Oznaczenia zdolności adhezyjnych bakterii zawartych w

Oznaczenia zdolności adhezyjnych bakterii zawartych w

„Oznaczenia zdolności adhezyjnych bakterii
zawartych w złożonym preparacie probiotyku
do kultury nabłonka jelitowego Caco-2”.
„Oznaczenia zdolności adhezyjnych bakterii zawartych w złożonym preparacie
probiotyku do kultury nabłonka jelitowego Caco-2”.
Prof. dr hab. med. Jacek Piątek
Katedra Fizjologii Człowieka Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.
Kierownik Oddziału Chorób Wewnętrznych Szpitala w Jarocinie.
Streszczenie
Na rynku można spotkać coraz większą ilość produktów (leki,
suplementy diety) zawierających różne szczepy bakteryjne należące do probiotyków. Jednym z najważniejszych wykładników efektywności działania preparatów zawierających bakterie probiotyczne jest obok przeżywalności ich zdolność adhezji do nabłonka
jelitowego.
Cel pracy: Celem pracy było zbadanie adhezji bakterii zawartych
w złożonym z 9 różnych szczepów bakteryjnych preparacie (4 Lactobacillus, 3 Bifidobacterium, 1 Lactococcus, 1 Streptococcus) do
nabłonka jelitowego Caco-2.
Metodyka: Do oznaczenia właściwości adhezyjnych bakterii probiotycznych zawartych w badanym preparacie zastosowano dojrzałą 17-dniową kulturę nabłonka jelitowego Caco-2. Zawartość
preparatu probiotyku (4,5 x 109 kom.) zawieszono w 4,5 ml soli
fizjologicznej. Hodowlę mikroorganizmów założono na płynnym
podłożu MRS. Na podstawie wyników wcześniej przeprowadzonych doświadczeń obliczono objętość zawiesiny komórek zawierającą odpowiednio 5 x 106, 5 x 107, 5 x 108 komórek. Obliczone parametry: Stopień adhezji [%] = (ilość bakterii ulegających adhezji/ilości bakterii wprowadzanych na kulturę Caco-2)
x 100%, Ilość komórek bakterii związanych do powierzchni 1 komórki nabłonka jelitowego = (jtk/1kom Caco-2), jtk
(jednostka tworząca kolonię). Dawka bakterii = ilość komórek
bakterii użytych do adhezji przypadająca na pojedynczą komórkę
nabłonka jelitowego (jtk/1kom Caco-2).
Wyniki: Uzyskane wyniki wskazują, że szczepy bakterii probiotycznych zawarte w preparacie MULTILAC® posiadają zdolność adhezji
do komórek nabłonka jelitowego in vitro. Ilość związanych komórek
bakterii z komórkami Caco-2 była uzależniona od dawki preparatu. Największą efektywność adhezji obserwowano przy zastosowaniu największego inokulum wynoszącego 5,5 x 108 jtk/ml/9,6 cm2
tkanki nabłonkowej in vitro, co odpowiadało dawce 190 komórek
bakterii przypadających na jedną komórkę Caco-2. W tym przypadku adhezji do każdej komórki nabłonka jelitowego uległo około 157
komórek bakterii, co stanowiło 83,1±9,6% inokulum. Biorąc pod
uwagę kryteria opublikowane przez Candela i wsp. (2005) można
stwierdzić, że kombinacja mikroorganizmów zawartych w preparacie złożonym może być charakteryzowana jako silnie adhezyjna (3).
Wnioski: Biorąc pod uwagę dane literaturowe charakteryzujące właściwości adhezyjne pojedynczych szczepów probiotycznych,
można stwierdzić, że w mieszaninie zastosowanej w preparacie
złożonym MULTILAC®, szczepy bakterii wykazują wyższą skuteczność zasiedlania nabłonka jelitowego. Kombinacja bakterii probiotycznych zawartych w preparacie MULTILAC® może być charakteryzowana jako silnie adhezyjna.
