RECEPTORY I TRANSPORTERY AMIN BIOGENNYCH W

&ARM0RZEGL.AUK†
2%#%04/29)42!.30/24%29!-).")/'%..9#(7|/ˆ93+5
702:%")%'5.!$#)g.)%.)!).$5+/7!.%'/#)~ˆ~
)#5+2:9#9#)~ˆ/7%*
2%#%04/23!.$42!.30/24%23/&")/'%.)#!-).%3
).0,!#%.4!#/-0,)#!4%$7)4(02%'.!.#9).$5#%$(90%24%.3)/.
!.$02%'.!.#9$)!"%4%3
!GNIESZKA7IÃCŒAWEK(ELENA3ŒAWSKA*USTYNA3ZOTA
'RA˜YNA*ANIKOWSKA!LEKSANDER/WCZAREK
%WA0LUCIÊSKA5RSZULA-AZUREK
+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJ+ATEDRAI+LINIKA'INEKOLOGIII0ERINATOLOGII
:AKŒAD#HEMII!NALITYCZNEJ:AKŒAD3TATYSTYKIgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Patofizjologia nadciśnienia indukowanego ciążą (PIHpregnany induced hypertension) i cukrzycy ciążowej
(GDM- gestational diabetes mellitus) nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Kluczową rolę w rozwoju analizowanych zaburzeń odgrywają aminy biogenne, których transport i sygnalizacja receptorowa odbywają się
w tkance łożyska.
Celem pracy jest ocena aktywności transkrypcyjnej genów kodujących receptory i transportery amin biogennych (adrenaliny, noradrenaliny, dopaminy i serotoniny)
w łożysku w grupie kobiet ciężarnych z rozpoznanym
nadciśnieniem indukowanym ciążą oraz w grupie kobiet
w przebiegu cukrzycy ciążowej w porównaniu do grupy kontrolnej metodą mikromacierzy oligonukleotydowych.
Uzyskane wyniki wykazały, iż znaczące statystycznie
różnice dotyczą ekspresji genów kodujących transporter
NET (norepinephrine transporter) w obu grupach badanych i ekspresji receptora ADR B2 (adrenergic, beta-2-,
receptor) w grupie nadciśnienie ciążowego w stosunku
do grupy kontrolnej. Wyniki te wskazują, iż receptory
i transportery amin biogennych zajmują szczególne miejsce w patogenezie PIH i GDM.
Słowa kluczowe: nadciśnienie ciążowe, cukrzyca ciążowa, transporter noradrenaliny, receptor adrenergiczny,
mikromacierze oligonukleotydowe
Summary
The pathophysiology of pregnancy induced hypertension
and pregnancy diabetes is yet not quite explained. Crucial
role in these pathologies plays biogenic amines, which
transport and receptor signalling occurs in placenta tissue.
Aim of his study is transcription activity evaluated of
the genes encoded receptors and transporters of biogenic
amines (epinephrine, norepinephrine, dopamine, serotonin) in placentas women complicated with pregnancy
induced hypertension, pregnancy diabetes, comparison to
control group by using microaray method.
Obtained results suggest, that statistical significance concern genes encoded NET transporters, in both testing
groups, and ADR B2 receptor in pregnancy induced hypertension in comparison to control group
These results indicate that receptors and transporters of
biogenic amines are very important in pathogenesis of
PIH and GDM.
Key words: pregnancy induced hypertension, gestational
diabetes mellitus, norepinephrine transporter, adrenergic
receptor, oligonucleotide microarray
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
' "Õ
Istotnymi patologiami, które towarzyszą ciąży są nadciśnienie ciążowe oraz cukrzyca ciążowa. W Polsce rok
rocznie obserwuje się około 30 tysięcy nowych zachorowań
u kobiet ciężarnych na tę postać nadciśnienia, co daje ogółem 5-10% występowanie tej patologii [1]. Z kolei cukrzyca
ciąża wikła około 3-5% ciąż [2].
Nadciśnienie ciążowe zawiera w sobie nadciśnienie tętnicze przewlekłe, które rozwinęło się i zostało rozpoznane
jeszcze przed zajściem w ciąże lub przed 20 tygodniem ciąży, stan przedrzucawkowy i rzucawkę (z białkomoczem),
które zazwyczaj występują po 20 tygodniu ciąży, stan przedrzucawkowy nałożony na przewlekłe nadciśnienie tętnicze
oraz nadciśnienie tętnicze ciążowe wykryte po 20 tygodniu
ciąży bez białkomoczu [3].
