Przemysª Skrobiowy

Transkrypt

Przemysª Skrobiowy

Przemysª Skrobiowy
2005/2006
16 maja 2006
1
2
Spis tre±ci
1 Kwasowa hydroliza skrobi
4
1.1
Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2
Mechanizm procesu hydrolizy kwasowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.3
Analityczne metody kontroli procesu hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.4
Produkty uboczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.5
Przemysªowy proces hydrolizy skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.6
wiczenia laboratoryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.1
Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.2
Przeprowadzenie hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.3
Oznaczenie redukcyjno±ci hydrolizatu . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.4
Wykonanie krzywej wzorcowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.5
Wykonanie oznaczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.6
Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2 Enzymatyczna hydroliza skrobi
14
2.1
Podstawy katalizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2
Enzymy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.3
Enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.4
2.3.1
Endoamylazy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3.2
Egzoamylazy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4.1
Izoamylaza; glikogen 6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.68 . . . . . . . . 21
2.5
Pomiar degradacji skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.6
Przemysªowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi. . . . . . . . . . 23
2.7
2.6.1
Produkcja maltodekstryn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.6.2
Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej . . . . . . . 24
2.6.3
Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego. . . . 25
2.6.4
Inne zastosowania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
wiczenia laboratoryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.7.1
2.7.2
Przeprowadzenie hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.7.3
Wykonanie oznaczenia redukcyjno±ci . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.7.4
Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3
3 Chemiczna modykacja skrobi: utlenianie
3.1
3.2
3.3
31
Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1
Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu . . . . . . . . . . . . 32
3.1.2
Utlenianie skrobi w obecno±ci jodanu(VII) sodu . . . . . . . . . . . 33
3.1.3
Utlenianie skrobi w obecno±ci H2 O2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.4
Przemysªowe metody utleniania skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Wykonanie ¢wiczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.1
3.2.2
Przeprowadzenie reakcji utleniania . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.3
Reakcja utleniania skrobi przy pomocy H2 O2 . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.4
Reakcja utleniania skrobi przy pomocy NaClO . . . . . . . . . . . . 36
3.2.5
Oznaczenie zawarto±ci grup karboksylowych w skrobi utlenionej . . 37
3.2.6
Oznaczenie zawarto±ci grup karbonylowych w skrobi utlenionej . . . 37
Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4 Chemiczna modykacja skrobi: estrykacja
38
4.1
Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.2
Octany skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.3
Fosforany skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.4
Inne estry skrobiowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.5
Wykonanie ¢wiczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.6
4.5.1
4.5.2
Acetylowanie skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.5.3
Oznaczenie stopnia zacetylowania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4
Kwasowa hydroliza skrobi
1 Kwasowa hydroliza skrobi
1.1 Wst¦p
Skrobia, jako w peªni odtwarzalny materiaª biologiczny zyskuje coraz wi¦ksze znaczenie
przemysªowe, i to zarówno w szeroko rozumianej technologii »ywno±ci i »ywienia jak i
w tzw. zastosowaniach nie»ywno±ciowych. Stosunkowo niewielkie zastosowanie (ok. 3%)
ma tzw. skrobia natywna, wydzielona z materiaªu pochodznia ro±linnego i nie poddana
»adnym dodatkowym modykacjom. Pozostaªa cz¦±¢ otrzymywanego materiaªu jest prze
twarzana ró»nymi metodami:
• zycznymi,
• chemicznymi,
• biologicznymi
• na drodze kombinacji kilku procesów (na przykªad hydroliza kwasowo-enzymatyczna).
Skrobia, jako biopolimer zbudowany z powtarzaj¡cych si¦ jednostek glukozowych ulega,
podobnie jak dwucukry i inne oligosacharydy, reakcjom hydrolizy. Pod nazw¡ t¡ rozumie
si¦ rozpad wi¡zania glikozydowego w ±rodowisku wodnym w obecno±ci katalizatorów kwa
sowych (hydroliza kwasowa) lub enzymatycznych (hydroliza enzymatyczna), poª¡czony
dodatkowo z przyª¡czeniem cz¡steczki wody do ka»dego zhydrolizowanego wi¡zania. Re
akcja hydrolizy kwasowej skrobi prowadzi do jej depolimeryzacji z utworzeniem D-glukozy
oraz wytworzeniem szerokiej grupy produktów po±rednich zawieraj¡cych wi¦cej ni» jedn¡
cz¡steczk¦ glukozy (disacharydy np. maltoza, dekstryny itp.). Bardziej podatny na proces
hydrolizy jest polimer nierozgaª¦ziony, a wi¦c amyloza.
Proces hydrolizy jest reakcj¡ stopniow¡. W jej pierwszym etapie zachodzi rozpad wi¡
za« wodorowych pomi¦dzy poszczególnymi ªa«cuchami polimeru poª¡czony ze wst¦pn¡
depolimeryzacj¡. Powoduje to zwi¦kszenie rozpuszczalno±ci polimeru, a co za tym idzie,
znaczne obni»enie lepko±ci. Zainicjowany w ten sposób proces zaczyna przebiega¢ coraz
szybciej z wytworzeniem produktów po±rednich o zró»nicowanej dªugo±ci ªa«cuchów czyli
dekstryn. Wielko±¢ oraz morfologia dekstryn wynika przede wszystkim z faktu, »e proce
sowi hydrolizy ulegaj¡ zarówno cz¡steczki amylozy jak i amylopektyny. W miar¦ wzrostu
st¦»enia glukozy w mieszaninie reakcyjnej, pod wpªywem kationów wodorowych, zaczy
naj¡ zachodzi¢ tak»e ró»nego rodzaju reakcje wtórne i uboczne, niekorzystnie wpªywaj¡ce
na proces hydrolizy. W±ród nich niew¡tpliwie najwa»niejsze to rewersja oraz tworzenie
5-hydroksymetylofurfuralu wraz z produktami jego rozkªadu lub polimeryzacji (Rysunek
5
oligosacharydy
rewersja
HYDROLIZA
SKROBIA −−−−−−−→ dekstryny −−−−−−−→ GLUKOZA −
)−
−−
−−
−*
− Produkty rewersji
hydroliza


y
HYDROLIZA
Kwas mrówkowy ←−−−−− 5-hydroksymetylofurfural −−−−−→ Produkty polimeryzacji


y
Kwas 4-okso-pentanowy
Rysunek 1: Reakcje chemiczne zachodz¡ce w trakcie kwasowej hydrolizy skrobi.
1.1). Szybko±¢ procesu hydrolizy zale»na jest przede wszystkim od st¦»enia czynnika kata
lizuj¡cego (kwasu) oraz temperatury procesu. Prawdopodobnie czynnikiem wpªywaj¡cym
na globaln¡ szybko±¢ hydrolizy jest te» budowa, a szczególnie wielko±¢ ziarenek skrobio
wych.
1.2 Mechanizm procesu hydrolizy kwasowej
W sensie samego mechanizmu reakcji chemicznej proces hydrolizy przebiega dwutorowo
(Rysunek 1.2):
• cie»ka A:
Protonowanie tlenu pier±cienia glukopiranozowego (A1) powoduje jego rozpad z wy
tworzeniem karbokationu na w¦glu C-1 (A2). W takiej sytuacji do karbokationu
przyª¡cza si¦ cz¡steczka wody (A3). Przesuni¦cie ªadunków w obr¦bie otrzymanego
kompleksu (A4) powoduje, z jednej strony, ponowne zamkni¦cie pier±cienia, a z
drugiej odszczepienie, zarówno kationu wodorowego, jak i cz¡steczki glukozy (lub
fragmentu ªa«cucha polimerowego w zale»no±ci od lokalizacji procesu w cz¡steczce
polimeru).
• cie»ka B:
Reakcja rozpoczyna si¦ protonowaniem mostkowego atomu tlenu przy wi¡zaniu
α-1,4-glikozydowym (B1). Przeniesienie ªadunku na ten atom umo»liwia rozerwa
nie wi¡zania glikozydowego i rozszczepienie ªa«cucha polimeru na dwa krótsze, lub
odszczepienie cz¡steczki glukozy, je±li reakcja ma miejsce na ko«cu ªa«cucha. Po
rozpadzie ªa«cucha na pozostaªej jego cz¦±ci odtworzony zostaje karbokation (B2)
umo»liwiaj¡cy w kolejnym etapie przyª¡czenie cz¡steczki wody (B3). Odszczepienie
6
CH2OH
O H
OH
glukoza
A
O
O
glukoza
B
OH
+
+H
+
+H
CH2OH
H
O H
A1
glukoza
CH2OH
OH
O H
O
O
B1
OH
glukoza
OH
O
glukoza
O
CH2OH
glukoza
- HO
H
OH
CH2OH
O
O
O H
glukoza
OH
OH
glukoza
OH
CH2OH
glukoza
B2
O
H2O
H
H
O
O
A3
glukoza
H
O
A2
glukoza
H
OH
H
OH
O
H2O
O
CH2OH
glukoza
O H
OH
H
OH
B3
O
glukoza
O
H
OH
CH2OH
O
O
- H+
H
OH
A4
glukoza
H
H
O
O
glukoza
CH2OH
OH
O H
B4
OH
O
glukoza
O
H
OH
CH2OH
O H
OH
glukoza
+
O
O
OH
HO
glukoza
H
Rysunek 2: Mechanizm hydrolizy kwasowej skrobi.
7
od tak utworzonego kationu jonu H+ umo»liwia wytworzenie na w¦glu C-1 stabilnej
i trwaªej grupy hydroksylowej (B4).
1.3 Analityczne metody kontroli procesu hydrolizy
Proces kwasowej hydrolizy skrobi powoduje zmniejszenie masy cz¡steczkowej, lepko±ci
oraz przede wszsytkim struktury chemicznej w¦glowodanów w próbce poddanej tej prze
mianie. Wykorzystuj¡c zmiany tych wªa±ciwo±ci, mo»na kontrolowa¢ przebieg hydrolizy
na kilka sposobów:
• Badanie zmian redukcyjno±ci: Zarówno jak i amylopektyna zawieraj¡ nie
wielkie ilo±ci wolnych grup hydroksylowych o charakterze póªacetalowym (jedna
wolna grupa na pojedyncz¡ makrocz¡steczk¦). Produkty caªkowitej hydrolizy cz¡
steczki skrobi o stopniu polimeryzacji skªadaja sie tylko i wyª¡cznie z cz¡steczek
glukozy, z których ka»da posiada woln¡ grup¦ póªacetalow¡ podatn¡ na reakcje re
doks.
Je±li wi¦c, na przykªad, czasteczka skrobi wykazuje stopie« polimeryzacji 500 (skªada
si¦ z 500 jednostek anhydroglukozowych) to po caªkowitej hydrolizie w ±rodowisku
reakcyjnym znajdzie si¦ 500 wolnych cz¡steczek glukozy, a wi¦c 500 wolnych grup
hydroksylowych o charakterze póªacetalowym. W przypadku hydrolizy niecaªkowi
tej zachodzacej do stadium dekstryn liczba grup póªacetalowych bedzie mie±cic¢ si¦
w zakresie 1-500, w zale»no±ci od stopnia hydrolizy (scukrzenia).
W celu ujednolicenia pomiaru redukcyjno±ci wprowadza si¦ tzw. równowa»nik gluko
zowy (ang. Dextrose Equivalent; DE) jako ilo±¢ wi¡za« glikozydowych, które ulegªy
hydrolizie (oznaczonych na drodze okreslenia zmian redukcyjno±ci) do caªkowitej
ilo±ci wi¡za« glikozydowych obecnych w 100g materiaªu (skrobi) wyj±ciowego, co
ilustruje Równanie 1. Dla uproszczenia zale»no±¢ t¡ oblicza si¦ najcz¦±ciej korzysta
j¡c z Równania 2.
w.h.
· 100%
w.c
m.g.
DE =
· 100%
s.m.s
DE =
gdzie:
w.h. - ilo±¢ zhydrolizowanych wi¡za« glikozydowych,
w.c. - caªkowita ilo±¢ wi¡za« glikozydowych obecna w skrobi wyj±ciowej,
m.g. - masa glukozy okre±lona na podstawie redukcyjno±ci hydrolizatu,
s.m.s. - masa skrobi poddana hydrolizie w przeliczeniu na such¡ mas¦.
(1)
(2)
8
Oznaczenie ilo±ci substancji redukuj¡cych z reguªy bazuje na zastosowaniu zasado
wego roztworu soli miedzi (II) jako ±rodka utleniaj¡cego. Ró»nice pomi¦dzy poszcze
gólnymi metodami wynikaj¡ za± gªównie z ilo±ciowego oznaczenia wytr¡conego po
reakcji Cu2 O.
• Próba jodowa: Oznaczenie z zastosowaniem próby jodowej wynika ze zdolnmo
±ci do tworzenia przez skrobi¦ kompleksów z jodem o ró»nej barwie, w zale»no±ci
od stopnia jej polimeryzacji. W pocz¡tkowej fazie hydrolizy zwi¡zki wysokocz¡stecz
kowe (tzw. amylodekstryny) barwi¡ roztwór jodu na niebieskooletowo. Gª¦bsza
hydroliza, a wi¦c wytworzenie produktów o ni»szej masie cz¡steczkowej (tzw. ery
trodekstryny), daje kompleksy barwy czerwonej. Ko«cowe produkty hydrolizy, tzw.
achrodekstryny oraz maltodekstryny, nie daj¡ barwnych reakcji z jodem podobnie
jak sama glukoza.
• Badania zmian rozpuszczalno±ci w alkoholu: Badania tego typu opie
raj¡ si¦ na wzrastaj¡cej, wraz z post¦pem hydrolizy, rozpuszczalno±ci produktów roz
padu. Podczas gdy skrobia niezhydrolizowana wykazuje w roztworach alkoholowych
zm¦tnienie oraz wypadanie z roztworu, to produkty jej rozkªadu s¡ lepiej rozpusz
czalne w alkoholu (mniejsze zm¦tnienie) lub tak, jak to jest w przypadku glukozy i
wi¦kszo±ci oligosacharydów, s¡ w tym rozpuszczalniku caªkowicie rozpuszczalne.
• Badania sk¦calno±ci wªa±ciwej: Rozpuszczona skrobia wykazuje skr¦cal
no±¢ wªa±ciw¡ +200◦ , podczas gdy czysta glukoza w roztworze skr¦ca pªaszczyzn¦
±wiatªa spolaryzowanego o k¡t +52,5◦ . Powstaj¡ce w trakcie hydrolizy po±rednie pro
dukty rozkªadu skrobi wykazuj¡ równie» po±redni¡ warto±¢ skr¦calno±ci, co umo»li
wia polarymetryczne monitorowanie procesu hydrolizy.
