mueller - hinton 56137- 63824 - Bio-Rad

mueller - hinton 56137- 63824 - Bio-Rad

MUELLER - HINTON
56137- 63824 - 63901- 64884 - 64888
MUELLER – HINTON + SHEEP BLOOD
63825 - 63902
MUELLER – HINTON + HORSE BLOOD + β-NAD
63524
PODŁOŻE DO OZNACZANIA WRAŻLIWOŚCI BAKTERII NA ANTYBIOTYKI
1. ZASTOSOWANIE
Podłoże agarowe Mueller-Hinton jest wystandaryzowanym podłożem, zalecanym do oznaczania wrażliwości na antybiotyki
bakterii metodą rozcieńczeń w agarze oraz metodą dyfuzyjno-krążkową.
2. ZASADA METODY
W celu uzyskiwania wiarygodnych wyników, podłoże Mueller Hinton wymaga standaryzacji i ściśle określonych stężeń CaCl2,
MgCl2 i ZnCl2, jako że zmiany stężenia kationów Mg+2 oraz Ca+2 mają wpływ na otrzymywane wyniki (wielkość strefy
zahamowania lub wartość MIC) dla pałeczek Pseudomonas aeruginosa na aminoglikozydy i karbapenemy oraz wrażliwości
gronkowców na tetracykliny(3, 4, 5, 6).
Niskie stężenie tymidyny redukuje zjawisko podrostu wokół krążków: trimetoprim/sulfonamid oraz trimetoprim.
3. POSTAĆ PODŁOŻA
•
•
•
•
•
Podłoże gotowe do użycia:
okrągłe płytki Petriego 20 x 90 mm (MH)
nr kat. 63824
kwadratowe płytki Petriego 10 x 120 mm (MH)
nr kat. 63901
Podłoże gotowe do użycia (do rozpuszczenia):
butelki 6 x 200 ml (MH)
nr kat. 56137
Podłoże w proszku
500 g
nr kat. 64884
5kg
nr kat. 64888
Podłoże z krwią owczą, gotowe do użycia:
- okrągłe płytki Petriego 20 x 90 mm (MHB)
nr kat. 63825
- kwadratowe płytki Petriego 10 x 120 mm (MHB)
nr kat. 63902
Podłoże z krwią końską, suplementowane β-NAD, gotowe do użycia:
- okrągłe płytki Petriego 20 x 90 mm (MHF)
nr kat. 63524
4. PODSTAWOWE SKŁADNIKI (g/l wody destylowanej)*
Podłoże Mueller-Hinton, z dodatkiem krwi lub bez, sporządzono wg składu podanego przez WHO91, 20
Peptony
Hydrolizat kazeiny
Agar
Ca2+
Mg2+
Końcowe pH:
Suplementy: + 5% krew barania (dla podłoża MHB) lub
5% krew końska (dla podłoża MHF)
β-NAD (wyłącznie dla podłoża MHF)
3.0
17.5
15
20-25 mg/ml
10-12.5 mg/ml
7.4 ± 0.2
20 mg/l
β-NAD: β-Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy
*skład zaadaptowany w celu podwyższenia jakości podłoża.
Przygotowanie podłoża:
Przed użyciem wstrząsnąć suche podłoże w pojemniku.
Rozpuścić 35 g suchego podłoża w 1 l świeżo destylowanej wody, dobrze wymieszać. Ogrzewać do zagotowania i całkowitego
rozpuszczenia.
Wysterylizować w autoklawie w temp. 121°C ± 1°C przez 15 minut. Rozlać w próbówki lub w butelki.
Przed użyciem upłynnić podłoże we wrzącej łaźni wodnej i całą zawartość butelki lub próbówek wylać na płytki Petriego.
Warstwa agaru powinna mieć grubość 4 mm. Wysuszyć płytki przez 30 minut w temp. 37°C. Aby uzyskać agar o grubości 4
mm, potrzeba 25 ml podłoża na płytkę o średnicy 90 mm, 60 ml na płytkę kwadratową 120 mm, 70 ml na płytkę okrągłą 150
mm.
Przed użyciem (przed rozlaniem) podłoże można uzupełnić:
•
5% krwią baranią lub końską, aby otrzymać podłoże MH z krwią
•
5% chlorkiem sodu (NaCl), aby otrzymać podłoże MH z 5% NaCl
1
5. PRZECHOWYWANIE
•
Podłoże gotowe do użycia: w temperaturze +2 do 20°C.