Termin nadciśnienie indukowane ciążą jest zbiorczym
terminem zawierającym w sobie nadciśnienie tętnicze ciążowe i stan przedrzucawkowy [4].
Jak pokazują dane literaturowe wśród zaburzeń o charakterze metabolicznym cukrzyca jest najistotniejszym
zaburzeniem tego rodzaju dotykającym kobiety ciężarne
i jeśli zostało ono po raz pierwszy rozpoznane w czasie ciąży określamy je terminem cukrzycy ciążowej –GDM [2].
W tym miejscu należy podkreślić, iż cukrzyca ciążowa
stanowi istotny czynnik predysponujący wystąpienie nadciśnienia indukowanego ciążą [5], czego potwierdzeniem
mogą być wyniki prezentowane w niniejszej pracy.
Wśród licznych spekulacji dotyczących patomechanizmu nadciśnienia indukowanego ciążą sugeruje się, iż tkanka łożyskowa, która jest ważnym miejscem syntezy i metabolizmu amin biogennych, zajmuje miejsce szczególne, tym
bardziej, iż jedynym, w pełni skutecznym na chwilę obecną
sposobem leczenia tej postaci nadciśnienia jest terminach
ciąży [6-9].
Szczególnie istotne w rozwoju PIH są geny kodujące
receptory i transportery amin biogennych, których zmiany
w ekspresji obserwowane są w przebiegu tej postaci nadciśnienia [9-12]. W licznych danych literaturowych spotyka
się skorelowanie występowania nadciśnienia indukowanego
ciążą z obniżoną ekspresją transporterów katecholowych
amin biogennych [9, 13].
Powikłania, które towarzyszom nadciśnieniu indukowanemu ciążą dotyczą zarówno organizmu matki, jak i płodu. Do nich zalicza się: rzucawkę porodową, niewydolność
krążeniowo-oddechową, przedwczesne odklejenie łożyska,
zespół wykrzepiania wewnątrznaczyniowego oraz powikłanie o największej śmiertelności wśród wymienionych
– udar krwotoczny mózgu. Konsekwencje dla płodu wiążą się
w głównej mierze ze zmniejszoną masą urodzeniową (zahamowanie wewnątrzmacicznego rozwoju płodu) na skutek
zmniejszonej łożyskowej perfuzji, a przypadku cukrzycy
ciążowej powikłania koncentrują się wokół nadmiernej
masy urodzeniowej, makrosomii, dystocji barkowej, zespołu zaburzeń oddechowych, żółtaczki, hipoglikemii, czasem
cukrzyca ciążowa prowadzi także do urodzeń martwych
płodów [1, 5].
U kobiet ciężarnych należy pamiętać, iż GDM często
jest stanem na bazie, którego wraz z rozwojem ciąży powstaje PIH [5].
Wobec takiego faktycznego stanu rzeczy poznanie patomechanizmu PIH wydaje się być w pełni uzasadnione.
"ŸŸ")
Materiał do badań stanowiły fragmenty tkanki łożyska pobrane od kobiet w trakcie zabiegu cięcia cesarskiego. Grupy badane
stanowiły pacjentki z rozpoznanym nadciśnieniem indukowanym ciążą (grupa I, n=6) oraz pacjentki z cukrzycą ciążową (grupa II, n=5). Grupę kontrolną stanowiły kobiety o prawidłowym
przebiegu ciąży pod względem ciśnienia tętniczego i metabolizmu węglowodanów, a cięcia cesarskiego dokonano z powodów
okulistycznych czy też z powodu wąskiej miednicy
Analizę molekularną rozpoczęto od ekstrakcji całkowitego RNA przy użyciu odczynnika TRIZOL (Invitrogen)
i oczyszczonego z wykorzystaniem kolumienek Rneasy Mini
Spin Kolumn i zestawu odczynników RNease–Free Dnase
Set zawierającego DNazę I i bufor RDD (Qiagen). Ocenę jakościową ekstraktów przeprowadzono metodą elektroforezy
agarowej a ilościowo techniką spektrofotometrii, przy użyciu
spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech).
Wyznaczanie transkryptomu przeprowadzono techniką
mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HGU 133A (Affymetrix) zgodnie z protokołem producenta. Sygnały fluorescencji na płytce odpowiadające 22283
mRNA odczytano przy użyciu skanera Agilent GeneArray
Scanner G2500A (Agilent Technologies, Kalifornia, USA).
