QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA Lite® SLA
708775
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
QUANTA LiteTM SLA (rozpuszczalny antygen wątrobowy) jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do
półilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko SLA klasy IgG w surowicy człowieka. Obecność
przeciwciał przeciwko SLA można wykorzystać wraz z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi
do wspomagania diagnozy stanów charakteryzujących się podwyższonym poziomem przeciwciał przeciwko
SLA, włączając w to autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH).
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) jest przewlekłą, heterogeniczną postępującą chorobą zapalną
wątroby o nieznanej etiologii.1-6 Diagnoza jest często trudna ponieważ nie istnieje jeden test diagnostyczny
przeznaczony do wykrywania AIH, a występujące u pacjentów objawy mogą być bardzo różnorodne.1-6
Diagnoza obejmuje ocenę wyników badań klinicznych, laboratoryjnych i histologicznych jak również
wykluczenie innych przyczyn przewlekłego zapalenia wątroby.1-6 Diagnoza jest szczególnie trudna u
pacjentów z kryptogennym zapaleniem wątroby, czyli takich, u których występuje niezdefiniowane przewlekłe
zapalenie wątroby bez przeciwciał przeciwko markerom wirusowym lub konwencjonalnym markerom
autoimmunologicznym.1-2 Aby zapobiec ciężkiemu uszkodzeniu wątroby niezbędna jest wczesna diagnoza
AIH i zastosowanie terapii immunosupresyjnej. Niestety brak pewności diagnostycznej w ustalaniu diagnozy
spowodować może opóźnienie leczenia i dalszy rozwój choroby.7-8
Wszystkich pacjentów z AIH można ogólnie podzielić na dwie kategorie, zależnie od tego, czy występują u
nich autoprzeciwciała czy nie.1-6,9,10 AIH typu 1 (nazywane również klasycznym zapaleniem wątroby,
przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby, plazmatycznokomórkowym zapaleniem wątroby lub
autoimmunologicznym przewlekłym aktywnym zapaleniem wątroby) jest powszechniejszym typem AIH. AIH1 charakteryzuje się występowaniem przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwciał przeciwko mięśniom gładkim
ASMA (skierowanych zarówno przeciwko komponentom aktynowym jak i nieaktynowym) oraz
cytoplazmatycznych i okołojądrowych przeciwciał przeciwneutrofilowych.1,4,6 AIH typu 2 charakteryzuje się
obecnością przeciwciał przeciwko mikrosomom wątrobowym/nerkowym (LKM-1) skierowanych głównie
przeciwko cytochromowi P4502D6 i antygenowi cytosolowemu wątroby (LC-1).4,6,11 W pacjentów z AIH-1 nie
wykrywa się przeciwciał przeciwko LKM-1 i LC-1.
W roku 1987 zidentyfikowano przeciwciała przeciwko cytosolowemu rozpuszczalnemu antygenowi
wątrobowemu (SLA) u 23 pacjentów z chronicznym zapaleniem wątroby, u których nie wykrywano
przeciwciał przeciwko HbsAg, ANA i LKM-1.12 U niektórych pacjentów z AIH wykryto również przeciwciała
skierowane przeciwko innemu rozpuszczalnemu cytosolowemu białku wątrobowemu, nazywanemu
antygenem wątrobowo-trzustkowym (LP).12 Obecnie wiadomo, że przeciwciała przeciwko SLA i LP
rozpoznają ten sam antygen.13 SLA to białko o masie około 50 kDa z 99% homologią względem związanego
z tRNA białka supresorowego UGA, które może brać udział w metabolizmie selenocysteiny.14-15 Chociaż
podejrzewano, że głównym celem aktywności przeciwciał przeciwko SLA jest cytokeratyna 8, cytokeratyna
18 i S-transferaza glutationowa to późniejsze badania tego nie potwierdziły 14,16-19. Chociaż jedynie u około
12-30% pacjentów z AIH występują przeciwciała przeciwko SLA, to ich obecność jest prawie w 100%
swoista dla AIH.8,10,14,19-20
Ocenia się, że u 70-80% pacjentów z AIH występują przeciwciała przeciwko ANA i/lub ASMA, a u
niewielkiego odsetka z nich występują przeciwciała przeciwko LKM-1. U około 10-30% pacjentów z
klinicznymi objawami AIH nie występuje istotne miano przeciwciał przeciwko któremukolwiek z tych
markerów.1,2,7,12 W chwili obecnej jedynym wskaźnikiem AIH u tych pacjentów jest ich odpowiedź na leczenie
przeciwzapalne.1,2 Przeciwciała przeciwko SLA wykryto u 14-20% pacjentów z kryptogennym zapaleniem
wątroby.13,19,20 Z tego też względu test na obecność SLA może wspomóc ustalenie diagnozy AIH i przyczynić
się do spowolnienia postępu choroby spowodowanego opóźnionym leczeniem. Niezbędne jest dokładne
rozpoznanie AIH gdyż sposób leczenia AIH i wirusowego zapalenia wątroby bardzo się różni. Leczenie
immunosupresyjne stosowane w terapii AIH może być szkodliwe w przypadku infekcji wirusowej a leczenie
interferonem może spowodować pogorszenie AIH.21
Rozważano wyróżnienie trzeciego typu AIH, głównie w oparciu o występowanie przeciwciał przeciwko SLA,
lecz prawdopodobnie nie jest to konieczne4,6,9,19 Wydaje się, że istnieje podobieństwo między pacjentami
wykazującymi obecność przeciwciał przeciwko SLA a pacjentami z AIH-1 nie wykazującymi takich
przeciwciał, w odniesieniu do większości objawów klinicznych, histologicznych i laboratoryjnych.9,10,19