•
Podłoże gotowe do użycia (do rozlewania): w temperaturze +2 do 25°C.
•
Podłoże krwawe gotowe do użycia w temperaturze +2 do 8°C
•
Podłoże suche: w szczelnie zamkniętym pojemniku, w suchym miejscu, w temperaturze +15 do 25°C.
Data ważności i numer serii znajduje się na opakowaniu.
6. PROCEDURA
Materiał:
Materiał dostarczony: podłoże Mueller Hinton z dodatkiem lub bez krwi.
Materiał nie dostarczony:
•
Standard gęstości równy 0,5 MacFarlanda.
•
Sprzęt laboratoryjny konieczny do oznaczania antybiotykowrażliwości met. dyfuzyjno-krążkową.
Uwaga: Należy postępować zgodnie z najnowszymi wytycznymi (CLSI7, 8, CA-SFM9, lub EUCAST10, 11, 12). Zawsze stosuj się do
aktualnych zasad bezpieczeństwa pracy z czynnikami zakaźnymi.
Inokulacja:
Z czystej, młodej hodowli na agarze, przygotować zawiesinę bakterii, o gęstości 0.5 w skali McFarlanda. Protokół standaryzacji
inokulum w metodzie rozcieńczeń w agarze i w metodzie dyfuzyjno-krążkowej opisano w szeregu wytycznych opublikowanych
przez CLSI, CA-SFM, oraz EUCAST.
Jeśli podłoże jest przechowywane w temp. +4°C, przenieść je przed użyciem do temp. pokojowej (+18-30°C). Jeśli na
powierzchni występuje woda kondensacyjna, przed użyciem wysuszyć płytki 10-30 minut w cieplarce w temp. 35°C.
METODA DYFUZYJNO-KRĄŻKOWA
Inokulacja: Wylanie inokulum na powierzchnię podłoża (metoda rekomendowana przez CA-SFM):
Postępując wg procedury podanej przez CA-SFM, z wystandaryzowanego wyjściowego inokulum, sporządza się rozcieńczenie
bakterii, o gęstości zależnej od badanego gatunku.
Otrzymaną zawiesiną bakterii zalewa się całą powierzchnię podłoża, poczym nadmiar zawiesiny zbiera się.
Inokulacja: Wysiew inokulum za pomocą wymazówki (metoda Kirby-Bauer rekomendowana przez CLSI, CA-SFM, oraz
EUCAST):
Używając wystandaryzowanego inokulum, postępuj zgodnie z wytycznymi CLSI, CA-SFM, lub EUCAST:
•
Zanurz jałową nie toksyczną dl bakterii wymazówkę w zawiesinie.
•
Usuń nadmiar płynu delikatnie przetaczając wymazówkę po ściance probówki.
•
Równomiernie pokryj podłożę zawiesiną bakterii tak by uzyskać zlewny wzrost bakterii.
Na zaszczepione podłoże nanieść krążki za pomocą dyspensera lub ułożyć pęsetą, lekko dociskając.
METODA ROZCIEŃCZEŃ W AGARZE
Sposób inokulacji i wykonanie testu zawierają Standardy CLSI i CA-SFM.
Inkubacja:
Należy postępować ściśle wg aktualnych zaleceń CLSI, CA-SFM, oraz EUCAST.
Warunki inkubacji różnią się w zależności od gatunku badanych drobnoustrojów.
7. ODCZYT WYNIKÓW
Interpretacja testu wrażliwości wykonanego metodą dyfuzyjno-krążkową lub metodą rozcieńczeń w agarze jest na bieżąco
aktualizowana w Standardach CLSI, CA-SFM, oraz EUCAST.
8. KONTROLA JAKOŚCI
•
•
•
Podłoże gotowe do użycia jest przejrzyste do matowego, o bursztynowej barwie.
Podłoże w proszku ma beżową barwę.
Podłoże gotowe do użycia z krwią jest czerwone.