Otrzymane wyniki zapisano i zarchiwizowano w programie
Microarray Suite. Analizę porównawczą transkryptomów
przeprowadzono wykorzystując programy komputerowe:
Statistica v.6,0, Excel oraz: Microarray Suite v.5,0, SAM (significance analysis of microarrays), program RMA Express
oraz program do analizy danych QRT–PCR ABI Prism 7000
SDS Software. Typowanie transkryptów różnicujących wycinki łożysk patologicznych od prawidłowych, przeprowadzono zmodyfikowaną do potrzeb danych z mikroamcierzy
metodą statystyczną opracowaną przez Blanda i Altmana
opisaną w 1986 roku. Metoda bazuje na obliczeniu współczynika SLR (signal log ratio) określającego logarytm różnicy intensywności fluorescencji mikromacierzy jednej grupy względem mikromacierzy grupy drugiej
2 bi ,
SLR b a log
i
i
2
2 ai
gdzie, –i-oznacza transkrypt na mikromacierzy A,
–i transkrypt na mikromacierzy B.
Analizę porównawczą zakończono oceną statystyczną
otrzymanych wyników przeprowadzoną w programie SAM,
wykorzystującym analizę wariancji dwóch niezależnych
prób. Wykorzystany test T Studenta został wzbogacony analizą permutacji (parametr Score), natomiast prawdopodobieństwo przypadowości obserwowanych różnic oceniona na
podstawie współczynnik Q. Jest on wyrażony w procentach.
O istotnych statystycznie różnicach decyduje Q<5% parametr
score>3. (przy wzroście wariancji, współczynnik Q maleje).
')
Porównanie transkryptomów rozpoczęto od normalizacji wyników w programie RMA Express, mającej na celu
wyeliminowanie różnic w intensywności fluorescencji po-
&ARM0RZEGL.AUK
nie ekspresji NET (nadciśnienie/kontrola
p=0.017, cukrzyca/kontrola, p=0.025) w obu
grupach badanych w porównaniu do grupy
kontrolnej oraz obniżenie ekspresji ADRA
B2 (p=0,025) pomiędzy grupą cukrzycy
ciążowej, a grupą kontrolną. Zmiany te
nie dotyczą porównania grupy nadciśnienia względem cukrzycy ciążowej. Dla potwierdzenia zdolności różnicowania NET
i ADRA B2 zastosowano metodę wektorów
nośnych (SVM, suport vector machines),
której rezultaty są wysoce zbieżne z analizą
Blanda-Altmana.
) # Problem groźnych w skutkach powikłań, których występowanie w przebiegu
nadciśnienia indukowanego ciążą dotyczy
zarówno organizmu matki, jak i organizmu
dziecka jest jedną z głównych przyczyn
umieralności okołoporodowej kobiet ciężarnych i płodów. Chan i wsp. określają nadciśnienie indukowane ciążą, a szczególnie
stan przedrzucawkowy jako jednostkę choRycina 1
robową wieloukładową dotyczącą wątroby,
Geny związane z aktywnością biologiczną amin biogennych
układu nerwowego, układu krzepnięcia,
NET–transporter dla noradrenaliny, DAT –transporter dla dopaminy, SERT–trannerek, ale przede wszystkim struktury łożysporter dla serotoniny, VMAT1– pęcherzykowy transporter monoamine 1, OCT
ska, które jest istotnym organem odpowie1–3 transportery jonów organicznych , ADRA– receptory adrenergiczne, DRD–
receptory dopaminowe, HTR– receptory serotononowe, PAH– hydroksylaza fenydzialnym za katabolizm oraz syntezę amin
loalaninowa, TH– hydroksylaza tyrozynowa, DDC– dekarboksylaza aminokwasów
biogennych. Badania wskazujące podwyżaromatycznych, MAOA– oksydaza monoaminowa A, COMT– metylotranferazy O–
szony poziom stężenia amin biogennych
katecholowa, DBH– β–hydroksylazy dopaminowa, PNMT – N–metylotransferaza
w przebiegu stanu przedrzucawkowego [15]
fenyloetanoloaminowa, TPH1– hydroksylaza tryptofanu, MAO B– oksydaza mosugerować mogą, iż stan ten, jak i ogólnie
noaminowa B, CYP– cytochrom P–450, ALDH– dehydrogenaza aldehydowa,
AANAT– N – acetylotransferaza serotoniny, ASMT – acetyloserotonino – O –
nadciśnienie indukowane ciążą, może być
metylotransferaza, ASMTL– acetyloserotonino – O – metylotransferaza, AOX1–
związane z nasiloną biosyntezą lub zmniejoksydaza aldehydowa 1
szonym katabolizmem amin biogennych.
