Pobierz wersję PDF
Transkrypt
Pobierz wersję PDF
ISSN 1895 - 4421 EPISTEME CZASOPISMO NAUKOWO-KULTURALNE KRAKÓW Nr 14/2012 EPISTEME CZASOPISMO NAUKOWO-KULTURALNE Redakcja: Zdzisław Szczepanik (red. naczelny) Katarzyna Daraż-Duda (sekretarz redakcji) Piotr Walecki Grzegorz Chajko Krzysztof Duda Rada Naukowa: Prof. dr hab. Dariusz Rott Prof. dr hab. Włodzimierz Sady Prof. dr hab. Michał Śliwa Prof. dr hab. inż. Ryszard Tadeusiewicz Prof. dr hab. Bogdan Zemanek Ks. Prof. UPJP II, dr hab. Władysław Zuziak Prof. nadzw. dr hab. Wiesław Alejziak Prof. Ignatianum i UJ, dr hab. Józef Bremer SJ Prof. dr przew. kwal. II Paweł Taranczewski Prof. dr Olga E. Kosheleva Prof. dr Aleksandr Lokshin Prof. dr Hans Jørgen Jensen Prof. dr Oleksandr Chyrkov Prof. dr Iryna Diachuk Prof. dr Luiza Arutinov Prof. dr hab. Michaił Odesskij Prof. dr hab., dr. phil. Andrzej Wiercinski Prof. dr eng. Elena Horska projekt okładki i skład: Roman Turowski Wydawca: Stowarzyszenie Twórców Nauki i Kultury „Episteme” ul. Okólna 28/87 30-669 Kraków © Stowarzyszenie Twórców Nauki i Kultury „Episteme” i Autorzy Szanowni Państwo ! Niezmiernie nam miło przekazać Państwu nowy numer naszego czasopisma, którego zawartość zapełniają teksty młodych naukowców z zakresu nauk przyrodniczych. Teksty te mają charakter nowatorski i wnoszą nową jakość do nauki. Artykuły te przeszły gruntowną recenzję specjalistów z zakresów do których się odnoszą i uzyskały ich akceptację, co ostatecznie zadecydowało o ich publikacji. Gratulując autorom tekstów opublikowanych jednocześnie życzymy czytelnikom inspiracji z nich wynikających. Redakcja SPIS TREŚCI I. OCHRONA I INŻYNIERIA ŚRODOWISKA Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura SEZONOWA ZMIENNOŚĆ WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WÓD OPADOWYCH I ODPŁYWAJĄCYCH ZE ZLEWNI PLANOWANEGO ZBIORNIKA MAŁEJ RETENCJI „BISTUSZOWA” . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Marta Czekaj OPINIE WYBRANYCH PRODUCENTÓW ROLNYCH DOT. STOSOWANIA NAWOZÓW NIEKONWENCJONALNYCH (ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM POPIOŁU PALENISKOWEGO) . . . . . . . . 25 Leszek Gersztyn, Anna Karczewska SPECJACJA MIEDZI W OSADACH POFLOTACYJNYCH GÓRNICTWA MIEDZI WZBOGACONYCH W RÓŻNE DODATKI ORGANICZNE . . . . . . . . . . . . . . 33 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka KSZTAŁTOWANIE SIĘ ZAWARTOŚCI METALI CIĘŻKICH W GLEBACH WYBRANYCH DWÓCH OBSZARÓW CHRONIONYCH DOLNEGO ŚLĄSKA . . . . . . . . . 41 Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek ZAWARTOŚĆ NIKLU W ROŚLINACH PO ZASTOSOWANIU OSADÓW ŚCIEKOWYCH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk POZIOM EDUKACJI PRZYRODNICZO-LEŚNEJ DOTYCZĄCEJ GROMADY REPTILIA W WOJEWÓDZTWIE MAZOWIECKIM . . . . . . . . 59 Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek OCENA ZAGROŻENIA EROZJĄ WODNĄ ZLEWNI POTOKU SMUGAWKA W BESKIDZIE MAKOWSKIM Z WYKORZYSTANIEM TECHNIK GIS . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Anna Lehmann, Marta Jabłońska, Magdalena Giemza-Mikoda WALORY PRZYRODNICZE PARKU PRZYPAŁACOWEGO W WOLSZTYNIE . . . . . . . . . . 77 Małgorzata Leja, Agnieszka Hawryło WALORYZACJA HYDROMORFOLOGICZNA NA PRZYKŁADZIE ODCINKA RZEKI WISŁOKI OD MOKRZCA DO PUSTKOWA . . . . . . . . 85 Agnieszka Listosz BIOMASA NADZIEMNA TRZCINNIKA PIASKOWEGO NA GRUNTACH ZDEGRADOWANYCH PRZY ZAKŁADACH AZOTOWYCH „PUŁAWY” S.A W KONTEKSCIE WYKORZYSTANIA NA CELE ENERGETYCZNE . . . . . . . . . . . . . . . 93 spis treści Mateusz Malinowski UWARUNKOWANIA WYTWARZANIA PALIW ALTERNATYWNYCH ZE ZMIESZANYCH ODPADÓW KOMUNALNYCH . . . . . . . . . . . 101 Weronika Maślanko, Joanna Sender STAN EKOLOGICZNY JEZIORA KRASNE W OPARCIU O WSKAŹNIKI MAKROFITOWE ORAZ ANALIZA STRUKTURY UŻYTKOWANIA JEGO ZLEWNI . . . . 109 Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran WPŁYW NAWOŻENIA KOMPOSTAMI Z DODATKIEM ODPADÓW BIODEGRADOWALNYCH NA ZAWARTOŚĆ MANGANU W GLEBIE I ROŚLINACH . . . . . . . . 121 Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski THE BREEDING POPULATION OF MAGPIE PICA PICA IN CHEŁM (EASTERN POLAND) – A COMPARISON OF SURVEYS OF 1991 AND 2011 . . . . . . . . . . . . 129 Ewelina Szwaj BIORÓŻNORODNOŚĆ RYJKOWCÓW (CURCULIONOIDEA) KSEROTERMICZNYCH OBSZARÓW LUBELSZCZYZNY . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Krzysztof Wąs ANALIZA WARUNKÓW CIEPLNO-WILGOTNOŚCIOWYCH W OKRESIE LATA W PASYWNYM PREFABRYKOWANYM BUDYNKU SZKIELETOWYM . . . . . . . . 147 II. TECHNOLOGIA ŻYWNOŚCI Mariusz Adamski, Katarzyna Pisarska WYSTĘPOWANIE ENDOSYMBIOTYCZNYCH BAKTERII W KOMÓRKACH BOCZNIAKA (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 Iwona Cieślik, Barbara Mickowska, Katarzyna Kluz, Władysław Migdał PRÓBA ZASTOSOWANIA CHROMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ DO ANALIZY AMIN BIOGENNYCH W MIĘSIE RYB . . . . . . . . . . 161 Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała WPŁYW PRESURYZACJI NA PRZEŻYWALNOŚĆ MIKROFLORY JOGURTOWEJ . . . . 169 Agnieszka Dylewska WPŁYW CZASU OGRZEWANIA ROZTWORÓW KONCENTRATU BIAŁEK SERWATKOWYCH NA NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE I LEPKOŚĆ . . . . . . . 177 6 spis treści Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida OCENA WIEDZY ORAZ POBRANIA KWASU FOLIOWEGO PRZEZ MIESZKANCÓW WOJEWÓDZTWA MAŁOPOLSKIEGO . . . . . . . . . . . . . . . . . .185 Justyna Górecka WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE MODELOWYCH PRODUKTÓW MIĘSNYCH, WYPRODUKOWANYCH Z WSTĘPNIE UTRWALONEGO MIĘŚNIA NAJDŁUŻSZEGO GRZBIETU DZIKA . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Dorota Kowalewska WPŁYW KULTURY STARTOWEJ NA PROCESY LIPOLIZY W SERACH MIĘKKICH Z MLEKA KROWIEGO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205 Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna WPŁYW WYBRANYCH SKŁADNIKÓW MINERALNYCH NA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE UTLENIONEJ SKROBI KUKURYDZIANEJ . . . . . . . . . 215 Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch WPŁYW TEMPERATURY FERMENTACJI BRZECZKI PIWNEJ NA PROFIL WYBRANYCH ZWIĄZKÓW LOTNYCH PIWA . . . . . . . . . . . . . . . 223 Gabriela Kulig, Monika Halik, Anna Ptaszek WŁAŚCIWOŚCI OSMOTYCZNE WODNYCH UKŁADÓW PVP- ŻELATYNA RYB MORSKICH-WODA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 Karolina Malecka, Ryszard Macura, Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg WYKORZYSTANIE KRIOKONCENTRACJI DO PRODUKCJI PREPARATÓW BARWIĄCYCH Z SOKU BURAKA ĆWIKŁOWEGO PODDANEGO FERMENTACJI MLEKOWEJ I AKOHOLOWEJ . . . . . . . . . . . . . 239 Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik OSZACOWANIE SPOŻYCIA PRODUKTÓW ZAWIERAJĄCYCH FRUKTANY . . . . . . . 247 Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska WYBRANE DETERMINANTY DECYZJI PODEJMOWANYCH PRZEZ KONSUMENTÓW NA RYNKU USŁUG GASTRONOMICZNYCH NA PRZYKŁADZIE McDONALD’S . . . . . . . . . . . . . .255 Agnieszka Staszowska, Anna Litwińczuk, Monika Kędzierska, Piotr Skałecki ZAWARTOŚĆ MIKRO- I MAKROELEMENTÓW W TKANCE MIĘŚNIOWEJ WYBRANYCH GATUNKÓW RYB Z MORZA BAŁTYCKIEGO . . . . . . . . 263 Marek Szeląg, Karolina Malecka WPŁYW PARAMETRÓW TECHNICZNYCH UKŁADU ROBOCZEGO KUTRA NA OGRANICZENIE PRZYROSTU TEMPERATURY I MIGRACJI ZUŻYTYCH CZĄSTEK DO ROZDRABNIANEGO SUROWCA PODCZAS KUTROWANIA . . . . . . . 269 7 spis treści III. BIOLOGIA I BIOTECHNOLOGIA Łukasz Dyba ANALIZA SEKWENCJI INTRONÓW GENÓW IPI I CRTISO MARCHWI CHARAKTERYZUJĄCYCH SIĘ OBECNOŚCIĄ TRANSPOZONÓW TYPU MITE . . . . . 279 Agnieszka Fornal, Anna Radko OCENA POLIMORFIZMU MARKERÓW MIKROSATELITARNYCH DNA U KONIKÓW POLSKICH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Marta Głogowska, Grzegorz Formicki, Bogdan Kosowski, Robert Stawarz KUMULACJA RTĘCI W LUDZKICH TKANKACH NOWOTWOROWYCH ŻOŁĄDKA I JELITA GRUBEGO W ZALEŻNOŚCI OD WIEKU I PŁCI . . . . . . . . . . . . . 293 Beata Horecka STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI DZIKO ŻYJĄCEJ LISA POSPOLITEGO (VULPES VULPES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 Andrzej Jurkowski, Andrzej Latusek ANALIZA OBECNOŚCI MARKERA XCFD81-5D U ŻYTA OZIMEGO . . . . . . . . . . . . . . 309 Agata Kapturowska, Wanda Zamojska, Izabela Stolarzewicz, Ewa Białecka-Florjańczyk SUBSTRATY HYDROFOBOWE W PODŁOŻACH STYMULUJĄCYCH AKTYWNOŚĆ LIPOLITYCZNĄ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA . . . . . . . . . . . . . 317 Bartosz Kozak WYBÓR STARTERÓW Z NUKLEOTYDAMI SELEKCYJNYMI DO ANALIZ AFLP U ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) . . . . . 325 Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska WPŁYW ILOŚCI PORODÓW NA KUMULACJĘ KADMU, MIEDZI I CYNKU W ŁOŻYSKACH KOBIET ORAZ KRWI PĘPOWINOWEJ NOWORODKÓW. . . . . . . . . 333 Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec UDZIAŁ OPIOIDÓW W MODULOWANIU WPŁYWU RAPAMYCYNY NA STĘŻENIE BIAŁKA S6K1 SZLAKU MTORC1 W PODWZGÓRZU . . . . . . . . . . . . . . 341 Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski ODDZIAŁYWANIE WODY ANIONOWEJ NA TEMPO WZROSTU DROBNOUSTROJÓW .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 8 spis treści Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka MAPOWANIE QTL PLONU I ZAWARTOŚCI SACHAROZY W STRESIE SUSZY U PSZENICY . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW CANDIDA ALBICANS ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .365 Hubert Okła, Jan Słodki, Krzysztof P. Jasik ZAKAŻENIE KLESZCZY IXODES RICINUS TYPOWYMI PATOGENAMI NA TERENIE WYBRANYCH SIEDLISK WOJEWÓDZTWA ŚLĄSKIEGO . . . . . . . . . . . . 373 Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski OCENA WPŁYWU ENDOFITYCZNEGO METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS NA WYBRANE CECHY KUKURYDZY (ZEA MAYS L.) . . . . . . . . . . . . . 381 Jan Słodki, Hubert Okła, Krzysztof P. Jasik TRANSMISJA WERTYKALNA PIERWOTNIAKA BABESIA MICROTI U SZCZURÓW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska FIZJOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ROŚLIN JĘCZMIENIA JAREGO (HORDEUM VULGARE L.) NA STRES SUSZY . . . . . . . . . . . . . . . 395 Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec PROTEKCYJNA ROLA MET-ENKEFALINY W CENTRALNYM UKŁADZIE NERWOWYM W WARUNKACH HIPOGLIKEMII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .409 Katarzyna Śniegowska, Katarzyna Stalmach THE COMPARISON OF HVA1 AND SRG6 GENES EXPRESSION PROFILES IN SEEDLING AND FLOWERING STAGE IN A SPRING BARLEY (HORDEUM VULGARE L.) CULTIVARS DURING DROUGHT TREATMENT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417 Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart AEROZOL MIKROBIOLOGICZNY W WYBRANYCH POMIESZCZENIACH UNIWERSYTETU ROLNICZEGO W KRAKOWIE .. . . . . . . . . . . . 423 Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn DYNAMIKA EKSPRESJI GENÓW FOXP3, JAK1, STAT1 W TRAKCIE ROZWOJU CIA U SZCZURÓW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431 9 I. OCHRONA I INŻYNIERIA ŚRODOWISKA Łukasz Borek Krzysztof Ostrowski Tomasz Stachura EPISTEME 14/2012 s.13-23 ISSN 1895-4421 SEZONOWA ZMIENNOŚĆ WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH WÓD OPADOWYCH I ODPŁYWAJĄCYCH ZE ZLEWNI PLANOWANEGO ZBIORNIKA MAŁEJ RETENCJI „BISTUSZOWA” SEASONAL CHANGEABILITY OF THE PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF RAINWATER AND RUNOFF FROM THE CATCHMENT OF THE PLANNED OF SMALL RETENTION RESERVOIR „BISTUSZOWA” Abstrakt. Celem analizy było określenie istotności różnic sezonowych stężeń wybranych wskaźników zanieczyszczeń wód opadowych i odpływających ze zlewni potoku Rygliczanka, na terenie której planowana jest budowa zbiornika małej retencji. Badania wód opadowych przeprowadzono w okresie od V 2007 do XII 2010 r., a wód powierzchniowych od XI 2006 do XII 2010 r. Próbki wody opadowej i powierzchniowej pobierano systematycznie raz w miesiącu. Badane wskaźniki poddano analizie statystycznej. Istotną różnicę między wartościami stężeń zanieczyszczeń pomiędzy półroczem letnim i zimowym stwierdzono w przypadku kilku na kilkanaście oznaczanych wskaźników w wodzie opadowej i powierzchniowej. W pozostałych przypadkach różnice te były statystycznie nieistotne, przy założonym poziomie istotności 0,05. Ogólna ocena jakości wód odpływających, wykonana w oparciu o Rozporządzenie Ministra Środowiska z 2008 r. wykazała, że stan jednolitych części wód powierzchniowych jest zły. Słowa kluczowe: zasoby wodne, mała retencja, wskaźniki jakości wody Summary. The aim was to determine the significance of seasonal differences in concentrations of examined indicators of pollution rainwater and the runoff from the catchment Rygliczanka stream, where a small retention reservoir is planned to be built. The examination of the rainwater was conducted from May 2007 to December 2010, and of the surface water from November 2006 to December 2010. The samples of rainwater and surface water were collected regularly once a month. The tested indicators were analyzed statistically. A significant difference between the values of concentrations of pollutants between summer and winter semester was found in the case of several indicators in some designated rainwater and surface water. In other cases the differences were not statistically significant, at the assumed level of significance 0,05. Overall assessment of the quality of the runoff water, made on the basis of the Minister of Environment’s regulation from 2008 revealed, that the level of surface waters is bad. Key words: water resources, small retention, water quality indicators 13 Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura WSTĘP Obszar województwa małopolskiego ze względu na swoją fizjografię charakteryzuje się dość dużymi opadami atmosferycznymi, osiągającymi roczne sumy 600-700 mm, a w terenach górskich i podgórskich nawet ponad 1200 mm [Mikulski 1998]. Nie zmienia to jednak faktu, że w latach suchych rejon ten zmaga się z deficytami wody, szczególnie jeśli chodzi o sektor rolniczy i zaopatrzenie ludności. Natomiast występowanie krótkich, ale obfitych deszczy, połączonych z burzami na terenach zurbanizowanych o rozbudowanej infrastrukturze technicznej jest przyczyną wezbrań tzw. „flash floods”, podtopień a nawet powodzi, często tragicznych w swych skutkach. Wskazuje to na potrzebę odpowiedzialnego i odpowiedniego gospodarowania wodą w skali lokalnej, w tym szczególnie w małych zlewniach podgórskich, gdzie zaczynają się formować zasoby wodne, a rzeźba terenu wpływa na szybki odpływ wód opadowych. Bez takiego podejścia w gospodarowaniu wodą tracona jest bezproduktywnie duża jej część, co w naszych warunkach klimatycznych nie powinno mieć miejsca. Jednym z działań wychodzącym naprzeciw tym potrzebom jest „Program Małej Retencji Województwa Małopolskiego” [Program… 2003/2004]. Głównych celem Programu jest przeciwdziałanie negatywnym skutkom powodzi i suszy, poprzez zwiększanie retencyjności zlewni oraz poprawę stanu technicznego urządzeń ochrony przeciwpowodziowej. Woda dociera na powierzchnię Ziemi w postaci opadów deszczu, śniegu lub gradu. To jakimi charakteryzuje się właściwościami zależy od stanu czystości środowiska naturalnego na danym obszarze, w tym również czystości atmosfery. Wody naturalne cechuje dynamika procesów chemicznych, dlatego tak ważne jest określenie właściwości, na podstawie których możemy ocenić ich przydatność do różnych celów [Chełmicki 2002]. Celem artykułu jest analiza sezonowej zmienności właściwości fizyko-chemicznych wód opadowych i odpływających ze zlewni potoku Rygliczanka, i ich wpływu na stan jednolitej części wód powierzchniowych. MATERIAŁ I METODY Teren, na którym planowana jest budowa zbiornika wodnego małej retencji położony jest w województwie małopolskim w powiecie tarnowskim w granicach miejscowości Bistuszowa, administracyjnie należącej do gminy Ryglice. Zakres badań obejmował pomiary terenowe, prowadzone bezpośrednio w miejscu projektowanej zapory czołowej zbiornika w kilometrze cieku 0+630 oraz oznaczenia laboratoryjne wybranych wskaźników jakości wody. Zlewnia ma charakter rolniczo-leśny. Oznaczenia w wodzie opadowej przeprowadzono w okresie od V 2007 r. do XII 2010 r., a w wodzie powierzchniowej od XI 2006 14 Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód... r. do XII 2010 r. Bezpośrednio w terenie w wodzie opadowej i powierzchniowej mierzono: temperaturę, pH, przewodność elektrolityczną właściwą oraz zawartość tlenu rozpuszczonego. Fitobentos do określenia wskaźnika okrzemkowego pobierano z podłoża trwale zanurzonego w wodzie – głównie z otoczaków, przy pomocy nożyka [Przewodnik Metodyczny 2010]. W pobranych próbkach wody oznaczono metodami standardowymi stężenia: wapnia (Ca2+), magnezu (Mg2+), żelaza (Fe2+/3+), manganu (Mn2+), ołowiu (Pb2+), niklu (Ni2+), kadmu (Cd2+), chromu (Cr3+/6+), cynku (Zn2+), miedzi (Cu2+), azotu amonowego (N-NH4+), azotanowego (N-NO3-), azotynowego (N-NO2-), fosforu ogólnego (Pog.), fosforanów (PO43-), chlorków (Cl-), zawiesiny ogólnej (ZO), substancji rozpuszczonej (SR), siarczanów (SO42-) oraz BZT5 i CHZTMn [Hermanowicz i in. 1999]. Wyniki pomiarów terenowych i laboratoryjnych poddano opracowaniu statystycznemu w programie Statistica PL wersja 9. Dla badanych wskaźników określono miary: położenia i rozproszenia [Stanisz 1998]. W celu sprawdzenia istotności różnic między wartościami badanych wskaźników jakości wody pomiędzy półroczem letnim (V-X) i zimowym (XI-IV) zastosowano testy parametryczne i nieparametryczne dla poziomu istotności α = 0,05, służące odpowiednio do weryfikacji hipotez istotności różnic wartości średnich i charakteru rozkładu. Jakość wody odpływającej ze zlewni oceniono w oparciu o Rozporządzenie Ministra Środowiska (RMŚ) z 20 sierpnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji stanu jednolitych części wód powierzchniowych [Dz. U. z 2008 r. Nr 162, poz. 1008]. WYNIKI W analizie statystycznej wody opadowej uwzględniono 15 (Tab. 1), a w wodzie powierzchniowej 19 wskaźników [Tab. 2]. W wodzie opadowej średnie stężenia ZO, pH, Pog., PO43-, N-NO2-, SR, SO42-, Ca2+ i Mg2+ osiągnęły większe wartości w półroczach letnich (PL), natomiast w półroczach zimowych (PZ) odnotowano wyższe średnie wartości stężeń: N-NH4+, N-NO3-, EC, Cl-, Fe2+/3+ i Mn2+. W wodzie powierzchniowej, w półroczach letnich, wyższymi średnimi wartościami odznaczały się: temperatura, ZO, pH, CHZT-Mn, Pog., PO43-, N-NO2-, EC, SR, SO42-, Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+ i Mn2+. W półroczach zimowych notowano natomiast wyższe średnie wartości: tlenu rozpuszczonego, BZT5, N-NH4+, N-NO3- oraz Cl-. Na podstawie wartości testu Shapiro-Wilka, wykazano, że 3 spośród 15 wskaźników określonych w wodzie opadowej oraz 5 spośród 19 wskaźników wody powierzchniowej, charakteryzowało się przebiegiem zgodnym z krzywą Gaussa – rozkładu normalnego (p>0,05), a w pozostałych przypadkach stwierdzono asymetryczność i dekoncentrację wartości wokół wartości średniej. 