1.4 Produkty uboczne
W toku reakcji hydrolizy powstaj¡ cz¡steczki o coraz ni»szym stopniu polimeryzacji (ma
sie cz¡steczkowej). Hydroliza tych poª¡cze« zachodzi szybciej ni» wyj±ciowego materiaªu
skrobiowego, tak wi¦c po stosunkowo niedªugim czasie w mieszaninie reakcyjnej obecne
s¡ ju» znaczne ilo±ci trimerów, dimerów a przede wszystkim glukozy. Fakt ten, impli
kuje niestety zainicjowanie, ju» na wst¦pnym stadium hydrolizy, niepo»¡danych procesów
ubocznych z udziaªem glukozy:
• Rozpad glukozy: Pod wpªywem kationów wodorowych, a wi¦c w ±rodowisku
kwa±nym, podobnie jak ma to miejsce przy gªównej reakcji hydrolizy, glukoza ulega
9
H
H
C
O
C
O
H
H
C
OH
C
O
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2OH
OH
HO
CH CH
HOH2C
- H2O
CH
C
CHOH
O
CH2OH
- H2O
OH
OH
CH CH
CH CH
HOH2C
C
CH
HOH2C
CHO
C
C
CHOH
O
O
- H2O
CH CH
HOH2C
C
C
CHO
5-hydroksymetylofurfural
O
+ H2O
HOH2C
CH2
CH2
C
C
O
O
CHO
HOH2C
CH2
CH2
C
C
O
O
OH
kwas 4-okso-pentanowy
(kwas lewulinowy)
+
HCOOH
kwas
.
mrowkowy
Rysunek 3: Mechanizm reakcji z udziaªem 5-hydroksymetylofurfuralu.
przegrupowaniu do 5-hydroksymetylofurfuralu (Rysunek 1.4). W warunkach reakcji,
zwi¡zek ten mo»e, b¡d¹ to ulega¢ procesom polimeryzacji (z wytworzeniem smoli
stych trudno usuwalnych zwi¡zków makrocz¡steczkowych) lub dalszej degradacji
z wytworzeniem kwasu 4-okso-pentanowego (kwas lewulinowy) oraz toksycznego
kwasu mrówkowego. Reakcji powstawania 5-hydroksymetylofurfuralu sprzyja wy
soka temperatura (ok. 130◦ C), niskie pH (a wi¦c po±rednio wysokie st¦»enie kwasu)
oraz wysokie st¦»enie glukozy.
• Rewersja glukozy: Jony wodorowe katalizowa¢ mog¡ tak»e reakcje konden
sacji dwóch (Rysunek 1.4) lub kilku (Rysunek 1.4) cz¡steczek glukozy. Zjawisko to
znane pod nazw¡ rewersji zachodzi gªównie przy wi¦kszych st¦»eniach glukozy i w
przypadku otrzymywania syropów wysokoscukrzonych jest wysoce niekorzystne. Re
wersja mo»e spowodowa¢, »e w czasie hydrolizy, prowadzonej na skal¦ techniczn¡,
wydajno±¢ glukozy spada z warto±ci teoretycznej 110kg ze 100kg skrobi do warto±ci
90kg. Gªównymi oligosacharydami powstaj¡cymi w trakcie rewersji s¡: izomaltoza,
gencjobioza, soforoza, trehaloza i celebioza. Dodatkowo w procesie tym powstaj¡
bardziej odporne na proces hydrolizy wi¡zania α- i β - 1,6-glikozydowe. W trakcie
reweresji powstawa¢ mog¡ tak»e oligosacharydy, w których jednostki glukozowe po
10
wiazanie α-1,6 glikozydowe
CH2OH
CH2OH
O
O
OH
OH
- H2O
O
OH
H
O
OH
OH
CH2
OH
CH2
OH
O
O
OH
OH
Izomaltoza
OH
OH
OH
OH
OH
OH
wiazanie β-1,6 glikozydowe
CH2OH
CH2OH
O O
O O
H
OH
OH
CH2
OH
- H2O
OH
O
OH
CH2
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Gencjobioza
Rysunek 4: Reakcja rewersji, powstawanie dimerów glukozy
CH2OH
O
OH
OH
O
H
CH2
OH
OH
O
OH
OH
O
CH2
OH
O
OH
OH
OH
OH
- H2O
CH2OH
O
OH
OH
O
CH2
OH
Izomaltotrioza
α-D-glukopiranozylo-α-D-glukopiranozylo-O-6-D-glukopiranoza
O
OH
O
OH
CH2
OH
O
OH
OH
OH
OH
Rysunek 5: Rewersja glukozy, trimeryzacja
11
ª¡czone s¡ wi¡zaniami 1,1-, 1,2-, 1,3- glikozydowymi.
• Reakcja Maillarda: Procesowi hydrolizy mo»e towarzyszy¢ tzw. reakcja Ma
illarda prowadz¡ca poprzez stadium zasad Schi'a do barwnych produktów nazywa
nych melanoidami. Reakcja Maillarda przebiega mi¦dzy cz¡steczk¡ cukru (np. glu
koz¡) oraz aminokwasu. Zwi¦kszona zawarto±¢ aminokwasów wynikaj¡ca, na przy
kªad z niedokªadnego, wst¦pnego oczyszczenia skrobi, sprzyja temu procesowi, nie
korzystnie wpªywaj¡c na efektywno±¢ hydrolizy ze wzgl¦du na straty glukozy oraz
powstawanie trudno usuwalnych barwnych produktów.
1.5 Przemysªowy proces hydrolizy skrobi
W praktyce przemysªowej proces hydrolizy kwasowej stosuje si¦ gªównie do produkcji syro
pów skrobiowych i dekstryn (Rysunek 1.5). Znacznie rzadziej metoda ta sªu»y do produk
cji glukozy gdzie wyparta zostaªa przez hydroliz¦ enzymatyczn¡. Podstawowym surowcem
do produkcji syropów jest tzw. krochmal zielony czyli skrobia zawieraj¡ca ok. 50% wody.
Ze wzgl¦du na dªu»szy okres przechowywania surowca i mo»liwo±¢ zachodzenia procesów
gnilnych i fermentacyjnych surowiec oczyszcza si¦ i dezynfekuje. Oczyszczony surowiec
poddaje si¦ nast¦pnie konwersji w ±rodowisku kwa±nym oraz podwy»szonej temperaturze.
Po osi¡gni¦ciu wymaganej wielko±ci równowa»nika glukozowego proces hydrolizy przerywa
si¦ przez zoboj¦tnienie, a mieszanin¦ reakcyjn¦ oczyszcza, ltruje i zag¦szcza. W zale»no±ci
od stopnia scukrzenia, a wi¦c warto±ci równowa»nika glukozowego, rozró»nia si¦ syropy: ni
skoscukrzony (DE 30-38), normalnie scukrzony (DE 38-45), ±rednioscukrzony (DE 45-50)
i wysokoscukrzony (DE 50-55). Podobn¡ metod¦ mo»na stosowa¢ do produkcji glukozy
u p ³y n n ia n ie
s k r o b i
h y d r o liz a
( H C l)
z o b o jê t n ia n ie
( w ê g la n s o d u )
o c z y s z c z a n ie
( w ê g ie l a k t y w n y )
k r y s t a liz a c j a
G L U K O Z A
Z E S T A L O N A
z a g ê s z c z a n ie
S Y R O P
S K R O B I O W
z a g ê s z c z a n ie
w ir o w a n ie
c u k r z y c y
p r z e r ó b
o d c ie k ó w
G L U K O Z A
K R Y S T A L I C Z N A
H Y D R O L
Y
Rysunek 6: Przemysªowy proces hydrolizy skrobi
12
krystalicznej. Reakcj¦ hydrolizy prowadzi si¦ wtedy przy ni»szym st¦»eniu mleczka skro
biowego. W przypadku produkcji glukozy reakcj¦ prowadzi si¦ a» do osi¡gni¦cia warto±ci
DE na poziomie 92. W opisywanym procesie, oprócz tzw. glukozy zestalonej oraz glukozy
krystalicznej, uzyskuje si¦ tak»e, jako produkt odpadowy, hydrol. Wariacj¡ metody kwaso
wej otrzymywania glukozy jest proces kwasowo-enzymatyczny, w którym po pocz¡tkowej
hydrolizie surowca obni»a si¦ temperatur¦ procesu, zoboj¦tnia mieszanin¦ reakcyjn¡ oraz
dodaje enzym glukoamylaz¦ w celu jej scukrzenia metod¡ enzymatyczn¡.
1.6 wiczenia laboratoryjne
1.6.1 Oznaczenie suchej masy
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi z
dokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢
z dokªadno±ci¡ do 0,1% wraz z analiz¡ statystyczn¡.
1.6.2 Przeprowadzenie hydrolizy
Na wadze analitycznej odwa»y¢ 2,5g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ pocz¡t
kow¡ zawarto±¢ wody równ¡ 20%, a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡
poprawk¦). Skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do kolby miarowej o pojemno±ci 250cm3 i uzupeª
ni¢ do kreski wod¡ destylowan¡. Zawiesin¦ dobrze wymiesza¢ i pobra¢ z niej 10 próbek
po 25cm3 ka»da. Próbki umie±ci¢ w kolbkach Erlenmayera o pojemno±ci 100cm3 . Do 9
próbek doda¢ 12,5cm3 przygotowanego roztworu kwasu solnego (st¦»enia 5%, 10% lub
15% w zale»no±ci od grupy). Próbka 10 stanowi prób¦ zerow¡. Kolbki kolejno umie±ci¢ w
ªa¹ni wodnej o temperaturze 90◦ C na czas: 2, 3, 4, 6, 8, 15, 20, 30 i 40min. Po wyj¦ciu z
ªa¹ni, w celu zatrzymania reakcji hydrolizy, kolbki umieszcza¢ w ªa¹ni wodnej chªodzonej
lodem. Próbk¦ zerow¡ (nie zawieraj¡c¡ kwasu) ogrzewa¢ przez okres 40min, schªodzi¢ a
po ozi¦bieniu doda¢ do niej 12,5cm3 kwasu. Ochªodzone próbki natychmiast zoboj¦tni¢
30% NaOH (wobec papierka uniwersalnego) i umie±ci¢ w kolbach miarowych o pojemno±ci
100cm3 . Zawarto±¢ kolbek uzupeªni¢ do kreski wod¡ destylowan¡, wymiesza¢.
13
1.6.3 Oznaczenie redukcyjno±ci hydrolizatu
1.6.4 Wykonanie krzywej wzorcowej
W 10 probówkach odmierzy¢ 5cm3 mieszaniny pªynów Fehlinga I i II, po czym doda¢ od
1 do 10cm3 roztworu glukozy o st¦»eniu 2,78·10−3 mol/dm3 i uzupeªni¢ wod¡ do 25cm3 .
Po wymieszaniu zawarto±¢ ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni wodnej przez 5min i przela¢ do
probówek wirówkowych i odwirowa¢ (2min, 5000rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofo
tometryczny, stosuj¡c ±wiatªo o dªugo±ci fali λ=640nm, u»ywaj¡c jako odniesienia wody
destylowanej. Wykre±li¢ krzyw¡ wzorcow¡, obliczy¢ metod¡ regresji liniowej równanie tej
krzywej (Cglukozy = f (Abs.)) oraz podstawowe parametry statystyczne.
1.6.5 Wykonanie oznaczenia
Z próbek otrzymanych hydrolizatów pobra¢ do kolbek po 10cm3 , doda¢ 5cm3 mieszaniny
pªynów Fehlinga I i II i uzupeªni¢ wod¡ destylowan¡ do 25cm3 . Po wymieszaniu zawarto±¢
ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni wodnej przez czas 5min, przenie±¢ do probówek wirówkowych
i odwirowa¢ (2min, 5000rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofotometryczny jak opisano
to dla krzywej wzorcowej. Okre±li¢ zawarto±¢ glukozy i na jej podstawie warto±¢ DE dla
kolejnych próbek i sporz¡dzi¢ wykres jego warto±ci w zale»no±ci od czasu.
1.6.6 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wyniki
bada«, obliczenia, krzyw¡ wzorcow¡, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymane
dane nale»y skomentowa¢ i wyci¡gn¡¢ wnioski. Porówna¢ tak»e dynamik¦ zmian DE w
zale»no±ci od st¦»enia u»ytego kwasu.
14
Hydroliza enzymatyczna
2 Enzymatyczna hydroliza skrobi
2.1 Podstawy katalizy
Reakcje chemiczne charakteryzuj¡ si¦ ró»nymi szybko±ciami (staªymi szybko±ci) a co za
tym idzie ró»n¡ dynamik¡ procesu. Warto±¢ staªej szybko±ci reakcji chemicznej zale»y
mi¦dzy innymi od st¦»enia substratów i temperatury. W wielu przypadkach procesów za
równo o znaczeniu technicznym jak i laboratoryjnym, nie istnieje praktyczna mo»liwo±¢
zwi¦kszania dynamiki reakcji poprzez zwi¦kszenie temperatury (ze wzgl¦du na np. de
gradacj¦ substratów/produktów). Procesy chemiczne mog¡ równie» charakteryzowa¢ si¦
niewielk¡ warto±ci¡ staªej równowagi (procesy odwracalne), wysok¡ energi¡ aktywacji i
wieloma innymi, niekorzystnymi z punktu widzenia efektywno±ci procesu, parametrami.
W przypadkach takich, rozwi¡zaniem problemu zwi¦kszenia wydajno±ci i selektywno±ci
reakcji oraz skrócenia jej czasu jest zastosowanie katalizatora.
Jak wiadomo z termodynamiki procesy chemiczne b¦d¡ przebiega¢ samorzutnie tylko
wtedy, gdy zmiana energii swobodnej reakcji ∆G (∆G = G20 - G10 ; G20 - energia swo
bodna produktów, G10 - energia swobodna substratów) b¦dzie mniejsza od zera. Za zmiany
energii swobodnej zgodnie z Równaniem 3
∆G = ∆H − T ∆S
(3)
odpowiada b¡d¹ to zmiana entalpii procesu (∆H) b¡d¹ te» zmiana uporz¡dkowania ukªadu
(zmiana entropii, ∆S).