Stosunkowo nowo opisywaną w literaturze
funkcję metaboliczną tkanki łożyska przymiędzy analizowanymi mikromacierzami wynikających
pisuje
się
występującym
w tym narządzie transporterom
z różnego czasu przeprowadzenia eksperymentu, czy
amin
biogennych.
Białka
te,
umożliwiają wychwyt krążąteż różnic związanych z poziomem tła fluorescencji
cych
w
osoczu
amin,
dzięki
czemu
utrzymywana jest wedanej mikromacierzy. Następnie z 22283 mRNA dokownątrzmaciczna
równowaga
0.
Nguyen
i wsp. sugerują, że
nano selekcji transkryptów związanych z aktywnością
głównym
mechanizmem
warunkującym
oczyszczanie krwi
biologiczną adrenaliny, noradrenaliny, dopaminy i sez
amin
biogennych
podczas
ciąży
jest
mechanizm
zależny
rotoniny (ryc. 1). Wyboru tych transkryptów dokonano
od
transporterów,
zabezpieczający
płód
przed
szkodliwym
na podstawie zebranych danych literaturowych oraz informacji dostępnych w internetowych bazach danych, a działaniem wysokich stężeń krążących amin biogennych
następnie poszukiwano transkyptów związanych z ak- 0. Tylko całościowe spojrzenie na cząsteczki uczestniczątywnością biologiczną amin biogennych o potencjale ce w aktywności amin biogennych może stanowić podstaróżnicującym łożyska kobiet z nadciśnieniem induko- wę do oceny udziału amin biogennych w zmianach patowanym ciążą oraz cukrzycą ciążową w porównaniu do logicznych indukowanych nadciśnieniem ciążowym.
łożysk pobranych od kobiet o prawidłowym przebiegu W przedstawionej pracy całościowe spojrzenie obejmociąży (grupy kontrolnej). Zastosowana metoda Blanda- wało transkryptom wyznaczony techniką mikromacierzy
Altmana umożliwiła wyłonienie genów różnicujących oligonukleotydowych HGU133A (Affymetrix). Analizą
obie patologie względem grupy kontrolnej. Wśród ana- zostały objęte geny, które kodują białka związane z: translizowanych genów kodujących receptory i transportery portem i metabolizmem amin biogennych oraz geny koamin biogennych znaczące są geny kodujące transporter dujące receptory amin biogennych i białka uczestniczące
dla NEToraz receptor adrenergiczny ADRA 2C i ADR w sygnalizacji komórkowej regulowanej przez aminy
B2 (rys. 2 i 3, tabela 1 i 2). Analiza istotności statystycz- biogenne. Otrzymane wyniki wskazują na znaczący udział
nej testem U-Manna Withneya wykazała znaczące obniże- w obsewrwowanej patologii genów NET i MAOB.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
PIŚMIENNICTWO
[1] K. Kawecka-Jaszcz W. Lubaszewski.
„Nadciśnienie tętnicze w ciąży.” Przewodnik
Lekarza, 6:120-124, 2003.
[2] Standardy Polskie Towarzystwa Ginekologicznego postępowania u kobiet z cukrzycą,
2005:. www.gpsk.am.poznan.pl
[3] M. Mazanek-Mościcka, K. Kawecka-Jaszcz,
„Podwyższone ciśnienie tętnicze u kobiet w ciąży”. Medycyna Praktyczna, 4: 39-68, 2001.
[4] C.G. Solomon, E.W. Seely. Hypertension in
Pregnancy. Hypertension, 37: 232-239, 2001..
[5] C.l. Bryson, G.N. Ioannou, S.J. Rulyak,
C. Critchlow. Association between gestational
diabetes and pregnancy-induced hypertension.
Am J Epidemiol, 158: 1148-1153, 2003.
[6] J.P. Granger i wsp., Patophysiology of
Pregnancy-Induced Hypertension. Am J Hypertens, 14: 178-185., 2001.
Rycina 2
Typowanie genów różnicujących łożyska kobiet z nadciśnieniem indukowanym [7] P. Ian, S.E. Kjeldsen, I. Eide, N. Norman.
ciążą od łożysk pobranych od kobiet o prawidłowym przebiegu ciąży.
“Adrenaline and Preeclampsia”. Acta Medica
MAOB–transkrypt monoaminooksydazy B, CYP1A1–transkrypt cytochromu Scandinavica. Supplementum,693:29-32., 1985.