Wstęp
Adhezją w sensie biologicznym nazywa się trwałe i nieodwracalne połączenie się komórki drobnoustroju z powierzchnią ciała
stałego. Zdolności adhezyjne bakterii probiotycznych są uważane
za jedną z najbardziej pożądanych cech tych drobnoustrojów. Ad-
2
hezja umożliwia mikroorganizmom i komórkom nabłonka bezpośredni kontakt, a zatem pozwala lepiej przeciwdziałać adhezji
patogenów. Duży stopień adhezji bakterii do nabłonka jelitowego
warunkuje długotrwałe ich przebywanie w przewodzie pokarmowym człowieka i tym samym przedłużony wpływ na jego zdrowie.
Dzieje się tak nawet wówczas, gdy adhezja bakterii ma charakter
przejściowy i nie kończy się trwałą kolonizacją jelit [2,10]. Szczepy wykazujące wysoką adhezyjność są skuteczne w zapobieganiu
i łagodzeniu ostrych biegunek. Z tego powodu badania nad zdolnościami adhezyjnymi bakterii, obok badań nad ich przeżywalnością w środowisku o niskim pH oraz w obecności żółci i enzymów
trawiennych, stanowią podstawowy etap w pracach naukowych
z tej dziedziny [13,18,19]. Najczęściej stosowanym modelem do
badań adhezji bakterii są jednowarstwowe kultury nabłonka jelitowego in vitro, szczególnie linii komórkowych Caco-2 i HT-29.
Kultury nabłonkowe, są biologicznie najbardziej zbliżone do nabłonka jelitowego in vivo, trudno uznać za łatwy model badawczy.
Ich hodowla wymaga specjalistycznej aparatury, jest długotrwała i
bardzo kosztowna [18].
Materiał i metodologia
Przygotowanie kultury nabłonka jelitowego Caco-2
Do oznaczenia właściwości adhezyjnych bakterii probiotycznych zawartych w preparacie MULTILAC® zastosowano dojrzałą
17-dniową kulturę nabłonka jelitowego Caco-2.
Ampułkę z komórkami Caco-2 (ECACC, 86010202), przechowywaną w atmosferze ciekłego azotu, rozmrożono i komórki przeniesiono do pożywki DMEM (Sigma) z 10% dodatkiem
płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Gibco), z 1% dodatkiem mieszaniny aminokwasów (Sigma) i gentamycyny (Gibco). Komórki
Caco-2 hodowano w butelkach o powierzchni wzrostu wynoszącej 25 cm2, inkubowano w temperaturze 37oC, w atmosferze zawierającej 5%CO2 i 95% powietrza. Hodowlę prowadzono do momentu uzyskania 80-90-procentowego pokrycia powierzchni. Następnie komórki usuwano z podłoża za pomocą roztworu trypsyny (0,25%) i wersenianu (Sigma) i przenoszono do nowego naczynia hodowlanego. Przed wykorzystaniem kultury Caco-2 do właściwego doświadczenia, wykonano dwa kolejne pasaże przez czas
siedmiu dni.
Przygotowane komórki przeniesiono do większej butelki hodowlanej o powierzchni wzrostu 75 cm2 i prowadzono hodowlę w warunkach standardowych, podanych powyżej. Po 4 dniach
hodowli uzyskano warstwę komórek pokrywająca w 80-procentach dostępną powierzchnię naczynia, odpowiednią do utworzenia modelu nabłonka jelitowego przeznaczonego do oznaczeń
adhezji bakterii probiotycznych obecnych w preparacie MULTILAC®. W tym celu komórki Caco-2 usunięto z powierzchni naczynia za pomocą roztworu trypsyno-wersenu, oznaczono ich żywotność przez barwienie błękitem trypanu, a liczebność metodą hemocytometryczną przy zastosowaniu komory Neubauera.
Uzyskane komórki Caco-2 wykorzystano do założenia hodowli przeznaczonych do oznaczenia procesu adhezji. Hodowle
prowadzono w naczyniach o powierzchni 9,6 cm2 (Falcon), przy
początkowej gęstości komórek wynoszącej 3,4 x 104 kom./cm2.
Hodowle komórek Caco-2 inkubowano przez 17 dni, wymieniając pożywkę co 24-48 godzin w zależności od stadium rozwoju
hodowli. Utrzymywano wyżej opisane standardowe warunki hodowli. Przebieg hodowli monitorowano przez obserwacje mikroskopowe.