Jednakże u pacjentów z przeciwciałami przeciwko SLA istnieje związek z HLA DR3 i może występować u
nich skłonność do nawrotu choroby po odstawieniu kortykosteroidów.22
Różne formy AIH, w których pacjenci wykazują objawy charakterystyczne dla AIH i pierwotnej żółciowej
marskości wątroby (PBC) lub głównego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych (PSC) nazywane są
często zespołami nakładania. Zespoły te, wraz z autoimmunologicznym zapaleniem dróg żółciowych (AIC),
który to termin zaproponowano dla opisania stanu o objawach przypominających PBC, lecz bez przeciwciał
przeciwko mitochondriom (AMA)1-3,5 mogą stanowić problem diagnostyczny i leczniczy.
1
Zasada badania
Częściowo oczyszczony zrekombinowany ludzki antygen SLA pełnej długości wiąże się z dołkami płytki
polistyrenowej w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego natywnym stanie. Wstępnie rozcieńczone
kontrole i rozcieńczone surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków, umożliwiając obecnym
przeciwciałom przeciwko SLA związanie się z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest
wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciwludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem
związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po
wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność
pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy.
Badanie może zostać ocenione spektrofotometrycznie, poprzez zmierzenie i porównanie intensywności
barwy, która powstaje w dołkach z próbkami od pacjenta z barwą dołków kontrolnych.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Polistyrenowa płytka z mikrodołkami ELISA pokryta częściowo oczyszczonym rekombinowanym
antygenem SLA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem, w torebce foliowej zawierającej osuszacze
Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawiera konserwant i surowicę ludzką bez ludzkich
przeciwciał przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Słabo pozytywna kontrola testu SLA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA, 1 fiolka buforu zawierającego konserwant i przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciwko zrekombinowanemu ludzkiemu SLA, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml
Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka – zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną
TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml
Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x – zabarwienie czerwone, zawiera sól
fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć
w sekcji Metody.
Koniugat HRP IgG, (kozi), przeciwciała przeciw-ludzkie IgG, 1 fiolka – zabarwienie niebieskie,
zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml
Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml
Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344M, 1 fiolka – bezbarwny, 10 ml
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (chloramfenikol 0,02%) w
rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie
zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może
całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. Z tego
też względu słabo pozytywną kontrolę testu SLA ELISA, silnie pozytywną kontrolę testu SLA ELISA
oraz kontrolę negatywną ELISA należy użytkować w ten sam sposób, jak materiał potencjalnie
zakaźny.23
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali.
Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być
toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych,
należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania,
spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub
kontaktu ze skórą i oczami.
Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać
wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z
kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być
toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony
osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i
lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA
wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła.
2
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się
w akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność
płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy
trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga
staranności i precyzji.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i
osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania.
Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może
spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne
jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP.
Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym
czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji
chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem
spowoduje
degradację
koniugatu
HRP.
Po
użyciu
chemicznych
substancji
czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia.