Dodatkowo jednym z najistotniejszych czynników limituj¡cych przebieg reakcji jest wy
soko±¢ bariery aktywacji (energii aktywacji) zgodnie z równaniem Arrheniusa (Równanie
4).
Ea
k = A · e− RT
gdzie:
• k - staªa szybko±ci reakcji,
• A - tzw. wspóªczynnik przedekspotencjalny,
• R - staªa gazowa,
• Ea - energia aktywacji,
• T - temperatura.
(4)
15
Zastosowanie wªa±ciwego katalizatora umo»liwia zwi¦kszenie szybko±ci reakcji chemicznej
i/lub skierowanie jej na jedn¡ z kilku mo»liwych termodynamicznie dróg prowadz¡cych do
ró»nych produktów. Substancje b¦d¡ca katalizatorem, tworz¡c nietrwaªe poª¡czenia przej
±ciowe (kompleksy przej±ciowe), nie s¡ ¹u»ywane"w reakcji i nie wyst¦puj¡ w jej równaniu
stechiometrycznym. Katalizator nie zmienia przy tym poªo»enia równowagi chemicznej,
wpªywa jedynie na szybko±¢ dochodzenia ukªadu do tego stanu poprzez zmniejszenie ener
gii aktywacji. Mechanizm dziaªania katalizatora polega na zast¡pieniu reakcji z równania
5
S1 + S2 = P
(5)
S1 + K = S1 K
(6)
S1 K + S2 = P + K
(7)
Procesem:
Gdzie:
• S1 ,S2 - substraty
• P - produkt
• K - katalizator
• S1 K - kompleks przej±ciowy
Je»eli dla reakcji (5) energia aktywacji wynosi EN to dla procesu katalizowanego wynosi
ona odpowiednio Ek1 (dla reakcji 6) i Ek2 (dla reakcji 7). Zmiany energii aktywacji procesu
katalitycznego obrazuje Rysunek 3.
2.2 Enzymy
Specycznymi katalizatorami reakcji chemicznych s¡ enzymy, grupa biaªek dziaªaj¡cych w
komórkach i pªynach ustrojowych »ywych organizmów i bior¡cych udziaª w procesach syn
tezy lub rozkªadu istotnych z biochemicznego punktu widzenia substancji organicznych.
Enzymy rzadko zbudowane s¡ z samego biaªka (np. trypsyna). W znakomitej wi¦kszo
±ci skªadaj¡ si¦ one z cz¦±ci biaªkowej (tzw. apoenzym) oraz niebiaªkowej, grup prostetycz
nych i koenzymów (maªocz¡steczkowe zwi¡zki nieorganiczne, atomy metali). Niebiaªkowe
cz¦±ci enzymu peªni¡, w reakcjach enzymatycznych, funkcj¦ przeno±ników elektronów,
okre±lonych atomów lub ich ugrupowa« w trakcie katalizowanych procesów. Bior¡ one
udziaª w cyklu reakcji enzymatycznych: w pierwszej jego fazie umo»liwiaj¡ dysocjacj¦
16
E n e r g ia
E
E
S
k 2
E
S
S 1 - - S 2
N
S
1
k 1
+
S
2
+
K
1
1
K - - S
2
- - K
S
1
K
P +
K
P o s tê p r e a k c ji
Rysunek 7: Przemiany energetyczne podczas zachodz¡ce podczas procesów chemicznych (S1 S2 kompleks aktywny reakcji niekatalizowanej; S1 K, S1 KS2 - kompleksy aktywne poszczególnych
etapów reakcji katalizowanej.
okre±lonych wi¡za« substratu oraz ich zwi¡zanie z enzymem. W fazie drugiej nast¦puje
natomiast zwi¡zanie atomów pochodz¡cych od substratu w produkt, oraz odtworzenie
cz¦±ci niebiaªkowej w pierwotnej postaci, po czym proces si¦ powtarza. Poª¡czenie koenzy
mów z przenoszon¡ grup¡ funkcyjn¡¡ odznacza si¦ du»¡ reaktywno±ci¡. Dzi¦ki cykliczno±ci
procesu przenoszenia, koenzymy mog¡ wyst¦powa¢ w »ywej komórce w ilo±ciach równo
wa»nych ilo±ciom enzymów, cho¢ reaguj¡ z substratami stechiometrycznie. Trwaªo±¢ po
ª¡czenia apoenzymu w koenzymami jest ró»na; je±li koenzym ªatwo dysocjuje, reakcje
przenoszenia grup chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje ukªad zªo»ony z 2
enzymów o wspólnym koenzymie; je±li koenzym jest zwi¡zany z enzymem trwale, enzym
ten katalizuje kolejno obie reakcje.
Cz¦±¢ biaªkowa odpowiada natomiast za konguracj¦ przestrzenn¡ enzymu oraz za
zmiany hydrofobowo±ci centrum aktywnego. Budowa taka powoduje »e enzymy zawiera
j¡ce t¡ sam¡ grup¦ prostetyczn¡ ale ró»ne cz¦±ci biaªkowe bed¡ katalizowa¢ ró»ne reakcje
jednostkowe.
Zgodnie z równaniami 6 i 7 podstaw¡ reakcji enzymatycznej jest wytworzenie odwra
calnego kompleksu pomi¦dzy enzymem i substratem reakcji. Kompleks ten ulega nast¦p
nie nieodwracalnej przemianie z odtworzeniem enzymu oraz wytworzeniem nalnego pro
duktu. Tak jak w przypadku wi¦kszo±ci katalizatorów st¦»enie enzymów w trakcie procesu
jest znacz¡co mniejsze niz st¦»enie substratów. Wynika st¡d i» mo»na przyj¡¢, »e st¦»enie
kompleksu S1 K jest staªe w czasie i zale»y tylko od st¦»enia enzymu.
17
Szybko±¢ reakcji enzymatycznej zale»na jest tak»e od wielu innych czynników (pH,
temperatura, st¦»enie koenzymów itp.), w tym przede wszystkim od st¦»enia substratu.
Zale»no±¢ szybko±ci procesu od tego st¦»enia opisuje równanie Michaelisa-Menten'a:
v=
vmax · [S]
Km + [S]
(8)
Gdzie:
• v - chwilowa szybko±¢ reakcji
• vmax - maksymalna szybko±¢ reakcji
• [S] - st¦»enie substratu
• Km - staªa Michaelisa-Menten'a
Staªa Michaelisa-Menten'a jest to takie st¦»enie substratu (wyra»one w mol/dm3 ), przy
którym szybko±¢ reakcji osi¡ga poªow¦ szybko±ci maksymalnej.
Innym wska»nikiem aktywno±ci enzymu s¡ tzw. jednostki aktywno±ci na przykªad tzw.
jednostka mi¦dzynarodowa (ilo±¢ enzymu, która zdolna jest wytworzy¢ 1 mmol produktu
w temp. 30◦ C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkach reakcyjnych), katal
(aktywno±¢ enzymu zdolnego do przeksztaªcenia 1mol substratu w czasie 1s w temp.
30◦ C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkach reakcyjnych lub tzw. ilo±¢
obrotów (liczba moli substratu która mo»e przereagowa¢ w ci¡gu 1min z 1 molem centrum
aktywnego enzymu w temp. 30◦ C i w optymalnych dla enzymu pozostaªych warunkach
reakcyjnych).
Liczba znanych dotychczas enzymów znacznie przekracza 3000, st¡d te» wprowadzona
jest ich klasykacja (wprowadzona przez Komisj¦ Enzymow¡ IUB). Wszystkie enzymy
podzielone zostaªy na sze±¢ klas gªównych (1. Oksyreduktazy, 2. Transferazy, 3. Hydrolazy,
4. Liazy, 5. Izomerazy, 6. Ligazy.) W czteroliczbowej klasykacji enzymów kolejne liczby
oznaczaj¡ klasy, podklasy, podpodklasy oraz numer enzymu w podpodklasie.
2.3 Enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦
Oprócz celulozy skrobia jest gªównym polisacharydem pochodzenia ro±linnego. Z prze
mysªowego punktu widzenia istotne znaczenie maj¡ przede wszystkim produkty jej hy
drolizy umo»liwiaj¡ce produkcj¦ syropów glukozowych, dekstryn, cyklodekstryn, glukozy
(krystalicznej i zestalonej) i innych produktów wykorzystywanych gªównie w przemy±le
spo»ywczym. Stosowana do niedawna kwasowa hydroliza skrobi wraz z post¦pem w dzie
dzinie biotechnologii coraz cz¦±ciej ust¦puje miejsca procesom enzymatycznym. Enzymy
18
stosowane do hydrolizy skrobi podzieli¢ mo»na na 5 grup: endoamylazy, egzoamylazy,
enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia, izomerazy oraz glikozylotransferazy cyklodekstryn (Ry
sunek 2.3).
Rysunek 8: Najcz¦±ciej stosowane enzymy hydrolizuj¡ce skrobi¦
2.3.1 Endoamylazy
α-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu - EC 3.2.1.1
Enzymy z tej grupy umo»liwiaj¡ hydroliz¦ wi¡za« α-1,4-glikozydowych zarówno w amy
lozie jak amylopektynie a nie s¡ aktywne w stosunku do wi¡za« α-1,6- (np. w amylo
pektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku s¡ oligosacharydy posiadaj¡ce kon
guracje α przy w¦glu C1. Enzymy te dziaªaj¡ w ±rodku ªa«cucha polimerowego co po
woduje gwaªtowny spadek lepko±ci hydrolizowanego kleiku skrobiowego. Znane s¡ dwa
rodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α-amylaza termostabilna jest enzymem
pochodzenia bakteryjnego. Enzym ten w przypadku pochodzenia ze szczepu Bacillus sub
tilis wykazuje optimum temperaturowe pomi¦dzy 65 a 70◦ C w obecno±ci jonów wapnia,
i ze wzgl¦du na swoj¡ nisk¡ stabilno±¢ nie jest stosowana w zastosowaniach komercyj
nych. α-amylaza pochodz¡ca ze szczepu Bacillus licheniformis (Rysunek 2.3.1) jest na
tomiast aktywna i stabilna w temperaturach powy»ej 90◦ C, a dodatkowo jej aktywno±¢
w znacznie mniejszym stopniu zale»ny od obecno±ci jonów Ca2+ oraz stosowanego pH.
19
Dziaªanie opisywanego enzymu sprowadza si¦ gªównie do
generowania z ªa«cucha polisacharydowego jednostek zawie
raj¡cych 5 jednostek glukozowych. Powoduje to, »e szybko±¢
hydrolizy jest bardzo wysoka na pocz¡tku procesu a potem
wraz z post¦pem reakcji spada. Na dalszych etapach pro
cesu generowane s¡ jednostki o mniejszej liczbie merów. Ter
molabilne α-amylazy s¡ enzymami pochodznie grzybowego.
Produktami hydrolizy skrobi w tym przypadku s¡: maltoza
Rysunek 9: α-amylaza ze i maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazuj¡
szczepu Bacillus licheniformis wi¦ksz¡ w porównaniu do swoich bakteryjnych odpowied
nikow odporno±¢ na zmiany pH ±rodowiska reakcji. Znane
s¡ te» αamylazy immobilzowane (osadzane) na no±nikach. Taki proces heterogenizacji
enzymu umo»liwia przynajmniej cz¦±ciowe odzyskiwanie katalizatora oraz mo»liwo±¢ po
nownego jego u»ycia co istotne jest z punktu widzeni ekonomiki procesu. Enzymy immobi
lizowane na no±nikach wykazuj¡ jednak z ni»sza aktywno±¢, a to ze wzgl¦du na utrudnione
warunki dyfuzji pomi¦dzy katalizatorem w fazie staªej a rozpuszczonymi/skleikowanymi
ªa«cuchami polisacharydowymi.
2.3.2 Egzoamylazy
Enzymy z grupy egzoamylaz dziela si¦ na ukªady dziaªaj¡ce z wytworzeniem glukozy lub
maltozy.
γ -amylaza, 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu, glukoamylaza; EC 3.2.1.3
Glukoamylaza zwana tak»e γ -amylaz¡ umo»liwia wysoce efektywn¡ reakcj¦ hydrolizy
wi¡za« α-1,4-glikozydowych z wytworzenim glukozy jako produktu ko«cowego.
Atak enzymu rozpoczyna si¦ na nieredukuj¡cym ko«cu ªa«
cucha polimerowego a powstaj¡ca glukoza posiada kongu
racj¦ β . Enzym ten dziaªa na skrobi¦ odcinaj¡c po jede
nej jednostce glukozowej, a» do miejsca rozgaª¦zienia. Hy
droliza wi¡za« 1,6-glikozydowych z udziaªem glukoamylazy
równie» jest mo»liwa cho¢ proces ten przebiega z bardzo ni
sk¡ szybko±ci¡. W przypadku wysokich st¦»e« glukozy lub
enzymu mo»liwa jest tak»e podobnie jak w przypadku hy
Rysunek 10: γ -amylaza ze
szczepu Aspergillus niger
drolizy kwasowej reakcja repolimeryzacji (rewersji) glukozy
z wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza cha
rakteryzuje si¦ du»¡ odporno±ci¡ na zmiany pH (stabilno±¢
20
w zakresie 1,8-8,8 dla enzymu z Aspergillus niger oraz 1,8-10,5 dla ukªadu pochodz¡cego
z Aspergillus awamori). Enzym ten najwy»sz¡ aktywno±¢ przejawia przy pH z zakresu
4,0-5,6 w temperaturze 40-65◦ C. Odwrotnie ni» w przypadku α-amylazy jony Ca2+ wyka
zuj¡ inhibicyjne dziaªanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziaªem glukoamylazy.