Przed procesem adhezji dojrzałą warstwę komórek Caco-2
przemywano buforem fosforanowym (PBS, Sigma). Przed wykonaniem procesu adhezji, oznaczono ilość komórek Caco-2 zawartą
w naczyniu hodowlanym. Oznaczenie wykonano metodą hemocytometryczną dla trzech różnych hodowli.
Przygotowanie mikroorganizmów do procesu adhezji
Zawartość kapsułki MULTILAC® (4,5 x 109 kom.) zawieszono
w 4,5 ml soli fizjologicznej. Hodowlę mikroorganizmów założono na płynnym podłożu MRS (10 ml) przez wprowadzenie 100 μl
rozpuszczonej zawartości kapsułki MULTILAC®. Hodowlę inkubowano w temperaturze 37oC, w warunkach beztlenowych przez 20
godzin. Po inkubacji hodowlę mikroorganizmów wirowano (4500
rpm, 10 min.), a osad 2-krotnie przemywano solą fizjologiczną.
Na podstawie wyników wcześniej przeprowadzonych doświadczeń obliczono objętość zawiesiny komórek zawierającą odpowiednio 5 x 106, 5 x 107, 5 x 108 komórek.
Oznaczenie adhezji bakterii probiotycznych do kultury
nabłonka jelitowego
Komórki mikroorganizmów, w ilościach 5x106, 5x107, 5x108,
zawieszano w 1 mililitrze czystej pożywki DMEM (bez surowicy
i antybiotyków) i następnie wprowadzono na warstwę nabłonka
jelitowego. Każdą próbę wykonano w trzech powtórzeniach. Proces adhezji prowadzono przez 90 minut w temperaturze 37oC,
w atmosferze zawierającej 5%CO2 i 95% powietrza.
Po adhezji zawiesinę komórek bakterii niezwiązanych z nabłonkiem usuwano i nabłonek przemywano 3-krotnie buforem
PBS. W celu uwolnienia związanych bakterii od komórek nabłonka jelitowego, komórki Caco-2 lizowano za pomocą 1% roztworu Triton X-100 w PBS. Lizę komórek prowadzono na lodzie
przez 10 minut. Następnie lizaty przenoszono do naczyń wirówkowych i poddawano wirowaniu przy 4500 rpm, przez10 min.
Osad 2-krotnie przemywano PBS. Ostatecznie osad zawieszano w 1 ml soli fizjologicznej i wykonano posiew ilościowy celem
oznaczenia ilości mikroorganizmów adherujących do nabłonka
jelitowego in vitro.
Oznaczenie ilościowe mikroorganizmów wykonano metodą Kocha. Przygotowano rozcieńczenia dziesiętne w zakresie od
101 do 105. Z każdego rozcieńczenia posiewano materiał na trzy
równoległe płytki Petriego. Posiew wykonywano metodą zalewową przy zastosowaniu podłoża MRS. Hodowle mikroorganizmów
inkubowano w temperaturze 37oC, w warunkach beztlenowych
przez 48 godzin. Wykonano również oznaczenie gęstości komórek
bakterii w hodowli macierzystej wykorzystanej w badaniach procesu adhezji. Po inkubacji oznaczono ilość kolonii i obliczono liczbę
mikroorganizmów, które uległy adhezji do nabłonka jelitowego.
Na podstawie wyników oznaczeń obliczono również dawkę bakterii stosowaną przy oznaczaniu właściwości adhezyjnych, ilość bakterii związanych z nabłonkiem w odniesieniu do zastosowanego
inokulum (%), ilość bakterii związanych w stosunku do ilości komórek nabłonkowych.
Wyniki
Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach. Wyniki
zestawiono w tabelach.
Obliczone parametry:
Stopień adhezji [%] = (ilośc bakterii ulegających adhezji/ilości
bakterii wprowadzanych na kulturę Caco-2) x 100%,
Ilość komórek bakterii związanych do powierzchni 1 komórki nabłonka jelitowego = (jtk/1kom Caco-2),
Dawka bakterii = ilość komórek bakterii użytych do adhezji przypadająca na pojedynczą komórkę nabłonka jelitowego (jtk/1kom
Caco-2).
