Mgr farm. Monika Agnieszka Leśniewska Streszczenie pracy

Mgr farm. Monika Agnieszka Leśniewska
Streszczenie pracy doktorskiej: Analiza porównawcza lipofilowości oraz trwałości aktywnej
przeciwwirusowo pochodnej 9-okso-5H-imidazo-[1,2-a]puryny, jej estrów oraz estrów
acyklowiru
Niedogodności związane ze stosowaniem acyklowiru skłaniają do ciągłego poszukiwania
jego nowych analogów o skuteczności i bezpieczeństwie leku macierzystego, a jednocześnie
posiadających korzystniejsze parametry farmakokinetyczne. Celem badań niniejszej pracy
była ocena wpływu modyfikacji strukturalnych w obrębie części zasadowej i pseudocukrowej
acyklowiru na trwałość chemiczną, enzymatyczną oraz lipofilowość wybranych nowych
pochodnych ACV.
W celu zwiększenia lipofilowości cząsteczki acyklowiru oraz jego trójcyklicznego
analogu – związku XXVII (3,9-dihydro-3-[(2-hydroksyetoksy)metylo]-6-(4-metoksy-fenylo)9-okso-5H-imidazo-[1,2-a]puryna), estryfikacji poddano grupę hydroksylową wymienionych
substancji tworząc proste estry. Do badań wybrano pięć estrów obu związków: acetylowe
(Ac-), izobutyrylowe (iBut-), piwaloilowe (Piv-) oraz etoksykarbonylowe (Etc-) i nikotynowe
(Nic-).
Dokonano syntezy pięciu estrów acyklowiru oraz potwierdzono ich tożsamość (estry AcI, iBut-I, Piv-I) metodami spektroskopowymi. Dla nowozsyntetyzowanych estrów Etc-I i
Nic-I wykonano charakterystykę przy użyciu metod spektroskopowych, analizy elementarnej
i pomiaru temperatury topnienia. Wszystkie otrzymane estry charakteryzowały się wysoką
czystością potwierdzoną metodą HPLC (98,4% – 100,0%). Analogicznym badaniom poddane
zostały estry związku XXVII zsytnetyzowane przez dr hab. Tomasza Ostrowskiego (Instytut
Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu).
Lipofilowość badanych związków wyznaczono doświadczalnie przy użyciu metody
HPLC, a następnie porównano otrzymane wyniki z wartościami uzyskanymi za pomocą
technik obliczeniowych (ALOGPS 2.1 program) w celu sprawdzenia możliwości zamiennego
stosowania
obu
metod
do
określania
lipofilowości
związków
należących
do tej grupy. Porównano wartości uzyskane eksperymentalnie z danymi piśmiennictwa
i stwierdzono, że
zastosowana metoda doświadczalna jest poprawna i użyteczna dla
wyznaczania lipofilowości
Obserwując
istnienie
badanych substancji, a jednocześnie jest też szybka i tania.
korelacji
między
wartościami
wyznaczonymi
doświadczalnie
i obliczonymi, wybrano algorytm AC logP o najlepszych parametrach korelacji.
Obserwowaną zależność opisano równaniem: log kw = k1 + k2 × AC logP
(logP = k1 + k2 × AC logP), które pozwala wyznaczyć lipofilowość metodą obliczeniową z
niewielkim błędem względem wartości uzyskanych eksperymentalnie. W związku z tym
może ona być z powodzeniem wykorzystywana do przewidywania lipofilowości analogów
ACV i XXVII zamiast badań doświadczalnych. Badane związki zostały uszeregowane
według wzrastającej lipofilowości: ACV < Ac-I <Nic-I < Etc-I < iBut-I < Piv-I < XXVII <
AcXXVII < Nic-XXVII < Etc-XXVII < iBut-XXVII <Piv-XXVII.
Dla każdego z analizowanych związków opracowano metodę wysokosprawnej
chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz z detekcją UV, do rejestrowania zmian
stężenia
w
obecności
produktów
jego
rozkładu
i
wzorca
wewnętrznego
w warunkach rozkładu w środowisku kwasowym, w osoczu ludzkim oraz w osoczu
w obecności esterazy. Opracowane metody poddano walidacji poprzez ocenę takich
parametrów jak: selektywność, liniowość, precyzja, dokładność, powtarzalność, zakres
i czułość metody, granice wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ), a dla metod
opracowanych dla badań trwałości w materiale biologicznym także stabilność analitu.