β -amylaza, maltohydrolaza-α-1,4-glukanu; EC 3.2.1.2
β -amylaza jest enzymem dziaªaj¡cym na skrobi¦ z wy
tworzeniem maltozy jako produktu nalnego. Gªównym
¹ródªem tego enzymu s¡ zbo»a takie jak: pszenica i j¦cz
mie« oraz soja. Znane s¡ jednak tak»e bakteryjne ¹ró
dªa β -amylazy. β -amylaza umo»liwia degradacj¦ ªa«cu
chów amylozy i amylopektyny poprzez hydroliz¦ wi¡za«
α-1-4- glikozydowych pomi¦dzy drug¡ a trzeci¡ jednostk¡
glukozow¡ licz¡c od nieredukuj¡cego ko«ca ªa«cucha. Wy
tworzona w ten sposób maltoza jest beta-anomerem. Po Rysunek 11: β -amylaza z Hor
niewa» enzym ten nie umo»liwia hydrolizy wi¡za« 1,6-gli deum vulgare
kozydowych produktami hydrolizy skrobi z jego udziaªem
s¡ maltoza (w przypadku amylozy) oraz mieszanina oligosacharydów o ró»nym stopniu
rozgaª¦zienia, tzw. dekstryny graniczne (dla amylopektyny). Optimum kwasowo±ci ±rodo
wiska reakcji dla tego enzymu wynosi okoªo 5 a optymalna temperatura dziaªania 55 60◦ C. Je±li chodzi o budow¦ enzymu to w odró»nieniu od innych enzymów hydrolitycz
nych skrobi beta-amylaza nie zawiera w centrum aktywnym jonów metali a jedynie grupy
merkaptanowe (-SH). Wszystkie beta-amylazy trac¡ swoj¡ aktywno±¢ w obecno±ci takich
zwi¡zków jak HgCl2 , AgNO3 oraz jodu. Oba opisywane rodzaje egzoenzymów mog¡ by¢
immobilizowane na no±nikach aczkolwiek tak jak w przypadku α-amylazy obni»a to efek
tywno±¢ dziaªania enzymów ze wzgl¦dów kinetycznych.
2.4 Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia
α, β i γ - amylazy to enzymy które b¡d¹ to s¡ nieaktywne w stosunku do wi¡za« 1,6-gli
kozydowych b¡d¹ te» reakcja hydrolizy tych wi¡za« zachodzi przy ich udziale z niezo
dawalaj¡ca szybko±ci¡. Enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia dziaªaj¡ natomiast selektywnie
wªa±nie na wi¡zania α-1,6 glikozydowe w ªa«cuchach polisacharydowych, umo»liwiaj¡c
peªniejsz¡ hydroliz¦ skrobi. Najwa»niejszymi przedstawicielami tej grupy s¡ pullulanaza
oraz izoamylaza.
21
Pullulanaza, pullulan-6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.41
Enzym ten umo»liwia usuni¦cie rozgaª¦zie« zarówno amylopektyny jak i amylozy. Efek
tem nalnym jego dziaªania s¡ oligo- i poli- sacharydy o stopniu polimeryzacji z zakresu
115 - 2300. Enzym ten jest z reguªy stosowany w kombinacji z α, β lub γ - amylazami.
Optimum temperaturowe dla pullulanazy wynosi ok 60◦ C. Chocia» enzym ten zidenty
kowano w takich ro±linach jak: baweªna, ry» i szpinak to jednak w celach przemysªowych
izoluje si¦ go gªównie ze szczepów bakterii (np. Bacillus stearothermophilus). Pullulanaza
umo»liwia hydroliz¦ wi¡za« 1,6- glikozydowych jedynie gdy wi¡zanie to scala ªa«cuchy po
lisacharydowe poª¡czone wi¡zaniem 1,4-glikozydowym (np. w pullulanie st¡d nazwa). W
zale»no±ci od zdolno±ci pollulanazy do hydrolizy oprócz wi¡za« 1,6-, tak»e ukªadów 1,4rozró»nia si¦ dwa typy pollulanaz: I (nieaktywne w hydrolizie wi¡za« 1,4-) i II (aktywne
w hydrolizie wi¡za« 1,4-).
2.4.1 Izoamylaza; glikogen 6-glukanohydrolaza; EC 3.2.1.68
Izoamylaza podobnie jak opisywana wy»ej pullula
naza jest enzymem umo»liwiaj¡cycm hydroliz¦ roz
gal¦zie« ªa«cuchów polisacharydowych tam gdzie wy
st¦puj¡ wi¡zania 1,6-glikozydowe. W odró»nieniu od
pullulanazy izoamylaza nie hydrolizuje jednak wi¡
za« 1,6- w pullulanie lecz w glikogenie. Dziaªanie obu
wymienionych anymów na skrobi¦ (amylopektyn¦)
jest natomiast zbli»one. Opisane enzymy nie wyczer
puja wszystkich mo»liwo±ci enzymatycznej hydrolizy
Rysunek 12: Izomylaza ze szczepu skrobi. Jednak to α, β i γ amylaza wraz z pullula
naz¡ i izoamylaz¡ maj¡ najwi¦ksze znaczenie przymy
Pseudomonas amyloderamosa
sªowe.
2.5 Pomiar degradacji skrobi
Stopie« hydrolizy a wi¦c rozªo»enia skrobi mierzy sie z reguªy przy pomocy metod zycz
nych lub chemicznych.
Metody zyczne obejmuj¡ przede wszystkim pomiary zwiazane z okresleniem ±rednich
mas cz¡steczkowych polimeru oraz rozrzutu mas cz¡steczkowych (najcz¦±ciej w formie
tzw. RCC czyli ró»niczkowego rozrzutu mas cz¡steczkowych. Do metod takich nale»¡:
1. pomiary wiskozymetryczne: lepko±¢ graniczna roztworów polimerów zwi¡zana jest
22
ze ±redni¡ mas¡ cz¡steczkow¡ równaniem Marka-Houwinka
η = K · Mα
(9)
gdzie K i α s¡ staªymi empirycznymi dla danego polimeru.
2. turbidymetryczne: wykorzystanie zjawiska rozproszenia ±wiatªa widzialnego przez
cz¡stki bardzo rozcie«czonej zawiesiny lub roztworu koloidalnego (ukªadu dyspersyj
nego). Dokonuj¡c pomiarów w wi¡zce promieniowania przechodz¡cego przez ukªad
dyspersyjny, otrzymuje si¦ wielko±¢ charakteryzuj¡c¡ rozproszenie (tzw. turbidan
cj¦), która jest proporcjonalna do st¦»enia cz¡stek zawiesiny. Pomiary mog¡ by¢
wykonane za pomoc¡ zwykªych spektrofotometrów.
3. nefelometryczne: na podstawie pomiaru nat¦»enia ±wiatªa rozproszonego przez zawie
sin¦, pod okre±lonym (ró»nym od 180◦) k¡tem wzgl¦dem wi¡zki padaj¡cej, oznacza
si¦ st¦»enie tej zawiesiny lub rozmiary tworz¡cych j¡ cz¡stek.
4. osmometryczne: wykorzystuj¡c osmometri¦ parow¡
5. kriometryczne: obni»enie temperatury krzepni¦cia rozpuszczalnika w roztworze po
limeru.
6. jodometryczne: helisy skrobi o dªugo±ci powy»ej 20 DP, tworz¡ z jonami polijod
kowymi kompleksy inkluzyjne o zabarwieniu niebieskim. Intensywno±¢ barwy tych
kompleksów wzrasta z dªugo±ci¡ ªa«cuchów amylozy i zale»y od temperatury i pH.
Wad¡ metody jest brak jednoznacznego zwi¡zku mierzonej absorbancji ze st¦»eniem
produktów o okre±lonym DP.
7. spektroskopowe: widmo skrobi w podczerwieni ulega zmianom podczas hydrolizy
za pomoc¡ glukoamylazy. Najwyra¹niejsze ró»nice obserwuje si¦ przy liczbie falowej
1078 cm−1 , gdzie nast¦puje znacz¡cy wzrost absorpcji, jak równie» przy 1020 cm−1 ,
gdzie obserwowane jest zmniejszenie jej intensywno±ci. Pierwsza zmiana zwi¡zana
jest z powstawaniem β -D-glukozy, druga natomiast z rozerwaniem wi¡zania α-1,4,
które blokuje drgania s¡siednich wi¡za« C-O oraz C-C .
Do metod chemicznych nale»y przede wszystkim oznaczanie wytworzonych cukrów
redukuj¡cych.
Bezpo±redni¡ metod¡ oznaczania aktywno±ci enzymów amylolitycznych jest pomiar
szybko±ci tworzenia produktów hydrolizy. Poniewa» podczas amylolizy tworz¡ si¦ grupy
redukuj¡ce, w oparciu o ich oznaczenie mo»na wnioskowa¢ o ilo±ci powstaªych cukrów.
Wykorzystuje sie oznaczenia:
23
1. z heksacyjano»elazianem(III) potasu (redukuje si¦ do heksacyjano»elazianu(II) po
tasu)
2. Somogyi-Nelsona (jony miedzi(II) redukuj¡ si¦ do miedzi(I), daj¡c barwn¡ reakcj¦
z arsenomolibdenianem)
3. z DNS (kwas 3,5-dinitrosalicylowy jest redukowany do kwasu 3-amino-5-nitrosalicylowego)
4. z CuSO4 i bichinolin¡ (jony miedzi(II) redukuj¡ si¦ do miedzi(I), daj¡c barwn¡
reakcj¦ z 4,4'-dikarboksy-2,2'-bichinolin¡
Oznaczanie produktów hydrolizy skrobi mo»liwe jest tak»e przy u»yciu nowoczesnych
metod instrumentalnych, gªównie chromatogracznych. W szczególno±ci nale»y wymieni¢
tutaj:
1. TLC - chromatogra¦ cienkowarstwow¡
2. HPLC - wysokosprawn¡ chromatogra¦ cieczow¡ wraz z jej odmiana chromatogra¡
»elow¡ (GPC)
3. HPAE-PAD - wysokosprawn¡ chromatogra¦ jonowymienn¡ z impulsow¡ detekcj¡
amperometryczn¡
2.6 Przemysªowe zastosowanie hydrolizy enzymatycznej skrobi.
Metoda enzymatycznej hydrolizy skrobi umo»liwia otrzymywanie szerokiej gamy mody
katów skrobiowych z du»¡ wydajno±ci¡ i efektywno±ci¡. Spo±ród produktów o najwi¦k
szym tona»u wyró»nia si¦ produkcj¦: syropów skrobiowych, maltodekstryn, syropu glu
kozowego i glukozy krystalicznej oraz syropów maltozowych a po dalszej przeróbce tak»e
takich nowoczesnych produktów jak syropy o wysokiej zawarto±ci fruktozy (High-Fructose
Corn Syrup; HFCS)
2.6.1 Produkcja maltodekstryn.
Produkcja maltodekstryn przebiega zgodnie ze Rysunkiem 2.6.1. Przygotowana suspen
sja skrobi w wodzie jest zakwaszana do pH odpowiedniego dla zastosowanego enzymu a
nast¦pnie uzupeªniana o jony wapnia oraz pierwsz¡ porcj¦ enzymu. Tak otrzymana zawie
sina poddawana jest dziaªaniu wysokiej temperatury, co z jednej strony uªatwia szybkie
skleikowanie skrobi z drugiej jednak powoduje inaktywacj¦ cz¦±ci dodanego enzymu. Po
skleikowaniu mieszanina reakcyjna jest ochªadzana do wªa±ciwej temperatury pracy en
zymu oraz uzupeªniana o kolejn¡ jego porcj¦. Po zako«czeniu procesu, czyli osiagni¦ciu
24
warto±ci DE 20-40 w zale»no±ci od zakªadanego stopnia hydrolizy enzym jest inaktywo
wany poprzez zakwaszenie ±rodowiska oraz podwy»szenie temperatury a otrzymany syrop
poddawany ltracji i oczyszczaniu na w¦glu aktywnym. Otrzymane w ten sposób malto
w o d n a z a w ie s in a s k r o b i
( 3 0 - 4 0 %
w / v ; p H 6 .5
C a 2 + ; a - a m y la z a )
k le ik o w a n ie
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m
(a - a m
in
h y d r o liz a
y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g
9 0 - 1 2 0 m in )
in a k t y w a c j a e n z y m u
( p H 3 - 5 ; 1 0 0 d e g ;
5 m in )
f ilt r a c j a i o c z y s z c z a n ie
S Y R O P
S K R O B I O W
Y
M A L T O D E K S T R Y N Y
Rysunek 13: Enzymatyczna produkcja maltodekstryn
dekstryny posiadaj¡ nast¦puj¡cy ±redni skªad: 0,3-1,6% glukozy, 0,9-5,8% maltozy, 4-11%
maltotriozy i 1,4-6,1% maltotetraozy. Reszt¦ stanowi¡ poli- i oligo-sacharydy o DP > 4.
Maltodekstryny charakteryzuj¡ si¦ mi¦dzy innymi takimi wªa±ciwo±ciami jak: niska higro
skopijno±¢, wysoka lepko±¢, a tak»e bardzo niska sªodko±¢ (w sensie sensorycznym) oraz
wªasno±ci hamuj¡ce wzrost kryszatªów w takich substancjach spo»ywczych jak lody. Impli
kuje to ich szerokie zastosowanie w przemy±le spo»ywczym (produkcja lodów i cukierków)
i farmaceutycznym (powlekanie tabletek i produkcja syropów). Ponadto ze wzgl¦du na
skªonno±¢ do kapsuªkowania aromatów wykorzystywane by¢ mog¡ do ochrony zwi¡zków
maªocz¡steczkowych (np. aromatów »ywno±ci, skªadników leków itp.) przed utlenianiem.
Nowoczesne zastosowania maltodekstryn w przemy±le spo»ywczym skupiaj¡ si¦ na stoso
waniu ich jako zamienników tªuszczy, od»ywkach dla sportowców oraz ±rodkach spo»yw
czych dla niemowl¡t.
2.6.2 Produkcja syropów glukozowych/glukozy krystalicznej
Produkcja syropów glukozowych metod¡ enzymatyczn¡ jest procesem wielostopniowym
(Rysunek 2.6.2). Etapy wst¦pne, a wi¦c otrzymywanie suspensji skrobi oraz jej kleikowanie
25
s¡ identyczne z procesem otrzymywania maltodekstryn podobnie jak wst¦pne upªynnienie
kleiku skrobiowego przy u»yciu α-amylazy. Kolejnym etapem procesu jest w przypadku
syropów glukozowych scukrzanie upªynnionej skrobi a» do warto±ci DE ok 95 w celu
otrzymania maksymalnej wydajno±ci glukozy. Warto±¢ graniczna DE = ok. 95 wynika z
mo»liwej reakcji repolimeryzacji glukozy przy wysokich jej st¦»eniach w obecno±ci amy
loglukozydazy. Kolejne etapy procesu obejmuj¡ oczyszczanie produktu (usuwanie biaªek
i tªuszczy), dekoloryzacj¦ (na w¦glu aktywnym) oraz usuwanie skªadników mineralnych
(kolumny jonowymienne). Syropy glukozowe produkowane metod¡ enzymatyczn¡ zawie
( 3 0 - 4 0 %
w / v ; p H 6 .5
C a 2 + ; a - a m y la z a )
k le ik o w a n ie
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m
(a - a m
in
h y d r o liz a
y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g
D E < 1 5 )
s c u k r z a n ie
( D E > 9 6 ; a m y lo g lu k o z y d a z a , p u llu n a la z a ;
p H 4 .5 ; 5 5 - 6 0 d e g ; 4 8 - 9 6 h
S Y R O P
G L U K O Z O W
Y
Rysunek 14: Produkcja syropu glukozowego.
raj¡ 94-98% glukozy, 1-3% maltozy, 0,3-0,5% maltotriozy i do 2% wy»szych polisachary
dów. Syropy te wykorzystywane s¡ w procesach biotechnologicznych bez udziaªu dro»d»y
(produkty farmaceutyczne, synteza organiczna, produkcja witamin), do produkcji glukozy
krystalicznej oraz syropów fruktozowych (np. HFCS). Z glukozy otrzymuje si¦ te» tzw.
polidekstroz¦ o niskiej kaloryczno±ci oraz sorbitol.