Tabela 1. Przed adhezją
Dawka bakterii
do adhezji /ml
Dawka bakterii
do adhezji/1 kom.Caco-2
5,5 x 106
1,9
5,5 x 107
19
5,5 x 10
190
8
Tabela 1. Po adhezji
Ilość bakterii
adherujących
% bakterii
adherujących
Ilość bakterii
związanych
/1 kom.Caco-2
2,48 x 106
45,5 (6,8) %
0,86
3,28 x 10
7
60,2 (1,7) %
11,3
4,53 x 108
83,1 (9,6) %
156,7
Dyskusja wyników
Uzyskane wyniki wskazują, że szczepy bakterii probiotycznych zawarte w preparacie MULTILAC® posiadają zdolność
adhezji do komórek nabłonka jelitowego in vitro. Ilość związanych komórek bakterii z komórkami Caco-2 była uzależniona od
dawki preparatu. Największą efektywność adhezji obserwowano przy
zastosowaniu największego inokulum wynoszącego 5,5 x 108 jtk/ml/
9,6 cm2 tkanki nabłonkowej in vitro, co odpowiadało dawce 190 komórek bakterii przypadających na jedną komórkę Caco-2. W tym
przypadku adhezji do każdej komórki nabłonka jelitowego
uległo około 157 komórek bakterii, co stanowiło 83,1±9,6%
inokulum. Biorąc pod uwagę kryteria opublikowane przez Candela i wsp. (3) można stwierdzić, że kombinacja mikroorganizmów zawartych w preparacie MULTILAC® może być charakteryzowana jako silnie adhezyjna. Mikroorganizmy probiotyczne zostały sklasyfikowane przez autorów w trzech grupach: (i)
szczepy nieadhezyjne, gdy adhezji do jednej komórki Caco-2 ulega
mniej niż 5 komórek bakterii, (ii) szczepy adhezyjne, gdy efektywność
adhezji wynosi od 5 do 40 komórek bakterii/1 komórkę Caco-2 i (iii)
szczepy silnie adhezyjne, gdy poziom adhezji przekracza 40 komórek bakterii związanych z 1 komórką nabłonka (3).
Dane literaturowe dotyczące właściwości adhezyjnych poszczególnych szczepów bakterii probiotycznych zawartych w preparacie
MULTILAC® są bardzo zróżnicowane. W zależności od źródła pochodzenia i dawki, różne szczepy bakterii wykazują odmienny poziom adhezji do nabłonka jelitowego. W przypadku bakterii Lactobacillus rhamnosus efektywność adhezji oszacowano na poziomie
7,2-14,4% (22) i 20% (14). Nieliczne dane wskazują na słabe właściwości adhezyjne niektórych szczepów L. rhamnosus określające
adhezję jako 0,2% komórek adherujacych, co odpowiadało 2 komórkom bakterii związanym z 1 komórką Caco-2 (9). Dla pojedynczego szczepu L. plantarum określono właściwości adhezyjne
na poziomie 6,7% (22), 80% (14), czy wyrażone jako 25 komórek
związanych z 1 komórką Caco-2 ( 3). Zbliżony poziom adhezji charakteryzował bakterie z rodzaju Bifidobacterium longum i Bifidobacterium lactis (ok. 20 bakterii/kom. Caco-2) (3). Gagnon i współautorzy (2003) stwierdzili, że bakterie z rodzaju B. bifidum i B. longum
ulegają adhezji w odpowiednio 3,2-4,2 i 4,6% w stosunku do zastosowanej dawki, wynoszącej 107 jtk/dołek/ml(7). Według Candela i in. (2008) niski potencjał do zasiedlana nabłonka jelitowego in
vitro posiadają bakterie L. acidophilus (ok. 5 kom. bakterii/1kom.
Caco-2)(3).
