2010)
48. Tompson J.A.: Legume inoculant production and control. (w)
Report on expert consultation on legume inoculants production and control, FAO, Rome, Italy, 1991 s. 15–32
49. Tyburski J., Łachacz A.: Efektywność środków ulepszających
gleby ciężkie w gospodarstwach ekologicznych. Sprawozdanie z badań podstawowych na rzecz rolnictwa ekologicznego
w zakresie upraw polowych metodami ekologicznymi, 2009.
http//www.uwm.edu.pl/wksir/systemy/raporty
50. Van Elsas J.D., Garbeva P., Salles J.: Effects of agronomical
measures on the microbial diversity of soils as related to the
suppression of soil-borne plant pathogens. Biodegradation, 13,
29–40 (2002)
51. Van Vliet P.C.J., Bloem J., de Goede R.G.M.: Microbial diversity,
nitrogen loss and grass production after addition of Effective
Microorganisms (EM) to slurry manure. Appl. Soil Ecol. 32,
188–198 (2006)
52. Vessey J.K.: Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil, 255, 571–586 (2003)
53. Wielgosz E., Dziamba Sz., Dziamba J.: Effect of application
of EM spraying on the populations and activity of soil microorganisms occurring in the root zone of spring barley. Pol.
J. Soil Sci. 43, 65–72 (2010)
54. http//www.emy.com.pl/mikroorganizmy
55. http//www.emgreen.pl