Warunki przechowywania
1.
2.
3.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce
foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do
próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A2 zaleca
następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej
niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury
2–8°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy
zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą
zostać dobrze wymieszane. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek.
Badanie
Dostarczone materiały
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Płytka z mikrodołkami testu SLA ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA
1,2 ml wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA
50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP
25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x
10 ml koniugatu IgG HRP, (kozie), przeciw-ludzkie IgG
10 ml chromogenu TMB
10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety na 5, 100, 200–300 i 500 µl
Jednorazowe końcówki mikropipet
Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości
Woda destylowana lub dejonizowana
Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania
Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla
odczytów przy dwóch długościach fali)
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26oC) i dobrze
wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do
płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie
przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml
koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte.
Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2–8oC.
3
3.
4.
Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl
rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od
przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, silnie pozytywnej
kontroli testu SLA ELISA i kontroli negatywnej ELISA.
Ustalenie obecności lub nieobecności SLA z zastosowaniem jednostek umownych wymaga dwóch
dołków dla każdej z trzech kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki od pacjenta.
Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek.
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE
DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20–26°C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w
uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i
dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną.
Do dołków dodać 100 µl wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, silnie
pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, kontroli negatywnej testu ELISA i rozcieńczone próbki
pochodzące od pacjentów. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na
równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki.
Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Wlać 200–300 µl rozcieńczonego
buforu HRP do płukania do wszystkich dołków, a następnie go odessać. Powtórzyć tę sekwencję
jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na
materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby
całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję
odsysania, jak w przypadku dodawania próbki.
Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu IgG HRP. Koniugat powinien być usunięty z butelek z
zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych.
Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO
ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO Z POWROTEM
WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w
etapie 2.
Etap płukania: Powtórzyć etap 3.
Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w
temperaturze pokojowej.
do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas
dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać
płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków.
Odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm w ciągu
jednej godziny od zatrzymania reakcji. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną
długością fali może być długość 620 nm.
Kontrola jakości
1.
2.
3.
4.
Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek
należy testować wraz ze słabo pozytywną kontrolą testu SLA ELISA, silnie pozytywną kontrolą testu
SLA ELISA i kontrolą negatywną ELISA.
Należy zauważyć, że ponieważ słabo pozytywna kontrola testu SLA ELISA, silnie pozytywna kontrola
testu SLA ELISA i kontrola negatywna testu ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one
stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek.
Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub
krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne
można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze
≤ - 20°C.
Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako
nieważne i powinno zostać powtórzone.
a.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być
większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA,
która z kolei musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej
ELISA.
b.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej silnie pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być
większa niż 1,0, natomiast absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA
nie może przekroczyć 0,2.
c.
Absorbancja wstępnie rozcieńczonej słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA musi być
ponad dwukrotnie większa niż absorbancja kontroli negatywnej ELISA lub być większa niż
0,25.
d.
Kontrola negatywna testu ELISA i silnie pozytywna kontrola testu SLA ELISA mają za
zadanie wykazać ewentualne istotne nieprawidłowe działanie odczynnika. Silnie pozytywna
kontrola testu SLA ELISA nie zapewni dokładności przy wartości granicznej badania.
e.
Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie
CLSI (NCCLS) C24-A.24
4
Obliczanie wyników
W pierwszej kolejności jest określana średnia gęstość optyczna każdego zestawu duplikatów. Reaktywność
każdej próbki można następnie wyliczyć, dzieląc średnią gęstość optyczną próbki przez średnią gęstość
optyczną słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA. Otrzymany wynik mnoży się przez liczbę jednostek
przypisanych do słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA, którą można znaleźć na etykiecie.
Gęstość optyczna próbki
Wartość próbki =
(jednostki)
x słabo pozytywna
kontrola testu SLA
ELISA
gęstość optyczna słabo pozytywnej kontroli testu SLA ELISA
(jednostki)
Reaktywność w sposób nieliniowy zależy od ilości obecnych przeciwciał. Wzrosty i spadki stężeń przeciwciał
u pacjenta będą odzwierciedlone w analogicznym wzroście lub spadku reaktywności, jednak zmiana ta nie
jest proporcjonalna (tzn. podwojenie stężenia przeciwciał nie oznacza podwojenia reaktywności). Jeśli
wymagane jest dokładniejsze oszacowanie ilości przeciwciał pacjenta, należy przeprowadzić badanie
seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzących od pacjenta i ostatnie rozcieńczenie w ramach badania z
wynikiem pozytywnym powinno być zaraportowane jako miano przeciwciał pacjenta.