Wszystkie metody spełniały stawiane im wymagania i mogły być stosowane w określonym
zakresie prowadzonych badań.
Dokonano oceny trwałości związku XXVII za pomocą testu stresowego, przyspieszonego
i
pośredniego
z
pomiarem
zmian
stężenia
substancji
metodą
HPLC-UV
i analizą produktów degradacji przy użyciu metody HPLC-MS/MS. Badany związek został
sklasyfikowany jako nietrwały/fotolabilny we wszystkich analizowanych warunkach testu
stresowego.
Dowiedziono,
przy
użyciu
metody
HPLC-MS/MS,
że
niezależnie
od środowiska reakcji rozkładowi związku XXVII, towarzyszy tworzenie się acyklowiru.
Podczas testu przyspieszonego i pośredniego ustalono natomiast, że ani temperatura, ani
wilgotność względna powietrza, nie mają istotnego wpływu na trwałość badanej substancji w
fazie stałej.
Badania
kinetyczne
reakcji
hydrolizy
kwasowej
wykonano
w
roztworach
wodno-organicznych (związek XXVII i jego estry) lub wodnych (estry ACV),
w środowisku kwasu solnego w zakresie stężeń 0,05 mol/l – 0,50 mol/l (pH 0,42 – 1,38) przy
stałej wartości siły jonowej (μ = 0,50 mol/l). Wyznaczono obserwowane stałe szybkości
reakcji hydrolizy, a następnie opisano odpowiednimi równaniami kinetycznymi zależności
log
kpH
=
f(pH),
wyznaczając
katalityczne
stałe
szybkości
reakcji.
Ustalono,
że w środowisku kwasowym rozkład badanych związków zachodzi z kinetyką
pseudopierwszego
rzędu
i
składa
się
na
niego
hydroliza
form
protonowanych
pod wpływem jonów wodorowych, hydroliza spontaniczna pod wpływem wody form
protonowanych i/lub form obojętnych. Stwierdzono ponadto, że stałe szybkości hydrolizy
analogicznych estrów ACV i XXVII (poza estrami nikotynowymi) są zbliżone, w związku z
czym
obecność
dodatkowego
pierścienia
w
strukturze
analogów
trójcyklicznych
nie wywiera wpływu na podatność estrów na hydrolizę w powyższych warunkach.
Istotny wpływ na szybkość hydrolizy badanych związków wywiera natomiast budowa
przestrzenna podstawników w części estrowej. Zaobserwowano wyraźny efekt steryczny
podstawników, opisany parametrem Tafta. Dla wybranych estrów wyznaczono również
obserwowane stałe szybkości tworzenia (dla związku XXVII i ACV) i rozkładu
(dla związku XXVII) obserwowanego produktu hydrolizy. Zaproponowano mechanizm
hydrolizy badanych estrów do związków macierzystych w środowisku kwasowym, jako
reakcję dwuetapową (dla Etc-I i Etc-XXVII) lub jednoetapową (dla pozostałych estrów).
Stwierdzono również, że różnica w szybkości hydrolizy bezpośredniej związku XXVII oraz
tworzącego się podczas rozkładu jego estru może wynikać z katalitycznego wpływu kwasu
organicznego powstającego podczas hydrolizy estru.
Wykonano
również
badania
kinetyczne
hydrolizy
analizowanych
związków
w temperaturze 37°C w 80% osoczu ludzkim oraz w osoczu w obecności esterazy z wątroby
wieprzowej w zakresie czterech stężeń enzymu. W ramach powyższych badań wyznaczono
parametry
kinetyczne
reakcji:
obserwowane
stałe
szybkości
(kobs.)
i biologiczne okresy półtrwania (t0,5). Ustalono, że w osoczu rozkład estrów acyklowiru
zachodzi znacznie szybciej niż estrów trójcyklicznych, natomiast w obecności esterazy
różnice w szybkości hydrolizy są niewielkie. Dla wszystkich związków rozkład
w obecności enzymu zachodzi szybciej niż w osoczu, a wzrost szybkości reakcji jest
proporcjonalny do wzrostu stężenia enzymu. Stwierdzono ponadto, że typ podstawnika
w części estrowej obu grup związków wywiera wpływ na podatność na hydrolizę
w analizowanych warunkach, nie daje się on jednak wytłumaczyć jedynie efektem
sterycznym zgodnie z analizą Tafta.