Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD103/FITC
Anti-Human CD11c/RPE
Anti-Human CD19/APC
Nr kat. TC665
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC665 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD103, CD11c i CD19.
Ekspresja CD103 zachodzi w komórkach T w błonach śluzowych oraz w aktywowanych limfocytach T
wykazujących również ekspresję CD8. W przebiegu niektórych nowotworów złośliwych, takich jak chłoniaki
z komórek T i białaczki włochatokomórkowe, w komórkach T zachodzi ekspresja CD103. Przeciwciała
przeciwko CD103 są użyteczne w ocenie przewlekłych białaczek z komórek B i chłoniaków z komórek T (1, 2).
Ekspresję CD11c wykazuje szereg różnych komórek, w tym granulocyty, monocyty, makrofagi, naturalne
komórki cytotoksyczne (NK), komórki dendrytyczne i komórki nowotworowe. Przeciwciała przeciwko CD11c są
użyteczne do wstępnej oceny zaburzeń proliferacji limfocytów B, np. białaczki włochatokomórkowej i
przewlekłej białaczki limfocytowej z komórek B (1, 3, 4).
CD19 jest najszerzej rozpowszechnionym markerem powierzchniowym swoistym dla linii komórkowych
limfocytów B i występuje na powierzchni niemal wszystkich limfocytów B, łącznie ze wczesnymi progenitorami
limfocytów B (5). Ekspresja CD19 utrzymuje się w limfocytach B, które przeszły zwyrodnienie nowotworowe (6).
Uważa się, że przeciwciała skierowane przeciwko CD19 mają kluczowe znaczenie we wstępnej ocenie ostrych
i przewlekłych zaburzeń proliferacji limfocytów (7).
Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych —
powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC665 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD103, klon Ber-ACT8, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD11c, klon KB90, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, klon HD37, sprzężone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty w TC665 wytworzono z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych izotypu IgG1 kappa.
Odczynnik TC665 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej
(BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL koniugatu dla
leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała anty-CD103, Ber-ACT8, opisano podczas warsztatów Fifth International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (5. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat
antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD103 została potwierdzona przez wiele
laboratoriów (8).
Przeciwciała anty-CD11c, KB90, opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and Conference on
Leucocyte Cell Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD11c została potwierdzona przez wiele laboratoriów (9).
Przeciwciała anty-CD11c, KB90, reagują z końcem C antygenu CD11c (10).
Przeciwciało anty-CD19, HD37, opisano podczas warsztatów Second, Third, Fourth and Fifth International
Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens (2., 3., 4. i 5. międzynarodowe
warsztaty i konferencje na temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD19
została potwierdzona przez wiele laboratoriów (11, 12). Przeciwciała anty-CD19, HD37, znakują ludzkie
limfocyty B w krwi obwodowej, szpiku kostnym i innych tkankach. Ponadto reakcje dodatnie z przeciwciałami
obserwowano w zaburzeniach proliferacji limfocytów B, tj. ostrej białaczce limfoblastycznej, przewlekłej
białaczce limfocytowej, białaczce włochatokomórkowej, chłoniakach limfoblastycznych (Burkitta), chłoniakach
centroblastycznych/ centrocytowych oraz rozlanych chłoniakach nieziarniczych (11, 12).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Przechowywanie
(113873-002)
Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności
tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać
dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić
TC665/PL/SSA/06.09.05 s.1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem, należy się
skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC665 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą
mieszadła wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie
wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne
w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do odczynnika ze sprzężonymi przeciwciałami. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem kontrolnym
dla TC665 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza, np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364, PBS w etapie 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, lub zostać
poddany badaniu w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Dzięki minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC ich połączenie
umożliwia wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(113873-002)
1.
van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves
MF, editors. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
2.
Kruschwitz M, Fritzsche G, Schwarting R, Micklem K, Mason DY, Falini B, et al. Ber-ACT8: New
monoclonal antibody to the mucosa lymphocyte antigen. J Clin Pathol 1991;44:636-45.
3.
Sánchez ML, Almeida J, Vidriales B, López-Berges MC, García-Marcos MA, Moro MJ, et al. Incidence of
phenotypic aberrations in a series of 467 patients with B chronic lymphoproliferative disorders: basis for
the design of specific four-color stainings to be used for minimal residual disease investigation. Leukemia
2002;16:1460-9.
4.
Marotta G, Raspadori D, Sestigiani C, Scalia G, Bigazzi C, Lauria F. Expression of the CD11c antigen in
B-cell chronic lymphoproliferative disorders. Leuk Lymphoma 2000;37:145-9.
5.
Pezzutto A, Dörken B, Rabinovitch PS, Ledbetter JA, Moldenhauer G, Clark EA. CD19 monoclonal
antibody HD37 inhibits anti immunoglobulin-induced B cell activation and proliferation. J Immunol
1987;138:2793-9.
6.
Sato S, Tedder TF. BC3. CD19 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5.
7.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
8.
Cepek KL, Wong DA, Brenner MB, Springer TA. AS7/8.4. CD103 (E) cluster report. In: Schlossman SF,
Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell
TC665/PL/SSA/06.09.05 s.2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
differentiation antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7;
Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. p. 1666-7.
9.
Hogg N. AS4. CD11c workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert
SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens.
Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New
York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 347-8.
10.
Luk J, Luther E, Diamond MS, Springer TA. AS5.9. Subunit specificity and epitope mapping of Mac-1 and
p150,95 mAb using chimeric CD11b X CD11c transfectants. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W,
Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA.
Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. Volume 2. p. 1599-1601.
11.
Nadler LM. B cell/leukemia panel workshop: summary and comments. In: Reinherz EL, Haynes BF,
Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on
Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg,
Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 3-43.
12.
Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies.
In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the
2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston,
USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
(113873-002)
t
o
s
o
w
a
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC665/PL/SSA/06.09.05 s.3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17