Interpretacja wyników
Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w
populacjach pacjentów. Poniższe wartości są jedynie wartościami sugerowanymi. Każde laboratorium
powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji
pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami.
Próbki uznaje się za dające wynik negatywny (negatywny pod względem przeciwciała IgG przeciwko SLA),
niejednoznaczny lub pozytywny (wykryte zostaje przeciwciało IgG przeciwko SLA ) w oparciu o poniższą
tabelę.
Negatywny
Niejednoznaczna
Pozytywna
0,0 - 20,0 jednostek
20,1 - 24,9 jednostki
≥ 25 jednostek
Przed przedstawieniem wyników niejednoznaczne próbki powinny zostać przebadane ponownie.
1.
2.
3.
4.
5.
Wynik pozytywny wskazuje na obecność przeciwciał IgG przeciwko SLA i sugeruje możliwość
wystąpienia autoimmunologicznego zapalenia wątroby.
Próbka z niejednoznacznym poziomem przeciwciał przeciwko IgG SLA nie może być oznaczona pod
kątem statusu przeciwciał. Jeśli wyniki nadal są niejednoznaczne po powtórzonym badaniu, wynik
należy zaraportować jako niejednoznaczny i/lub pobrać dodatkową próbkę.
Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko SLA, lub że ich
poziom jest poniżej granicy wykrywania dla tego testu.
W przypadku próbek o gęstości optycznej przewyższającej zakres odczytu czytnika płytek, można je
zaraportować jako takie, których najwyższą mierzalną wartość gęstości optycznej dzieli się przez
gęstość optyczną kontroli słabo pozytywnej i mnoży przez 25, lub można je rozcieńczyć, przebadać
ponownie i wyliczyć pożądaną wartość. Przybliżony zakres liniowy tego badania mieści się w
zakresie od 9 do 125 jednostek.
Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały stwierdzenie: „Poniższe wyniki
otrzymano przy wykorzystaniu testu INOVA QUANTA Lite® SLA ELISA. Nie można stosować
zamiennie wartości przeciwciał przeciwko SLA uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych
innych producentów. „Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z
mianem punktu końcowego”.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Niewykrycie przeciwciał przeciwko SLA nie wyklucza autoimmunologicznego zapalenia wątroby.
Negatywny wynik na obecność przeciwciał przeciwko SLA nie wyklucza obecności przeciwciał
przeciwko SLA, ponieważ stężenie przeciwciał może być poniżej granicy wykrywania dla tego testu.
Wynik pozytywny świadczy jedynie o występowaniu przeciwciał przeciwko ludzkiemu
zrekombinowanemu SLA i nie koniecznie może wskazywać na autoimmunologiczne zapalenie
wątroby.
Zdiagnozowanie autoimmunologicznego zapalenia wątroby wymaga zebrania dokumentacji
dotyczącej danych demograficznych pacjenta, manifestacji klinicznej oraz innych badań
diagnostycznych.
Dane literaturowe sugerują, że przeciwciała przeciwko SLA nie są charakterystyczne dla AIH-2.10
Chociaż trzy próbki dla AIH-2 przedstawione w części pt. Specyficzna charakterystyka wyników
poniżej dały wynik negatywny, to liczba ta nie jest dostatecznie duża, aby korzystając z tego testu
potwierdzić brak przeciwciał przeciwko SLA w próbkach od pacjentów z AIH-2.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
5
Spodziewane wartości
Według szacunków przeciętna roczna zapadalność na AIH wynosi 1,9 przypadków/100,000 w populacji
kaukaskiej w Europy Zachodniej i Ameryce Północnej i 0,08-0,015 przypadków/100,000 w Japonii.25,27
Częstość występowania w populacji norweskiej oszacowano na 16,9/100,000.26 Choroba ta występuje
najczęściej u kobiet, przy czym stosunek chorych kobiet do mężczyzn wynosi 4:1. Szczyt zachorowań na tę
chorobę pojawia się w wieku 15-30 lat, chociaż choroba ta pojawia się w każdym wieku.1-5
Normalny zakres
Grupę 131 bezobjawowych osób zdrowych zbadano za pomocą testu QUANTA Lite® SLA ELISA na
obecność przeciwciał przeciwko SLA. Grupa ta obejmowała 91 mężczyzn i 40 kobiet. Nie wykryto różnic w
średnich wartościach uzyskanych dla kobiet i mężczyzn. Zakres wiekowy wynosił od 5 do 69 lat
(mediana=33). Swoistość badania dla badanej grupy wyniosła 100% (131/131). Wartość średnia dla tej
populacji wynosiła 2,0 jednostki, a największa wartość wynosiła 5,8 jednostki.