2.6.3 Produkcja syropów maltozowych i syropu wysokoscukrzonego.
Zarówno syropy maltozowe jak i syrop wysokoscukrzony produkowane s¡ metod¡ enzyma
tyczn¡ dwustopniow¡. W pierwszym etapie po otrzymaniu suspensji skrobiowej poddaje
si¦ j¡ kleikowaniu a nast¦pnie upªynnieniu (do DE max. 10 w przypadku syropów mal
tozowych i DE = 38-40 w przypadku syropu wysokoscukrzonego). Drugi etap procesu
polega zwykle na procesie scukrzania enzymatycznego i de facto prowadzi do otrzymania
wªa±ciwego ko«cowego produktu. W przypadku syropów maltozowych proces ten prowa
dzi¢ mo»na na dwa sposoby (Rysunek 2.6.3) stosuj¡c ró»ne enzymy i warunki prowadze
26
( 3 0 - 4 0 %
w / v ; p H 6 .5
C a 2 + ; a - a m y la z a )
k le ik o w a n ie
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m
in
h y d r o liz a D E 5 - 1 0
(a - a m y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g
9 0 - 1 2 0 m in )
s c u k r z a n ie D E > 9 6 ;
( a - m y la z a lu b b - a m y la z a ;
p H 5 .0 - 5 .5 ; 5 0 - 5 5 d e g )
(a - a m
s c u k r z a n
( a - m y la z a
p u llu la n a z a
p H 6 .0 ;
ie D E 4 5
lu b b - a m
lu b iz o a
5 0 - 5 5 d e
m
- 6 0
y la z a ;
y la z a
g )
s c u k r
( a - m y la
a m y
p H
Y
M A
O W
Z A W
M
( 7
S Y R
L T O
Y S
A R
A L T
0 - 8
z a n ie D
z a lu b b
lo g lu k o
6 .0 ; 7 5
E
- a
z y
d
6 0
m
d a
e g
)
O P
Z O
O K
T O
O Z
5 %

W
n e )
- 7 0
y la z a ;
z a
in a k t y w a c j a e n z y m
( 8 0 - 8 5 d e g ;
1 5 m in )
S Y R O P
M A L T O Z O W
h y d r o liz a D E 3 8 - 4 0
y la z a ; r o d . k w a
u
Y
I E J
C I
Y
)
W
S Y R O P
Y S O K O S C U K R Z O N Y
Rysunek 15: Proces otrzymywania syropu wysokoscukrzonego i syropów maltozowych.
nia procesu otrzymuj¡c syropy o ró»nej zawarto±ci maltozy. Zastosowanie enzymów usu
waj¡cych rozgaª¦zienia (pullulanaza lub izoamylaza) umo»liwia peªn¡ hydroliz¦ zarówno
amylozy jak i amylopektyny, co skutkuje wysok¡ zawarto±ci¡ zwi¡zków niskocz¡steczko
wych (zwªaszcza maltozy). W produkcji syropu wysokoscukrzonego równie» stosuje si¦
mieszanin¦ enzymów (α-amylaza i amyloglukozydaza) w celu zwi¦kszenia stopnia kon
wersji. Syropy maltozowe otrzymywane metod¡ enzymatyczn¡ znajduj¡ zastosowanie w
piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do »yw
no±ci uªatwia kontrol¦ wodochªonno±ci. Syropy te stosuje si¦ tak»e jako wypeªniacze i
stabilizatory »ywno±ci przetworzonej. Mo»na je, podobnie jak maltodekstryny, stosowa¢
do opó¹niania wzrostu krysztaªów. Dodatkowo z syropu o wysokiej zawarto±ci maltozy
produkuje si¦ maltoz¦ krystaliczn¡ wykorzystywan¡ do w produkcji leków jako zamiennik
glukozy dla diabetyków, maltitolu, maltulozy. Syropy te charakteryzuj¡ si¦ nisk¡ lepko±ci¡
w roztworach, nisk¡ higroskopijno±ci¡ oraz stabilno±ci¡ w podwy»szonych temperaturach.
2.6.4 Inne zastosowania
Wytwarzanie polialkoholi Cukry otrzymywane w syropiarniach mog¡ by¢ poddawane
katalicznemu uwodornieniu, poª¡czonemu z rozdziaªem chromatogracznym. Umo»liwia to
w miare efektywn¡ produkcj¦ polialkoholi, takich jak sorbitol, ksylitol, maltitol i erytritol.
27
Produkcja kwasów organicznych
Kwas cytrynowy jest najwa»niejszym kwasem organicznym, produkowanym w du
»ych ilo±ciach i wykorzystywanym w przemy±le spo»ywczym i farmaceutycznym. Wi¦ksza
cz¦±¢ produkcji opiera si¦ na Aspergillus niger. ródªem w¦gla mog¡ by¢ mi¦dzy innymi
hydrolizaty skrobiowe i inne po»ywki oparte na skrobi
Kwas mlekowy produkowany jest gªównie w oparciu o maltoz¦ i glukoz¦. Bezpo
±rednia hydroliza skrobi jest mo»liwa przy udziale bakterii kwasu mlekowego: Lactobacillus
thermophillus oraz Lactobacillus amylophillus.
Inne kwasy organiczne produkowane w syropiarniach to kwas itakonowy (do pro
dukcji tworzyw sztucznych, farb i lakierów) i glukonowy (prepearaty do czyszczenia, gluko
niany wapnia, magnezu i »elaza wykorzystywane s¡ jako dodatki wzbogacaj¡ce produkty
spo»ywcze w odpowiednie sole mineralne).
Piekarstwo Preparaty amylolityczne s¡ wykorzystywane przy produkcji pieczywa w
celu zwi¦kszenia zawarto±ci cukrów w cie±cie, zintensykowania fermentacji, a co za tym
idzie zwi¦kszenia obj¦to±ci mi¦kiszu i porowato±ci, poprawy koloru skórki, oraz polepszenia
smaku i zapachu pieczywa. Powstaj¡ce w wyniku dziaªania α-amylazy niskocz¡steczkowe
dekstryny wpªywaj¡ na przedªu»enie trwaªo±ci pieczywa, gdy» utrudniaj¡ powstawanie
poª¡cze« pomi¦dzy skrobi¡ i glutenem oraz spowalniaj¡ retrogradacj¦ skrobi.
Gorzelnictwo i browarnictwo ródªem skrobi do produkcji etanolu mog¡ by¢ ró»ne
ro±liny, np. kukurydza, pszenica, ziemniaki, maniok. Poniewa» dro»d»e zazwyczaj nie s¡
zdolne do hydrolizy skrobi, u»ywa si¦ do tego celu preparatów enzymatycznych. Du»e
ilo±ci preparatów amylolitycznych zu»ywane s¡ tak»e przez browary, przy produkcji piwa,
podczas zacierania (przy stosowaniu surowców niesªodowanych) i klarowania. Zastosowa
nie w browarnictwie surowców niesªodowanych i preparatów enzymatycznych zwi¦ksza
wydajno±¢ warzelni i obni»a koszty zwi¡zane z budow¡ i eksploatacj¡ sªodowni.
Produkcja acetonu i butanolu W roku 1914 Chaim Weizmann wyizolowaª Clostri
dium acetobutylicum, bakteri¦ zdoln¡ do przetwarzania skrobi w aceton i butanol. Ze
wzgl¦du na znaczenie militarne (produkcja nitrocelulozy) proces Weizmanna zostaª szybko
wdro»ony i byª powszechnie wykorzystywany do ko«ca drugiej wojny ±wiatowej. Obecnie
28
(2003) technologia ta stosowana jest jeszcze w niektórych zakªadach na terenie Federa
cji Rosyjskiej. Ze wzgl¦dów ekologicznych technologia ta ma pewne szanse na powtórne
wprowadzenie w innych krajach.
Produkcja pasz Dodatek odpowiednich enzymów do pasz mo»e poprawia¢ ich przyswa
jalno±¢, co obni»a wska¹nik zu»ycia pasz na przyrost ci¦»aru ciaªa. Do produkcji prepara
tów dla celów paszowych szczególnie nadaje si¦ Aspergillus oryzae, wytwarzaj¡cy enzymy
amylolityczne i proteolityczne. Preparaty enzymatyczne mog¡ by¢ stosowane w procesie
ich produkcji lub jako bezpo±redni dodatek do gotowych mieszanek paszowych.
Biodegradacja α-Amylaza jest wykorzystywana jako dodatek przyspieszaj¡cy bio
degradacj¦ na skªadowiskach odpadów oraz w oczyszczalniach ±cieków.
Usuwanie zanieczyszcze« skrobiowych Zanieczyszczenia skrobiowe mog¡ by¢ usu
wane z ró»nego rodzaju produktów spo»ywczych i niespo»ywczych. Glukoamylaza jest wy
korzystywana do klarowania wina i soków owocowych. Wytªoki jabªkowe, u»ywane jako
surowiec w produkcji pektyny zawieraj¡ pewne ilo±ci skrobi. Ich obecno±¢ powoduje silne
zm¦tnienie soku pektynowego i wpªywaj¡ niekorzystnie na proces ltracji. Usuwanie skrobi
mo»na przeprowadza¢ ró»nymi metodami, (samosklarowanie, dodatek taniny, ozi¦bianie,
ltracja), jednak najkorzystniejsze jest u»ycie do tego celu α-amylazy o optimum pH 34.
W przemy±le wªókienniczym u»ywa si¦ substancji sklejaj¡cych osnow¦ zawieraj¡cych skro
bi¦ lub jej hydrolizaty. W procesie odklejania tkanin konieczne jest dokªadne usuni¦cie
klejonki, która przeszkadza w dalszych etapach technologicznych (bielenie, farbowanie,
tªoczenie). W tym celu u»ywa si¦ preparatów α-amylazy. Podobne preparaty mog¡ by¢
u»ywane tak»e do innych celów (oczyszczanie papieru, mycie naczy«, proszki do prania
itp.).
Zastosowania analityczne Badanie produktów hydrolizy skrobi ma istotne znaczenie
w poznaniu budowy ziarenek skrobiowych, jak i wewn¦trznej struktury amylopektyny.
Najcz¦±ciej wykorzystywane s¡ w tym celu egzoamylazy, gªównie β -amylaza, bowiem po
zostaj¡ce po ich dziaªaniu dekstryny graniczne dostarczaj¡ istotnych informacji na temat
rozgaª¦zie«. Przykªadem zastosowania skrobi pozbawionej rozgaª¦zie« do celów analitycz
nych jest wykorzystanie jej jako wzorca do kalibracji mas cz¡steczkowych w chromatogra
i »elowej. α-Amylaza wykorzystywana jest tak»e przy oznaczaniu niestrawnego bªonnika
pokarmowego (non-digestible ber)
29
2.7 wiczenia laboratoryjne
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi
z dokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez
1 godz. Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢.
Z ró»nicy mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik
przedstawi¢ z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
2.7.2 Przeprowadzenie hydrolizy
Na wadze analitycznej odwa»y¢ 1,75g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ zawar
to±¢ wody równ¡ 20% a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡ poprawk¦).
Odwa»on¡ skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do wytarowanej kolby sto»kowej o poj. 300cm3 .
Zawarto±¢ uzupeªni¢ wod¡ destylowan¡ do masy 200g. Kolb¦ umie±ci¢ na wrz¡cej ªa¹ni
wodnej na okres 5 minut intensywnie mieszaj¡c zawarto±¢ (w celu otrzymania homogenicz
nego kleiku). Nast¦pnie otrzymany kleik gotowa¢ (stosuj¡c palnik gazowy) pod chªodnic¡
zwrotn¡ przez kolejne 5minut. Caªo±¢ schªodzi¢ do temperatury 60◦C (50◦C lub 40◦C w
zale»nosci od grupy) i po wytarciu kolby z zewn¡trz uzupeªni¢ ewentualne ubytki wody
do caªkowitej masy mieszaniny 200g. Caªo±¢ starannie wymiesza¢ i pobra¢ próbk¦ zerow¡
do oznaczenia redukcyjno±ci (5 cm3 ). Do pozostaªej próbki doda¢ 0,5 cm3 roztworu en
zymu i zawarto±¢ intensywnie wymiesza¢. Hydroliz¦ prowadzi¢ w temperaturach 60◦C
50◦C i 40◦C (zale»nie od grupy). Przed ka»dorazowym pobraniem próbki zawarto±¢ kolby
wymiesza¢. Próbki do bada« pobra¢ po 2, 5, 8 15, 25, 45, 65, 80 i 90 minutach.
2.7.3 Wykonanie oznaczenia redukcyjno±ci
W badaniach posªu»y¢ si¦ krzyw¡ wzorcow¡ otrzyman¡ w trakcie ¢wicze« nt. hydrolizy
kwasowej. Do próbówek odmierzy¢ 5 cm3 mieszaniny pªynów Fehlinga, 5 cm3 próbki oraz
15 cm3 wody. Próbk¦ ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni przez 5min, przenie±¢ do probówek wirów
kowych i odwirowa¢ (2 min, 5000 rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofotometryczny jak
opisano to dla krzywej wzorcowej w ¢wiczeniu nt hydrolizy kwasowej. Okre±li¢ warto±¢
DE dla kolejnych próbek i sporz¡dzi¢ wykres jego warto±ci w zale»no±ci od czasu.