P–450, rodziny 1, podrodziny A, polipeptydu 1, ALDH1A2–transkrypt dehydroge[8] S. Tenhola i wsp. “Blood Pressure, serum lipids,
nazy aldehydowej rodziny 1, przedstawiciela A2, CYP19A1–transkrypt cytochromu P–450, rodziny 19, podrodziny A, polipeptydu 1, NET–transkrypt transportera fasting insulin and adrenal hormones in 12-year-old
children born with maternal preeclampsia”. J Clin
dla noradrenaliny, ADRA2C–transkrypt receptora adrenergicznego α 2C.
Endocrinol Metab, 88: 1217-1222, 2003.
[9] B. Bottalico i wsp. “Norepinephrine transporter (NET), serotonin transporter (SERT),
vesicular monoamine transporter (VMAT2)
and organic cation transporters (OCT1, 2 and
EMT) in human placenta from pre-eclamptic
and normotensive pregnancies”. Placenta,
25:518-29, 2004.
[10] T.T .Nguyen i wsp. “Placental biogenic
amine transporters: in vivo function, regulation and pathobiological significance”, Placenta, 20:3-11, 1999.
[11] MA Elwan, T Ishii, N.Sakuragawa “Characterization of dopamine D2 receptor gene
expression and binding sites in human placenta amniotic epithelial cells”, Placenta.,
24:658-63, 2003.
[12] P. Oian. i wsp. “Adrenaline and preecuśredniony sygnał fluorescencji
lampsia”. Acta Medica Scandinavica. Supplementum; 693:29-32, 1985..
Rycina 3
[13] L. Bzoskie i.wsp. “Human placental noGeny różnicujące łożyska pobrane od kobiet z cukrzycą ciążową od łożysk pobrarepinephrine transporter mRNA: expression
nych od kobiet z prawidłowym przebiegiem ciąży.
MAOB–transkrypt monoaminooksydazy B, ALDH1A2–transkrypt dehydrogena- and correlation with fetal condition at birth”.
zy aldehydowa rodziny 1, przedstawiciela A2, CYP19A1–transkrypt cytochromu Placenta. 18::205-210, 1997.
P–450, rodziny 19, podrodziny A, polipeptydu 1, NET–transkrypt transportera dla [14] Manyona LT, Slater DM, Fenske C, Hole D, Choy
noradrenaliny, ADRA2C–transkrypt receptora adrenergicznego α 2C, ADRB2– MJ, Wilson C. A role for noradrenaline in pre-eclapsia:
transkrypt receptora adrenergicznego β2
towards a unifying hypothesis for the pathophysiology, Br J Obstet Gynaecol 1998; 105: 641–648
[15] Bolte AC, van Geijn HP, Dekker GA, Pathophysiology
of preeclampsia and the role of serotonin, Eur J Obstet
Gynecol Reprod Biol 2001; 95: 12–21.
[16] Nguyen TT, Tseng YT, Mc.Gonnigal B et al. Placental
biogenic amine transprters: in vivo function, regulation
andpathobiological sigificance.Placn
&ARM0RZEGL.AUK
Grupa transkryptów
Transportery
Metabolizm
Transkrypt
Różnicujący
NET
216611_s_at
MAOB
204041_at
Istotność statystyczna
Test
Test T
U-Manna
(Q)
Withneya (p)
Score
SLR
2 SLR
↑↓
PIH/C
0,02
0
2,9
-0,869
1,615
↓
0,038
8,125
1,88
-1,1
2,14
↓
Tabela 1
Transkrypty różnicujące wśród transkryptów kodujących receptory, transportery oraz związanych z metabolizmem amin biogennych wyznaczone w oparciu o metodę Blanda i Altmana oraz metodę SAM pomiędzy grupą nadciśnienia indukowanego ciążą i grupą kontrolną
Grupa transkryptów
Transportery
Metabolizm
Transkrypt
różnicujący
NET
215303_s_at
MAO B
204041_at
ALDH1A2
207016_s_at
Istotność statystyczna
Test
U-Manna
Test T
Withneya
(Q)
(p)
Score
SLR
2 SLR
↑↓
GDM/C
0,05
0
2,33
-0,999
1,99
↓
0,10
0
3,16
-1,11
2,16
↓
0,05
0
3,63
-1,64
3,12
↓
Tabela 2
Transkrypty różnicujące wśród transkryptów kodująyche receptory, transportery oraz związanych z metabolizmem amin biogennych
wyznaczone w oparciu o metodę Blanda i Altmana oraz metodę SAM pomiędzy cukrzycy ciążowej, a grupą kontrolną
Adres do korespondencji:
Dr Agnieszka Więcławek
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej
Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-206 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1