3
Wnioski
Biorąc pod uwagę dane literaturowe charakteryzujące właściwości adhezyjne pojedynczych szczepów probiotycznych można stwierdzić, że w preparacie złożonym z 9 szczepów bakterii probiotycznych
MULTILAC®, poszczególne szczepy bakterii wykazują wyższą skuteczność zasiedlania nabłonka jelitowego niż pojedyncze szczepy bakterii probiotycznych opisywane w literaturze. Kombinacja bakterii
probiotycznych zawartych w preparacie MULTILAC®
może być charakteryzowana jako silnie adhezyjna.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
4
Borritello SP, Hammes WP, Holzapfel W. Safety of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria. Clin Infect Dis 2003; 36: 775-78
Candela, M., Seibold, G., Vitali, B., Lachenmaier, S., Eikmanns, B.J., Brigidi, P., 2005. Realtime PCR quantification of bacterial adhesion to Caco-2 cells: competition between
bifidobacteria and enteropathogens. Search in Microbiology 156, 887–895.
Candela M, Perna F., Carnevali P., Vitali B., Ciati R., Gionchetti P., Rizzello F., Campieri M., Brigidi P. 2008. Interaction of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains
with human intestinal epithelial cells: Adhesion properties, competition against enteropathogens and modulation of IL-8 production. International Journal of Food Microbiology 125, 286–292.
De Simone C. Impact of prebiotics and probiotics on enteric flora. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005; 40: S40.
De Simone C. The role of probiotics in modulation of the immune system in man and in animals. Int J Immunother 1993; 1: 23-28
D’Souza AL, Rajkumar C, Cooke J, et al. Probiotics in prevention of antibiotic associated diarrhoea: meta-analysis. Br Med J 2002; 324: 1361-4.
Gagnon M., Kheadr E.E., Blay G., Fliss I. 2003. In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. International Journal of Food Microbology 92, 69– 78.
Goldin BR, Salminen S. Lactic acid bacteria and gut mucosal barrier function. Gastroenterology Inter 1998; 11: 69-73.
Gopal P.K., Prasad J, Smart J, Gill H.S. 2001. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic
activity against an enterotoxigenic Escherichia coli . International Journal of Food Microbiology 67, 207–216.
Isolauri E, Joensuu J, Suomalainem H. Improved immunogenicity of oral Dx RRV reassortant rotavirus vaccine by Lactobacillus casei GG. Vaccine 1995; 13: 310-312.
Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002
Mack DR, Michail S, Wei S. Probiotics inhibit gastropatogenic E.coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Amer J Phisiol 1999; 276: 941-950.
Marteau PR, de Vrese M, Cellier CJ, et al. Protection from gastrointestinal diseases with the use of probiotics. Am J Clin Nutr 2001; 73 (Suppl.): 430S-36S
Moussavi M., Adams M.C. 2010. An In Vitro Study on Bacterial Growth Interactions and Intestinal Epithelial Cell Adhesion Characteristics of Probiotic Combinations. Curr
Microbiol, 60:327–335
Perdigon G, De Macias MEN, Alvarez S. Effect of perorally administred lactobacilli on macrophage activation in mice. Infect Immun 1986; 53: 404-410.
Pothoulakis C, Kelly CP, Joshi MA. Sacharomyces boulardii inhibits Clostridium difficile toxin A binding and enterotoxicity in rat ileum. Gastroenterology 1993; 104: 1108 -1115
Rolfe RD. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. J Nutr 2000; 130: 396S-402S.
Sarem-Damerdjii LO, Sarem F, Marchal L. In vitro colonization ability of human colon mucosa by exogenous Lactobacillus strains. FESM Microbiol Lett 1995; 131: 133-137.
Silva M, Jacobus NV, Deneke C. Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain. Agents Chemother 1987; 31: 1231-1233.
Słownik podstawowych pojęć. Medycyna Praktyczna Pediatria 2005.
Szajewska H, Mrukowicz J. Probiotics in the treatment and prevention of acute infectious diarrhea in infants and children:a systematic review of published randomized, double
blind, placebo controlled trials. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001; 33:17-25.
Tuomola E.M, Salminen S.J. 1998. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures. International Journal of Food Microbiology 41, 45–51
Vanderbergh PAA. Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbal growth. FEMS Microbiol Rev 1993; 12: 221-238.
Van Niel C, Feudtner C, Garrison MM, et al. Lactobacillus therapy for acute infectious diarrhea in children: a meta-analysis. Pediatrics 2002;109:678-84.
Wilson KH, Perini I. Role of competition for nutrients in supression of Clostridium difficile by colonic mikroflora. Infect Immun 1988; 56: 2610-2614.