15 Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura Dość dużym zróżnicowaniem (dyspersją) i rozproszeniem wyników wokół wartości średniej, zmiennych w wodzie opadowej, charakteryzowały się stężenia: ZO, SR, SO42-, Cl-, Ca2+ i EC. W wodzie odpływającej największym zróżnicowaniem wartości cechowały się: temperatura, ZO, tlen rozpuszczony, EC, SR, SO42-, Cl-, Ca2+ i Mg2+. Mn2+ [mg∙dm-3] Fe2+/3+ [mg∙dm-3] Mg2+ [mg∙dm-3] Ca2+ [mg∙dm-3] Cl- [mg∙dm-3] SO42- [mg∙dm-3] SR [mg∙dm-3] EC 20oC [µS∙cm-1] N-NO3- [mg∙dm-3] N-NO2- [mg∙dm-3] N-NH4+ [mg∙dm-3] PO43- [mg∙dm-3] Pog. [mg∙dm-3] Odczyn [pH] ZO [mg∙dm-3] Wskaźnik / Statystyka W celu sprawdzenia równości średnich w dwóch populacjach, mających rozkład normalny i jednorodne wariancje skorzystano z testu T-Studenta. Sformułowano następującą hipotezę zerową (Ho) – średnie z półroczy letnich i zimowych nie różnią się istotnie (m1 = m2), wobec hipotezy alternatywnej (H1) – średnie z półroczy letnich i zimowych nie są równe (m1 ≠ m2). W przypadkach braku jednorodności wariancji – określonej testem Fishera-Sendecora, do oceny równości średnich wykorzystano parametryczną alternatywę testu T-Studenta, tj. test Cochrana-Coxa. 16 0,03 0,04 0,02 0,02 0,00 0,03 0,09 0,01 0,07 0,28 0,06 0,20 0,00 0,07 0,29 0,09 0,21 0,14 0,14 0,10 0,07 0,27 0,16 0,02 1,08 0,66 0,57 0,52 2,65 1,63 0,56 0,31 0,81 0,89 0,41 0,85 2,92 1,71 0,43 0,18 3,71 2,93 2,57 2,47 15,58 3,95 1,93 3,72 25,58 158,17 14,00 22,00 15,85 12,58 6,28 39,40 17,54 19,00 16,00 20,53 36,52 6,04 8,31 69,04 0,42 0,62 0,40 0,60 0,03 0,18 0,24 0,06 0,02 0,01 0,01 0,01 0,00 0,02 0,01 0,00 0,74 0,89 0,75 0,74 0,17 0,42 0,59 0,35 0,32 0,04 0,10 0,03 0,37 0,61 0,04 0,00 0,11 0,01 0,03 0,01 0,04 0,20 0,01 0,00 5,51 4,75 6,20 5,38 0,46 0,68 1,10 1,20 3,60 2,60 2,00 1,55 14,01 3,74 3,41 11,63 PL PZ PL PZ PL PZ PL PZ Odch.std Wariancja Mediana Średnia Podstawowe statystyki opisowe: 0,003 0,180 - - - - - - - 0,002 - - - - - - 0,002 0,002 0,458 0,185 - - - 0,750 0,003 0,688 0,539 0,002 0,697 - - - - - - - - - - - 0,040 - - T-Studenta 0,219 U Manna CochranaCoxa Whitnea - - - - - - 0,003* 0,150 0,195 - - - - - - FisheraSendecora 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 20 20 20 20 19 20 20 20 20 20 20 20 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 24 24 20 20 PL PZ Liczebność 24 Normalność rozkładów – prawdopodobieństwo (p) testu: 19 <0,05 <0,05 ShapiroWilka PL 0,61 0,07 1,72 2,41 0,79 2,62 0,40 1,00 0,48 1,86 1,89 6,80 0,15 0,23 1,02 7,79 8,65 18,95 26,00 40,00 35,00 23,00 0,86 0,04 2,67 0,19 0,06 3,69 16,10 14,40 PZ Zakres PL PZ 0,73 0,07 1,72 2,41 0,79 7,02 0,27 0,00 0,37 0,00 0,00 4,00 0,40 1,00 0,48 1,86 1,95 7,21 0,15 0,23 1,02 7,79 8,65 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 18,95 0,41 30,00 48,00 4,00 43,00 32,00 8,00 1,13 0,04 3,04 0,19 0,06 7,69 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8,00 9,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 4,40 0,60 PL Minimum 16,30 15,00 0,20 PZ Maksimum Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód... Jednorodność wariancji – prawdopodobieństwo (p) testu: Określenie istotności różnic między wartościami wybranych wskaźników jakości wody z badanych półroczy testem: Tab. 1. Analiza statystyczna wody opadowej w zlewni potoku Rygliczanka. * wartości podkreślone oznaczają, że różnice są statystycznie istotne (p < 0,05) na założonym poziomie istotności α = 0,05 17 18 2,26 9,32 2,60 0,51 0,10 6,58 0,17 2,00 0,65 1,27 0,03 0,01 10,43 0,65 0,28 45,74 37,84 9,82 1,89 9,03 2,34 0,19 0,06 1,00 7,88 6,71 0,40 3,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,11 361,00 260,00 11,12 6,30 43,41 14,80 0,21 0,00 0,60 7,75 8,52 0,20 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,15 374,00 208,00 14,94 7,23 48,96 10,20 0,00 0,00 14,08 40,98 45,67 0,19 0,02 0,005 0,02 0,07 1,88 0,53 1,12 0,14 7,41 3,42 2,90 6,40 0,00 PL PZ PL Odch.std PZ Minimum 0,00 0,04 5,47 81,45 3,57 96,53 1431,61 2091,72 0,08 0,42 108,79 0,00 0,00 1,61 0,42 4,02 0,03 43,32 8,39 PZ 0,01 0,26 6,76 86,89 5,11 198,25 1679,24 2085,90 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 3,53 0,28 1,26 0,02 54,88 11,68 PL Wariancja 0,10 0,45 17,51 63,14 9,17 40,58 315,00 446,50 0,44 0,007 0,00 0,02 0,05 3,60 0,90 11,98 8,13 2,85 4,25 PZ 0,09 0,52 19,32 68,50 9,01 43,05 341,00 477,50 0,34 0,01 0,00 0,03 0,09 4,55 0,80 8,59 8,15 3,20 14,10 PL Mediana 0,09 0,45 17,33 64,01 9,70 39,85 310,62 446,96 0,51 0,13 2,24 0,02 0,05 3,28 1,00 12,00 8,08 5,57 4,27 PZ 0,11 0,68 19,15 66,16 9,38 42,11 339,25 460,63 0,39 0,02 0,002 0,03 0,11 5,38 0,90 8,81 8,12 7,03 13,91 PL Średnia Mn2+ [mg∙dm-3] Fe2+/3+ [mg∙dm-3] Mg2+ [mg∙dm-3] Ca2+ [mg∙dm-3] Cl- [mg∙dm-3] SO42- [mg∙dm-3] SR [mg∙dm-3] EC 20oC [µS∙cm-1] N-NO3- [mg∙dm-3] N-NO2- [mg∙dm-3] N-NH4+ [mg∙dm-3] PO43- [mg∙dm-3] Pog. [mg∙dm-3] ChZT-Mn [mg∙dm-3] BZT5 [mg∙dm-3] Tlen rozpuszczony [mgO2∙dm-3] Odczyn [pH] ZO [mg∙dm-3] Temp. wody [oC] Wskaźnik \ Statystyka Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura Na podstawie przeprowadzonych analiz można stwierdzić, że istotne różnice (p<0,05) pomiędzy półroczem letnim a zimowym w wodzie opadowej występują w przypadku: N-NO3- i SR, natomiast w wodzie powierzchniowej dla: temperatury, SR i Mg2+. Modelem statystyki, będącym nieparametrycznym odpowiednikiem testu T-Studenta jest test U Mnna Whitneya. Na jego podstawie stwierdzono, że różnice stężeń pomiędzy rozpatrywanymi okresami w wodzie opadowej były statystycznie istotne w przypadku: pH, Pog., PO43-, Cl- i Fe2+/3+, natomiast w wodzie powierzchniowej w odniesieniu do: tlenu rozpuszczonego, CHZTMn, Pog., PO43- i N-NO2-. Dla pozostałych wskaźników wynik prawdopodobieństwa (p) nie pozwolił odrzucić hipotezy zerowej zarówno w odniesieniu do wody opadowej jak i powierzchniowej. Podstawowe statystyki opisowe: 0,49 0,23 0,48 24 24 26 26 0,23 2,52 24,90 20,68 0,82 2,31 10,10 24 26 0,82 24 26 10,48 77,91 85,97 34,50 24 26 37,01 17,24 83,02 71,69 14,71 10,94 71,90 24 26 7,48 24 26 56,75 432,00 372,00 172,00 24 26 164,00 0,81 533,00 535,00 172,00 0,08 24 26 161,00 1,33 0,70 0,02 24 1,18 3,30 0,08 0,09 26 3,30 53,17 0,02 24 26 53,17 0,29 0,18 0,06 0,09 0,29 24 26 0,05 24 26 0,16 10,12 2,60 3,00 5,00 6,42 2,20 24 26 5,00 24 26 2,80 11,66 15,70 4,95 7,18 24 24 26 8,45 24,50 28,80 8,40 0,57 23,50 24 26 0,65 PL 26 28,20 9,00 PZ PL 13,90 24 26 PZ PL PZ 9,00 Maksimum Zakres Liczebność 20,30 Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód... <0,05 <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 Wilka Shapiro- Normalność rozkładów – prawdopodobieństwo (p) testu: - - 0,603 - - - 0,695 0,999 - - - - - - - - - 0,178 0,421 Sendecora Fishera- Jednorodność wariancji – prawdopodobieństwo (p) testu: - - 0,137 0,662 - 0,603 - 0,125 0,012 0,425 - 0,431 - - - - 0,013 0,065 0,296 0,000 - 0,072 - 0,000 - 0,000 - 0,000 - 0,579 - 0,000 - - - 0,547 - - 0,385 Coxa 0,000* CochranaU Manna Whitneya T-Studenta Określenie istotności różnic między wartościami wybranych wskaźników jakości wody z badanych półroczy testem: Tab. 2. Analiza statystyczna wody powierzchniowej w zlewni potoku Rygliczanka. * - Wartości podkreślone oznaczają, że różnice są statystycznie istotne (p < 0,05) przy założonym poziomie istotności α = 0,05 Do oceny stanu jednolitej części wód powierzchniowych w zlewni omawianego potoku, wykorzystano 22 wskaźniki charakteryzujące stan: ekologiczny, fizyczny i chemiczny wody powierzchniowej (Tab. 3]. Stwierdzono, że stan ekologiczny wód, określony na podstawie elementu biologicznego kwalifikuje się jako umiarkowany (III klasa). Wartości wskaźników dotyczące grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego spełniają wymagania stanu dobrego i wyższego niż dobry. Reasumując – ocena stanu jednolitej części wód powierzchniowych na podstawie elementu ekologicznego i chemicznego wskazuje na zły stan wód. 19 II. Półrocza zimowego Półrocza letniego Wielolecie Klasa III* 0,30 Wskaźnik okrzemkowy >0,70 1 Wyniki badań – percentyl 501,902 lub 1003 Element biologiczny 0,50 I. Klasa II Nazwa wskaźnika jakości wód Wartości graniczne wg Rozporządzenia 2008 Klasa I Lp. Jednostka Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura 0,36 (III) Elementy fizykochemiczne wspierające element biologiczny 4 Tlen rozpuszczony 5 BZT5 6 CHZT-Mn 7 Przewodność w 20˚C 8 Substancje rozpuszczone 8 Substancje rozpuszczone ≤500 9 Siarczany 10 Chlorki 11 16,32 (I) 17,12(I) 7,82(I) ≤25 ≤50 16,12(I) 19,52(I) 14,42(I) ≥7 ≥5 8,12(I) 9,52(I) 14,42(I) ≤3 ≤6 1,62(I) 1,42(I) 1,72(I) ≤6 ≤12 6,42(II) 8,62(II) 4,52(I) ≤1000 ≤1500 512,22(I) 508,12(I) 506,52(I) ≤800 372,42(I) 380,02(I) 361,02(I) ≤800 372,42(I) 380,02(I) 361,02(I) ≤150 ≤250 48,82(I) 54,82(I) 47,72(I) ≤200 ≤300 12,12(I) 11,12(I) 12,32(I) Wapń ≤100 ≤200 76,92(I) 76,32(I) 76,12(I) 12 Magnez ≤50 ≤100 20,82(I) 22,22(I) 20,22(I) 13 Odczyn 6-8,5 6-9 8,32(I) 8,32(I) 8,32(I) 14 Azot amonowy ≤0,78 ≤1,56 0,0362(I) 0,0092(I) 0,0432(I) 15 Azot azotanowy ≤2,2 ≤5 0,7612(I) 0,7062(I) 0,9142(I) 16 Fosfor ogólny ≤0,2 ≤0,4 0,0432(I) 0,0672(I) 0,0252(I) 20 mg·dm-3 pH mg·dm-3 mgO2·dm-3 o C Zawiesina ogólna ≤24 mg·dm-3 3 ≤22 µS·cm-1 Temperatura ≤500 2 Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód... Substancje szczególnie szkodliwe dla środowiska wodnego 17 Chrom 18 Cynk 19 Miedź ≤0,05 0,0103(+) 0,0093(+) 0,0103(+) ≤1 0,0573(+) 0,0573(+) 0,0163(+) ≤0,05 0,0043(+) 0,0043(+) 0,0033(+) 0,0031(+) 0,0013(+) 0,0011(+) 0,0003(+) 0,0011(+) Ołów 0,0011(+) 22 0,0001(+) 0,0013(+) Nikiel 0,0001(+) 21 ≤0,02 Kadm ≤0,0072 20 ≤0,0015 Chemiczne wskaźniki jakości wody mg·dm-3 IV. mg·dm-3 III. Przyjmuje się następujące oznaczenia w celu lepszego zobrazowania jakości wody: (I) (+) - (-) Klasa jakości wody, - - Wartość wskaźnika jakości z grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego spełnia wymagania dla stanu dobrego i stanu wyższego niż dobry, a z grupy wskaźników chemicznych jakości wody spełnia stan dobry, Wartość wskaźnika jakości z grupy substancji szczególnie szkodliwych dla środowiska wodnego nie spełnia wymagania dla stanu dobrego i stanu wyższego niż dobry, a z grupy wskaźników chemicznych jakości wody oznacza stan poniżej dobrego. Tab. 3. Ocena stanu jednolitej części wód powierzchniowych potoku Rygliczanka w oparciu o Rozporządzenie Ministra Środowiska z roku 2008. * - Wartości granicznej dla klas III - V nie ustala się DYSKUSJA I WNIOSKI Według Chełmickiego [2002] relacje między właściwościami fizyko-chemicznymi i biologicznymi, a środowiskiem naturalnym są bardzo złożone. W przyrodzie bowiem nie występuje woda chemicznie czysta, gdyż zawiera ona różnego rodzaju domieszki substancji mineralnych i organicznych tworząc zawiesiny i roztwory. Właściwości wody są więc uzależnione od uwarunkowań naturalnych i antropogenicznych. Na terenie zlewni można wyróżnić zanieczyszczenia punktowe, pochodzące z niekontrolowanych zrzutów 21 Łukasz Borek, Krzysztof Ostrowski, Tomasz Stachura ścieków bytowych i niedostatecznie rozwiniętej infrastruktury wodno-kanalizacyjnej, zanieczyszczenia obszarowe – z terenów użytkowanych rolniczo (49,1% pow. zlewni) oraz zanieczyszczenia liniowe, których głównym źródłem jest szeroko rozumiany transport. Zanieczyszczenia transgeniczne również wpływają na jakość wód opadowych, co w pewnym stopniu przekłada się na właściwości wód powierzchniowych. Analiza uzyskanych wyników pozwala na sformułowanie następujących wniosków: • Spośród badanych cech w wodzie opadowej rozkładem normalnym można opisać 3 wskaźniki, a w wodzie powierzchniowej 5 wskaźników. • Większość badanych wskaźników zanieczyszczeń, zarówno w półroczu letnim jak i zimowym, osiągała większe wartości w wodzie odpływającej, jedynie N-NH4+ i N-NO3- w obu półroczach oraz PO43- i N-NO2w półroczu zimowym były większe w wodzie opadowej. • W wodzie opadowej kilka wskaźników wykazało istotne różnice wartości pomiędzy półroczem letnim a zimowym. Statystycznie istotnie większymi wartościami w sezonie letnim cechowały się: SR, Pog. i PO43-, a w sezonie zimowym: N-NO3-, Cl-, i Fe2+/3+. • W wodzie powierzchniowej istotnie większe wartości średnie w okresie letnim wykazywały: temperatura, CHZT-Mn, Pog., PO43-, N-NO2-, SR i Mg2+, a w zimowym tylko tlen rozpuszczony. • Stan ekologiczny wody oceniono jako umiarkowany, a stan chemiczny jako dobry, co klasyfikuje stan jednolitej części wód powierzchniowych jako zły. Zachodzi więc potrzeba by równolegle z budową zbiornika podjąć działania ograniczające zanieczyszczenia wód powierzchniowych w jego zlewni. LITERATURA Chełmicki W. 2002. Woda. Zasoby, degradacja, ochrona. PWN. Warszawa. Hermanowicz W., Dojlido J., Dożańska W., Koziorowski B., Zerbe J. 1999. Fizyczno–chemiczne badania wody i ścieków. Arkady. Warszawa. Mikulski Z. 1998. Gospodarka wodna. PWN. Warszawa. Program małej retencji województwa małopolskiego – Nr 10. Zbiornik Bistuszowa. Hydroprojekt Kraków Sp. z o.o. 2003/2004. Program małej retencji województwa małopolskiego. 2004. Załącznik nr 1 do Uchwały nr XXV/344/04 Sejmiku Województwa Małopolskiego z dnia 25 października 2004 r. 22 Sezonowa zmienność właściwości fizyko-chemicznych wód... Przewodnik Metodyczny. Zasady poboru i opracowania prób fitobentosu okrzemkowego z rzek i jezior, wersja 2010. Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 20 sierpnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji stanu jednolitych części wód powierzchniowych (Dz. U. Nr 162 poz. 1008). Stanisz A. 1998. Przystępny kurs statyki w oparciu o program Statistica PL na przykładach z medycyny. StatSoft Polska Sp. z o.o. Kraków. Adres do korespondencji: mgr inż. Łukasz Borek, dr inż. Tomasz Stachura Katedra Melioracji i Kształtowania Środowiska Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krzysztof Ostrowski 23 Marta Czekaj EPISTEME 14/2012 s. 25-32 ISSN 1895-4421 OPINIE WYBRANYCH PRODUCENTÓW ROLNYCH DOT. STOSOWANIA NAWOZÓW NIEKONWENCJONALNYCH (ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM POPIOŁU PALENISKOWEGO) FARMERS OPINIONS ABOUT FERTILIZING USING NONCONVENTIONAL FERTILIZERS (PARTICULARLY FLY ASH) Abstrakt. Artykuł porusza problematykę nawożenia gleby oraz możliwości zastosowania różnorodnych produktów do tego celu. Szczególną uwagę skupiono w nim na znajomości wśród rolników niekonwencjonalnych produktów wykorzystywanych do nawożenia gleby, w tym na popiele paleniskowym. Z wykorzystaniem kwestionariusza ankiety zbadane zostały opinie rolników o takim nawozie. Pozyskano również informacje o poziomie wiedzy wśród producentów rolnych na temat możliwości wykorzystania do celów nawozowych takich produktów jak np. wermikompost czy wysłodki. Słowa kluczowe: produkcja rolnicza, nawożenie gleby, popioły paleniskowe jako nawóz Summary. Fertilizing can be done using non - conventional fertilizers. One of them is fly ash. The main purpose of the study was to check the farmers opinion about that solution. The studies were conducted by using an interview questionnaire in 35 farms located in Małopolska. The collected information concerned the farms situation in 2011. Obtained information about knowledge among farmers about the possibility of use for fertilizer products such as for example fly ash, vermicompost or beet pulp. Key words: agricultural production, fertilizing, fly ash as fertilizer 25 Marta Czekaj WSTĘP W sytuacji dostępności na rynku różnego rodzaju nawozów mineralnych producent rolny ma przed sobą trudną decyzję, o wyborze tego, który będzie najlepiej podnosił jakość gleby i poziom uzyskiwanych plonów. Kryterium najczęściej wykorzystywanym przez rolnika przy zakupie nawozu jest jego cena. Wobec rosnących kosztów produkcji rolniczej i znaczącego udziału kosztów zakupu nawozów mineralnych w ogóle kosztów ponoszonych przez producentów rolnych coraz częściej mówi się o wykorzystywaniu do nawożenia gleby niekonwencjonalnych produktów, których koszty zakupu są niższe niż koszty zakupu nawozów mineralnych. Produktem takim może być popiół paleniskowy pozyskiwany jako produkt uboczny w procesie spalania węgla kamiennego. Znalazł on już różnorodne zastosowania m.in. jako surowiec do produkcja cementu i betonu; jako materiał nasypowy, przy budowie wałów przeciwpowodziowych; jako surowiec do polepszanie i stabilizacji gruntów budowlanych; w górnictwie do wypełniania podziemnych pustek; w ceramice, itd. Zastosowania popiołów paleniskowych w rolnictwie do celów nawozowych dotyczy w szczególności tych popiołów, które mają zwiększoną zawartość wapnia i magnezu, dlatego mogą być one stosowane jako nawozy przeznaczone do wapnowania gleby. Użycie do nawożenia popiołów pozwala na poprawę następujących cech fizykochemicznych gleby: odczynu, kwasowości, ilości glinu pobieranego przez rośliny, pojemności kompleksu sorpcyjnego, pojemności wodnej, kwasowości hydrolitycznej [Czekaj 2012a]. Stosowanie popiołu paleniskowego do celów nawozowych w rolnictwie stoi wciąż jeszcze pod znakiem zapytania. Wynika to głównie z nowatorstwa tego rozwiązania, konieczności jego rozpropagowania wśród rolników oraz przekonania ich o jego zasadności. Z drugiej strony znane jest powszechnie zjawisko wypalania traw i ściernisk oraz przekonanie rolników o pozytywnym jego wpływie na jakość gleb ze względu na pozostające w glebie popioły. I chociaż jest to zabieg mocno krytykowany przez wiele środowisk i uznawany za szkodliwy przeżytek, w mentalności ludności wiejskiej pozostaje jako mocno utrwalone przyzwyczajenie. Sprawą wartą zbadania wydaje się więc określenie postaw producentów rolnych wobec możliwości wykorzystania nawozu jakim jest popiół paleniskowy pozyskiwany ze spalania węgla kamiennego. MATERIAŁ I METODY Materiał źródłowy do przygotowania opracowania pozyskano z wykorzystaniem kwestionariusza ankiety. Badania przeprowadzone zostały na terenie województwa małopolskiego, dobór badanych gospodarstw do próby miał charakter celowy. Dane do badań zbierane były od lutego do kwietnia 2012 roku i dotyczyły roku 2011.W pierwszym etapie badań przeprowadzone 26 Opinie wybranych producentów rolnych... zostały badania pilotażowe. Ankiety zebrane zostały w 5 gospodarstwach. Po ich uzyskaniu dokonano wstępnej analizy informacji w nich zawartych. Kwestionariusz ankiety nie został skorygowany, dlatego przystąpiono do kolejnego etapu badań – zbierania właściwych danych. Pozyskano w ten sposób kolejne 30 ankiet, cała próba składała się zatem z 35 ankiet. Kwestionariusz ankiety zawierał podstawowe pytania charakteryzujące badane gospodarstwa, w tym m.in. dot. wielkości gospodarstwa, powierzchni przeznaczanej pod uprawę poszczególnych roślin, wielkości produkcji zwierzęcej. Ponadto respondentów zapytano o stosowane w gospodarstwie nawozy organiczne i mineralne. Poproszono o wskazanie rocznych wydatków ponoszonych w związku z koniecznością zakupu nawozów mineralnych. Ważną częścią ankiety były pytania pozwalające na ustalenie stopnia wiedzy ankietowanych na temat różnorodnych produktów wykorzystywanych do nawożenia gleby. Część wykorzystanych w opracowaniu danych pochodzi z Raportu opracowywanego przez autorkę artykułu w ramach projektu „Wiedza, praktyka, kadry...” - staże dla pracowników naukowych w przedsiębiorstwach, prowadzonego przez Małopolską Agencję Rozwoju Regionalnego w Krakowie. Projekt ten porusza tematykę oceny ekonomicznośrodowiskowych aspektów nawożenia gleby popiołem paleniskowym. W opracowaniu posłużono się metodą opisową i metodą analizy poziomej, dane zostały zaprezentowane z wykorzystaniem metody tabelarycznej i graficznej. WYNIKI Zboża Ziemniaki Przemysłowe Warzywa Owoce Pastewne Łąki Pastwiska Inne Suma Jak już wcześniej wspomniano w badanej próbie znalazło się 35 gospodarstw rolniczych. Ich przeciętna powierzchnia znacząco odbiegała od przeciętnej powierzchni gospodarstwa w województwie małopolskim (wg danych GUS jest to około 3,7 ha UR), bowiem wynosiła 8,49 ha UR. Gleby użytkowane przez ankietowanych rolników