2.7.4 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wyniki
bada«, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymane dane nale»y skomentowa¢ i
30
wyci¡gn¡¢ wnioski. Porówna¢ tak»e dynamik¦ zmian DE w zale»no±ci od rodzaju hydrolizy
(kwasowa, enzymatyczna) oraz temperatury.
Utlenianie skrobi
31
3 Chemiczna modykacja skrobi: utlenianie
3.1 Wst¦p
Skrobie uzyskiwane bezpo±rednio z materiaªu biologicznego (tzw. naturalne lub natywne)
maj¡, ze wzgl¦du na swoje cechy funkcjonalne, ograniczone zastosowanie praktyczne.
Znacznie cz¦±ciej w procesach technologicznychuzywa si¦ skrobi zmodykowanych, w któ
rych surowiec ten poprzez poddanie go procesom zycznym, chemicznym, biologicznym
lub innym dostosowuje si¦ do wymogów procesów technologicznych. Modykacja taka w
znacz¡cy sposób wpªywa na polepszenie warto±ci u»ytkowych produktu oraz trwaªo±ci i
stabilno±ci wyrobu podczas jego przechowywania. Modykacja chemiczna poprzez stosun
kowo ªatwe wprowadzenia do polimeru nowych atomów lub grup funkcyjnych stanowi uni
wersalne narz¦dzie zmiany wªa±ciwo±ci polimerów i biopolimerów, w tym skrobi. Jednostki
glukozowe wchodz¡ce w skªad ªa«cuchów skrobiowych posiadaj¡ wolne grupy hydroksy
lowe, które s¡ podatne na dziaªanie wielu klas zwi¡zków organicznych i nieorganicznych.
Modykacjom chemicznym poddawa¢ mo»na zarówno skrobi¦ ziarnist¡, skleikowan¡ jak
równie» wytr¡con¡ przed reakcj¡ (np. alkoholem etylowym). Modykacja skrobi ziarnistej
powoduje, »e reakcji ulegaj¡ jedynie zewn¦trzne warstwy ziarenek skrobi a szczególnie
ich powierzchnia. Procesy chemicznej modykacji skrobi bez wzgl¦du na stosowane czyn
niki modykuj¡ce oraz metod¦ ich przeprowadzania mo»na sprowadzi¢ do trzech zasad
niczych reakcji: estrykacji, eterykacji i utleniania. Proces utleniania skrobi sprowadza
si¦ do utleniania pierwszo- lub drugo-rz¦dowych grup hydroksylowych jednostek glukozo
wych z wytworzeniem grup karboksylowych lub karbonylowych. Ilo±¢ utworzonych grup
zale»na jest mi¦dzy innymi od rodzaju utleniacza, warunków prowadzenia procesu oraz
pochodzenia botanicznego polisacharydu. Reakcji utleniania mo»e towarzyszy¢ cz¦±ciowa
depolimeryzacja ªa«cuchów polimerowych lub/oraz rozlu¹nienie wi¡za« mi¦dzycz¡steczko
wych. Reakcje utleniania skrobi prowadzi¢ mo»na stosuj¡c jako czynniki utleniaj¡ce takie
substancje jak: tlen lub powietrze (z zastosowaniem jako katalizatorów jonów metali przej
±ciowych), nadtlenki nieorganiczne np. H2 O2 lub organiczne, utleniacze na bazie zwi¡zków
chlorowców (Br2 , NaClO NaIO4 itp.), zwi¡zki azotu (N2 O4 , HNO3 ), zwi¡zki metali (np.
CrO3 ) oraz utleniacze organiczne. Szczególnym przypadkiem utlenienia, któremu mo»e
podlega¢ ka»dego materiaª organiczny a wi¦c i skrobia jest reakcja spalania prowadz¡ca
do tlenku w¦gla (IV) i wody. Spo±ród wy»ej wymienionych poª¡cze« o charakterze elek
tronatorów najwi¦ksze znaczenie maj¡: chloran(I) sodu, jodan(VII) sodu oraz nadtlenek
wodoru.
32
Utlenianie skrobi
3.1.1 Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu
Skrobia utleniona chloranem (I) sodu znana jest jako tzw. skrobia chloranowana (ang.
chlorinated starch ) pomimo, »e w struktur¦ ªa«cucha skrobiowego nie zostaj¡ wbudo
wane atomy chloru. Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu prowadzi si¦ w roz
tworach skleikowanego polimeru. W reakcji tej utlenieniu do grup karboksylowych ulega
cz¦±¢ pierwszorz¦dowych grup hydroksylowych (przy w¦glu C1). Grupy te ulegaj¡ utlenie
niu zarówno do grup karbonylowych (aldehydowych) jak i karboksylowych. W zale»no±ci
od warunków prowadzenia procesu utlenienie ulega jedna grupa hydroksylowa na 35 do
50 jednostek glukozowych. W wi¦kszo±ci wypadków procesowi utleniania chloranem (I)
sodu towarzyszy cz¦±ciowa depolimeryzacja (degradacja) ªa«cuchów polisacharydowych.
Stopie« utlenienia skrobi zale»y gªównie, oprócz st¦»enia utleniacza, od pH ±rodowiska
CH2OH
O
OH
glukoza
O
O
glukoza
OH
NaClO
CHO
COOH
O
O
OH
OH
glukoza
O
O
OH
glukoza
glukoza
O
O
glukoza
OH
Rysunek 16: Utlenianie skrobi przy pomocy NaClO
i pochodzenia botanicznego skrobi. Wysokie st¦»enie utleniacza umo»liwia transformacj¦
wi¦kszej ilo±ci grup podobnie jak ni»sze pH (reakcje prowadzi¢ jednak nale»y przy pH
lekko zasadowym). Ró»n¡ ilo±¢ utlenionych grup hydroksylowych otrzymuje si¦ te» w za
le»no±ci od pochodzenia botanicznego skrobi co wynika¢ mo»e z ró»nej zawarto±ci biaªek
w materiale wyj±ciowym. Przyjmuje si¦, i» w warunkach reakcji najpierw utleniane s¡
biaªka a dopiero potem skrobia. Wªasno±ci skrobi utlenionej NaClO ró»ni¡ si¦ od tych
obserwowanych dla skrobi naturalnej. Wykazuje ona mi¦dzy innymi wi¦ksz¡ stabilno±¢ w
wysokiej temperaturze, jest bardziej oporna na dziaªanie enzymów (α, β i γ amylaz) oraz
wykazuje zdolno±¢ do kompleksowania jonów wapnia, zachowuj¡c si¦ przy tym jako po
lielektrolit. Skrobia utleniona NaClO daje tak»e roztwory, pozbawione charakterystycznej
dla skrobi natywnej opalizacji a kleiki ze skrobi utlenionej wykazuj¡ mniejsz¡ lepko±¢. Kle
iki te nie retrograduj¡. Spo±ród skrobi utlenionych tylko skrobia utleniona NaClO (E 1404)
Utlenianie skrobi
33
mo»e by¢ stosowana jako dodatek do »ywno±ci. Preparaty zawieraj¡ce skrobi¦ utlenian¡
chloranem(I) sodu stosuje si¦ jako stabilizatory przy produkcji ketchupów i do produkcji
nadzie« do ciast, jak równie» jako zag¦stniki i pomocnicze ±rodki »eluj¡ce mi¦dzy innymi
do sosów, galaretek, budyniów i kremów. Tak zmodykowana skrobia sªu»y tak»e jako
±rodek pomocniczy w przemy±le papierniczym w celu zwi¦kszenia odporno±ci papieru na
zrywanie.
3.1.2 Utlenianie skrobi w obecno±ci jodanu(VII) sodu
Dziaªaj¡c na skrobi¦ jodanem(VII) sodu (lub kwasem jodowym(VII)) otrzymuje si¦ tzw.
skrobi¦ dialdehydow¡ (DAS). W modykacie tym wi¡zanie pomi¦dzy w¦glem C2 i C3
ulega rozerwaniu z wytworzeniem na ka»dym z tych atomów grup karbonylowych (aldehy
dowych). Utlenianie skrobi DAS na przykªad przy u»yciu Br2 lub NaClO2 prowadzi nato
miast do powstania tzw. skrobi dikarboksylowej (DCS) w której wspomniane grupy alde
hydowe utlenione s¡ do grup karboksylowych. Obok procesu z udziaªem NaClO utlenianie
NaIO4 jest gªówn¡ metod¡ przemysªowego utleniania skrobi. Skrobi¦ dialdehydow¡ wyko
CH2OH
O
OH
glukoza
O
O
glukoza
OH
NaIO4
CH2OH
CH2OH
O
O
[O]
glukoza
O
O
CHO CHO
glukoza
glukoza
O
O
glukoza
COOH COOH
Rysunek 17: Utlenianie skrobi przy pomocy NaIO4
rzystuje si¦ jako substancj¦ zag¦szczaj¡c¡ w po»ywkach dla bakterii tlenowych i dro»d»y
jak równie» jako czynnik utrwalaj¡cy zapach (matryca do mikrokapsuªkowania). Skrobi¦
DAS wykorzystuje si¦ tak»e jako dodatek w przemy±le tworzyw sztucznych zwi¦kszaj¡cy
wytrzymaªo±¢ i rozpuszczalno±¢ w wodzie materiaªów pomocniczych. Skrobia dialdehy
dowa charakteryzuje si¦ spadkiem lepko±ci i masy cz¡steczkowej w porównaniu do skrobi
naturalnych a zmiany te zale»ne s¡ od stopnia utlenienia oraz od warunków prowadzenia
procesu. Skrobi¦ utlenion¡ wykorzystuje si¦ tak»e w produkcji jadalnej folii skrobiowej
oraz jako skªadnik ±rodków czysto±ci i tworzyw biodegradowalnych jak równie» substancji
34
Utlenianie skrobi
spowalniaj¡cych korozj¦.
3.1.3 Utlenianie skrobi w obecno±ci H2 O2
Nadtlenek wodoru jest jednym z coraz cz¦±ciej stosowanych utleniczy. Dzieje si¦ tak przede
wszystkim ze wzgl¦du na jego walory proekologiczne: brak toksycznych odpadów poreak
cyjnych czy te» bezpiecze«stwo stosowania. Spo±ród utleniaczy H2 O2 wykazuje jedn¡ z
najwi¦kszych zawarto±ci aktywnego tlenu - 47% (odpowiednio dla NaClO - 21,6%, dla
NaIO4 - 7,0%) oraz bardzo wysoki potencjaª utleniania - 1,77V (odpowiednio dla NaClO
- 1,63V, dla NaIO4 - 1,6V). Pomimo swojej atrakcyjno±ci nie jest on na razie powszech
nie stosowany jako utleniacz co wynika z jego niskiej reaktywno±ci wzgl¦dem wi¦kszo±ci
organicznych grup funkcyjnych oraz faktu, »e w obecno±ci poª¡cze« o charakterze elektro
lowym zachowuje si¦ jako nukleol nieprzejawiaj¡cy wªasno±ci utleniaj¡cych. Ta nieko
rzystna z punktu widzenia technologicznego wªa±ciwo±¢ wyeliminowana mo»e by¢ poprzez
aktywacj¦ nadtlenku wodoru gªównie poprzez zastosowanie katalizatorów na bazie soli
metali grup przej±ciowych (Cu, Fe, W, Pd, Ni, itp.). Reakcja utleniania przy u»yciu H2 O2
katalizowana przez zwi¡zki metali mo»e mie¢ charakter jonowy lub rodnikowy. W przy
padku zwi¡zków »elaza i miedzi dominuje mechanizm rodnikowy. Proces ten nosi nazw¦
reakcji Fentona. Utleniona w ten sposób skrobia zawiera grupy aldehydowe, które mog¡
-
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + OH + OH
CH2OH
CHOH
O
O
+
OH
glukoza
O
O
OH
glukoza
+
OH
glukoza
O
O
OH
OH
CHOH
CHO
O
O
OH
glukoza
+
O
O
Fe3+
glukoza
+
+
H
+
Fe2+
OH
glukoza
O
O
OH
glukoza
OH
CHOH
CHO
O
O
OH
glukoza
H2O
glukoza
+
O
O
OH
glukoza
H2O2
+ H2O
OH
glukoza
O
O
glukoza
+ OH
OH
Rysunek 18: Utlenianie skrobi w procesie Fentona
tak»e by¢ utleniane "gª¦biej" a» do stadium kwasów karboksylowych. W metodzie utle
Utlenianie skrobi
35
niania skrobi przy u»yciu nadtlenku wodoru podobnie jak jest to w przypadku NaClO
obserwuje si¦ depolimeryzacj¦ ªa«cucha polisacharydowego. Porównuj¡c oba opisywane
sposoby utleniania obserwuje si¦ tak»e wy»szy stosunek zawarto±ci grup karboksylowych
-COOH do karbonylowych -CHO ni» dla skrobi utlenionej NaClO.
3.1.4 Przemysªowe metody utleniania skrobi
Najbardziej popularn¡ i najszerzej stosowan¡ metod¡ przemysªowego utleniania skrobi
jest proces wykorzystuj¡cy jako utleniacz chloran (I) sodu. Proces utleniania przebiega w
ªagodnym re»imie temperaturowym (do 35◦ C) i w ±rodowisku alkalicznym. Proces prowa
dzi si¦ do zaniku reakcji na chlor lub cz¦±ciej przerywaj¡c j¡ po osi¡gni¦ciu odpowiedniej
lepko±ci przez zastosowanie ±rodka redukuj¡cego (tiosiarczan sodu, tlenek siarki(IV)). Po
niewa» utlenianie skrobi NaClO jest reakcj¡ egzotermiczn¡ temperatur¦ procesu reguluje
si¦ szybko±ci¡ dodawania utleniacza lub przez bezpo±rednie chªodzenie reaktora. Otrzy
man¡ mieszanin¦ reakcyjn¡ zoboj¦tnia si¦, suszy i pakuje. Tak otrzymana skrobia utle
niona (ang. Oxidised starch ) stosowana jest jako dodatek do »ywno±ci (E1404). Skrobie
( o k . 3 8 %
w / v ; p H 9 - 1 0
3 0 - 3 5 oC ,; 3 %
N a O H )
N a C lO
( 3 - 4 5 g C l/
1 k g s m s k r o b i)
r e a k c j a
u t le n ie n ia
p r z e r w a n ie r e a k c j i
( N a 2 S O 3 )
z o b o jê t n ia n ie
( H C l; p H o k . 6 )
S K R O B I A
U T L E N I O N A
o d w a d n ia n ie ,
s u s z e n ie
( d o
P r z e m y w a n ie
w o d ¹
z a n ik u r e a k c j i n a
C l-)
Rysunek 19: Przemysªowy proces utleniania skrobi chloranem(I) sodu
dwuladehydow¡ otrzymuje si¦ w zbli»onych temperaturach jednak w silnie kwa±nym ±ro
dowisku (pH ok. 1) zadaj¡c zawiesin¦ ziaren skrobiowych w wodzie kwasem jodowym
(VII).