Specyficzna charakterystyka wyników
Pacjenci z AIH i chorobą wątroby
Próbki od pacjentów z AIH i innymi chorobami wątroby badano na miejscu (ślepa próba) i w laboratoriach
zewnętrznych, posługując się testem QUANTA Lite® SLA ELISA. Wiek pacjentów mieścił się w zakresie od
13 do 82 lat a stosunek mężczyzn do kobiet wynosił około 3,5. Wyniki uzyskane dla różnych grup połączono
i podsumowano poniżej.
Grupa kliniczna:
AIH-1
zachodzenie AIH-1/PBC (Primary Biliary Cirrhosis,
pierwotna żółciowa marskość wątroby)
AIH-2
Kryptogenne zapalenie wątroby
Autoimmunologiczne zapalenie dróg żółciowych
AIH-1/PSC
Polekowe autoimmunologiczne zapalenie wątroby
Pierwotna żółciowa marskość wątroby
Pierwotne stwardniające zapalenie dróg
żółciowych (PSC)
PBC/PSC
Inne niewirusowe choroby wątroby
Wirusowe zapalenie wątroby typu B (B, C lub D)
Wirusowe zapalenie wątroby typu C
Wirusowe zapalenie wątroby typu C/D
n=
289
SLA+
34
% SLA+
11,8
20
3
9
8
4
2
15
11
0
4
1
1
0
0
55
0
44,4
12,5
25
0
0
7
19
10
8
37
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Czułość testu wyłącznie dla AIH-1
Czułość testu dla wariantów AIH-1 i AIH-1 (zachodzenie):
Swoistość (choroba wątroby inna niż AIH):
Swoistość (dla grupy osób zdrowych i cierpiących na chorobę
wątroby inną niż AIH):
34/289 = 11,8%
51/330 = 15,4%
73/73 = 100%
204/204 = 100%
Badanie reaktywności krzyżowej
Surowice pochodzące od 70 pacjentów z różnymi przeciwciałami charakterystycznymi dla chorób
autoimmunologicznych lub zapalnych badano na reaktywność krzyżową z zastosowaniem testu QUANTA
LiteTM SLA ELISA . Przebadano 10 próbek z przeciwciałami przeciwko ludzkiemu wirusowi opryszczki 6, 6 - z
przeciwciałami przeciwko riketsji, 10 - z przeciwciałami przeciwko wirusowi cytomegalii, 3 - z przeciwciałami
przeciwko błonie podstawowej kłębuszków nerkowych, 3 - z przeciwciałami przeciwjądrowymi, 3 - z
przeciwciałami tocznia rumieniowatego układowego, 3 - z przeciwciałami przeciwko mitochondriom, 3 - z
przeciwciałami przeciwko komórkom ściennym żołądka, 3 - z przeciwciałami przeciwko LKM-1, 26 - z
przeciwciałami przeciwko cytokeratynie 8 lub 18. Żadna z próbek nie dała pozytywnego wyniku na obecność
przeciwciał przeciwko SLA.
6
Precyzja i powtarzalność
Wewnątrztestową wydajność testu QUANTA Lite® SLA ELISA oceniono przeprowadzając siedmiokrotnie
badanie 6 próbek. Poniżej zostały przedstawione wyniki.
Wyniki w ramach badania dla testu QUANTA LiteTM SLA ELISA
Próbka A
Próbka B
Próbka C
Próbka D
Jednostki średnie
72,6
46,2
27,6
13,5
SD
1,4
1,9
1,4
0,4
CV%
1,9
4,1
5,2
2,8
Próbka E
9,7
0,2
2,2
Próbka F
2,0
0,1
7,2
Zmienność pomiędzy badaniami oceniono, przeprowadzając dwukrotnie badanie panelu 5 próbek i kontroli z
zestawu 2 razy dziennie przez 3 dni. Podsumowanie tych wyników przedstawiono poniżej.