były dość dobrej jakości – dominowały użytki rolne zaliczane do II (ponad 17% ogółu gospodarstw) i III (ponad 51% ogółu gospodarstw) klasy. Ankietowani rolnicy zajmowali się różnorodną produkcją rolniczą. Strukturę użytkowania ziemi przedstawiono w tab.1. Największą powierzchnię w badanych gospodarstwach rolnicy przeznaczali pod zboża, na drugim miejscu znalazły się warzywa, a na trzecim łąki. 41 6 2 17 9 1 15 5 4 100 Tab. 1. Struktura użytkowania ziemi w badanych gospodarstwach [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań 27 Marta Czekaj Wśród badanych gospodarstw znalazły się takie, w których utrzymywane były zwierzęta. Ponad 45% gospodarstw utrzymywało bydło mleczne – średnio były to 3 sztuki w stadzie. Trzoda chlewna było utrzymywania w 43% gospodarstw, a średnia liczba tych zwierząt w gospodarstwie to 30 sztuk. Ponadto wśród respondentów znaleźli się tacy, którzy utrzymywali owce (8%), konie (14%) oraz drób (49%). Wszystkie gospodarstwa posiadające inwentarz żywy wykorzystywały wytworzony przez niego nawóz naturalny – tylko 3 rolników zajmujących się wyłącznie produkcją roślinną nie stosowało takiego nawozu. Rolnikom zadano pytanie dotyczące stosowania przez nich nawozów sztucznych. W badanej grupie 66% ankietowanych odpowiedziało, iż stosuje nawozy sztuczne. Dane gromadzone na potrzeby statystyki masowej przez GUS w 2011 roku wskazują, że podobnie w zakresie stosowania nawozów mineralnych wygląda sytuacja dla całego kraju, bowiem 62,9% gospodarstw rolnych w Polsce, które posiadały użytki rolne w dobrej kulturze stosowało w roku gospodarczym 2010/2011 nawozy mineralne i wapniowe [GUS 2011]. W grupie badanych gospodarstw respondenci stosujący nawozy mineralne wskazywali, że stosują następujące nawozy: polifoska (14 gospodarstw), saletrzak (14 gospodarstw), mocznik (12 gospodarstw), saletra amonowa (10 gospodarstw). Ponadto część badanych rolników sięgała po takie nawozy jak: superfosfat, wapno tlenkowe i magnezowe, fosforany czy sól potasowa. Rolnicy zostali poproszeni o wskazanie jak wysokie wydatki ponoszą w ciągu roku w związku z zakupem nawozów mineralnych. Wśród respondentów stosujących nawożenie mineralne średni poziom wydatków na te nawozy wynosił około 5 920 zł w ciągu roku, przy czym wydatki te były zróżnicowane, bowiem wybrani producenci rolni nabywali nawozy za kwotę około 100 zł rocznie, podczas gdy właściciele największych obszarowo gospodarstw wydatkowali na ten sam cel do 20 000 zł (tak wysokie wydatki ponosili właściciele sadów). Bardziej miarodajnym miernikiem poziomu wydatków na nawozy sztuczne jest udział wydatków na te środki w ogólnej kwocie kosztów ponoszonych w ciągu roku przez rolnika. Respondentów poproszono o wskazanie takiego udziału. Wyniki zaprezentowane zostały na ryc. 1. W grupie producentów stosujących nawozy mineralne 26% wskazało, że udział ten wynosi poniżej 5%. Nieco ponad 1/3 ankietowanych (35% rolników) wskazała, że koszty związane z zakupem nawozów mineralnych stanowią ponad 20% ogółu ponoszonych w gospodarstwie kosztów. W związku z różnorodnością pojawiających się na rynku oraz stosowanych w praktyce rolniczej nawozów (nie zaliczanych do grupy nawozów mineralnych) rolnikom zadano pytanie dotyczące stosowania tych produktów ubocznych bądź odpadowych. Wśród respondentów 29% odpowiedziało, że stosuje w swoim gospodarstwie tego typu rozwiązania. Wśród produktów wykorzystywanych do nawożenia rolnicy wskazali: kompost (8 ankietowanych) oraz trociny (2 odpowiedzi). Zróżnicowanie 28 Opinie wybranych producentów rolnych... stosowanych nawozów było więc niewielkie, aczkolwiek pozyskane wyniki świadczyć mogą, iż rolnicy w przyszłości mogą być zainteresowani dalszym stosowaniem tego typu środków. Ryc. 1. Jaką część kosztów ogółem ponoszonych w gospodarstwie stanowią koszty nawozów? [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań W celu ustalenia poziomu wiedzy ankietowanych na temat różnorodnych produktów stosowanych do użyźniania gleby przedstawiono im listę takich środków z prośbą o wskazanie wśród nich tych, z którymi już wcześniej się zetknęli, bądź o których słyszeli. Rolnikom zaprezentowano do wyboru zestaw następujących produktów wykorzystywanych do nawożenia gleby: kora; trawa; liście; rozdrobnione gałęzie drzew i krzewów; roślinne odpady z targowisk; popielęgnacyjne części roślin z rabat i ogrodów; grzybnia pochodząca z hodowli pieczarek; wytłoki i inne odpady z przetwórstwa produktów roślinnych; wysłodki; odpady z przemysłu ziemniaczanego; wermikompost (odchody dżdżownic); osad biologiczny ze ścieków garbarskich; szlamy z mycia, czyszczenia, obierania, odwirowywania i oddzielania surowców; odpady węglanu wapnia i odpady z gaszenia wapna palonego; osady ściekowe; popioły ze słomy; popioły paleniskowe. Poproszono ich także o uzupełnienie tej listy o inne produkty, z którym się zetknęli, a które nie znalazły się w prezentowanym zestawieniu. Ryc. 2. O jakich produktach (oprócz nawozów mineralnych i naturalnych) wykorzystywanych do nawożenia gleby Pan(i) słyszał(a)? [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań 29 Marta Czekaj Respondenci w badanej grupie wykazali dość dużą znajomość w zakresie stosowania różnorodnych produktów do użyźniania gleby (ryc. 2). Najczęściej wymieniali oni trawy oraz liście jako produkty, o których słyszeli, a którymi może być nawożona gleba (odpowiednio po 77% wskazań). Na kolejnych miejscach znalazły się pozostające po pielęgnacji części roślin (49%), popioły po spaleniu słomy (49%) oraz rozdrobnione gałęzie drzew i krzewów (46%). Żaden z ankietowanych nie wskazał osadu biologicznego ze ścieków garbarskich, a tylko jeden stwierdził, że słyszał o wykorzystywaniu szlamów z mycia, czyszczenia, obierania, odwirowywania i oddzielania surowców jako produktu do użyźniania gleby. Ponadto żaden z respondentów nie wskazał innych (oprócz zawartych w pytaniu) produktów przeznaczonych do użyźniania gleby. Specyficznym produktem wykorzystywanym do użyźniania gleby jest popiół paleniskowy. O rosnącym zainteresowaniu wśród producentów rolnych możliwością wykorzystania go do celów nawozowych świadczyć mogą informacje zawarte na ryc. 2. Zgodnie z nimi 26% badanych rolników słyszało o takim kierunku wykorzystania popiołów paleniskowych. Respondentom zadano także pytanie dotyczące ich skłonności do nabycia takiego nawozu w przyszłości, gdyby pojawił się on na rynku. Wyniki uzyskanych odpowiedzi zaprezentowano na ryc. 3. Tylko 17% badanych zdecydowanie odpowiedziało, że nie nabyłoby nawozu wyprodukowanego z popiołu paleniskowego, a 1/5 ankietowanych pozytywnie odniosła się do takiego pomysłu. Pozostałe osoby nie były w stanie udzielić jednoznacznej odpowiedzi na zadane pytanie. Ryc. 3. Skłonność rolników do nabycia nawozu produkowanego na bazie popiołu paleniskowego [%]. Źródło: opracowanie własne na podstawie badań W ostatnim pytaniu, które zostało skierowane do rolników poproszono ich o podanie kwoty, jaką skłonni byliby wydać, aby zakupić za nawozy produkowane z popiołu paleniskowego, a przeznaczone do wapnowania 1 ha gleby. Ponadto w pytaniu tym zawarta była informacja, że dla dostarczenia niezbędnej dawki CaO na powierzchnię 1 ha gleb ciężkich rolnik potrzebuje około 4,5 t nawozu wapniowego (46% CaO), a koszty zakupu takiej ilości nawozu to kwota około 1 530 zł [Czekaj 2012b]. W badanej zbiorowości na pytanie to 8 respondentów odpowiedziało „trudno powiedzieć”, nie podając konkretnej kwoty, natomiast odpowiedzi pozostałych respondentów pozwoliły na określenie średniej kwoty na poziomie 830 zł/ha. 30 Opinie wybranych producentów rolnych... WNIOSKI • Badana grupa rolników dobrana została w sposób celowy, dlatego nie można uogólniać pozyskanych w ramach badań wyników na ogół producentów rolnych działających w województwie małopolskim, można jednakże na podstawie przeprowadzonych badań poczynić spostrzeżenia o zainteresowaniu rolników z badanej zbiorowości koncepcją rolniczego wykorzystania popiołów paleniskowych. • Nawozy mineralne stosowane były przez 2/3 badanych rolników. W grupie tej najwięcej respondentów (35%) wskazało, że wydatki na zakup nawozów mineralnych stanowią ponad 20% ogółu kosztów ponoszonych w gospodarstwie w ciągu roku, 26% ankietowanych na ten cel przeznaczało do 5% rocznego budżetu, 22% od 5do 10%, a pozostałe osoby od 10 do 20%. Średni poziom wydatków na nawozy mineralne został w badanej grupie (stosującej nawozy mineralne) ustalony na poziomie 5 920 zł. • Ankietowani rolnicy byli dobrze zorientowani w zakresie stosowania różnorodnych produktów do użyźniania gleby, wybrane osoby spotkały się bądź też słyszały o takich produktach do nawożenia gleby jak: szlamy z mycia, czyszczenia, obierania, odwirowywania i oddzielania surowców, wysłodki buraczane, wermikompost, odpady z przemysłu ziemniaczanego oraz popiół paleniskowy. • Pomimo szerokiej wiedzy w zakresie stosowania różnorodnych produktów do nawożenia gleby, rolnicy wykazują stosunkowo małe zainteresowanie w tym temacie, bowiem w badanej grupie tylko nieliczni wskazali na stosowanie innych niż nawozy mineralne środków do podnoszenia żyzności gleby (były to kompost oraz trociny). • Wśród badanych producentów rolnych tylko 17% zdecydowanie stwierdziło, że nie kupiłoby nawozów produkowanych na bazie popiołów paleniskowych. Wśród pozostałych 63% nie było w stanie udzielić jednoznacznej odpowiedzi, natomiast 1/5 była zdecydowana nabyć takie nawozy w sytuacji, gdy pojawiłyby się one rynku. • Kwota, jaką respondenci byli skłonni wydatkować za nawozy wapniowe produkowane na bazie popiołów paleniskowych przeznaczone do wapnowania 1 ha UR była dwukrotnie niższa niż cena dostępnych na rynku konwencjonalnych nawozów wapniowych przeznaczonych do nawożenia takiej samej powierzchni (przy założeniu, że w obu przypadkach ilość wprowadzanego do 1 ha UR czystego składnika CaO będzie identyczna). 31 Marta Czekaj LITERATURA Czekaj M. 2012a. Ekonomiczno-środowiskowe aspekty nawożenia gleby – innowacyjne rozwiązania stosowane w tym zakresie. Artykuł w recenzji. Czekaj M. 2012b. Raport kwiecień. Analiza i ocena ekonomicznych aspektów rolniczego wykorzystania popiołu paleniskowego. Materiały niepublikowane: 1-12. GUS 2011 http://www.stat.gov.pl Adres do korespondencji: Marta Chekaj Katedra Zarządzania i Marketingu w Agrobiznesie Wydział Rolniczo-Ekonomiczny Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected] 32 Leszek Gersztyn Anna Karczewska EPISTEME 14/2012 s. 33-39 ISSN 1895-4421 SPECJACJA MIEDZI W OSADACH POFLOTACYJNYCH GÓRNICTWA MIEDZI WZBOGACONYCH W RÓŻNE DODATKI ORGANICZNE COPPER SPECIATION IN MINE TAILINGS ENRICHED WITH DIFFERENT ORGANIC MATTER ADDITIVES Abstrakt. W osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi badano ogólną zawartość Cu oraz jej rozmieszczenie we frakcjach wydzielonych zgodnie z metodyką zaproponowaną przez Community Bureau of Reference (BCR). Badaniom poddane zostały osady poflotacyjne testowane w doświadczeniu wazonowym. Osady te, pochodzące z 2 różnych składowisk, zostały wzbogacone w materię organiczną w postaci osadów ściekowych o różnym stopniu humifikacji. Dodatek materii organicznej spowodował zmiany w rozmieszczeniu miedzi w poszczególnych frakcjach. Zmiany te zależały od właściwości osadów poflotacyjnych oraz rodzaju wprowadzonej materii organicznej. Słowa kluczowe: osady poflotacyjne, miedz, materia organiczna, specjacja, BCR Summary. Copper mine tailings obtained from two different impoundments were enriched in various kinds of organic matter and used in a pot experiment. Copper distribution in operationally defined fractions, separated according to the Community Bureau of Reference methodology (BCR), was examined thereafter. Copper speciation depended strongly on tailings origin and properties. The addition of organic matter led to changes in the distribution of copper in various fractions. Those changes depended on the characteristics of copper tailings and the properties of organic matter. Key words: mine tailings, copper, organic matter, speciation, BCR 33 Leszek Gersztyn, Anna Karczewska WSTĘP Składowiska osadów poflotacyjnych górnictwa miedzi stanowią olbrzymie zagrożenie dla środowiska m.in. ze względu na wywiewanie drobnych cząstek deponowanego materiału do otoczenia, co powoduje lokalne wzbogacenie gleb w metale ciężkie [Kabała i in. 2008]. W celu ograniczenia erozji wietrznej, po zakończeniu eksploatacji składowisk na ich powierzchnię powinna zostać wprowadzona roślinność okrywająca, której celem jest zmniejszenie niekorzystnego oddziaływania składowisk na środowisko. Jednakże rekultywacja tych obiektów jest utrudniona ze względu na niekorzystne właściwości fizyko-chemiczne osadów, a zwłaszcza toksyczne zawartości metali ciężkich oraz niską zasobność w składniki pokarmowe [Bogda i in. 2003; Karczewska 2008; Spiak, Gediga 2009]. Wprowadzenie na teren składowiska materii organicznej nie tylko poprawi niekorzystne właściwości rekultywowanych osadów, ale także wpłynie korzystnie na intensywność procesów biochemicznych. Źródłem substancji organicznej w rekultywacji gruntów bezglebowych, w tym osadników poflotacyjnych, są często osady ściekowe [Siuta 2005; Karczewska 2008], które stanowią źródło substancji organicznej oraz pierwiastków biogennych [Baran, Turski 1999; Siuta 2005; Rosik-Dulewska 2010]. W związku z tym użycie osadów ściekowych do procesu rekultywacji jest jednym z najbardziej uzasadnionych sposobów ich utylizacji [Kaniuczak i in. 2009]. Jednak wprowadzenie materii organicznej w postaci osadów ściekowych może spowodować zmiany w rozmieszczeniu metali ciężkich w glebach [Patorczyk-Pytlik, Gediga 2008]. Analiza specjacyjna pozwoli na określenie rozmieszczenia miedzi w poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych jak i określenie toksyczności i biodostępności analizowanych metali [Quevauvuller i in. 1994]. Celem pracy jest określenie wpływu dodatku materii organicznej na specjację miedzi w osadach poflotacyjnych. MATERIAŁY I METODY Do doświadczenia wytypowano 2 osady pochodzące ze składowisk osadów poflotacyjnych Żelazny Most (ZM) oraz Iwiny III (Iw). Osady te zostały wykorzystane w doświadczeniu wazonowym, które zostało założone wiosną 2011 roku. Do wazonów o pojemności 1 kg wprowadzono osad poflotacyjny wymieszany z osadami ściekowymi, zastosowanymi w dawce 20 g s.m. Doświadczenia prowadzano w trzech powtórzeniach. Osady ściekowe pozyskane zostały z wrocławskiej oczyszczalni ścieków Janówek. Do doświadczania użyto osadów surowych (W1) oraz osadów po fermentacji metanowej (W2). Cechowały się one zróżnicowanymi właściwościami fizyko-chemicznymi. 34 Specjacja miedzi w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi... Po zakończeniu doświadczenia wazonowego z każdego wazonu pobrane zostały 3 próbki średnie, które zostały wymieszane. Uzyskana próbka zbiorcza poddana została analizie sekwencyjnego frakcjonowania miedzi zmodyfikowaną metodą BCR [Rauret i in. 1999, Sahuquillo i in. 1999]. Nr frakcji Nazwa frakcji Odczynnik ekstrahujący F1 rozpuszczalna w kwasach 0,11 mol×dm-3 CH3COOH F2 redukowalna 0,5 mol×dm-3 NH2OH-HCl F3 utlenialna 8,8 mol×dm-3 H2O2 + 1 mol×dm-3 CH3COOHN4 F4 rezydualna mineralizacja stężonym kwasem nadchlorowym Tab. 1. Frakcje i odczynniki ekstrahujące użyte w metodzie BCR Metoda BCR umożliwia wydzielenie pierwiastka we frakcjach (Tab. 1): rozpuszczalnej i wymiennej w środowisku kwaśnym (F1), ekstrahowanej za pomocą 0,11 mol×dm-3 kwasu octowego, redukowalnej (F2) która obejmuje połączenia miedzi z uwodnionymi tlenkami żelaza i manganu otrzymywanej za pomocą 0,5 mol×dm-3 NH2OH-HCl przy pH=1,5, oraz frakcji utlenialnej (F3), związanej z substancją organiczną i siarczkami, wydzielanej za pomocą 8,8 mol×dm-3 H2O2 i 1 mol×dm-3 CH3COONH4. Frakcję rezydualną (F4) uzyskano poprzez mineralizację próbki w stężonym kwasie nadchlorowym. Stężenia miedzi w pozyskanych ekstraktach określone zostały za pomocą metody atomowej spektroskopii absorpcyjnej. WYNIKI Rozmieszczenie miedzi w poszczególnych frakcjach różniło się w zależności od pochodzenia osadu poflotacyjnego, a także – choć w mniejszym stopniu od rodzaju wprowadzonej materii organicznej oraz (Tab. 2). Dodatek (Addition) F1 F2 Kontrola W1 W2 690a 592a 674a 100a 184b 122c Kontrola W1 W2 388a 340b 352b 1455a 1289a 1309a F3 F4 F1+F2+F3+F4 435a 507a 493a 173a 180a 189a 1398a 1463a 1479a 266 a 281 a 251 a 132a 187b 151a 2201a 2097a 2063a ZM Iw Tab. 2. Zawartość miedzi w poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych. Objaśnienie: a,b,c – grupy jednorodne wyznaczone testem Duncana α<0,05 35 Leszek Gersztyn, Anna Karczewska Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 2, całkowita zawartość miedzi w osadach poflotacyjnych nie zmieniała się w wyniku aplikacji materii organicznej, podwyższone wartości miedzi odnotowane w wariantach z dodatkiem osadów ściekowych W1 i W2 nie różniły się istotnie od wariantu kontrolnego. Wyższą zawartość miedzi odnotowano w osadach Iw (20632201 mg×kg-1), natomiast niższe stężenia Cu stwierdzono w osadach poflotacyjnych ZM ze składowiska Żelazny Most (1398-1479 mg×kg-1). Zawartość miedzi w poszczególnych frakcjach osadu ZM jest różna (ryc 1). Dominującą frakcją jest frakcja rozpuszczalna w kwasach (F1), a mniejsze udziały stanowią kolejno frakcja utlenialna (F3), rezydualna (F4) i redukowalna (F2). Dodatek osadów ściekowych W1 i W2 spowodował istotne zmiany w udziale frakcji redukowalnej, czyli związanej z tlenkami żelaza i manganu. Efekt ten może być spowodowany wzrostem rozpuszczalności miedzi bezpośrednio po aplikacji materii organicznej, a następnie wiązaniem jej w nierozpuszczalne połączenia żelazisto-manganowe. W pozostałych frakcjach nie odnotowano istotnych zmian w zawartości Cu. Ryc. 1. Rozmieszczenie frakcji miedzi w osadzie poflotacyjnym Żelazny Most Osad poflotacyjny Iw (ryc. 2) cechował się największą zawartością miedzi we frakcji redukowalnej (F2), następnie we frakcji rozpuszczalnej i wymiennej (F1), rezydualnej (F4) i frakcji utlenialnej (F3). Istotne statystycznie zmiany w zawartości miedzi w poszczególnych frakcjach zaobserwowano po aplikacji osadu W1 - we frakcji F1 oraz we frakcji F4, a w przypadku osadu ściekowego W2 - we frakcji F1. W pozostałych frakcjach nie odnotowano istotnych zmian zawartości miedzi. 36 Specjacja miedzi w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi... Ryc. 2. Rozmieszczenie frakcji miedzi w osadzie poflotacyjnym Iwiny III. Wyniki sekwencyjnej ekstrakcji miedzi nie wykazały zmian w zawartości miedzi we frakcji utlenialnej (F3), która odpowiada za połączenia Cu z materią organiczną i siarczkami. WNIOSKI • Całkowite zawartości oraz formy miedz w osadach poflotacyjnych różnią się od siebie, w zależności od pochodzenia i właściwości osadu poflotacyjnego. • Główną frakcją, w której miedź występuje w osadzie poflotacyjnym ZM, jest frakcja F1 (potencjalnie rozpuszczalna), natomiast w osadzie poflotacyjnym Iw dominuje Cu we frakcji F2 (związana z tlenkami żelaza i manganu). • Wprowadzenie osadów ściekowych nie spowodowało istotnego wzrostu całkowitej zawartości miedzi w osadach poflotacyjnych. • Dodatek materii organicznej wpłynął na zmiany w rozmieszczeniu miedzi w poszczególnych frakcjach osadów poflotacyjnych. W przypadku osadów ZM po zastosowaniu osadów ściekowych W1 i W2 stwierdzono istotny wzrost zawartości Cu we frakcji F2.W osadach poflotacyjnych Iw, zastosowanie osadu ściekowego W1 spowodowało zmiany udziału Cu we frakcjach F1 i F4 • Zmiany we frakcji F2 osadu poflotacyjnego ZM po zastosowaniu osadów ściekowych, mogą być spowodowane wtórną sorpcją, początkowo mobilnych, związków miedzi ze związkami żelaza i manganu. • Należy kontynuować badania, z uwzględnieniem szczegółowej dynamiki miedzi w osadach poflotacyjnych po aplikacji różnych form materii organicznej. 