36
Utlenianie skrobi
3.2 Wykonanie ¢wiczenia
dokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
3.2.2 Przeprowadzenie reakcji utleniania
3.2.3 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy H2 O2
Sporz¡dzenie roztworu katalizatora
Odpowiedni¡ ilo±¢ pi¦ciowodnego siarczanu(VI) miedzi(II) lub siedmiowodnego siar
czanu(VI) »elaza(II) rozpu±ci¢ w 150ml wody destylowanej. Ilo±¢ katalizatora dobra¢ w
ten sposób aby stanowiª on 0,1% u»ytej w reakcji skrobi (100g).
Reakcja utleniania
Ze 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi, roztworu katalizatora oraz wody de
stylowanej sporz¡dzi¢ 40%w/w dyspersj¦ skrobi w wodzie. Naczynie z zawiesin¡ umie±ci¢
w ªa¹ni wodnej o temperaturze 40◦ C i ogrzewa¢ przez okres 60min stosuj¡c mieszanie
mechaniczne i wkraplaj¡c przy tym 10% roztwor H2 O2 w takiej ilo±ci aby ko«cowe st¦
»enie tego zwi¡zku w mieszaninie wynioslo 2%. Po wkropleniu utleniacza caªo±¢ miesza¢
w temperaturze reakcji przez dalsze 30min. Po zako«czeniu procesu skrobi oddzieli¢ od
roztworu na lejku Buechnera (intensywnie przepªukuj¡c materiaª wod¡ destylowan¡) i wy
suszy¢ w temperaturze 40◦ C. W otrzymanym materiale oznaczy¢ zawarto±¢ suchej masy
oraz zawarto±¢ grup karbonylowych i karboksylowych.
3.2.4 Reakcja utleniania skrobi przy pomocy NaClO
Ze 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi oraz wody destylowanej sporz¡dzi¢ 40%
dyspersj¦ skrobi w wodzie. pH zawiesiny nale»y ustali¢ na 10 przy pomocy roztworu NaOH
(o st¦»eniu 2mol/dm3 ) korzystaj¡c z pehametu elektronicznego. Otrzyman¡ suspensj¦ mie
sza¢ przy u»yciu mieszadªa mechanicznego w temperaturze pokojowej wkraplaj¡c do niej
roztwór chloranu(I) sodu (15% roztwór wodny o aktywno±ci 98gCl/1000g roztworu) w
ilo±ci takiej by byªa ona równowa»na 20g chloru na 100g skrobi. Po zako«czeniu wkra
plania caªo±¢ miesza¢ przez 50min. Nast¦pnie przy pomocy roztworu H2 SO4 (1mol/dm3 )
Utlenianie skrobi
37
obni»y¢ pH suspensji do 7. Otrzymany produkt oddzieli¢ na lejku Buechnera (intensywnie
przepªukuj¡c materiaª wod¡ destylowan¡) i wysuszy¢ w 30◦ C. W otrzymanym materiale
oznaczy¢ zawarto±¢ suchej masy oraz zawarto±¢ grup karbonylowych i karboksylowych.
3.2.5 Oznaczenie zawarto±ci grup karboksylowych w skrobi utlenionej
W kolbce sto»kowej o pojemno±ci 100cm3 odwa»y¢ 5g skrobi wyj±ciowej z dokªadno±ci¡ do
0,0001 g (w przeliczeniu na such¡ substancj¦), doda¢ 25cm3 HCl (o st¦»eniu 0,1mol/dm3 ),
a nast¦pnie otrzyman¡ zawiesin¦ wytrz¡sa¢ przez 30minut w temperaturze pokojowej.
Po tym czasie zawarto±¢ kolbki przeltrowa¢ pod pró»ni¡ przez lejek Schotta i przemy¢
porcjami wod¡ destylowan¡ (okoªo 400cm3 ) do momentu zaniku reakcji na chlorki (próba
z AgNO3 ). Po przemyciu przenie±¢ próbk¦ do zlewki o pojemno[ci 500cm3 i doda¢ 300cm3
wody destylowanej intensywnie mieszaj¡c. Zlewk¦ umie±ci¢ we wrz¡cej ªa¹ni wodnej na
15minut, mieszaj¡c od czasu do czasu zawiesin¦. Skleikowan¡ próbk¦ skrobi miareczkowa¢
na gor¡co 0,1M roztworem NaOH do warto±ci pH = 8,3. Tak samo post¡pi¢ w przypadku
skrobi utlenionej. Obliczy¢ procentow¡ zawarto±¢ grup karboksylowych wiedz¡c »e na 1mol
grup karboksylowych w skrobi przypada 1mol NaOH.
3.2.6 Oznaczenie zawarto±ci grup karbonylowych w skrobi utlenionej
Sporz¡dzi¢ roztwór chlorowodorku hydroksyloaminy przez rozpuszczenie 0,69g chlorowo
dorku hydroksyloaminy w 100cm3 wody destylowanej. Odwa»y¢ 3g skrobi wyj±ciowej. Do
nawa»ki doda¢ 40cm3 sporz¡dzonego roztworu NH2 OH·HCl oraz 50cm3 roztworu NaOH
(o st¦»eniu 0,1mol/dm3 ). Zawiesin¦ umie±ci¢ na mieszadle magnetycznym i miesza¢ przez
30min w temperaturze pokojowej. Nadmiar NaOH odmiareczkowa¢ roztworem HCl (o
st¦»eniu 0,1mol/dcm3 ) do pH=4 (z zastosowaniem pehametru elektronicznego). Pomiar
powtórzy¢ dla otrzymanych próbek skrobi utlenionej. Równolegle wykona¢ ±lep¡ prób¦
dla próbki niezawieraj¡cej chlorowodorku hydroksylaminy. Obliczy¢ zawarto±¢ procentow¡
grup karbonylowych.
3.3 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, a
przede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy
ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ ilo±ci grup karbonylowych i karbok
sylowych otrzymanych w produktach utleniania ró»nymi utleniaczami.
38
Estrykacja skrobi
4 Chemiczna modykacja skrobi: estrykacja
4.1 Wst¦p
Skrobia jako w¦glowodan nale»y do grupy polialkoholi. Wszystkie poª¡czenia z tej grupy
zawieraj¡ grupy hydroksylowe podatne na reakcje z kwasami lub ich pochodnymi. Pro
duktami takich transformacji s¡ estry. W skrobi skªadaj¡cej si¦ z powtarzalnych jednostek
glukozowych dla reakcji estryakcji dost¦pnych jest dwie lub trzy grupy hydroksylowe (w
tym jedna pierwszorz¦dowa a pozostaªe drugorz¦dowe) na jedn¡ jednostk¦ glukozow¡ co
implikuje mo»liwo±¢ syntezy szerokiej gamy tzw. estrów skrobiowych. Nale»y doda¢ »e es
trykacji ulega¢ mog¡ zarówno pierwszorz¦dowe jak i drugorz¦dowe grupy hydroksylowe
chocia», zwªaszcza przy ni»szym stopniu podstawienia estrykacji ulegaj¡ gªównie grupy
pierwszorz¦dowe (przy w¦glu C6). Estrykacja skrobi zachodzi zarówno w przypadku or
ganicznych jak i nieorganicznych kwasów i ich pochodnych. Pochodne kwasowe zdolne
do reakcji estryakcji ze skrobi² to gªównie: bezwodniki kwasowe, chlorki i tlenochlorki.
Zmiana wªa±ciwo±ci skrobi estrykowanej w porównaniu ze skrobi¡ natywn¡ umo»liwia
szerokie zastosowanie tego typu modykatów w wielu dziedzinach przemysªu. Najistotniej
szymi estrami nieorganicznymi skrobi s¡: azotany(V), siarczany(VI) a przede wszystkim
fosforany(V). Estry organiczne o szerszym zastosowaniu to gªównie pochodne acylowe,
karbaminiany i ksantogeniany.
4.2 Octany skrobiowe
Octany skrobiowe otrzymuje si¦ najcz¦±ciej w zawiesinie wodnej poprzez dziaªanie na
polisacharyd bezwodnikiem octowym (Rysunek 20) lub reakcje z octanem winylu (Rysu
nek 21). Proces przebiega w ±rodowisku alkalicznym ze wzgl¦du na konieczno±¢ wi¡zania
powstaj¡cego kwasu octowego, który mo»e powodowa¢ degradacj¦ ªa«cucha polisachary
dowego. Uzyskiwany w tym procesie stopie« podstawienia wynosi ok. 0,1 przy czym w
pierwszej kolejno±ci reakcji ulegaj¡ pierwszorz¦dowe grupy hydroksylowe. Co istotne, w
przypadku kleików otrzymanych z octanów skrobiowych o niskim stopniu podstawienia
wykazuj¡ one mniejsz¡ tendencj do retrogradacji i synerezy. Octany skrobiowe znajduj¡
zastosowanie w przemysªach wªókienniczym i spo»ywczym. W przemy±le spo»ywczym skro
bia acetylowana (o kodzie mi¦dzynarodowym E1420) znajduje zastosowanie jako dodatek
do sosów saªatkowych i majonezów o obni»onej zawarto±ci tªuszczu. Pochodna skrobi
acetylowanej, acetylowany fosforan dwuskrobiowy (E1414) stosowany jest przy produkcji
lodów i ich koncentratów a acetylowany adypinian dwuskrobiowy (E1422) u»ywany jest
przy produkcji majonezów.
Estrykacja skrobi
39
CH2OH
O
O
CH3
+
OH
glukoza
O
O
+
O
NaOH
CH3
glukoza
O
OH
CH3
O
C
O
CH2
O
+
OH
glukoza
O
O
CH3COONa
+
H2O
glukoza
OH
Rysunek 20: Reakcja estrykacji skrobi bezwodnikiem octwoym (substytucja grupy pierwszorz¦
dowej)
4.3 Fosforany skrobiowe
Grup¡ skrobi modykowanych o najszerszym zastosowaniu s¡ estry skrobiowe kwasu fosfo
rowego. W zale»no±ci od sposobu wbudowywania si¦ reszt kwasu fosforowego w struktur¦
polimeru rozró»nia si¦ fosforany jednoskrobiowe (Rysunek 22) i dwuskrobiowe (Rysunek
23). Stosowane w produktach »ywno±ciowych fosforany skrobi musz¡ wykazywa¢ si¦ niskim
stopniem podstawienia. Wynika to z faktu, »e zbyt wysoka ilo±c fosforu mo»e negatywnie
wpªywa¢ na wzajemny stosunek wapnia do fosforu w organizmie konsumenta. Z tego po
wodu dopuszczone do zastosowa« spo»ywczych s¡ fosforany jednoskrobiowe o zawarto±ci
fosforu poni»ej 0,4% i dwuskrobiowe o zawarto±ci tego pierwiastka do 0,04%. Fosforany jed
noskrobiowe otrzymuje si¦ poprzez dziaªanie na skrobi¦ fosforanami (V) sodu lub potasu
lub te» dziaªanie trójpolifosforanami tych metali. W tym drugim przypadku otrzymuje si¦
produkt uboczny w postaci pirodwufosforanu trisodowego, który musi by¢ usuni¦ty przez
wymywanie. Reakcja estryakcji przebiegaj w podwy»szonej temperaturze.
Fosforany jednoskrobiowe w stosunku do skrobi naturalnej charakteryzuj¡ si¦ przede
wszystkim zdolno±ci¡ do p¦cznienia w zimnej wodzie oraz skªonno±ci¡ do tworzenia lep
kich dyspersji. Bardzo istotn¡ cech¡ tych modykatów jest równie» wysoka zdolno±¢ wi¡
zania wody i to zrówno po zamro»eniu jak i po rozmro»eniu. Fosforany jednoskrobiowe
s¡ szeroko stosowane w przemy±le spo»ywczym jako zag¦stniki, dodatki do tzw. deserów
bªyskawicznych (E1410 - fosforan jednoskrobiowy). Zastosowanie w przemy±le farmaceu
tycznym znajduj¡ natomiast sole estrów skrobiowych zawieraj¡ce wap«, magnez lub glin.