Wzrost szczepów wzorcowych na podłożu Mueller-Hinton z krwią lub bez:
SZCZEP
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Haemophilus influenzae NCTC 8468/ CIP 54.94
WYNIK HODOWLI po 24 godz. w 37°C
Wzrost satysfakcjonujący
Wzrost satysfakcjonujący
Wzrost satysfakcjonujący
Wzrost satysfakcjonujący
Wzrost satysfakcjonujący
2
Skład podłoża Mueller Hinton kontrolowany jest z użyciem podanych krążków i szczepów wzorcowych (niepełna lista):
SZCZEP
Escherichia coli ATCC 25922
Amikacyna 30 μg
Ampicylina 10 μg
Tetracyklina 30 μg
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Amikacyna 30 μg
Cefalotyna 30 μg
Tetracyklina 30 μg
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Amikacyna 30 μg
Cefotaksym 30 μg
Ciprofloksacyna 5 μl
OZNACZENIE WRAŻLIWOŚCI
Średnica strefy zahamowania zgodna z aktualnymi
wartościami podanymi w standardach CLSI i/lub CASFM(8, 9)
Skład podłoża MHB kontrolowany jest z użyciem podanych krążków i szczepów wzorcowych (niepełna lista):
SZCZEP
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
- Erythromycin 15 µg
- Penicillin 10 UI
- Tetracycline 30 µg
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
- Amikacin 30 µg
- Cefotaxime 30 µg
- Ciprofloxacin 5 µg
OZNACZENIE WRAŻLIWOŚCI
Średnica strefy zahamowania zgodna z aktualnymi wartościami
podanymi w standardach CLSI (8).
Skład podłoża MHF kontrolowany jest z użyciem podanych krążków i szczepów wzorcowych (niepełna lista):
SZCZEP
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
- Erythromycin 15 µg
- Norfloxacin 10 µg
- Rifampin 5 µg
- Tetracycline 30 µg
Haemophilus influenzae NCTC 8468 / CIP 54.94
- Ampicillin 2 µg
- Cefaclor 30 µg
- Tetracycline 30 µg
OZNACZENIE WRAŻLIWOŚCI
Średnica strefy zahamowania zgodna z aktualnymi wartościami
podanymi w standardach EUCAST (12).
9. KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA
Każdy produkt Bio-Rad został przygotowany zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż
do ostatecznego produktu komercyjnego.
Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu, i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane
kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii.
10. OGRANICZENIA METODY
Aby uzyskać powtarzalne wyniki, zawsze należy używać czystych, młodych hodowli.
Niektóre szczepy bakterii mogą nie rosnąć na tym podłożu z powodu wyższych wymagań odżywczych. Odpowiednie podłoża
należy używać do badania niektórych bakterii: HTM dla Haemophilus sp., Mueller-Hinton z 5% krwią baranią dla Streptococcus
pneumoniae i paciorkowców beta-hemolizujących, GC Agar dla Neisseria gonorrhoeae.
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od szeregu czynników (wielkości inokulum, czasu i warunków inkubacji, etc). Dlatego
ważne jest postępowanie zgodne z najnowszymi zaleceniami (CLSI, CA-SFM).
Świeże podłoże Mueller-Hinton z krwią nie jest polecane do oznaczania wrażliwości S.pneumoniae na kotrimoksazol(7).
11. BIBLIOGRAFIA
123-
World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1981. Technical report series 673 (Révision
1981). W.H.O., Geneva – p156-192.
World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1992. Technical report series 822. W.H.O.,
Geneva.
Casillas, E.,Kenny, M.A., Minshew B.H., Schoenknecht, F. 1981. Effect of ionized calcium and soluble magnesium on the
predictability of the performance of Mueller-Hinton agar susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa with
Gentamicin. Antimicrob. Agents Chemother. 19:987-992.
3
45.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Murray, P.R., Zeitinger, J. R. 1983. Evaluation of Mueller-Hinton agar for disk diffusion susceptibility tests. J. Clin.
Microbiol. 18: 1269-1271
D’Amato, R.F., Thornsberry C., Baker C.N., Kirven, L.A. 1976. Effect of calcium and magnesium ions on the susceptibility
of Pseudomonas species to Tetracycline, Gentamicin Polymyxin B, and Carbenicillin. Antimicrob. Agents Chemother. 7:
596-600.
D’Amato, R.F., Thornsberry C. 1979. Calcium and Magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion
susceptibility results. Current Microbiol.2:135-138
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial
susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa.
Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. CLSI document M100-S19. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa.
Comité de l’antibiogramme. 2010. French Society of Microbiology.
European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. Media preparation for disc diffusion testing
V1.0.
European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. EUCAST disk diffusion antimicrobial
susceptibility testing method summary - V1.0.
European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2010. EUCAST QC Tables V1.1.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33
06/2010
4