37 Leszek Gersztyn, Anna Karczewska LITERATURA Baran S., Turski R. 1999. Wybrane zagadnienia z utylizacji i unieszkodliwiania odpadów. Wyd. AR w Lublinie, Lublin: s 336. Bogda A., Szopka K., Karczewska A. 2003. Zawartość i rozpuszczalność wybranych metali ciężkich w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi. W: Gworek B., Misiak J. (red.): Obieg pierwiastków w przyrodzie: bioakumulacja, toksyczność, przeciwdziałanie. T. II. Wydawn. IOŚ, Warszawa: 238-241. Kabała C., Medyńska A., Chodak T., Jezierski P., Gałka B. 2008. Zmiany zawartości miedzi i arsenu w glebach wokół składowiska odpadów po flotacji rud miedzi w 12-letnim cyklu badań monitoringowych. Roczn. Gleb. 58 (3-4): 81-88. Kaniuczak J., Hajduk E., Zamorska J., Ilek M. 2009. Charakterystyka osadów ściekowych pod względem przydatności do przyrodniczego wykorzystania. Zesz. Nauk. P-W O/PTIE i O/PTG w Rzeszowie, 11, 89-94. Karczewska A. 2008. Ochrona gleb i rekultywacja terenów zdegradowanych. Wyd. UP we Wrocławiu: s 414. Sahuquillo A., López-Sánchez J.F., Rubio R., Rauret G., Thomas R.P., Davidson C.M., Ure A.M. 1999: Use of a certified reference material for extractable trace metals to assess sources of uncertainty in the BCR three-stage sequential extraction procedure. Analytica Chimica Acta 382: 317-327. Siuta J. 2005. Rekultywacyjna efektywność osadów ściekowych na składowiskach odpadów przemysłowych Acta Agrophys., 5(2): 417-425. Spiak Z., Gediga K. 2009. Usefulness of selected mineral wastes for reclamation of copper industry dumping site. Environ. Prot. Eng. 35 (1): 79-88. Rauret G.,. López-Sànchez J.F, Sahuquillo A., Rubio R., Davidson C.M., Ure A.M.,. Quevauviller Ph, 1999: Improvement of the BCR three step sequential extraction procedure prior to the certification of new sediment and soil reference materials, J. Environ. Monit., 1, 57-61. Rosik-Dulewska Cz. 2010. Podstawy gospodarki odpadami. Wyd. IV. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa: s 377. Quevauvuller Ph, Rauret G., Muntau H., Ure A.M., Rubio R., Lopez-Sanchez J.F., Fiedler H.D., Griepink B. 1994 Evaluation of sequential extraction procedure for determination of extractable trace metal contents in sediments. Fresen. J. Anal. Chem. 349, 808-814. 38 Specjacja miedzi w osadach poflotacyjnych górnictwa miedzi... Adres do korespondencji: mgr inż. Leszek Gersztyn, prof. dr hab. Anna Karczewska Instytut Nauk o Glebie i Ochrony Środowiska Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 50-357 Wrocław, ul. Grunwaldzka 53 e-mail: [email protected], [email protected] 39 Katarzyna Kołodziejczyk Roman Pieprzka EPISTEME 14/2012 s.41-50 ISSN 1895-4421 KSZTAŁTOWANIE SIĘ ZAWARTOŚCI METALI CIĘŻKICH W GLEBACH WYBRANYCH DWÓCH OBSZARÓW CHRONIONYCH DOLNEGO ŚLĄSKA THE HEAVY METAL CONTENT IN SOILS OF TWO CHOSEN PROTECTED AREAS OF LOWER SILESIA Abstrakt. Obszary chronione narażone są na negatywne oddziaływanie antropogeniczne, które objawia się m.in. akumulacją metali ciężkich. Zawartość metali ciężkich na obszarach podlegających ochronie jest uzależniona zarówno od źródła naturalnego w skałach macierzystych, jak i źródeł pochodzenia zewnętrznego. Badaniami objęto gleby dwóch obszarów, które w myśl ustawy o ochronie przyrody z 2004 r. są kwalifikowane jako formy ochrony przyrody. Należą do nich Park Krajobrazowy Dolina Jezierzycy oraz Park Narodowy Gór Stołowych. Oba obiekty narażone są na oddziaływanie antropogeniczne. Przez PK Dolina Jezierzycy przebiega szlak komunikacyjny, a przez PNGS tzw. Szosa Stu Zakrętów. Zawartość metali ciężkich w analizowanych glebach porównano ze standardami jakości gleby i ziemi przedstawionymi w Rozporządzeniu Ministra Środowiska z 2002 r. dla obszarów chronionych należących do grupy „A”. Zawartość metali ciężkich w większości analizowanych profili glebowych kształtuje się na naturalnym poziomie i nie przekracza wartości dopuszczalnych. Słowa kluczowe: zawartość metali ciężkich, obszary chronione, standardy jakości gleby i ziemi Summary. Protected areas are exposed to negative anthropogenic impact, which is manifested by among others accumulation of heavy metals. The heavy metal content in the areas under protection is dependent on their natural presence in the soil parent rocks, as well as external origin. The study involved soils of two areas, which are classified as forms of nature conservation in polish law. These include Park Krajobrazowy Dolina Jezierzycy and Park Narodowy Gór Stołowych. Both areas are exposed to anthropogenic impacts, connected with roads going through them. The heavy metal content in the analyzed soils were compared with the standards of quality of soils according to Rozporządzenie Ministra Środowiska from 2002 for protected areas belonging to the group „A”. The heavy metal content in all of the analyzed soil profiles is at a natural level and does not exceed the limit values. Key words: heavy metal content, protected areas, the standards of soil quality 41 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka WSTĘP Obszary prawnie chronione, pomimo ograniczonej działalności gospodarczej, narażone są na różne zanieczyszczenia, głównie pochodzenia antropogenicznego. Zwykle głównym źródłem zanieczyszczeń jest ruch samochodowy. Obszary badań przecinają dwa ważne szlaki komunikacyjne. W Parku Narodowym Gór Stołowych jest to droga łącząca Kudowę Zdrój i Radków (nazywana jest „Szosą 100 Zakrętów”), natomiast w Parku Krajobrazowym Dolina Jezierzycy - droga wojewódzka łącząca Wołów ze Ścinawą. Obecność tak ważnych szlaków komunikacyjnych na obszarach podlegających prawnej ochronie może stanowić jedno z głównych źródeł zanieczyszczeń gleb metalami ciężkimi. Celem pracy było określenie wpływu transportu samochodowego na zawartość metali ciężkich w glebach badanych obszarów chronionych i ich porównanie z normami określonymi w Rozporządzeniu Ministra Środowiska [2002]. MATERIAŁ I METODY Materiał glebowy do prac laboratoryjnych został pobrany z terenu dwóch obszarów chronionych województwa dolnośląskiego: z Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy (PKDJ) oraz Parku Narodowego Gór Stołowych (PNGS). Odkrywki glebowe były zlokalizowane w odległości od 50 do 100 m od szlaków komunikacyjnych. Do badań wytypowano gleby wytworzone z piasków (PKDJ) oraz piaskowców (PNGS) - skał ubogich w pierwiastki śladowe, co pozwala wykluczyć skałę macierzystą jako główne źródło metali ciężkich. Wszystkie analizowane profile glebowe należały do działu gleb autogenicznych i rzędu gleb bielicoziemnych. Na obszarze PKDJ były to gleby rdzawe (profile: 1 i 3) oraz bielicowe (profile: 2 i 4), a na obszarze PNGS - bielicowe (profile: 5-8). W pobranym materiale glebowym oznaczono skład granulometryczny metodą Bouyoucosa-Casagrande’a w modyfikacji Prószyńskiego, pH w H2O i 1 M KCl potencjometrycznie oraz zawartość form ogólnych wybranych metali ciężkich (Cu, Pb, Zn) - metodą AAS, po mineralizacji w stężonym kwasie nadchlorowym. WYNIKI I DYSKUSJA W analizowanych glebach Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy i Parku Narodowego Gór Stołowych występuje bardzo niewielkie zróżnicowanie w obrębie grup granulometrycznych. Całość badanego obszaru pokrywają utwory piaszczyste. W glebach PKDJ większość poziomów glebowych cechuje się uziarnieniem piasku luźnego, w a glebach PNGS - piasku gliniastego, słabogliniastego lub gliny piaszczystej. Frakcja ilasta wynosi zaledwie od 0% do 10%, co decyduje m.in. o niekorzystnych właściwościach fizyko-chemicznych 42 Kształtowanie się zawartości metali ciężkich w glebach... badanych gleb [Kołodziejczyk i Kawałko 2010]. Pod względem kategorii ciężkości badane gleby należy zaklasyfikować do bardzo lekkich. Poziom genetyczny Nr profilu Gleby obu rozpatrywanych obszarów chronionych cechują się niskimi wartościami pH. W szczególności gleby pochodzące z Parku Narodowego Gór Stołowych charakteryzują się silnie kwaśnym odczynem. Niskie wartości pH są tu spowodowane wysoką sumą opadów, które przyczyniają się do wymywania składników o charakterze zasadowym [Kabała 2005]. Natomiast na obszarze Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy zakwaszenie gleb jest następstwem „lekkiego” składu granulometrycznego i obecnością roślinności borowej w omawianych siedliskach [Kawałko i in. 2007], gdzie kwaśne produkty rozkładu i humifikacji szczątków roślinnych gromadzą się w poziomie A. Głębokość poziomu [cm] Zawartość poszczególnych frakcji [%] >2 2,0-0,05 0,05-0,002 <0,002 Grupa granulometryczna PTG 2008 Gleby Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy 1 2 3 4 A Bv Bv/C Cgg 0- 29 29- 40 40- 52 >52 4 5 8 10 92 95 97 96 5 4 3 0 3 1 0 4 ps pl pl pl A 0- 13 7 94 4 2 pl Ees 13- 18 8 98 2 0 pl Bh 18- 28 8 97 2 1 pl Bfe 28- 36 9 98 2 0 pl Cgg >36 8 95 1 4 pl A 0- 15 5 95 4 1 pl Bv Bv/C Cgg A/Ees Ees Bhfe Cgg 15- 23 23- 68 >68 0- 20 20- 32 32- 46 >46 3 4 4 1 0 1 2 97 94 95 98 94 95 97 3 3 2 2 2 4 3 0 3 3 0 4 1 0 pl pl pl pl pl pl pl AEes Eesg Bhs1 Bhs2 Bs C 0-5 5-18 18-30 30-40 40-55 55+ 5 7 5 4 2 3 pg pg pg pg pg ps Gleby Parku Narodowego Gór Stołowych 1 0 0 0 7 2 39 78 79 82 84 82 87 17 14 13 12 16 10 43 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka 2 4 5 (A)Ees 0-3 0 77 21 2 pg Eesg 3-11 0 80 15 5 pg Bh 11-15 15 82 14 4 pg Bhs 15-22 5 82 14 4 pg Bs 22-40 0 88 8 4 ps 2BsC 40-70 0 90 8 2 ps C 70+ 0 90 4 6 ps A 0-23 0 63 37 0 gp Ees 23-28 15 66 31 3 gp Bhfe 28-46 0 69 27 4 gp C 46+ 64 81 15 4 użp A 0-10 14 76 24 0 pg A/Ees 10-15 0 73 25 2 pg Ees 15-25 0 72 24 4 gp Bhfe 25-45 0 73 20 7 gp C 45+ 23 73 17 10 gp Tab. 1. Skład granulometryczny badanych gleb W badanych glebach wartość pH mierzona w 1-molowym KCl mieściła się w granicach od 2,5 do 4,3 dla gleb PNGS i od 3,5 do 5,7 dla gleb PKDJ. Są to zatem gleby silnie kwaśne, kwaśne, jak i lekko kwaśne, charakterystyczne dla terenów leśnych [Kawałko i Kaszubkiewicz 2008]. W przypadku pH oznaczonego w wodzie destylowanej, jego wartości mieszczą się w przedziale od 3,5 do 6,3 w glebach parku krajobrazowego i od 3,2 do 4,7 w glebach parku narodowego. Niskie wartości pH sprzyjają uruchamianiu potencjalnie niebezpiecznych dla wzrostu i rozwoju roślin metali ciężkich obecnych w glebach. Na ich rozmieszczenie w profilu glebowym wpływają natomiast w dużym stopniu procesy glebotwórcze i glebowe oraz zawartość substancji organicznej [Czarnowska 1983, 1996]. Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska [2002] obszary badań, ze względu na pełnioną funkcję zostały zaliczone do grupy „A” czyli obszarów prawnie chronionych. Normy zawartości metali ciężkich w glebach obszarów grupy A są wyjątkowo restrykcyjne. Dopuszczalne stężenie miedzi w glebach tych obszarów ustalono na wysokości 30 mg.kg-1 gleby. W przypadku ołowiu, gleby niezanieczyszczone tym pierwiastkiem zawierają maksymalnie 50 mg.kg-1 gleby, zaś ilości cynku nie mogą przekraczać normy 100 mg.kg-1 gleby. MIEDŹ (Cu). Całkowita zawartość miedzi (Tab. 2) w poziomach mineralnych badanych gleb mieści się w granicach od 0,10 mg.kg-1 do 8,00 mg.kg-1 w glebach Parku Krajobrazowego „Dolina Jezierzycy” i w przedziale od 2,45 44 Kształtowanie się zawartości metali ciężkich w glebach... mg.kg-1 do 9,65 mg.kg-1 w glebach Parku Narodowego Gór Stołowych. Na żadnym z badanych obszarów zawartość Cu nie przekroczyła 19 mg.kg-1, co według Kabaty-Pendias i Pendiasa [1999] świadczy o występowaniu tego pierwiastka na poziomie naturalnym. Najwięcej Cu zgromadzone jest jednakże w poziomach próchnicy nadkładowej badanych gleb i kształtuje się od 12,50 mg.kg-1 gleby do 27,60 mg.kg-1 gleby. Wysokie zawartości miedzi w poziomach wierzchnich informują o źródle jej obecności w glebie [Kabała i in. 1997]. Występowanie miedzi w tych poziomach jest wynikiem akumulacji biologicznej (liście i igliwie). Można także przypuszczać, że Cu pojawia się w tych częściach profili glebowych na skutek transportu samochodowego. Porównując uzyskane wyniki z normami zawartymi w Rozporządzeniu Ministra Środowiska [2002] nie stwierdza się przekroczenia norm zawartości miedzi w glebie, co potwierdzają wcześniejsze badania prowadzone na opisywanym terenie [Kabała 2005, Kawałko i in. 2007], jak i w innych częściach Sudetów [Kabała 1998, Karczewska i in. 2004]. Nr profilu OŁÓW (Pb). W poziomach mineralnych badanych gleb całkowita zawartość Pb (Tab. 2) kształtuje się w granicach od 2,00 mg.kg-1 do 17,70 mg.kg-1 (gleby PKDJ) i od 8,35 mg.kg-1 do 38,20 mg.kg-1 (gleby PNGS). Pod względem zawartości ołowiu badane gleby należy zakwalifikować do nieznacznie przekraczających tło geochemiczne (kilka poziomów glebowych), gdyż według Kabaty-Pendias i Pendiasa [1999] dla gleb niezanieczyszczonych Polski zawartości Pb w glebach wynoszą 20 mg.kg-1. Podobne zawartości Pb w PNGS otrzymali Karczewska i Kabała [2002]. W poziomach organicznych jego ilości są wyższe (13,8-22,8 mg.kg-1 gleby). Zawartość Pb w analizowanych glebach nie przekracza zawartości dopuszczalnej (50 mg.kg-1 gleby) określonej w Rozporządzeniu Ministra Środowiska [2002]. Poziom genetyczny Głębokość poziomu [cm] pH H2O Cu Pb Zn [mg.kg-1] KCl Gleby Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy 1 2 O 2-0 4,9 4,3 15 17,7 7 A1 0-29 4,8 4 8 17,7 11,5 A2 0-29 3,7 3,2 1,5 9,1 10 Bv 29-40 5,5 4,7 1,5 8,7 8,5 Bv/C 40-52 5,8 5,2 n.o. n.o. n.o. Cgg >52 6,3 5,7 n.o. n.o. n.o. A 0-13 4,4 3,8 0,5 11,8 8 Ees 13-18 4,4 3,8 0,1 6,7 6,5 8,5 Bh 18-28 4,7 4,1 1,5 7,5 Bfe 28-36 5,6 4,9 n.o. 5,1 8 Cgg >36 6 5,5 n.o. 3,5 6,5 45 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka 3 4 O 3-0 4,9 4,1 12,5 16,9 6,5 A 0-15 3,8 3,4 2,5 7,9 9,5 Bv 15-23 4,6 4 0,1 2,4 6,5 Bv/C 23-68 4,9 4,1 n.o. 1,6 4 Cgg >68 5,6 5 n.o. n.o. n.o. 7 O 4-0 4,5 3,8 24,5 21,7 A/Ees 0-20 3,5 3 n.o. 5,5 4 Ees 20-32 4,5 3,7 0,5 3,1 3,5 Bhfe 32-46 5,3 4,6 n.o. 3,5 6 Cgg >46 5,7 5,1 n.o. 2 5 Oh(Ah) 1-0 3,6 2,7 27,6 22,8 57,35 AEes 0-5 3,6 2,9 5,95 34,6 17,6 Eesg 5-18 4 3,1 3,4 16,8 17 Bhs1 18-30 3,8 3,3 3,6 28,95 18,25 Bhs2 30-40 3,8 3,3 3,8 30,95 14,95 Bs 40-55 4,3 3,8 4,65 34,2 17,35 C 55+ 4,5 4,2 4,65 21,6 20,65 (A)Ees 0-3 3,5 2,9 4,1 21,75 14,1 Eesg 3-11 4,1 3,1 3,85 16,5 12,4 Gleby Parku Narodowego Gór Stołowych 5 6 7 8 Bh 11-15 4 3,3 4,4 35,85 16,55 Bhs 15-22 4,4 4 3,9 26,55 15,85 Bs 22-40 4,7 4,3 3,45 17,65 27,05 2BsC 40-70 4,7 4,3 4,05 12,85 23,45 C 70+ 4,7 4,1 6,1 17,2 23,7 A 0-23 3,3 3 5,15 38,2 13,75 Ees 23-28 3,7 3,3 2,65 11,15 8,35 Bhfe 28-46 4 3,8 4,35 9,6 20,3 C 46+ 4,2 3,8 4,50 8,35 19,9 A 0-10 3,2 2,5 9,65 14,35 14,5 A/Ees 10-15 3,4 2,7 2,65 8,95 7,6 Ees 15-25 3,3 2,8 2,45 9,90 8,95 Bhfe 25-45 3,5 3,3 3,25 9,90 12 C 45+ 4 3,7 5,45 11,85 26,1 Tab. 2. Zawartość wybranych metali ciężkich i pH (H2O i KCl) badanych gleb CYNK (Zn). W poziomach mineralnych badanych gleb całkowita zawartość cynku (Tab. 2) kształtuje się w granicach od 3,50 do 11,50 mg.kg-1 w glebach PKDJ i od 7,60 do 27,05 mg.kg-1 w glebach PNGS. Są to niskie zawartości. W żadnym z poziomów glebowych miedź nie występuje w ilościach wyższych niż typowych dla gleb niezanieczyszczonych Polski (30-125 mg.kg-1 w zależności od kategorii ciężkości gleb) [Kabata-Pendias, Pendias 1999]. 46 Kształtowanie się zawartości metali ciężkich w glebach... Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska [2002] dopuszczalna zawartość cynku dla obszarów chronionych należących do grupy „A” wynosi 100 mg.kg-1 gleby. Wartość ta nie została, więc przekroczona w żadnym z poziomów glebowych. Podobne wyniki zawartości Zn uzyskali Karczewska i in. [2004], badając gleby zlokalizowane w sąsiedztwie szosy jakuszyckiej na obrzeżach Karkonoskiego Parku Narodowego. Stwierdza się wyraźnie wyższe zawartości pierwiastków śladowych w glebach Parku Narodowego Gór Stołowych niż w glebach Parku Krajobrazowego Doliny Jezierzycy (Rys. 1). Przyczyną takiego stanu rzeczy jest ukształtowanie terenu oraz wpływ chemizmu skały macierzystej na właściwości chemiczne wytworzonych z niej gleb [Kabała 2005, Kawałko 2000]. Można przypuszczać, że gleby PNGS cechują się wyższymi zawartościami pierwiastków śladowych, gdyż obszary górskie stanowią barierę orograficzną dla zanieczyszczeń atmosferycznych, często o wyższych koncentracjach metali ciężkich [Karczewska i Kabała 2002, Kabała i in. 1997, Kabała 1998]. Rys. 1. Zawartość poszczególnych metali ciężkich w glebach PKDJ i PNGS PODSUMOWANIE Badania przeprowadzone na glebach dwóch obszarów chronionych Dolnego Śląska - Parku Narodowego Gór Stołowych i Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy - wykazały, iż: 47 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka • gleby obu parków należą do gleb lekkich, o niewielkiej ilości frakcji ilastej, a w związku z tym posiadają niekorzystne właściwości chemiczne, fizykochemiczne i biologiczne; • charakteryzują się one mało zróżnicowanym odczynem - są to gleby silnie kwaśne, kwaśne oraz lekko kwaśne charakterystyczne dla terenów leśnych; • gleby Parku Narodowego Gór Stołowych cechują się wyższymi zawartościami pierwiastków śladowych niż gleby Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy, co może być efektem ukształtowania terenu i wpływu skały macierzystej na właściwości gleb; • zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Środowiska w sprawie standardów jakości gleby oraz standardów jakości ziemi z dnia 9 września 2002 r. analizowane gleby nie wykazują przekroczenia dopuszczalnych zawartości metali ciężkich, tym samym transport samochodowy nie stanowi dla nich większego zagrożenia; • zaleca się dalsze prowadzenie badań na obu obszarach chronionych w celu monitorowania zmian zawartości metali ciężkich w badanych glebach i ewentualnego szybkiego reagowania w przypadku wystąpienia realnego zagrożenia zanieczyszczeniem. 48 Kształtowanie się zawartości metali ciężkich w glebach... LITERATURA Czarnowska K. 1983. Wpływ skały macierzystej na zawartość metali ciężkich w glebach. Zesz. Prob. Post. Nauk Rol. 242: 51-61. Czarnowska K. 1996. Ogólna zawartość metali ciężkich w skałach macierzystych jako tło geochemiczne gleb. Rocz. Glebozn. 