40
Estrykacja skrobi
CH2OH
O
O
+
OH
glukoza
O
O
CH2 CH
O
CH2 CH
OH
C
CH3
glukoza
OH
CH3
O
C
O
CH2
O
+
OH
O
glukoza
O
CH3 CHO
glukoza
OH
Rysunek 21: Reakcja estrykacji skrobi octanem winylu (substytucja grupy pierwszorz¦dowej)
CH2OH
O
OH
O
glukoza
O
glukoza
OH
Na2HPO4
O
Na5P3O10
O
ONa
O
ONa
P
P
O
OH
ONa
CH2
CH2
O
O
OH
OH
glukoza
O
O
OH
+
H2O
glukoza
glukoza
O
O
glukoza
OH
+
Na3HP2O7
Rysunek 22: Reakcja otrzymywania fosforanów jednoskrobiowych
Fosforany dwuskrobiowe s¡ przykªadem skrobi usieciowanej. Sieciowanie w znacz¡cy
sposób wpªywa na wªasno±ci otrzymanego modykatu. Podobnie jak w przypadku wszyst
kich innych polimerów usieciowanie skrobi powoduje wzrost odporno±ci chemicznej i me
chanicznej jak równie» spadek rozpuszczalno±ci. Jako sieciowanie rozumie si¦ poª¡czenie
przy pomocy zwi¡zków dwu- lub wielo-funkcyjnych dwóch lub wi¦cej ªa«cuchów polime
rowych. Prowadzi to do znacz¡cego wzrostu masy cz¡steczkowej polimeru. Fosforany dwu
skrobiowe otrzymuje si¦ poprzez dziaªanie na skrobi¦ tlenochlorkiem fosforu lub te» trój
metafosforanem sodu. Reakcja z udziaªem tlenochlorku fosforu jest bardziej efektywna i
Estrykacja skrobi
41
OH
CH2OH
glukoza
O
OH
OH
glukoza
O
O
O
glukoza
CH2
O
OH
+ POCl3
O
+
P
O
CH2OH
HCl
OH
CH2
O
OH
glukoza
glukoza
O
O
O
O
O
OH
OH
glukoza
glukoza
O
O
glukoza
OH
Rysunek 23: Reakcja otrzymywania fosforanów dwuskrobiowych z udziaªem tlenochlorku fosforu
zachodzi z wieksz¡ szybko±ci¡ chocia» stosowanie tego zwi¡zku stwarza niebezpiecze«stwo
ze wzgl¦du na toksyczno±¢ wydzielaj¡cych si¦ produktów gazowych oraz samego tleno
chlorku fosforu. W zale»no±ci od stopnia usieciowania skrobi dwufosforanowej zmienia si¦
mi¦dzy innymi zdolno±¢ jej p¦cznienia. Niski stopie« usieciowania umo»liwia otrzymanie
materiaªu o wysokiej zdolno±ci p¦cznienia a sp¦czniaªe ziarna wykazuj¡ zwi¦kszon¡ odpor
no±¢ na oddziaªywania mechaniczne i wysok¡ temperatur¦. Wzrost stopnia usieciowania
skrobi powoduje natomiast spadek podatno±ci na p¦cznienie a» do caªkowitej utraty tej
wªa±ciwo±ci. Wraz ze stopniem usieciowania wzrasta tak»e temperatura kleikowania skrobi
oraz lepko±¢ kleików. Wªa±ciwo±¢ ta jednak równie» drastycznie spada przy wysokich stop
niach usieciowania ze wzgl¦du na zahamowanie p¦cznienia. Wykorzystuj¡c te wªa±ciwo±ci
mo»na otrzyma¢, poprzez regulacj¦ stopnia usieciowania, zag¦stniki o wysokiej stabilno
±ci. Dodatkowo fosforany dwuskrobiowe s¡ ukªadami odpornymi na podwy»szone tempe
ratury oraz stabilnymi podczas procesów zamra»ania i rozmra»ania nie wykazuj¡c przy
tym skªonno±ci do retrogradacji i synerezy. W Polsce produkawany jest preparat Fremix
(oznaczony jako E1414, acetylowany fosforan dwuskrobiowy). Oprócz tego w przemy±le
spo»ywczym wykorzystuje si¦ tak»e takie fosforany jak: fosforan dwuskrobiowy E1412,
fosforowany fosforan dwuskrobiowy E1413 (stosowany przy produkcji ketchupu), hydrok
sypropylofosforan dwuskrobiowy E1442 (wykorzystywany przy produkcji knedli, pierogów,
wyrobów z ciasta ziemniaczanego itp). Oprócz fosforanów dwuskrobiowych skrobie usiecio
wane uzyskuje si¦ tak»e w reakcjach skrobi naturalnej z czynnikami zawieraj¡cymi grupy
adypinowe, glicerynowe itp.
42
Estrykacja skrobi
O
O
C
C
H
CH2
CH2
A
NH2
O
O
OH
OH
glukoza
O
O
glukoza
glukoza
O
O
NO2
O
SO3
CH2
CH2
C
D
O
O
OH
OH
glukoza
glukoza
OH
OH
O
B
O
O
O
O
glukoza
glukoza
O
O
glukoza
OH
OH
OH
glukoza
O
S
S
Me
O
CH2
CH2
O
S
O
C
OH
glukoza
glukoza
OH
C
O
E
O
S
S
O
O
glukoza
F
C
S
O
CH2
OH
O
OH
glukoza
O
O
glukoza
OH
Rysunek 24: Inne estry skrobiowe: A - mrówczan skrobi (skrobia formylowana); B - karbaminian
skrobi; C - nitroskrobia; D - siarczan skrobi; E - ksantogenian skrobi; F - skrobia ksantydowa
4.4 Inne estry skrobiowe
Podatno±¢ skrobi na dziaªanie czynników estrykuj¡cych umo»liwia syntez¦ wielu innych
estrów skrobiowych wykorzystywanych w mniejszym lub wi¦kszym zakresie zarówno w
przemy±le spo»ywczym jak i tzw. zastosowaniach niespo»ywczych. I tak dziaªanie na skro
bi¦ kwasem mrówkowym powoduje otrzymanie mrówczanów skrobiowych. Produkty for
mylowania skrobi maj¡ jednak do±¢ ograniczone znaczenie. Ogrzewaj¡c skrobi¦ z moczni
kiem w obecno±ci odpowiedniego katalizatora uzyskuje si¦ tzw. karbaminiany skrobiowe.
Cech¡ charakterystyczn¡ takich karbaminianów jest ich rozpuszczalno±¢ w zimnej wo
dzie i tworzenie ukªadów o bardzo wysokiej lepko±ci. Mieszanina karbaminianów i fos
foranów skrobiowych znajduje zastosowanie w przemy±le papierniczym i wªókienniczym
jako ±rodek klej¡cy. Dziaªaj¡c na skrobi¦ tzw. mieszanin¡ nitruj¡c¡ (mieszanina H2 SO4
i HNO3 ) otrzyma¢ mo»na niejednorodne pod wzgl¦dem budowy i struktury nitroskrobie
wykorzystywane jako skªadniki mieszanin wybuchowych dla górnictwa i wojska. Przy u»y
ciu samego kwasu siarkowego (VI) lub tlenku siarki (VI) uzyskuje si¦ siarczany skrobiowe
Estrykacja skrobi
43
sªu»¡ce jako koloidy ochronne, dodatki do klejów oraz jako ±rodek heparynopodobny. W
reakcji z disiarczkeim w¦gla w ±rodowisku zasadowym skrobia ulega transformacji do od
powiednich ksantogenianów. Ksantogeniany skrobi umo»liwiaj¡ mi¦dzy innymi usuwanie
jonów metali ci¦»kich z wód i ±cieków. Stosowane s¡ tak»e w przemy±le papierniczym
zwi¦kszaj¡c wytrzymaªo±¢ papieru i jego wodochªonno±¢. Utlenianie ksantogenianów skro
biowych prowadzi natomiast do tzw. skrobi ksantydowych równie» wykorzystywanych w
przemy±le papierniczym.
4.5 Wykonanie ¢wiczenia
dokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
4.5.2 Acetylowanie skrobi
Do zlewki o pojemno±ci 500cm3 odwarzy¢ 100g skrobi (w przeliczeniu na such¡ mas¦). Do
zlewki doda¢ wod¦ destylowan¡ do caªkowitej masy 300g. Caªo±¢ dokªadnie wymiesza¢ a
nast¦pnie zalkalizowa¢ do pH ok. 8-9 przy pomocy wodnego roztworu NaOH o st¦»eniu 3%.
Próbk¦ umie±ci na mieszadle magnetycznym. Reakcj¦ prowadzi¢ w temperaturze pokojo
wej wkraplaj¡c powoli bezwodnik octowy (w ilo±ci 1mol, 2,5mola lub 3,5mola w zale»no±ci
od grupy) przy ci¡gªym mieszaniu zawiesiny. Po zako«czeniu wkraplania mieszanin¦ reak
cyjn¡ miesza¢ przez dodatkowe 30min a nast¦pnie zakwasi¢ 10% roztworem kwasu solnego
do pH ok. 5,3. Mieszanin¦ ods¡czy¢ pod pró»ni¡ na lejku Schotta (G-3) a nast¦pnie prze
my¢ du»¡ ilo±ci¡ wody destylowanej. Otrzyman¡ skrobi¦ acetylowan¡ umie±ci¢ na szalce
Petriego i suszy¢ w temperaturze 30◦ C przez okres 1 godz. Ze wst¦pnie wysuszonej skrobi
pobra¢ ok. 12g materiaªu do oznaczenia stopnia zacetylowania. Pozostaª¡ cz¦±¢ materiaªu
zwa»y¢, pozostawi¢ do wysuszenia na okres 1 tygodnia. Po wysuszeniu próbk¦ zwa»y¢ w
celu okre±lenia suchej masy próbki u»ytej do oznaczenia stopnia zacetylowania.
4.5.3 Oznaczenie stopnia zacetylowania
Odwa»one 12g skrobi zmodykowanej przenie±¢ ilo±ciowo do kolby Erlenmayera o pojem
no±ci 250cm3 posªuguj¡c si¦ 65cm3 wody destylowanej. Caªo±¢ wymiesza¢ i doda¢ 3 kro
44
Estrykacja skrobi
ple wska¹nika alkacymetrycznego (fenoloftaleina). Do zawiesiny wkropli¢ 0,1mol roztwór
NaOH a» do zmiany zabarwienia fenoloftaleiny utrzymuj¡cego si¦ przez czas dªu»szy ni» 1
minuta. Do zawiesiny doda¢ dokªadnie 25cm3 0,5mol roztworu NaOH, wymiesza¢ i wytrz¡
sa¢ na wytrz¡sarce przez 35min. Po upªywie tego czasu caªo±¢ zmiareczkowa¢ 0,5mol mia
nowanym roztworem HCl. Równocze±nie zmiareczkowa¢ dokªadnie 25cm3 0,5mol NaOH
przy pomocy mianowanego, 0,5mol roztworu HCl. Na podstawie uzyskanych wyników
obliczy¢ stopie« zacetylowania.
4.6 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, a
przede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy
ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ stopnia zacetylowania otrzymanych
produktów od ilo±ci zastosowanego bezwodnika octowego.
Indeks
α-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu, disacharydy, 4
18
DNS, 23
α-amylaza termolabilna , 19
egzoamylaza, 18
α-amylaza termostabilna, 18
endoamylaza, 18
β -amylaza, maltohydrolaza-α-1,4-glukanu,
energia aktywacji, 14
20
energia swobodna, 14
β -amylaza, 20
entalpia, 14
γ -amylaza, 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu,
entropia, 14
19
enzym, 15
γ -amylaza, 19
enzym usuwaj¡cy rozgaª¦zienia, 18
beta-anomer, 20
enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia, 20
±rednia masa cz¡steczkowa, 21
erytrodekstryny, 8
5-hydroksymetylofurfural, 4, 9
gencjobioza, 9
achrodekstryny, 8
glikogen 6-glukanohydrolaza, 21
amylodekstryny, 8
glikozylotransferaza cyklodekstryn, 18
amyloza, 4, 7
glukoamylaza, 19
apoenzym, 15
glukoza krystaliczna, 23
Aspergillus awamori, 20
GPC, 23
Aspergillus niger, 19, 20, 27
grupa prostetyczna, 15
bªonnik pokarmowy, 28
heksacyjano»elazian(III) potasu, 23
Bacillus licheniformis, 18
Hordeum vulgare, 20
Bacillus stearothermophilus, 21
HPAE-PAD, 23
Bacillus subtilis, 18
HPLC, 23
celebioza, 9
hydrol, 12
chromatograa »elowa, 23
hydrolazy, 17
chromatograa cienkowarstwowa, 23
hydroliza enzymatyczna, 4
Clostridium acetobutylicum, 27
hydroliza kwasowa, 4
Cu2 O, 8
ilo±¢ obrotów, 17
D-glukoza, 4
immobilizowanie, 20
dekstryny, 4
immobilzowanie, 19
dekstryny graniczne, 20
izoamylaza, 21
Dextrose Equivalent, 7
izomaltoza, 9
45
46
izomerazy, 17
jednostka mi¦dzynarodowa, 17
Estrykacja skrobi
nefelometria, 22
nieredukuj¡y koniec ªa«cucha, 19
jednostki aktywno±ci, 17
oksyreduktazy, 17
jodometria, 22
osmometria parowa, 22
jon wodorowy, 9
pier±cienia glukopiranozowy, 5
kapsuªkowanie, 24
polialkohol, 26
karbokation, 5
próba jodowa, 8
katal, 17
procesy odwracalne, 14
katalizator, 14, 15
pullulan-6-glukanohydrolaza, 21
koenzym, 15
pullulanaza, 21
kompleks przej±ciowy, 15
kompleksy inkluzyjne, 22
konguracja α, 18
kriometria, 22
krochmal zielony, 11
kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 23
kwas 3-amino-5-nitrosalicylowy, 23
kwas 4-okso-pentanowy, 9
kwas cytrynowy, 27
kwas itakonowy, 27
kwas lewulinowy, 9
kwas mlekowy, 27
kwas mrówkowy, 9
Lactobacillus amylophillus, 27
Lactobacillus thermophillus, 27
lepko±¢ graniczna, 21
liazy, 17
ligazy, 17
ró»niczkowy rozrzut mas cz¡steczkowych,
21
równanie Arrheniusa, 14
równanie Marka-Houwinka, 22
równanie Michaelisa-Menten'a, 17
równowa»nik glukozowy, 7
reakcja Maillarda, 11
reakcja redoks, 7
rewersja, 9, 19
rozpad glukozy, 8
rozpuszczalno±¢ w alkoholu, 8
skr¦calno±¢ wªa±ciwa, 8
skrobia, 4
skrobia natywna, 4
soforoza, 9
sorbitol, 26
staªa gazowa, 14
staªa Michaelisa-Menten'a, 17
maltodekstryna, 23
staªa równowagi, 14
maltodekstryny, 8
staªa szybko±ci, 14
maltotrioza, 19
syrop ±rednioscukrzony, 11
maltoza, 4, 19
syrop glukozowy, 17, 23
merkaptan, 20
syrop maltozowy, 23
metoda Somogyi-Nelsona, 23
syrop niskoscukrzony, 11
Estrykacja skrobi
syrop normalnie, 11
syrop o wysokiej zawarto±ci fruktozy, 23
syrop skrobiowy, 11, 23
syrop wysokoscukrzony, 11
TLC, 23
transferazy, 17
trehaloza, 9
trypsyna, 15
turbidymetria, 22
wi¡zanie α- i β - 1,6-glikozydowe, 9
wi¡zanie α-1,4-glikozydowe, 18
wi¡zanie α-1,6 glikozydowe, 20
wspóªczynnik przedekspotencjalny, 14
wysokosprawna chromatograa cieczowa,
23
wysokosprawna chromatograa jonowymienna
z impulsow¡ detekcj¡ amperome
tryczn¡, 23
47

Przemysª Skrobiowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Kliknij aby pobrać dokument w formacie PDF

Bieganie po bagnach

Zalecenia żywieniowe w celiakii

Doświadczenie: Związki organiczne w naszym otoczeniu

Hydroliza skrobi przez unieruchomioną glukoamylazę Ćwiczenie