Wyniki pomiędzy badaniami dla testu QUANTA LiteTM SLA ELISA
Próbka A
Próbka B
Próbka C
Jednostki średnie
78,5
48,5
29,0
SD
1,8
1,1
0,9
CV%
1,9
4,1
5,2
Próbka D
13,6
0,5
2,8
Próbka E
9,5
0,4
2,2
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1996;334(14):897-903.
Krawitt EL. Can you recognize autoimmune hepatitis? Postgrad Med. 1998;104(2):145-149, 152.
Alvarez F, Berg PA, Bianchi FB, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of
criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(5):929-938.
Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;32(1
Suppl):181-197.
Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges. Gastroenterology.
2001;120(6):1502-1517.
Czaja AJ, Homburger HA. Autoantibodies in liver disease. Gastroenterology. 2001;120(1):239-249.
Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1995 Oct
12;333(15):1004-1005.
Kanzler S, Weidemann C, Gerken G, Lohr HF, Galle PR, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW.
Clinical significance of autoantibodies to soluble liver antigen in autoimmune hepatitis. J Hepatol.
1999;31(4):635-640.
McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in
autoimmune hepatitis. Gut. 1998;42:599-602.
Ballot E, Homberg JC, Johanet C. Antibodies to soluble liver antigen: an additional marker in type 1
auto-immune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):208-215.
Lapierre P, Hajoui O, Homberg JC, Alvarez F. Formiminotransferase cyclodeaminase is an organspecific autoantigen recognized by sera of patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology.
1999 Mar;116(3):643-649.
Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Buschenfelde KH. Characterization of a
new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver
antigen. Lancet. 1987;1:292-294.
Stechemesser E, Klein R, Berg PA. Characterization and clinical relevance of liver-pancreas
antibodies in autoimmune hepatitis. Hepatology. 1993;18(1):1-9.
Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW.
Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet. 2000
29;355(9214):1510-1515.
Costa M, Rodriguez-Sanchez JL, Czaja AJ, Gelpi C. Isolation and characterization of cDNA encoding
the antigenic protein of the human tRNP(Ser)Sec complex recognized by autoantibodies from
patients with type-1 autoimmune hepatitis. Clin Exp Immunol. 2000;121(2):364-374.
Wachter B, Kyriatsoulis A, Lohse AW, Gerken G, Meyer zum Buschenfelde KH, Manns MP.
Characterization of liver cytokeratin as a major target antigen of anti-SLA antibodies. J Hepatol.
1990;11(2):232-239.
Wesierska-Gadek J, Grimm R, Hitchman E, Penner E. Members of the glutathione S-transferase
gene family are antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998 Feb;114(2):329-335.
Klein R, Berg PA. Glutathione S-transferase as a major autoantigen in anti-SLA-positive autoimmune
hepatitis. Gastroenterology. 1998;116(4):1015-1016.
Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen: specific marker of autoimmune hepatitis. J Hepatol.
2000;33(2):326-328.
Czaja AJ, Carpenter HA, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial
complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology. 1993;105(5):1522-1528.
Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H, Manns MP. Epitope
mapping of cytochrome P4502D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alphainterferon treatment. J. Hepatol. 1999;30(3):366-375.
Czaja AJ, Donaldson PT, Lohse AW. Antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas and HLA risk
factors for type 1 autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97:413-419.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National
Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395).
7
24.
25.
26.
27.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1991. Internal quality control: Principles and
definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol.11(6).
Nishioka M, Morshed SA, Parveen S, Kono K, Matsuoka H, Manns MP. Antibodies to P450IID6, SLA,
PDH-E2 and BCKD-E2 in Japanese patients with chronic hepatitis. J Gastroenterol Hepatol.
1997;12(12):862-868.
Boberg KM, Aadland E, Jahnsen J, Raknerud N, Stiris M, Bell H. Incidence and prevalence of
primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and autoimmune hepatitis in a Norwegian
population. Scand J Gastroenterol. 1998;33(1):99-103.
Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of
selected autoimmune diseases in the United States. Clin Immunol Immunopathol. 1997; 84(3):223243.
QUANTA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonym znakiem handlowym firmy
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628775POL
Sierpień 2011
Wersja 0
8