47, Supl. 43-50. Kabała C. 2005. Geneza, właściwości i występowanie gleb bielicowych w zróżnicowanych warunkach geoekologicznych Dolnego Śląska, Zeszyty Naukowe AR we Wrocławiu. Nr 519. Rozprawy CCXXXIII, Wyd. AR we Wrocławiu, ss 169. Kabała C. Karczewska A. Szaflicka B. 1997. Metale ciężkie w glebach Parku Narodowego Gór Stołowych wzdłuż Szosy 100 Zakrętów. Wyd. PNGS Szczeliniec, Kudowa Zdrój 2: 9-14. Kabała C. 1998. Pierwiastki śladowe w glebach Gór Izerskich. Zesz. Naukowe AR we Wrocławiu, Rolnictwo LXXIII, 347: 95-106. Kabata-Pendias A. Kabata H. 1999. Biogeochemia pierwiastków sladowych. PWN, Warszawa. Karczewska A. Kabała C. Lizurek S. Zając S. 2004. Zanieczyszczenie gleb metalami ciężkimi w sąsiedztwie Szosy Jakuszyckiej na obrzeżach Karkonoskiego Parku Narodowego. Opera Corcontica, 41, 1: 60-65. Karczewska A. Kabała C. 2002. Pierwiastki śladowe w glebach PNGS. [w:] Gleby Parku Narodowego Gór Stołowych, Monografia, Wydawnictwo PNGS, „Szczeliniec” 6: 133-136. Kawałko D. 2000. Skład i właściwości gleb wytworzonych z różnych skał macierzystych na terenie Ślężańskiego Parku Krajobrazowego, część I. Właściwości fizyczne, Zesz. Nauk. AR we Wrocławiu, Rolnictwo LXXVII, 396: 29-47. Kawałko D. Kaszubkiewicz J. 2008. Właściwości gleb wybranych siedlisk leśnych na terenie Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy, Rocz. Glebozn. LIX (3/4): 115-121. Kawałko D. Kaszubkiewicz J. Woźniczka P. 2007. Zawartość metali ciężkich w glebach wybranych siedlisk leśnych na terenie Parku Krajobrazowego Dolina Jezierzycy. Ochrona środowiska i zasobów naturalnych, IOŚ, Warszawa, z. 31: 23 - 27. Kołodziejczyk K. Kawałko D. 2010. Wybrane właściwości gleb pod lasami grądowymi na terenie Parku Krajobrazowego „Dolina Jezierzycy”. Rocz. Glebozn. t. LXI nr 1: 52-59. Rozporządzenie Ministra Środowiska w sprawie standardów jakości gleb oraz standardów jakości ziemi z dnia 9 września 2002 r. (Dz. U. 2002 nr 165 poz.1359). 49 Katarzyna Kołodziejczyk, Roman Pieprzka Adres do korespondencji: Katarzyna Kołodziejczyk Katedra Botaniki i Ekologii Roślin Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Grunwaldzka 53, 50-357 Wrocław e-mail: [email protected] Roman Pieprzka Instytut Nauk o Glebie i Ochrony Środowiska Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Grunwaldzka 53, 50-357 Wrocław e-mail: [email protected] Promotor: dr hab. inż. Klara Tomaszewska, prof. nadzw. UP 50 Małgorzata Koncewicz-Baran Krzysztof Gondek Agnieszka Ozimek EPISTEME 14/2012 s. 51-58 ISSN 1895-4421 ZAWARTOŚĆ NIKLU W ROŚLINACH PO ZASTOSOWANIU OSADÓW ŚCIEKOWYCH NICKEL CONTENT IN PLANTS AFTER APPLICATION OF SEWAGE SLUDGE Abstrakt. Określenie wpływu osadów ściekowych ustabilizowanych różnymi metodami na plonowanie rzepaku jarego i owsa oraz zawartość niklu w biomasie przeprowadzono w oparciu o eksperyment wazonowy. Największe sumaryczne plony biomasy zarówno w pierwszym, jak i w drugim roku badań uzyskano w obiekcie, w którym zastosowano osad ściekowy ustabilizowany tlenowo. Zastosowane do nawożenia osady ściekowe nie spowodowały nadmiernej kumulacji niklu w częściach nadziemnych roślin. Najwięcej niklu stwierdzono w częściach nadziemnych rzepaku jarego i owsa w obiekcie, w którym zastosowano sole mineralne. Pierwiastek ten gromadzony był głównie w korzeniach roślin. Rzepak jary i owies charakteryzowały zbliżone wartości wskaźnika translokacji, przy czym istotny wpływ na wartość tego parametru wywierało nawożenie. Największą wartość współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo. Zastosowane nawożenie nie różnicowało wartości wskaźnika bioakumulacji niklu w owsie. Słowa kluczowe: osad ściekowy, nikiel, rzepak jary, owies Summary. Determination of the effects of sewage sludge stabilized by different methods on the yields of spring rape and oat and the nickel content in the biomass was based on the pot experiment. Both first and second year the biggest total biomass yields were obtained from the object fertilized with aerobically stabilized sewage sludge. Sewage sludges did not cause excessive accumulation of nickel in plants aboveground parts. The greatest nickel quantities were assessed in aboveground parts both spring rape and oat from the object with mineral salts treatment. This element was mainly accumulated in the root system. Spring rape and oat were characterized by similar values of translocation index, while the significant impact on the value of this parameter caused fertilization. The biggest value of nickel bioaccumulation index was found after application of aerobically stabilized sewage sludge. Applied fertilization did not differ significantly the value of bioaccumulation index for oat. Key words: sewage sludge, nickel, spring rape, oat 51 Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek WSTĘP Zgodnie z wytycznymi zawartymi w Krajowym Planie Gospodarki Odpadami [2014] w systemie gospodarowania tymi substancjami w najbliższych latach dążyć się będzie do maksymalizacji wykorzystania składników biogennych zawartych w komunalnych osadach ściekowych. Należy pamiętać jednak o obciążeniu tych odpadów m.in. metalami ciężkimi, co zwiększa ryzyko środowiskowego wykorzystania tych materiałów. Osady ściekowe charakteryzują się bardzo zróżnicowaną zawartością metali ciężkich, a także różną ich biodostępnością [Gondek 2006]. Jak wskazują badania innych autorów [Jakubus i Czekała 2001] nikiel w osadach ściekowych występuje głównie we frakcji rezydualnej, w postaci związanej z materią organiczną oraz z amorficznymi tlenkami żelaza. Wprowadzenie do gleby osadu ściekowego może modyfikować jej odczyn, pojemność sorpcyjną, zawartość substancji organicznej, a także aktywność biologiczną, co wpływa na mobilność niklu w środowisku glebowym [Kabata-Pendias i Pendias 1999]. Różnorodność form niklu wynikająca m.in. z właściwości gleby decyduje o jego biodostępności. Nie bez znaczenia dla bioakumulacji niklu pozostaje gatunek rośliny [Kabata-Pendias i Pendias 1999, Iżewska 2009]. Celem podjętych badań było określenie wpływu aplikacji do gleby ustabilizowanych osadów ściekowych na ilość biomasy roślin oraz zawartość w nich niklu, a także określenie wskaźników bioakumulacji i translokacji tego pierwiastka w roślinach. MATERIAŁ I METODY Doświadczenie wazonowe przeprowadzono w latach 2010-2011 w hali wegetacyjnej Katedry Chemii Rolnej i Środowiskowej UR w Krakowie. Wazony PCV użyte w doświadczeniu mieściły 9,00 kg powietrznie suchego materiału glebowego pobranego z warstwy 0-20 cm pola ornego zlokalizowanego w obrębie stacji doświadczalnej UR w Mydlnikach. Doświadczenie obejmowało 5 obiektów prowadzonych w 4 powtórzeniach wg schematu: 0 – gleba bez nawożenia, M – gleba z dodatkiem soli mineralnych, OB – gleba z dodatkiem obornika, OŚI – gleba z dodatkiem osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo, OŚII – gleba z dodatkiem osadu ściekowego ustabilizowanego beztlenowo. Doświadczenie założono na glebie o składzie granulometrycznym piasku gliniastego mocnego pylastego (klasyfikacja wg BN-78/9180-11) o odczynie lekko kwaśnym. Wybrane właściwości materiału glebowego oznaczono przed rozpoczęciem badań metodami powszechnie stosowanymi w chemii rolnej [Ostrowska i in. 1991]. Kwasowość hydrolityczna gleby wynosiła 19,4 mmol(+)·kg-1 s.m., zawartość węgla organicznego - 7,90 g C·kg-1 s.m., a azotu ogólnego - 1,16 g·kg-1 s.m. Ogólna zawartość niklu w glebie wynosiła 6,79 mg·kg-1 s.m. 52 Zawartość niklu w roślinach po zastosowaniu osadów ściekowych... W badaniach zastosowano osady ściekowe (obiekty OŚ i OŚII) pochodzące z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni ścieków zlokalizowanej w Krakowie-Płaszowie. Osady różniły się sposobem stabilizacji. Osad OŚI stabilizowano w warunkach tlenowych, zaś osad OŚII w warunkach beztlenowych. Jako odniesienie analizowanych cech w badaniach zastosowano średnio przefermentowany obornik od trzody chlewnej. W materiałach organicznych oznaczono podstawowe właściwości chemiczne według metodyki zamieszczonej w opracowaniu Barana i Turskiego [1996]. Wybrane właściwości materiałów organicznych zamieszczono w tabeli 1. Z wprowadzonym do gleby obornikiem (OB), osadem ściekowym ustabilizowanym tlenowo (OŚI) oraz osadem ściekowym ustabilizowanym beztlenowo (OŚII) wniesiono odpowiednio 0,14 mg Ni, 1,27 mg Ni oraz 1,64 mg Ni·wazon-1. Oznaczenie Jednostka Sucha masa g · kg-1 159,8 225,7 140,9 Materia organiczna g · kg-1 s.m. 839,7 504,5 485,0 7,73 6,35 7,81 4,03 3,04 1,65 36,72 46,38 42,17 11,72 32,77 34,00 pH (H2O) Przewodność elektrolityczna mS · cm-1 OB OŚI OŚII Formy ogólne N P g ∙ kg-1 s.m. K Ni mg ∙ kg-1 s.m. 18,44 2,18 8,61 5,90 54,65 64,05 Tab. 1. Wybrane właściwości obornika i osadów ściekowych zastosowanych w badaniach Dawka azotu, w pierwszym roku badań w obiektach, w których zastosowano nawożenie wynosiła 1,35 g N∙wazon-1, przy czym w obiektach, w których zastosowano obornik oraz osady ściekowe 80% dawki N wprowadzono z materiałami organicznymi, a 20% w formie wodnego roztworu czystej chemicznie soli NH4NO3. We wszystkich obiektach (oprócz obiektu bez nawożenia) uzupełniono do jednakowego poziomu wprowadzonego z nawożeniem fosfor (do 1,134g P∙wazon-1) i potas (do1,62 g K∙wazon-1) przy użyciu wodnych roztworów czystych chemicznie soli Ca(H2PO4)2∙H2O oraz KCl. W obiekcie, w którym zastosowano do nawożenia wyłącznie sole mineralne azot, fosfor i potas zastosowano odpowiednio w formie: NH4NO3, Ca(H2PO4)2∙H2O, KCl. W drugim roku badań we wszystkich obiektach, oprócz obiektu kontrolnego, zastosowano nawożenie mineralne azotem, fosforem i potasem w formie wodnych roztworów związków, jakie stosowano w roku pierwszym. Wprowadzone ilości składników wynosiły: 1,00 g N, 0,40 g P i 1,80 g K·wazon-1. 53 Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek Rośliną testową w pierwszym roku badań był rzepak jary odmiany „Feliks”, który zebrano w końcu fazy kwitnienia. W drugim roku badań rośliną testową był owies nagoziarnisty odmiany „Siwek” zebrany w fazie dojrzałości mlecznej ziarna. Plon roślin rozdzielano na części nadziemne i korzenie, suszono do stałej wagi w temperaturze 70 oC w suszarce z przepływem gorącego powietrza, a następnie określano plon suchej masy. Wysuszony i rozdrobniony materiał roślinny zmineralizowano na sucho w piecu komorowym (450 oC przez 5 godz.). Popiół roztworzono w rozcieńczonym (1:2) kwasie azotowym (V). W uzyskanych roztworach oznaczono zawartość niklu metodą ICP-OES na aparacie Perkin Elmer Optima 7300DV, a uzyskane wyniki przeliczono na absolutnie suchą masę materiału roślinnego. Na podstawie uzyskanych wyników wyliczono wskaźnik translokacji (WT) niklu jako iloraz zawartości tego pierwiastka w częściach nadziemnych do zawartości w korzeniach przyjmując za 100 zawartość w korzeniach [Kopcewicz i Lewak 1998] oraz wartość współczynnika bioakumulacji (WB) jako iloraz zawartości niklu w częściach nadziemnych i korzeniach roślin oraz ogólnej zawartości tego pierwiastka w glebie [Kabata-Pendias i Pendias 1999]. Uzyskane wyniki poddano ocenie statystycznej z uwzględnieniem analizy wariancji jednoczynnikowej (czynnik: nawożenie) lub dwuczynnikowej (czynniki: nawożenie i roślina) w zależności od analizowanego parametru. Istotność różnic pomiędzy średnimi arytmetycznymi oszacowano za pomocą testu Duncana przy poziomie istotności α < 0,05. WYNIKI I DYSKUSJA W obydwu latach badań w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe i obornik uzyskano więcej biomasy niż po zastosowaniu soli mineralnych (Tab. 2). Spośród materiałów organicznych najkorzystniej na ilość biomasy roślin, zwłaszcza części nadziemnych, wpływał osad ściekowy ustabilizowany tlenowo (OŚI). Osad ściekowy ustabilizowany beztlenowo (OŚII) działał podobnie jak obornik na ilość wytworzonej biomasy. Korzystny wpływ osadów ściekowych, zwłaszcza w stosowanych razem z nawożeniem mineralnym, na plonowanie roślin potwierdzają wyniki badań Jakubus [2006] i Iżewskiej [2009]. Zawartość niklu w biomasie zależała od gatunku rośliny, jej części oraz od zastosowanego nawożenia. Oznaczone zawartości niklu nie budziły zastrzeżeń pod względem wykorzystania paszowego roślin [Gorlach i Gambuś 2000]. Większe zawartości niklu oznaczono w biomasie owsa (Tab. 3), co potwierdza wyniki badań wskazujące na większą kumulację niklu przez tą roślinę, zwłaszcza w porównaniu do innych roślin zbożowych (Kabata-Pendias i Pendias 1999). Najwięcej niklu oznaczono w częściach nadziemnych roślin z obiektu, w którym zastosowano sole mineralne (M). Istotnie więcej 54 Zawartość niklu w roślinach po zastosowaniu osadów ściekowych... niklu zawierały części nadziemne roślin rzepaku jarego nawożonego osadem ściekowym ustabilizowanym beztlenowo (OŚII) w porównaniu do zawartości, jaką oznaczono w roślinach z obiektów, w których zastosowano obornik i osad ściekowy ustabilizowany tlenowo. Jakubus [2006] również nie zaobserwowała zróżnicowania zawartości niklu w częściach nadziemnych gorczycy i łubinu nawożonych osadem ściekowym ustabilizowanym tlenowo w porównaniu do obornika. Owies Obiekt* Rzepak jary Części nadziemne 0 30,90 a** 4,31 a 35,21a 41,50 a 5,19 a 46,69a M 52,91 b 7,88 bc 60,79b 79,88 b 8,13 b 88,01b OB 59,73 7,36 67,09 91,25 10,66 101,91cd OŚI 63,16 c 8,40 bc 71,56c 98,37 d 9,88 c 108,25d OŚII 53,09 9,47 62,56 84,63 10,64 95,27bc Korzenie Suma Części nadziemne Korzenie Suma g s.m. ∙ wazon-1 c b b c bc bc c bc c c Tab. 2. Ilości biomasy rzepaku jarego i owsa. *Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie Korzenie, niezależnie od gatunku rośliny, kumulowały kilkakrotnie więcej niklu niż części nadziemne. Najwięcej tego metalu zawierały korzenie rzepaku jarego i owsa z obiektu, w którym do gleby wprowadzono osad ustabilizowany beztlenowo (OŚII). Iżewska [2009] wskazuje na istotne zwiększenie kumulacji niklu w nasionach rzepaku i pszenżyta po zastosowaniu osadu ściekowego w porównaniu do obornika. Badania te prowadzone były na glebie kwaśnej, co mogło jednakże wpływać na większą biodostępność tego pierwiastka. Owies Obiekt* Rzepak jary Części nadziemne 0 1,71 a ** 5,37 a 2,72 a 9,55 a M 2,02 9,17 3,26 b 12,81 a OB 1,62 a 8,60 b 2,55 a 12,77 a OŚI 1,70 6,79 2,81 a 11,94 a OŚII 1,89 b 2,65 a 17,66 b Korzenie Części nadziemne Korzenie mg Ni ∙ kg s.m. -1 b a b a 9,63 b Tab. 3. Zawartość niklu w biomasie rzepaku jarego i owsa. * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie 55 Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek Nie zaobserwowano istotnego statystycznie zróżnicowania w wartościach wskaźnika translokacji niklu w roślinach w zależności od zastosowanego nawożenia (Rys. 1). Wartość wskaźnika translokacji niklu zarówno dla rzepaku jarego, jak i owsa w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe i obornik nie przekraczały wartości 25. Największe wartości wskaźnika translokacji stwierdzono dla obu roślin w obiekcie bez nawożenia (0), co wynikało z małej akumulacji tego pierwiastka w systemie korzeniowym. Istotnie większą wartość wskaźnika translokacji, niezależnie od rośliny, stwierdzono po zastosowania osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo (OŚI) niż beztlenowo (OŚII). Według danych literaturowych nikiel jest pierwiastkiem łatwo przemieszczanym z korzeni do części nadziemnych roślin, zwłaszcza do ziarna i liści [Kabata-Pendias i Pendias 1999, Gondek 2007,], co również wykazano w prezentowanych badaniach. Statystycznie istotnie największe wartości współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku jarym stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego beztlenowo (OŚII) (Tab. 4). W pozostałych wariantach doświadczenia nie stwierdzono istotnego zróżnicowania w wartości tego parametru. Zastosowane nawożenie nie zróżnicowało istotnie wartości współczynnika WB dla części nadziemnych i korzeni owsa za wyjątkiem obiektu, w którym do gleby wprowadzono osad ściekowy ustabilizowany beztlenowo (OŚII), który wpływał na zwiększenie bioakumulacji niklu w korzeniach. Również Jakubus [2006] nie stwierdziła większego zróżnicowania wartości współczynnika bioakumulacji niklu w roślinach nawożonych osadami ściekowymi. 35 f* ef 30 de de 25 cd bcd ab b WT 20 bc a 15 10 Rzepak Owies 5 0 0 M OB. OŚI OŚII Obiekty Rys. 1. Wartości wskaźnika translokacji (WT) niklu dla rzepaku jarego i owsa. Obiekty doświadczenia jak w metodyce. *- Średnie oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie x roślina 56 Zawartość niklu w roślinach po zastosowaniu osadów ściekowych... Obiekty* Części nadziemne Korzenie Rzepak jary Owies Rzepak jary Owies 0 0,258 a** 0,405 a 0,803 a 1,433 a M 0,313 bc 0,503 b 1,413 c 1,965 b OB 0,290 ab 0,453 ab 1,523 c 2,270 b OŚI 0,287 0,472 1,148 b 2,008 b OŚII 0,342 c 1,740 d 3,198 c ab b 0,480 b Tab. 4. Wartości współczynnika bioakumulacji (WB) niklu dla rzepaku jarego i owsa. * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy p < 0,05; czynnik: nawożenie WNIOSKI • Istotnie większe plony biomasy roślin w obydwu latach badań uzyskano w obiektach, w których zastosowano osady ściekowe lub obornik w porównaniu do obiektu, w którym zastosowano nawożenie mineralne. • Doglebowa aplikacja osadów ściekowych nie spowodowała nadmiernej akumulacji niklu w częściach nadziemnych roślin. Pierwiastek ten był gromadzony głównie w korzeniach. • Wartości wskaźnika translokacji niklu dla rzepaku i owsa były zbliżone i zależały od zastosowanego nawożenia. • Największą wartość współczynnika bioakumulacji niklu w rzepaku stwierdzono po zastosowaniu osadu ściekowego ustabilizowanego tlenowo. Zastosowane nawożenie nie różnicowało wartości wskaźnika bioakumulacji niklu w owsie. LITERATURA Baran S., Turski R. 1996. Ćwiczenia specjalistyczne z utylizacji odpadów i ścieków. Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Lublinie, 136 ss. BN-78/9180-11: Gleby i utwory mineralne - podział na frakcje i grupy granulometryczne Gondek K. 2007. Akumulacja metali ciężkich w owsie nawożonym kompostami. Acta Agrophysica. 10 (1): 89-102 57 Małgorzata Koncewicz-Baran, Krzysztof Gondek, Agnieszka Ozimek Gondek K. 2006. Zawartość różnych form metali ciężkich w osadach ściekowych i kompostach. Acta Agrophysica, 8(4): 825-838 Gorlach E., Gambuś F. 2000. Potencjalnie toksyczne pierwiastki śladowe (nadmiar, szkodliwość, przeciwdziałanie). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych. 472: 275-296 Iżewska A. 2009. The impact of manure, municipal sewage sludge and compost prepared from municipal sewage sludge on crop yield and content of Mn, Zn, Cu, Ni, Pb, Cd in spring rape and spring triticale. Journal of Elelementology. 14(3): 449-456 Jakubus M., Czekała J. 2001 Heavy metal speciation in sewage sludge. Polish Journal of Environmental Studies. 10(4): 245-250 Jakubus M. 2006. Ocena przydatności osadów ściekowych w nawożeniu roślin. Woda-Środowisko-Obszary Wiejskie, 6, 2(18): 87-97 Kabata-Pendias A., Pendias H. 1999. Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 388 ss. Kopcewicz J., Lewak S. 1998. Podstawy fizjologii roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 774 ss. Krajowy Plan Gospodarki Odpadami 2014. Monitor Polski Nr 101, Poz. 1183 Ostrowska A., Gawliński A., Szczubiałka Z. 1991. Metody analizy i oceny gleby i roślin. Wydawnictwo Instytutu Ochrony Środowiska, Warszawa, 325 ss. Adres do korespondencji: Małgorzata Koncewicz-Baran, Agnieszka Ozimek Katedra Chemii Rolnej i Środowiskowej Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicz 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Krzysztof Gondek 58 Jakub Kośmider Magdalena Greczuk EPISTEME 14/2012 s. 59-66 ISSN 1895-4421 POZIOM EDUKACJI PRZYRODNICZO-LEŚNEJ DOTYCZĄCEJ GROMADY REPTILIA W WOJEWÓDZTWIE MAZOWIECKIM THE LEVEL OF NATURAL AND FORESTRY EDUCATION REGARDING THE CLASS REPTILIA IN THE PROVINCE OF MAZOVIA, POLAND Abstrakt. Na przestrzeni kilkudziesięciu lat formy ochrony przyrody jakim podlegają gady okazały się mało skuteczne. Dewastacja naturalnych siedlisk, odłów młodych węży do prywatnych hodowli oraz strach przed nimi, poważnie zagrażają wszystkim rodzimych populacjom gadów. W pracy określono różnice w poziomie wiedzy i świadomości ekologicznej dotyczącej gadów wśród licealistów kształcących się w szkołach o odmiennych profilach nauczania. Badania ankietowe zostały przeprowadzone na terenie województwa mazowieckiego (miasta stołecznego Warszawy oraz Wołomina) w czterech typach szkół średnich wśród 240 respondentów. Słowa kluczowe: gady, świadomość ekologiczna, badania ankietowe Summary. Nature conservation methods applied over the last several decades for the preservation of snakes did not prove to be efficacious enough. Natural habitat destruction, young snakes’ private rearings and the fear of these reptiles severly threaten all native populations of reptiles. This article shows the effect of environmental and silvicultural education on the raising of ecological awareness in society (secondaryschool pupils) regarding their knowledge of reptiles. Survey research has been carried out in the area of Mazovian province, in four types of secondary schools, among 240 respondents. Key words: nature and silvicultural education, surver research 59 Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk WSTĘP Edukacja leśna społeczeństwa jest obecnie jednym z priorytetowych zadań realizowanych przez Lasy Państwowe. Podstawowym jej celem jest upowszechnienie wiedzy o środowisku leśnym, zrównoważonej gospodarce, racjonalnym korzystaniu z dóbr leśnych oraz zapoznanie z pracą i zawodem leśnika [Kraczek 2011]. Wskazane jest, aby była traktowana przez leśników m. in. jako ważne narzędzie do ochrony lasu oraz otaczającego środowiska. Podejmując się tak trudnego i jakże odpowiedzialnego zadania, jednostki administracyjne Lasów Państwowych nie mogą pominąć kwestii formalnego nauczania oraz instytucji i organizacji, które specjalizują się w nieformalnej edukacji ekologicznej społeczeństwa. Najważniejszym partnerem w aktywności edukacyjnej leśników jest szkoła. W nowej, zreformowanej szkole edukacja ekologiczna jest mocno osadzona w działaniach edukacyjnych i wychowawczych, co jest wynikiem odpowiednich zapisów w podstawowym dla niej dokumencie jakim jest obowiązująca podstawa programowa. Twórcy podstawy programowej podkreślają, że założone cele kształcenia ekologicznego będą osiągane wówczas, gdy w pełni zostaną wykorzystane możliwości aktywizowania uczniów poprzez organizowanie przez nauczycieli różnorodnych działań w dużo większym niż dotychczas kontakcie z przyrodą. We współczesnej szkole, zważywszy na to, że znaczna część uczniów żyjących w miastach zatraciła kontakt z przyrodą, konieczne stało się organizowanie zajęć w terenie, głównie po to, aby dostarczyć uczestnikom indywidualnych doświadczeń przyrodniczych. Jednocześnie skłania to nauczycieli do poszukiwania odpowiednich miejsc poza szkołą, które byłyby odpowiednie do przeprowadzenia zajęć w ramach edukacji przyrodniczej, ekologicznej czy regionalnej. Obie strony – leśnicy oraz nauczyciele – mają sobie wiele do zaoferowania. Nauczyciele dysponują wiedzą metodyczną i pedagogiczną, atutem zaś leśników jest wiedza szczegółowa z różnych dziedzin nauki oraz bardzo dobra znajomość lasu, poza tym umiejętność całościowego spojrzenia na przyrodę, poczucia piękna i estetyki oraz zdolność do zawierania konstruktywnego kompromisu między środowiskiem przyrodniczym, a nieustannie zmieniającymi się potrzebami człowieka [Mrowińska i Mrowiński 2003]. Lasy w Polsce zajmują niespełna 30 % powierzchni kraju, a z tego 78 % pozostaje w zarządzie Lasów Państwowych. Publiczna własność lasów ma swoje liczne zalety, a pierwszato ta, że pozostają one powszechnie dostępne dla społeczeństwa. Rosnąca świadomość i wrażliwość społeczna na sprawy związane z ochroną środowiska, w tym lasów powoduje, że coraz więcej środowisk, grup, stowarzyszeń, a nawet pojedynczych osób chce współdecydować o lasach, które są „nasze”. To dobre pod warunkiem, że oprócz autentycznej troski, dobrych chęci i często wielkich emocji – uczestnicy debaty dysponują wiedzą i odpowiedzialnością za wygłaszane opinie. Wiedza o lesie 60 Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej dotyczącej Gromady Reptilia... w społeczeństwie polskim jest bardzo mała. W formalnej edukacji szkolnej las pojawia się sporadycznie i niemal wyłącznie jako obiekt przyrodniczy, na który składają się gatunki roślin i zwierząt powiązane zależnościami i który z pewnością trzeba chronić. Często brak całkowicie, choćby podstaw wiedzy, o możliwościach i wiekowej praktyce racjonalnego użytkowania zasobów leśnych. Na ogół, niestety brak nawet świadomości, że las jest obiektem przyrodniczym odnawialnym, co przecież jest fundamentem współczesnej gospodarki leśnej w Polsce [Chrzanowski 2009]. Celem podjętych badań oraz analiz było ukazanie poziomu wiedzy z zakresu tematyki dotyczącej gadów oraz zaproponowanie rozwiązań podnoszących świadomość ekologiczną uczniów kształcących się w szkołach o odmiennych profilach. MATERIAŁY I METODY Do przedstawienia prezentowanego zagadnienia wykorzystano metodę sondażu (badanie ankietowe). W marcu 2011r. przygotowano kwestionariusze ankiet, które następnie zostały rozdane 240 uczniom klas pierwszych (16-17 lat), wśród czterech typów szkół średnich znajdujących się na terenie miasta stołecznego Warszawy oraz miejscowości Wołomin w województwie mazowieckim podczas zajęć godziny wychowawczej. Dawało to możliwość bezpośredniej odpowiedzi na pojawiające się pytania ze strony uczniów. Opracowana ankieta zawierała pięć zadań, gdzie pierwsze trzy dotyczyły pytań z zakresu biologii i ekologii polskich gadów, zaś pozostałe dwa tyczyły się podejścia respondentów do gromady Reptilia. Pytania zamieszczone w ankiecie były typu otwartego. Tematyka pytań dotyczyła zagadnień, które uczeń powinien znać po półrocznym kursie kształcenie w szkole średniej. Polecenia miały na celu sprawdzenie zarówno wiedzy ogólnej dotyczącej polskich gadów jak również zobrazować czy uczeń zna nowoczesne metody czynnej ochrony zwierząt, które w przypadku tej gromady kręgowców mają znaczenie priorytetowe. Wybór placówek oświatowo – wychowawczych, XIV LO im. Stanisława Staszica, gdzie wszystkie klasy w szkole realizują rozszerzony poziom nauczania biologii, XI LO im. Mikołaja Reja w Warszawie – klasa biologiczna, Technikum Ekonomicznie im. Stanisława Staszica w Wołominie oraz Liceum Profilowane w Wołominie o wiodących przedmiotach ekonomiczno – administracyjnych, umożliwił zobrazowanie poziomu wiedzy z zakresu omawianego materiału tyczącego się przedmiotu jakim jest biologia. Na uwagę zasługuje fakt, że jedynie XIV LO im. Stanisława Staszica i XI LO im. Mikołaja Reja, realizuje tematy dotyczące gromady gadów (Reptilia) w ramach rozszerzonego poziomu nauczania przedmiotu biologia. W pozostałych szkołach standardy wymagań wobec uczniów winny dotyczyć jedynie: fizjologii człowieka, podstaw genetyki i ekologii. 61 Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk WYNIKI Przeprowadzone badania dały jednoznaczną odpowiedź na temat celowości podejmowania działań ochronnych dotyczących gadów. Poprawne odpowiedzi uczniów z czterech badanych szkół zostały przedstawione na poniżej zamieszczonych wykresach. Rys. 1. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących ilości występujących węży w Polsce Rys. 2. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących ilości węży stanowiących zagrożenie dla człowieka Analizując wyniki uzyskanych odpowiedzi (Rys. 1, 2, 3) możemy zaobserwować kilka zależności. Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej na terenie badanych szkół w województwie mazowieckim nie jest zadowalający, na mało które pytanie ponad połowa uczniów z jednego typu szkoły odpowiedziała poprawnie. 62 Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej dotyczącej Gromady Reptilia... Rys. 3. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących liczebności gromady Reptilia Dodatkowo zaobserwować można, że przeanalizowanie materiału na lekcjach biologii dotyczącego gromady gadów, niekoniecznie odzwierciedla poprawność odpowiedzi w XIV LO im. Stanisława Staszica w Warszawie. Prawdopodobnie wynika to z faktu, że nauczyciele dużo więcej uwagi poświęcają na zapoznanie uczniów z nowymi cechami ewolucyjnymi gadów niż z potrzebami ochrony rodzimej herpetofauny. Nieoczekiwanym wynikiem okazało się wysokie miejsce w rankingu poprawnych odpowiedzi w Liceum Profilowanym (Rys. 2, 3). Biorąc pod uwagę obowiązującą podstawę programową możemy zaobserwować, że nauczanie biologii w takiej szkole jest bardzo zredukowane, co daje nam po raz kolejny informację o tym, że wiedza zdobyta w ramach zajęć lekcyjnych nie zawsze pokrywa się z umiejętnościami poruszania się i egzystencji uczniów w terenie. Najlepsze rezultaty prowadzonej edukacji ekologicznej miałyby miejsce w przypadku gdzie bezpośrednio po odbytych zajęciach w klasie, uczniowie mieliby szansę zweryfikować zdobyte informacje bezpośrednio w terenie. W kolejnych dwóch pytaniach, 4 i 5, poruszono kwestie unormowań prawnych ochrony gadów w Polsce. Wyniki powstałe z opracowania pytania nr 4, Rys. 4 okazały się satysfakcjonujące. Około 64% (154 osoby udzieliły poprawnej odpowiedzi) badanych respondentów dostrzega konieczność ochrony gromady Reptilia. Uczniowie zdają sobie sprawę z konieczności ochrony tych kręgowców jednak, mało który z nich potrafi wymienić zabiegi pomagające chronić polskie gady. Ponadto 19% ankietowanych nie udzieliło żadnej odpowiedzi. 63 Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk Rys. 4. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotyczących „ochronności” gadów Pytanie piąte było pytaniem otwartym. Poproszono uczniów o wskazanie kilku przykładów czynnej ochrony gadów. Wyniki okazały się niezadowalające. Rys. 5. Zestawienie poprawnych odpowiedzi dotczących metod ochrony czynnej gadów Większość ankietowanych nie udzieliło odpowiedzi na postawione pytanie. Jedynie 12% respondentów udzieliło poprawnej i wyczerpującej odpowiedzi. Kolejne 33% odpowiedziało częściowo poprawnie na zadanie piąte (respondenci udzieli informacji o jednej metodzie z co najmniej dwóch, o które zostali poproszeni). Ponad połowa badanych uczniów (55%) pozostawiło pytanie bez odpowiedzi. 64 Poziom edukacji przyrodniczo-leśnej dotyczącej Gromady Reptilia... DYSKUSJA Pomimo już niemal trzydziestoletniego propagowania aktywnych metod ochrony gadów i płazów w Polsce dostęp do informacji dla przeciętnego odbiorcy jest znacznie utrudniony. Społeczeństwo często nie zdaje sobie sprawy jakie działania ochronne są podejmowane w naszym kraju, a przede wszystkim, czemu one służą. Żeby temu przeciwdziałać konieczne jest odpowiednie edukowanie społeczeństwa już od najmłodszych lat. Jednym z zadań edukacji przyrodniczo - leśnej jest kształtowanie należytych postawy wobec otaczającej przyrody oraz promowanie działań umożliwiających przełamanie negatywnego odbioru węży, kształtowanego przez szereg pokoleń. Węże, z którymi to przede wszystkim utożsamiane są gady, w naszej kulturze praktycznie od zawsze wzbudzały negatywne emocje. Prawdopodobnie wynikało to z licznych zabobonów dotyczących ich biologii czy specyficznego zachowania. Jeszcze do niedawna, na wsiach, można było usłyszeć opowiadania o wężach, które pod osłoną nocy zbliżają się do wymion krów, aby pić ich mleko. Stwierdzenia te, okazywały się na tyle realistyczne, że opisywano przypadki jakoby węże podczas takiego procederu stawały się nad wyraz niewrażliwe i można je było spokojnie złapać i unieszkodliwić. Zaskrońcom, żmijom czy też innym gatunkom węży przypisywano zdolności hipnotyzerskie. Kolejny sąd, którego interpretacja pozostawia wiele do życzenia. Zwierzęta te posiadają „nieruchomy” wzrok a przypisywane zdolności hipnotyzerskie wynikają wyłącznie z wybujałej ludzkiej fantazji. Nie zawsze jednak mówiono o wężach pejoratywnie [Jaroniewski 1984]. Wierzenia ludowe, pomimo, że nie zawsze prawdziwe przyczyniły się do naszej odrębności kulturowej i indywidualności narodowej. Pamiętajmy, jednak, że niski poziom edukacji i świadomości ekologicznej społeczeństwa dotyczący, z jednej strony całej gromady zwierząt, z drugiej zaś strony pojedynczego gatunku w niedalekiej przyszłości może doprowadzić do zagłady rodzimych gatunków gadów. Należy wspierać kampanie edukacyjne mające na celu propagowanie zadań kształtujących poprawne postawy ekologiczne. Nie możemy bowiem dopuścić, aby brak wiedzy oraz podtrzymywanie abstrakcyjnych opowieści doprowadził do wymarcia choćby jednego naszego rodzimego gatunku gada. WNIOSKI Przeprowadzone badania na terenie województwa mazowieckiego, dotyczące wiedzy ogólnej z zakresu gromady gadów dały wynik niezadowalający. Pokazały, że wiedza dotycząca otaczającego nas środowiska jest niepełna. Uczniowie w wieku 16-17 lat nie potrafią trafnie wskazać przedstawicieli gromady gadów, a świat płazów i gadów traktują jako jedność. Zajęcia do65 Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk tyczące wyżej wymienionych gromad powinny być przeprowadzane w okresie wiosennym, kiedy po wstępie teoretycznym nauczyciel ma możliwość i wykazuje na tyle zaangażowania, aby pokazać odpowiednie gatunki bezpośrednio w terenie, oczywiście na tyle, na ile pozwalają mu na to warunki lokalizacyjne szkoły. Tego typu zabiegi umożliwiają niejako promowanie zachowań proekologicznych i dostarczają wiedzy prakseologicznej z danego zagadnienia. Chcąc uzyskać zadawalające efekty nauczania należy połączyć teorię z praktyką. Uczeń powinien otrzymać podstawowe informacje dotyczące danego zagadnienia przyrodniczego, a następnie uzyskać możliwość zweryfikowania go w przyrodzie, oczywiście na tyle, na ile jest to możliwe. LITERATURA Chrzanowski T. 2009. Edukacja leśna społeczeństwa w Lasach Państwowych - jaka jest, jaka może być. Postępy techniki w leśnictwie, 105: 13-20. Jaroniewski W. 1984. Jadowite węże świata. Wydawnictwo Szkolne i Pedagogiczne. Warszawa. Kraczek J. 2011. Lasy Lubelszczyzny Regionalny Przewodnik Leśny. Wojewódzki Fundusz Ochrony Środowiska i Gospodarki Wodnej. Lublin. Mrowińska I. Mrowiński P. 2003. Treści edukacji leśnej oraz ich realizacja. Poradnik edukacji leśnej, 5: 7-9. Adres do korespondencji: Jakub Kośmider, Magdalena Greczuk Wydział Leśny Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warszawa mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Michał Wasilewski, prof. nadzw. SGGW, prof. dr hab. Andrzej Grzywacz 66 Edyta Kruk Kamila Dedio Marek Ryczek EPISTEME 14/2012 s. 67-76 ISSN 1895-4421 OCENA ZAGROŻENIA EROZJĄ WODNĄ ZLEWNI POTOKU SMUGAWKA W BESKIDZIE MAKOWSKIM Z WYKORZYSTANIEM TECHNIK GIS EVALUATION OF WATER EROSION THREAT OF THE SMUGAWKA STREAM BASIN IN THE BESKID MAKOWSKI USING GIS TECHNIQUES Abstrakt. W pracy przedstawiono wyniki oceny potencjalnego zagrożenia erozją wodną górskiej zlewni potoku Smugawka w Beskidzie Makowskim. Do oceny wykorzystano model USLE, którego parametry oszacowano z zastosowaniem technik GIS. Powierzchnia zlewni wynosi 5,40 m2. Średnia wysokość zlewni osiąga 636,4 m npm. Średni spadek zlewni wynosi 21,31 %. Zlewnia w 54,26 % zajęta jest przez lasy, w 34,63% przez grunty orne, a pozostały obszar stanowią użytki zielone i nieużytki. Do oceny zagrożenia erozją wodną zastosowano 6-cio stopniową skalę. Obszary jednorodne pod względem zagrożenia erozyjnego wyróżniono na podstawie nakładania się warstw tematycznych określających poszczególne parametry modelu. Zlewnia charakteryzuje się korzystnym rozkładem lasów, pokrywają one miejsca o najwyższych spadkach. Silne zagrożenie erozyjne występuje jedynie na niewielkich obszarach użytkowanych jako grunty orne o nieprawidłowym kierunku upraw. Słowa kluczowe: erozja wodna, model USLE, GIS Summary. The results of evaluation of potential erosion water threat of the mountainous basin of the Smugawka basin located In the Beskid Makowski was presented in the work. For the evaluation the model USLE was used. The parameters for the models the GIS techniques were used. The area of basin amounts 5,40 m2, mean height 636,4 m asl and mean basin slope 21,31 %. Forests occupy 54,26 % of the basin area, while arable land 34,63%. The rest of the area is covered by grasslands and barren land. For the evaluation of water erosion threat the six degree scale was used. The homogenous areas regarding erosion threat were distinguished based on imposition of overlayers determining the following model parameters. The basin is characterized by very advantageous of forests distribution, they cover areas of the highest slopes. The high erosion threat occurs only on small areas used as arable land of unsuitable plough direction. Key words: water erosion, model USLE, GIS 67 Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek WSTĘP Erozja wodna będąca naturalnym procesem, znacznie przyczynia się do formowania powierzchni zlewni [Józefaciuk i Józefaciuk 1992]. Skutki erozji są powszechnie znane i znajdują swoje odzwierciedlenie przede wszystkim w niszczeniu wierzchniej, próchniczej warstwy gleby. Nawet niewielkie natężenie erozji negatywnie wpływa na warunki uprawne i plonowanie, a zdzierana i spłukiwana warstwa humusu obniża żyzność gleby co w efekcie może doprowadzić do całkowitego wyłączenia danego obszaru z upraw polowych lub do poważnych utrudnień w prowadzeniu zabiegów agrotechnicznych [Żmuda i in. 2005]. Celem pracy była ocena zagrożenia erozją wodną na przykładzie górskiej zlewni potoku Smugawka w Beskidzie Makowskim. Potok ten jest częścią zlewni potoku Lubieńka. Profil wodowskazowy zamyka obszar badawczy w miejscowości Tenczyn - Smuga. Powierzchnia zlewni liczy 5,40 km2. Jest słabo wydłużona i średnio zwarta (wskaźnik zwartości wynosi 1,27). Długość zlewni wynosi 3,08 km, szerokość 1,75 km, a obwód 10,85 km. Średnia wysokość zlewni to 636,4 m npm. Najwyższy punkt ma rzędną 857,9 m npm, a najniższy - 415,0 m npm. Potok główny ma długość 4,42 km i spadek 6,22%. Gęstość sieci rzecznej wynosi 2,43 km·km-2. Charakteryzuje się dość korzystnym rozmieszczeniem lasów w zlewni. Zajmują one głównie całą północną i część południowego fragmentu zlewni. Wskaźnik rozwinięcia lesistości wynosi 0,85. Pod względem składu granulometrycznego badana zlewnia charakteryzuje się dużym zróżnicowaniem. Największą powierzchnię zajmuje glina zwykła, która występuje w całej północnej i na niewielkich obszarach w pozostałej części. Mniejszą powierzchnię zajmuje glina piaszczysto-ilasta występująca w południowej części. Na niewielkich powierzchniach w części wschodniej i południowej znajduje się glina ilasta, pył ilasty i glina piaszczysta. MATERIAŁY I METODY W literaturze przedmiotu dostępnych jest kilka generacji modeli erozyjnych opisujących spływ wody oraz zjawiska erozji, z których najbardziej znanym i szeroko w świecie wykorzystywanym jest propozycja Wischmeiera i Smitha (1978) w postaci tzw. modelu USLE. Formuła USLE ma postać [Banasik i Górski 1991]: A = S · L · R · P ·C · K (t·ha-1·rok-1) (1) gdzie: A – średnia z wielolecia roczna masa erodowanej gleby z jednostki powierzchni (t·ha-1·rok-1), R – wskaźnik erozyjności deszczu (Je), K - wskaźnik podatności gleb na erozję (t·ha-1·Je-1), L – wskaźnik długości zbocza (-), S – wskaźnik spadku zbocza (-), C – wskaźnik pokrywy roślinnej (-), P –wskaźnik zabiegów przeciwdziałających erozji (-). 68 Ocena zagrożenia erozją wodną zlewni potoku Smugawka... Poszczególne parametry modelu wyznaczono z wykorzystaniem technik GIS, w wyniku nałożenia odpowiednich warstw tematycznych. Gleby występujące na terenie badanej zlewni zakwalifikowano do odpowiednich grup na podstawie mapy glebowo-rolniczej w skali 1:25000 i badań terenowych. Klasyfikację uziarnienia gleb określono na podstawie Normy BN/78/918011. Strukturę użytkowania zlewni sporządzono w oparciu o ortofotomapę uzyskaną z panchromatycznego zobrazowania satelity IRS, w skali 1:25000. Warstwy tematyczne zostały opracowane przy wykorzystaniu programu komputerowego MapInfo Professional 8.0 (Rys. 1). Rys. 1. Warstwy tematyczne opracowane przy wykorzystaniu technik GIS zlewni potoku Smugawka 69 Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek Wskaźnik erozyjności deszczu (R) wyznaczono na podstawie indeksu Fouriera w modyfikacji Arnouldsa (1977). Indeks wykazuje dobrą korelację ze wskaźnikiem R (Licznar 2005). Indeks Fouriera obliczono jako średnią z wielolecia dla całej zlewni, ze wzoru: gdzie: m – liczba lat w wieloleciu, pi,j – suma miesięczna opadu w i-tym miesiącu, w j-tym roku (mm), Pj – suma roczna opadu w j-tym roku (mm). Bazując na wartości indeksu Fouriera wyznaczono wskaźnik erozyjności deszczu, przystosowując wartość do jednostki Je (MJ·ha-1·cm·h-1), mnożąc F przez 1,702 (Renard i in. 1996). Wskaźnik podatności gleb na erozję (K) obliczono według Renarda i in. (1997): (3) gdzie: Przy czym, dla każdej frakcji granulometrycznej cząstek glebowych: di – maksymalna średnica ziaren w danej klasie (mm), di-1 – minimalna średnica ziaren w danej klasie (mm), fi – udział masowy (%). Współczynnik Dg wyznaczono na podstawie oznaczeń składu granulometrycznego, metodą Casagrande’a w modyfikacji Prószyńskiego, sklasyfikowano według BN78/9180-11. Wskaźniki długości i spadku zbocza (L,S) połączono w jeden współczynnik – wskaźnik rzeźby terenu – LS i wyznaczono z następujących wzorów (Mc Cool i in. 1989): - długość zbocza równa drodze spływu powierzchgdzie: niowego (m), DA–powierzchnia zlewni (m2), Ls – długość wszystkich cieków w zlewni (m), s – spadek zbocza (%), m – wykładnik potęgowy zależny od spadku zbocza [Stone i Hilborn 2000]: m = 0,2, gdy s ≤ 1,0%, m = 0,3, gdy 1,0 < s < 3,0%, m = 0,4, gdy 3,0 ≤ s < 5,0%, m = 0,5, gdy s ≥ 5%. 70 Ocena zagrożenia erozją wodną zlewni potoku Smugawka... Wskaźnik pokrywy roślinnej (C) przyjęto za Koreleskim (1992): dla owsa jarego - 0,104, pszenicy ozimej – 0,100, ziemniaków – 0,229, użytków zielonych – 0,015, lasów – 0,002, terenów zabudowanych – 0 i obliczono jego średnią ważoną wartość dla całej zlewni. Wskaźnik zabiegów przeciwdziałających erozji (P) przyjęto za Koreleskim (1992) w następujący sposób: dla upraw wzdłuż stoku P = 1, dla upraw w poprzek stoku przyjmuje wartości w zakresie od 0,5 do 1,0 w zależności od spadku. Kierunki upraw określono na podstawie ortofotomapy satelitarnej. WYNIKI I DYSKUSJA Poszczególne elementy USLE wyznaczono w niżej opisany sposób: arametr R - przyjęto jako średnia z wielolecia 1999 - 2008, z posterunku P opadowego reprezentatywnego dla badanej zlewni, jego wartość średnia wyniosła 193,461 Je. Parametr K – jego średnie wartości wyróżnionych grup granulometrycznych wahały się od 0,279 do 0,430 t·ha-1·Je–1. Wartość średnia ważona dla całej zlewni, obliczona według procentowego rozkładu grup granulometrycznych, wyniosła 0,340 t·ha-1·Je–1. Ze względu na niewielkie zróżnicowanie tego współczynnika przyjętą tą wartość jako charakterystyczną dla całego badanego obszaru (Tab. 1). Grupa granulometryczna wg BN-78/9180-11 Powierzchnia (km2) Udział w zlewni (%) Wartość średnia K dla grupy (t·ha-1·Je–1) Liczba próbek gi 0,20 3,71 0,395 2 pyi 0,35 6,48 0,430 1 gp 0,02 0,37 0,219 2 gpi gz Razem 1,41 3,42 5,40 26,11 63,33 100,00 0,279 0,354 - 2 4 11 Tab. 1. Udział grup granulometrycznych w zlewni i obliczenie średnich wartości parametru K Parametr LS - w zlewni przeważają spadki > 27% . Stanowią one 38,89% powierzchni ogólnej. Znacznie mniej jest spadków najmniejszych < 5% (1,30%) (Tab. 2). Średni spadek zlewni wynosi 21,32%. Ze względu na przeważające prostoliniowe kształty stoków nie uwzględniano ich niejednorodności. Wydzielono 4 obszary jednorodne pod względem wartości iloczynu LS. W obszarze I wartość LS wyniosła 0,139, w 2 – 0,602, w 3 – 1,336, a w 4 – 4,376. Największą powierzchnię (38,89%) zajmuje obszar IV. 71 Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek Parametr C - w strukturze użytkowania przeważają lasy (54,26%), grunty orne zajmują 34,63% natomiast użytki zielone 8,15%. Pozostałą część stanowią tereny zabudowane. Na gruntach ornych w roku wykonania zdjęć satelitarnych owies jary zajmował 42%, pszenica ozima 39% a ziemniaki 19% ich powierzchni. Parametr P - biorąc pod uwagę średni spadek zlewni (21,32%) oraz fakt iż na terenie zlewni przeważa uprawa w poprzek stoku przyjęto wartość parametru P równą 0,9. Przedział spadków (%) Pow. (km2) Udział w zlewni (%) <5 0,07 1,30 5-10 0,58 10,74 10-18 1,37 18-27 1,28 Obszar Udział w Pow. (km2) jednorodny zlewni (%) Wartość LS (-) I 0,65 12,04 0,139 25,37 II 1,37 25,37 0,602 23,70 III 1,28 23,70 1,336 >27 2,10 38,89 IV 2,10 38,89 4,376 Razem 5,40 100,00 - 5,40 100,00 - Tab. 2. Rozkład spadków w zlewni potoku Smugawka i obszary jednorodne parametru LS Obliczenie potencjalnej erozji wodnej Przeprowadzone modelowanie doprowadziło do podziału obszaru zlewni na strefy zagrożenia erozją wodną w oparciu o kryteria zaproponowane przez Marksa i wsp. (1989) (Tab. 3). Po nałożeniu warstw tematycznych związanych z kolejnymi parametrami uzyskano łącznie 24 pola jednorodne, o takim samym natężeniu erozji wodnej. Wielkość potencjalna strat z obszarów jednorodnych wahała się od 0,017 do 62,389 t·ha-1·rok-1. Skala wyróżniona na podstawie rocznych strat w tonach na ha 6 klas natężenia: I (brak <1), II (bardzo małe 1-5), III (małe 5-10), IV (średnie 10-15), V (wysokie 15-30) i VI (bardzo wysokie >30). W badanej zlewni największą powierzchnię zajmują grunty nie zagrożone erozją. Są one zajęte przez lasy i użytki zielone. Prawie 23% powierzchni znajduje się w obszarach zagrożonych bardzo małym natężeniem erozji. Znajdują się one w terenach zajętych przez grunty orne. Łączna potencjalna wielkość rocznej straty gleby na terenie zlewni wynosi 2009,54 t, co w przeliczeniu na 1 ha daje średnią wartość 3,35 t, a to klasyfikuje badaną zlewnię jako bardzo mało zagrożoną (II klasa). Zróżnicowanie erozji wodnej gleb w przestrzeni zlewni przedstawiono na Rys. 2. 72 Ocena zagrożenia erozją wodną zlewni potoku Smugawka... Średnie jednostkowe natężenie erozji wodnej Udział Klasa⃰ Wielkość całkowita erozji wodnej % km2 (t·ha-1·rok-1) (t·km2·rok-1) (t·rok-1) I 63,33 3,42 0,342 34,2 116,96 II 22,59 1,22 2,822 282,2 344,28 III 4,82 0,26 8,617 861,7 224,04 IV 3,15 0,17 10,314 1031,4 175,34 V 2,78 0,15 23,691 2369,1 355,37 VI 3,33 0,18 44,086 4408,6 793,55 Total 100,00 5,40 - - 2009,54 Tab. 3. Obliczenie potencjalnej wielkości erozji wodnej. * - Klasy zagrożenia erozją wodną wg Marksa i wsp. (1989) Rys. 2. Rozmieszcznie klas potencjalnego zagrożenia erozją wodną w zlewni potoku Smugawka 73 Edyta Kruk, Kamila Dedio, Marek Ryczek WNIOSKI • Potencjalna roczna strata gleby z całej badanej zlewni obliczona przy wykorzystaniu modelu USLE wynosi 2009,54 t. • Obliczona jednostkowa strata gleby z 1 ha wyniosła 3,35 t, co pozwala na ocenę badanej zlewni jako bardzo mało zagrożonej. • Ponad 63% powierzchni nie wykazuje się zagrożeniem erozyjnym. • Techniki GIS mogą stanowić istotne narzędzie do dalszego rozwoju modelu USLE. Szczególnej uwagi wymaga parametr LS, który w skali zlewni charakteryzuje się największym zróżnicowaniem spośród pozostałych. LITERATURA Arnoulds H.M.J., 1977. Methodology used to determine the maximum potential average annual soil loss due sheet and rill erosion in Morocco, [w:] Assesing Soil Degradation. FAO Soil Bulletin 34, Rome: 39-48 Górski D., Banasik K., 1992. Rozkłady prawdopodobieństwa erozyjności deszczy dla Polski południowo-wschodniej. Zesz. Nauk. AR Kraków, Sesja Naukowa 35, 271: 125-131 Józefaciuk A., Józefaciuk Cz. 1992. Struktura zagrożenia erozją wodną fizjograficznych krain Polski. Pamiętnik Puławski, 101, 23-49 Koreleski K., 1992. Próby oceny natężenia erozji wodnej. Zesz. Nauk. AR w Krakowie, Sesja Naukowa, z. 35:25-32 Licznar P., 2005. Ocena możliwości stosowania sztucznych sieci neuronowych dla określenia średniej rocznej wartości wskaźnika erozyjności deszczy. ���������� Acta Agrophisica, 5(1):65-74 Marks R., Müller M.J., Leser H., Klink H.J., 1989. Anleitung zur Bewertung des Leistungvermögens des Landschaftshaushaltes (BA LVL). Forschungen zur Deutschen Landeskunde Band 229, Zentralaussuss für deutsche Landeskunde, Selbstverlag, Trier. Mc Cool D.E., Foster G.R., Mutchler C.K., Meyer L.D., 1989. Revised slope length factor for the Universal Soil Loss Equation. Trans. ASAE, 32:1571-1576 Renard K.G., Foster G.R., Weesies G.A., Porter J.P., 1996. RUSLE: Revised Universal Soil Loss Equation. Journal od Soil and Water Conservation, 46(1):30-33 74 Ocena zagrożenia erozją wodną zlewni potoku Smugawka... Renard K.G., Foster G.R., Weesies G.A.,McCool D.K., Yoder D.C., 1997. Predicting soil erosion by water: a guide to conservation planning with the revised Universal Soil Loss Equation (RUSLE). USDA, Agricultural Handbook, 703 Stone R.P., Hilborn D., 2000. Universal soil loss equation (USLE). Ontario: Min. Agricult. Food Rural Affairs Wischmeier W.H., Smith D.D. 1978. Predicting Rainfall erosion losses – a guide to conservation planning; Supersedes Agriculture Handbook No.282; Washington, 4-11. Żmuda R., Sasik J., Szewrańska Sz. 2005. Analiza potrzeb zmian zagospodarowania przestrzennego wzgórz trzebnickich w aspekcie ochrony przed erozją wodną gleb. Acta Agrophysica 5 (1), 229-237, Wrocław Adres do korespondencji: dr inż. Marek Ryczek, mgr inż. Edyta Kruk, mgr inż. Kamila Dedio Katedra Rekultywacji Gleb i Ochrony Torfowisk Wydział Inżynierii Środowiska i Geodezji Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krzysztof Boroń 75 Anna Lehmann Marta Jabłońska Magdalena Giemza-Mikoda EPISTEME 14/2012 s. 77-83 ISSN 1895-4421 WALORY PRZYRODNICZE PARKU PRZYPAŁACOWEGO W WOLSZTYNIE NATURAL VALUES OF THE PALACE PARK IN WOLSZTYN Abstrakt. Województwo wielkopolskie słynie z dużej ilości pałaców i towarzyszącym im parków, które w wielu przypadkach zachowały się w dobrym lub nawet bardzo dobrym stanie. Park Miejski w Wolsztynie uważany jest za jedno z najciekawszych, pod względem przyrodniczym i historycznym, założeń ogrodowych istniejących na terenie powiatu wolsztyńskiego. Informacje na temat bogactwa taksonomicznego gminy Wolsztyn doczekały się swoich publikacji. Niestety szczegółowe dane dotyczące flory Parku Miejskiego zostały w nich pominięte. Nieliczne z pojawiających się wzmianek dotyczących zieleni kompleksu pałacowego są ogólnikowe i nie odzwierciedlają pełnej różnorodności badanego obiektu. Celem publikacji jest przedstawienie walorów przyrodniczych Parku Miejskiego w Wolsztynie, czyli zobrazowanie bogactwa flory występującej na badanym terenie. Ze względu na znaczne rozmiary parku pałacowego, przy pracach badawczych wzięto pod uwagę wyłącznie pewną jego część. W pracy określono również stopnie synantropizacji, a także wymagania siedliskowe gatunków, przyporządkowanych do odpowiednich klas. Słowa kluczowe: gatunki chronione, klasy fitocenotyczne, pomniki przyrody, rodziny botaniczne, status synantropizacji, wymagania siedliskowe Summary. Wielkopolskie province is famous for its large amount of palaces and accompanying parks, many of which are preserved in good or very good condition. City Park in Wolsztyn is regarded as one of the most interesting, in terms of natural and historical assumptions of the existing garden area of the district Wolsztyn. Information on taxonomic richness of Wolsztyn are comprised in some publications. Unfortunately, data on the flora of Town Park were omitted. Few mentions on palace greenery complex are vague and do not express the whole diversity of test object. The purpose of paper is presentation of environmental values of the City Park in Wolsztyn, which illustrates the richness of flora occurring in the investigated area. Due to the large size of the palace park, during research work the only a part of it was examined. In the paper also degrees of synanthropisation and habitat requirements of species assigned to the respective classes were determined. Key words: botanical family, class phytocenotic, habitat requirements, natural monuments, protected species, synanthropisation status 77 Anna Lehmann, Marta Jabłońska, Magdalena Giemza-Mikoda WSTĘP Parki przypałacowe uznawane są za cenne obiekty przyrodnicze oraz interesujące elementy krajobrazu miast i wsi. Pełnią one wiele funkcji, zarówno estetycznych jak i poznawczych. Wspomniane założenia, wykorzystujące naturalność otaczającego je krajobrazu, cechują się roślinnością urządzoną oraz rozwiniętą infrastrukturą wypoczynkową. Tereny zieleni miejskiej, dzięki szczątkowo stworzonej i zachowanej strukturze przyrodniczej, zdolne są do pełnienia funkcji ekologicznych. Jako najważniejsze wymienia się: funkcje ekologiczne gleb, klimatyczne, hydrologiczne, a także biotyczne oraz pochłaniania zanieczyszczeń. Wytwarzające się między nimi zależności mają znaczący wpływ na najbliższe środowisko [Szumacher 2005]. Dzięki dużej liczbie roślin i zwierząt, parki odgrywają bardzo ważną rolę w zachowaniu bioróżnorodności. Obszary te stanowią nierzadko miejsca gniazdowania licznego ptactwa, a ich teren porasta wiele okazałych drzew, które można uznać za pomniki przyrody. W granicach zieleni miejskiej zachowały się również zbiorowiska roślinne, których nie sposób spotkać w najbliższym sąsiedztwie [Latowski, Zieliński 2001]. Zarówno współczesne jak i historyczne ukształtowane założenia ogrodowe odpowiedzialne są za proces neofityzacji rodzimej flory. Jako „otwarte” wyspy zieleni stanowią one dynamiczne układy oddziaływujące na środowisko. Wymiana diaspor między parkami, a otaczającymi je obszarami wpływa m.in. na kształtowanie się zasięgów geograficznych gatunków [Latowski, Zieliński 2001]. Park Miejski w Wolsztynie założony został na przełomie XVII i XVIII wieku, na bazie pierwotnego lasu, który istniał na przesmyku między dwoma pobliskimi jeziorami. Większość starodrzewia stanowią przez to gatunki rodzime takie jak: dąb szypułkowy Quercus robur, lipa drobnolistna Tilia mordata i lipa szerokolistna Tilia platyphyllos, klon polny Acer campestre, czy klon jawor Acer pseudoplatanus. Najświetniejsze lata parku pałacowego przypadały na okres, gdy właścicielami majątku była rodzina Gajewskich. Osiągnął on wówczas formę regularnego założenia z okazałymi alejami grabowymi i lipowymi. Kolejni właściciele dóbr wolsztyńskich ograniczali swoją działalność do uzupełniania nasadzeń złożonych z ozdobnych drzew i krzewów. Po II wojnie park administrowany był przez zmieniające się firmy, które pielęgnowały tylko część znajdującą się najbliżej pałacu, pozostawiając pozostałe jego fragmenty bez opieki. W efekcie zginęły cenne odmiany cyprysików Chamaecyparis sp., żywotniki Thuja sp., brzoza Younga Betula pendula „Youngii”, a także wiele świerków Picea sp. oraz daglezje Pseudotsuga sp.. Sytuację pogorszono dodatkowo poprzez wprowadzenie nasadzeń złożonych z topoli, jesionów oraz klonów jesionolistnych. Od 1993 roku na terenie parku prowadzone są prace porządkujące mające na celu przebudowę struktury gatunkowej istniejącego drzewostanu [Mikołajczak 2000]. 78 Walory przyrodnicze parku przypałacowego w Wolsztynie... Obecnie park ma powierzchnię 17,76 ha i poprzecinany jest dróżkami spacerowymi. Położony jest on w ścisłym centrum Wolsztyna. Od południa i wschodu jego granice wyznaczane są przez zabudowę miejską. W północnej i zachodniej części krańce analizowanego założenia ogrodowego stanowią brzegi jeziora. Opisywany obiekt cechuje się nieregularnym kształtem oraz płaską powierzchnią. MATERIAŁ I METODY Celem publikacji jest przedstawienie walorów przyrodniczych Parku Miejskiego w Wolsztynie, czyli zobrazowanie bogactwa flory występującej na badanym terenie. Prace terenowe przeprowadzone zostały w latach 2010 - 2011. Ze względu na znaczne rozmiary parku pałacowego, wzięto przy nich pod uwagę wyłącznie pewną jego część. Przy wyborze kwater kierowano się bogactwem i różnorodnością składu gatunkowego występującego na ich terenie. Wydzielono w ten sposób cztery reprezentatywne powierzchnie badawcze. Okazy porastające omawiane obszary oznaczano przy pomocy specjalistycznych kluczy oraz atlasów. W pracy określono również stopnie synantropizacji, a także wymagania siedliskowe gatunków, przyporządkowanych do odpowiednich klas. WYNIKI Na badanym obszarze oznaczono 178 gatunków, w tym 53 drzewa i krzewy, 121 roślin zielnych, 3 paprocie oraz 1 skrzyp. Najbardziej urozmaiconym fragmentem Parku Miejskiego okazała się część związana z wodami Jeziora Wolsztyńskiego w pobliżu której odnotowano wystąpienie niewielkiego fragmentu podmokłego terenu, na którym wytworzył się ols. Najuboższy, pod względem liczebności gatunkowej, fragment analizowanego założenia ogrodowego związany jest z najbliższym otoczeniem pałacu, na który składają się w decydującej mierze gatunki dekoracyjne. Na podstawie obserwacji składu gatunkowego analizowanych sektorów, w oparciu o liczby wskaźnikowe [Zarzycki i in. 2002], określono wymagania siedliskowe, preferowane przez porastające je osobniki. Niestety dla kilku taksonów występujących na terenie Parku Miejskiego nie udało się podać charakterystycznych dla nich wartości. W większości były to gatunki obcego pochodzenia, które na omawiany obszar sprowadzono ze względu na ich walory estetyczne – 20 gatunków. W oparciu o analizy, najczęściej występujących wartości wskaźnika świetlnego, ustalono, iż na badanym obszarze dominują gatunki preferujące półcień. Stanowią one 75% wszystkich taksonów, a więc występują na trzech z czterech wytypowanych części. Jedynie rośliny porastające brzegi Jeziora Wolsztyń79 Anna Lehmann, Marta Jabłońska, Magdalena Giemza-Mikoda skiego oraz wydzieloną „olszynkę” wolą umiarkowany cień (25%). Na podstawie, najczęściej występującej wartości wskaźnika troficznego, uznano iż na objętych badaniami powierzchniach dominują gleby zasobne (eutroficzne). Charakteryzują się one odczynem obojętnym, mieszczącym się w przedziale 6≤pH<7. Na wszystkich przebadanych powierzchniach dominującą wartość wskaźnika kwasowości stanowiła liczba 4. Skład gatunkowy wytyczonych sektorów wskazuje, iż tworzące je utwory należą do gleb świeżych, bowiem na wszystkich powierzchniach dominował wskaźnik wilgotności równy 3. Spośród wszystkich gatunków porastających analizowane sektory Parku Miejskiego najwięcej, bowiem aż 5% należały do rodziny złożonych Asteraceae, turzycowatych Cyperaceae, wiechlinowatych Poaceae oraz wargowych Lamiaceae. Analiza stopnia synantropizacji parku wykazała, iż wśród wszystkich rozpoznanych roślin gatunki niesynantropijne stanowią większość. Na drugim miejscu pod względem ilościowości uplasowały się apofity, których najwięcej odnotowano w części porośniętej bluszczem (23 taksony). Największą liczbę kenofitów, bowiem aż 8, również zaobserwowano na wyżej wspomnianym terenie. Spośród wszystkich rozpoznanych gatunków najmniej należało do archeofitów – tylko 4 osobniki. Wyniki te świadczą o dużej naturalności analizowanego założenia. Część parku Gatunek I II III IV bluszcz pospolity, Hedera helix + + + grążel żółty, Nuphar lutea + grzybienie białe, Nymphaea alba + OCHRONA ŚCISŁA przylaszczka pospolita, Hepatica triloba + śniadek baldzaszkowaty, Ornithogalum umbellatum + + + śnieżyczka przebiśnieg, Galanthum nivalis + + + OCHRONA CZĘŚCIOWA konwalia majowa, Convallaria majalis + kopytnik pospolity, Asarum europaeum + + kruszyna pospolita, Frangula alnus + + porzeczka czarna, Ribes nigrum + Tab. 1. Gatunki objęte ścisłą i częściową ochroną prawną 80 Walory przyrodnicze parku przypałacowego w Wolsztynie... O walorach przyrodniczych Parku Miejskiego świadczy także ilość występujących na jego terenie gatunków, które objęte zostały ochroną prawną. W myśl Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 9 lipca 2004 r. w sprawie gatunków dziko występujących roślin objętych ochroną (Dz. U. z dnia 28 lipca 2004 r.) na analizowanym obszarze udokumentowano 10 chronionych taksonów (Tab. 1). Na obszarze Parku Miejskiego, w oparciu o literaturę [Żukowski i in. 1995], stwierdzono również występowanie gatunków rzadkich i przez to potencjalnie zagrożonych (Tab. 2). Gatunek / Część parku I II III IV klon polny, Acer campestre + + topola czarna, Populus nigra + + + zdrojówka rutewkowata, Isopyrum thalictroides + Tab. 2. Gatunki rzadkie i przez to potencjalnie zagrożone na terenie Wielkopolski. Źródło: Żukowski i in. 1995 Park w Wolsztynie jest starym założeniem, dlatego też w jego granicach znajduje się wiele okazałych drzew, którym należy się status pomnika przyrody. Aby drzewo zostało uznane za pomnik przyrody musi ono spełniać określone kryteria. Jego obwód w pierśnicy powinien być większy niż szacunkowe wartości minimalne dla danego gatunku. W oparciu o dane literaturowe [Mikołajczak 2000] na terenie parku zlokalizowano sześć okazów, które spełniają to kryterium, a są nimi: • dąb szypułkowy Quercus robur numer 461 o obwodzie 420 cm i wysokości 28 m, znajdujący się poza analizowanymi sektorami, • topola kanadyjska Populus x canadensis numer 462 o obwodzie 490 cm i wysokości 30 m, porastająca teren usytuowany najbliżej pałacu, • dąb szypułkowy Quercus robur numer 463, tzw. „Dąb Marcina Rożka” o obwodzie 420 cm i wysokości 30 m, rosnący na powierzchni III z wybranych sektorów, • miłorząb dwuklapowy Ginkgo biloba numer 678 o obwodzie 150 cm i wysokości 19 m, zlokalizowany w najbliższym sąsiedztwie pałacu, • dąb szypułkowy Quercus robur numer 708 o obwodzie 440 cm i wysokości 27 m, rosnący tuż przy parkingu należącym do pałacu, • buk pospolity Fagus sylvatica numer 709 o obwodzie 360 cm i wysokości 28 m, związany z otoczeniem pałacu. Na analizowanym terenie stwierdzono również występowanie gatunków roślin uznawanych za lecznicze – 69 okazów. Zaliczono do nich zarówno drzewa jak i krzewy. 81 Anna Lehmann, Marta Jabłońska, Magdalena Giemza-Mikoda DYSKUSJA I WNIOSKI Park Miejski w Wolsztynie charakteryzuje się dużym bogactwem florystycznym oraz różnorodnością występujących tam form. Najliczniej reprezentowaną grupę stanowią rośliny zielne, z których aż 7 gatunków objętych jest ochroną prawną. Ze względu na ciekawą historię oraz przebogatą faunę opisane założenie uważane jest za jeden z najbardziej interesujących obiektów architektoniczno-krajobrazowych powiatu. Różnorodna infrastruktura turystyczna zespołu pałacowo-ogrodowego sprawiła, iż jest to miejsce, w którym zarówno turyści jak i mieszkańcy miasta chętnie spędzają swój wolny czas. Szata roślinna Parku Miejskiego jest bardzo zróżnicowana. Wpływ na nią ma przede wszystkim rzeźba terenu oraz stosunki wodne i glebowe. Dzięki współwystępowaniu ze sobą różnych siedlisk drzewostan parkowy należy do bardzo różnorodnych. Różnice w strukturze zadrzewień i zakrzewień poszczególnych sektorów powstały najprawdopodobniej podczas przystosowywania pierwotnie istniejącego na tym terenie lasu do warunków parkowych. Zapewne wówczas nasadzone zostały ozdobne krzewy oraz unikatowe drzewa, które miały wzbogacić otoczenie pałacu. Na terenie omawianego obiektu spotkać można przedstawiciela roślin reliktowych. Jest nim, sprowadzony w celach dekoracyjnych, miłorząb dwuklapowy Ginkgo biloba, który usytuowany został w najbliższym otoczeniu pałacu. Rośliny zielne stanowią zaś najliczniejszą grupę ukazującą różnorodność parkowej flory. Należą do nich zarówno gatunki typowe dla siedlisk suchych i nasłonecznionych, jak również podmokłych i zacienionych. 82 Walory przyrodnicze parku przypałacowego w Wolsztynie... LITERATURA Latowski K. Zieliński J. 2001. Parki wiejskie – wybrane zagadnienia geobotaniczne i kulturowe. Szata roślinna Wielkopolski i Pojezierza Południowopomorskiego. Przewodnik sesji terenowych 52. Zjazdu PTB, 292-296. Matuszkiewicz W. 2006. Przewodnik do oznaczania zbiorowisk roślinnych Polski. Wydawnictwo Naukowe PWN. Mikołajczak E. 2000. Przyroda ziemi wolsztyńskiej. Wydawnictwo „Biblioteka”. Szumacher I. 2005. Funkcje ekologiczne parków miejskich. Prace i Studia Geograficzne, 36: 107-108. Zając A. Zając M. Tokarska-Guzik B. 1998. Kenophytes in the flora of Poland: list, status and ogigin. PHYTOCOENOSIS Vol. 10 (N.S). Supplementum Cartographae Geobotanicae 9, 108-109. Zając E.U. Zając A. 1975. Lista archeofitów występujących w Polsce. Zeszyty naukowe Uniwersytetu Jagiellońskiego. Prace Botaniczne, 3: 9-12. Zając M. Zając A. 1992. Prowizoryczna lista apofitów segetalnych i ruderalnych w Polsce. Zeszyty naukowe Uniwersytetu Jagiellońskiego. Prace Botaniczne, 24: 10-15. Zarzycki K. Trzcińska-Tacik H. Różański W. Szeląg Z. Wołek J. Korzeniak U. 2002. Ekologiczne liczby wskaźnikowe roślin naczyniowych Polski. Wydawnictwo IB PAN. Żukowski W. Jackowiak B. 1995. Ginące i zagrożone rośliny Pomorza Zachodniego i Wielkopolski. Prace Zakładu Taksonomii Roślin UAM w Poznaniu. Bogucki Wydawnictwo Naukowe. Adres do korespondencji: mgr inż. Anna Lehmann, mgr inż. Marta Jabłońska, mgr inż. Magdalena Giemza-Mikoda Katedra Kształtowania Argoekosystemów i Terenów Zieleni Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu pl. Grunwaldzki 24a, 50-363 Wrocław e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Wiesław Wojciechowski prof. dr hab. inż. Leszek Kordas, prof. dr hab. inż. Lesław Zimny 83 Małgorzata Leja Agnieszka Hawryło EPISTEME 14/2012 s. 85-91 ISSN 1895-4421 WALORYZACJA HYDROMORFOLOGICZNA NA PRZYKŁADZIE ODCINKA RZEKI WISŁOKI OD MOKRZCA DO PUSTKOWA HYDROMORPHOLOGICAL EVALUATION OF THE WISŁOKA RIVER SECTION FROM MOKRZEC TO PUSTKÓW Abstrakt. Niniejsza praca podejmuje problem waloryzacji hydromorfologicznej tj. elementu wyznaczania stanu ekologicznego cieków w ramach obowiązujących w UE przepisów. W artykule przedstawiono wyniki oceny hydromorfologicznej 30-kilometrowego odcinka Wisłoki wg normy EN-PN 14614 na podstawie, której wykazano wpływ budowli hydrotechnicznych na jakość hydromorfologiczną rzeki. Uzyskano duże zróżnicowanie klas jakości hydromorfologicznej na rozpatrywanym odcinku. Odcinki wysoko ocenione występują na obszarze Natura 2000 co wskazuje na ich wartość ekologiczną. Z drugiej strony te same stanowiska znajdują się w JCWP o silnie zmienionej morfologii. Z wyników można wnioskować, że wpływ przegród poprzecznych występujących w korycie na morfologię cieku zanika wraz z oddalaniem się od nich. Słowa kluczowe: potencjał ekologiczny, waloryzacja hydromorfologiczna, budowle hydrotechniczne Summary. This paper addresses the problem of hydromorphological evaluation – assessing of the ecological status of river according to EU legislation. The paper presents results of hydromorphological assessment of 30-kilometer section of Wisłoka made according to EN-PN-14614 and demonstrates the impact of hydraulic structures on the hydromorphological quality of the river. Obtained large variation of hydromorphological quality classes in the research section. The sections which are rated highly, are located in a Natura 2000 what indicates their ecological value. On the other hand, these sections are located in a heavily modified SWB. From the results, it can be concluded that the influence of weirs on stream morphology decreased with distance from them. Key words: ecological potential, hydromorphological evaluation, hydraulic structures 85 Małgorzata Leja, Agnieszka Hawryło WSTĘP Ocena hydromorfologicznej jakości rzeki wspomaga ocenę biologiczną stanu ekologicznego zgodnie z wymaganiami Ramowej Dyrektywy Wodnej [RDW]. Załącznik V RDW wymienia następujące niezbędne elementy hydromorfologiczne: reżim hydrologiczny, ciągłość rzeki (wraz z terenami lądowymi zależnymi od rzeki) oraz warunki morfologiczne(zmienność głębokości i szerokości strumienia, struktura i skład podłoża oraz struktura strefy nadbrzeżnej). Zakres oceny hydromorfologicznej został ujednolicony przez Europejski Komitet Normalizacji [CEN 2002].W ramach projektu: „Przywrócenie drożności korytarza ekologicznego rzeki Wisłoki i jej dopływów”, dotyczącego poprawy struktury siedlisk dla ryb poniżej jazu w Mokrzcu wykonano ocenę morfologiczną odcinka. Celem pracy jest wykazanie wpływu budowli hydrotechnicznych na jakość hydromorfologiczną rzeki. MATERIAŁ I METODY Ocenę stanu ekologicznego wykonano w korycie rzeki Wisłoka, jest to prawobrzeżny dopływ Wisły o długości ok. 160 km i powierzchni zlewni ponad 40 tys. km2. Na tym obszarze rzeka płynie po piaszczystych terenach rolniczych. Piaszczysto- żwirowe dno Wisłoki obniżało się od lat pięćdziesiątych do dziewięćdziesiątych od 5 do 9 cm na rok, natomiast w ostatnich dwudziestu latach intensywność tego procesu się znacznie zmniejszyła. [Galarowski, Klimek 1991; Wyżga 2008a]. Obecność łach żwirowych w korycie świadczy o występowaniu transportu rumowiska dennego, natomiast materiał piaszczysty jest transportowany w formie unosin. Wisłoka w opisywanym biegu jest jedną z trzech rzek o największym ładunku unosin [Klimek, Łajczak, 1991]. Waloryzacji hydromorfologicznej poddano około trzydziestokilometrowy odcinek rzeki między Mokrzcem (km 73+120) a Pustkowem (km 42+560) (Rys. 1). W zlewni wymienionego odcinka Wisłoki w ramach programu Natura 2000 wyodrębniony został Obszar o Znaczeniu Wspólnotowym (OZW) o nazwie „Dolna Wisłoka z dopływami” (PLH180053). Do tego obszaru zalicza się bezpośrednio dwa odcinki cieku: od ujścia lewostronnego dopływu –potoku Chotowskiego (km 67+120) do ujścia Czarnej (km 57+090) oraz od ujścia Wielopolki (km 45+590) do Pustkowa. Obszar Natura 200 ustalony w 2009 roku występuje na długości ok. 43% rozpatrywanego odcinka. Siedliska występujące na tym obszarze to w przeważającej części lasy łęgowe obejmujące łęgi wierzbowe, połączone z ziołoroślami nadrzecznymi i pozostałościami wielkich kęp łęgu topolowego [GDOŚ 2001]. Według klasyfikacji scalonych Jednolitych Części Wód Powierzchniowych (JCWP) opracowanej przez RZGW w Krakowie [2008] badany odcinek znajduje się w obrębie trzech JCWP, które określone zostały jako Silnie Zmienione JCWP. 86 Waloryzacja hydromorfologiczna na przykładzie... Według wspomnianego dokumentu hydrologia i morfologia badanego odcinka do ujścia potoku Chotowskiego (km 67+120) są silnie zmienione, co jest spowodowane wpływem zbiornika Klimkówka oraz stopniami uniemożliwiających wędrówkę ryb. Na kolejnym odcinku do ujścia Rzeki (km 49+570) morfologia pozostała silnie zmieniona, czego przyczyną są obwałowania oraz zabudowa podłużna na długim odcinku. Hydrologia od tego miejsca aż do końca opisywanego odcinka została zaklasyfikowana jako naturalna o stanie ekologicznym złym, słabym lub umiarkowanym. Natomiast pod względem morfoloigcznym dopiero część badanego odcinka poniżej ujścia Rzeki (km 49+570) została zakwalifikowana jako naturalna o stanie ekologicznym złym, słabym lub umiarkowanym, na co złożyły się takie czynniki jak: obwałowania oraz zabudowa podłużna ograniczająca różnorodność siedliska dla ryb i bezkręgowców [RZGW 2008]. Na opisywanym odcinku Wisłoki występuje pięć mostów oraz dwie przegrody: jaz w Mokrzcu (km 73+320) oraz stopień w Dębicy (km 57+850). Ocena hydromorfologiczna została wykonano wg EN-PN 14614 [CEN 2002]. Na opisanym wyżej obszarze wybrano 10 jednolitych odcinków rzeki o różnej morfologii, długości od ok. 150-350 m oraz jeden odcinek referencyjny zlokalizowany w miejscowości Pustków (Rys. 1). Do wyboru stanowiska referencyjnego przyjęto założenie, że jest to naturalny lub bliski naturze odcinek cieku z dopuszczalną presją, która ma jedynie nieznaczny wpływ na występujące ekosystemy wodne i wodno-lądowe [Czoch i Kulesza 2006]. Rys. 1. Odcinek Wisłoki od Mokrzca do Pustkowa Wszystkie wybrane stanowiska zostały ocenione wg wskazań ww. normy. Oceniono stopień naturalności dla 10 kategorii cech, część z nich dotyczy koryta (1-6), a część terenów zalewowych (7-10). Wzięto również pod uwagę wskazówki Wyżgi i in. [2008], który z zespołem oceniał rzekę górską. Wskazówki dotyczą: oceny roślinności (włączono występowanie roślinności lądowej w korycie rzeki); stopnia naturalności reżimu oraz hydrauliki przepływu w rzece, które uzupełniono o stopień łączności wód rzecznych z wodami krążącymi w aluwiach. 87 Małgorzata Leja, Agnieszka Hawryło WYNIKI I DYSKUSJA Średnia ocena hydromorfologiczna została obliczona jako średnia arytmetyczna ocen 10 (12 liczb) kategorii określonych w skali: od 1 – bardzo dobry stan, do 5 – stan bardzo silnie zmieniony (Tab. 1). Na podstawie średniej przypisano poszczególnym odcinkom klasy jakości hydromorfologicznej zgodnie z klasyfikacją zaproponowaną przez Wyżgę i in. [2008]: ocena 1–1,79 – jakość bardzo dobra (klasa 1); ocena 1,8–2,59 – jakość dobra (klasa 2); ocena 2,6–3,39 – jakość umiarkowana (klasa 3); ocena 3,4–4,19 – jakość słaba (klasa 4); ocena 4,2–5 – jakość zła (klasa 5). Wybór odcinka referencyjnego był poprzedzony wizją terenową oraz przestudiowaniem dokumentacji wykonanej w ramach programu ochrony siedlisk Natura 2000. Stanowisko wybrane jako referencyjne reprezentuje wyżej opisane siedliska łęgowe na terasach zalewowych rzeki natomiast bezpośrednio w korycie: rzadki typ siedliska stanowi łacha żwirowa na prawym brzegu, która przy niskim stanie wody zajmująca większą część koryta rzeki [GDOŚ 2001]. Odsypisko przy wyższym stanie rozdziela nurt poniżej bystrza i tworzy łachę śródkorytowa porośnięta kępami wierzby wąskolistnej oraz roślinnością trawiastą. Uziarnienie żwirowiska nie jest jednolite, na początku łachy występuje materiał kamienisty, natomiast za kępami wierzb, osadzony jest piasek. Ponadto, na łasze występują liczne ziarna ponadwymiarowe, które wzbogacają ten odcinek pod względem różnorodności siedlisk organizmów wodnych [Wyżga i in. 2003]. Pierwszy odcinek został zlokalizowany tuż poniżej jazu w Mokrzcu (km 73+324), który stanowi poprzeczną przegrodę w korycie uniemożliwiającą swobodną migrację organizmów wodnych (przepławka zlokalizowana przy budowli nie funkcjonuje). Jaz również zaburza reżim hydrologiczny oraz proces transportu rumowiska. Bardzo podobna sytuacja ma miejsce na odcinku 6 (km 57+500), gdzie budowlą poprzeczną jest stopień wodny w Dębicy. Na tym odcinku ocena jest dodatkowo obniżona ze względu na zmienioną geometrię koryta i zabudowę miejską na terenach przyległych do koryta. Spośród ocenionych sekcji tylko ta została zaklasyfikowana do 5 klasy, która oznacza złą jakość hydromorfologiczną. Słaby stan hydromorfologiczny również został zidentyfikowany dla odcinka 8, w którym geometria koryta jak i reżim hydrologiczny zostały zmienione ze względu na umiejscowienie wylotu oczyszczalni ścieków z miasta Dębica. Zróżnicowanie prędkości nie było widoczne na rozpatrywanym odcinku. Stanowisko 10 znajduje się tuż poniżej mostu w Brzeżnicy, gdzie zabezpieczenie konstrukcji mostu wymagało ubezpieczenia podłużnego brzegów jak i zmianę geometrii koryta. Sekcja ta pomimo tego, że znajduje się już w zasięgu JWCP o naturalnej morfologii 88 Waloryzacja hydromorfologiczna na przykładzie... Stopień przekształcenia Odcinek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Kilometr rzeki (środka odcinka) 73+120 71+680 68+235 64+890 61+300 57+620 56+990 55+680 54+570 48+380 42+560 Kategoria oceny Geometria cieku 1.a. 4 4 1.5 1 1 5 3 5 3 5 1 Nr 1 1.b. 2 4 2 1.5 1 5 4 5 4 4 2 2 Materiał budujący dno koryta 3 4 2.5 2 1.5 4 2 3 3.5 3 1 3 Roślinność w korycie, rumosz drzewny 3 3 4 2 2 2.5 3 3 3.5 2.5 1 4 Erozja i depozycja 5 3 1.5 2 1.5 5 2 3 2.5 3 2 Przepływ 5.a. zróżnicowanie v i h 2 2.5 1.5 3 1 4 3 4 4 4 1 5.b. reżim hydrologiczny 5 2.5 1.5 2.5 1 5 3 5 3.5 3 1 6 Wpływ zabudowy hydrotechnicznej na ciągłość potoku 5 3 2 2.5 2 5 3 3 2.5 3 2 7 Charakter brzegów i ich modyfikacje 4 5 3 2.5 2 4 4 4 3 4 2.5 8 Typ roślinności nadbrzeżnej oraz roślinność terenów przyległych 3 5 4 3 2 4 3.5 3.5 2 3 3 9 Użytkowanie obszaru zalewowego i inne 3 4 4 2.5 2 5 4 4.5 2.5 3.5 2 10 Stopień łączności oraz mobilność 4 5 3.5 4 4 5 5 5 4 5 2.5 2.38 1.75 4.46 3.29 4.00 3.17 3.58 1.75 2 1 5 3 4 3 4 1 5 średnia ocena 3.58 3.75 2.58 klasa jakości hydromorfologicznej 4 4 2 Tab. 1. Wyniki waloryzacji hydromorfologicznej Na wykresie znajdującym się na Rys. 2 widać duże zróżnicowanie pomiędzy ocenami poszczególnych odcinków oraz dwie wyraźne tendencje: pierwszą od odcinka 1(km 73+120) do 5 (km 61+500), oraz drugą od odcinka 6 (km 57+750) do odcinka 11 (km 42+560). W obu przypadkach poprawę stanu hydromorfologicznego można przypisać oddalaniu się od budowli poprzecznych w korycie. 89 Małgorzata Leja, Agnieszka Hawryło Rys. 2. Średnia ocena jakości hydromorfologicznej Poprzeczna i podłużna geometria cieku ulegają wyraźnemu pogorszeniu poniżej stopnia w Dębicy. Najgorzej ocenionym parametrem jest stopień łączności koryta oraz jego mobilność. Głęboko wcięte koryto uniemożliwia migrację cieku w układzie poziomym oraz ogranicza łączność z terenami zalewowymi. Większa część ocenianych kategorii wykazuje trendy zgodne ze średnią oceną stanowisk. Jedynie ocena obecności roślinności w korycie cieku ma odmienny przebieg, podnosząc średnią ocenę. Stanowisko od 1 do 9 należą do JCWP o silnie zmienionej morfologii. Zdawać by się mogło, że nie mogą przedstawiać funkcjonalności ekologicznej, jednak trzy kolejne odcinki (3,4 i 5) wg oceny hydromorfologicznej należą do pierwszej bądź drugiej klasy jakości pod względem morfologii. Potwierdzeniem ich dobrego stanu jak i poprawności przeprowadzonej oceny jest fakt, że dwa z nich znajdują się bezpośrednio w programie ochrony siedlisk i gatunków Natura 2000 i zostały opisane jako cenne siedliska. WNIOSKI Wpływ budowli hydrotechnicznych zanika już w odległości 5 km od jej lokalizacji. Na obszarach zaklasyfikowanych jako JCWP silnie zmieniona pod względem morfologicznym mogą występować odcinki o wysokiej jakości hydromorfologicznej, uznane jako cenne również w ramach programu Natura 2000. Na obszarze JCWP o naturalnej morfologii nie wyklucza się wystąpienia długich odcinków prostych z bardzo obniżoną użytecznością ekologiczną. Pomimo występowania złego stanu hydromorfologicznego w górnym biegu cieku w jego dolnym odcinku nadal mogą występować sekcje o dobry lub nawet bardzo dobrym stanie. Może to wskazywać na tendencję do odtworzenia naturalnej hydromorfologii. 90 Waloryzacja hydromorfologiczna na przykładzie... LITERATURA CEN TC 230/WG 2/TG 5: N32. 2002. A Guidance standard for assessing the hydromorphological features of rivers. Czoch K. Kulesza K. 2006. Warunki referencyjne specyficzne dla typów cieków w Polsce jako podstawa do prac nad oceną ekologicznego stanu wód płynących. Infrastruktura i Ekologia terenów Wiejskich. PAN. Kraków. 25-36. Galarowski T. Klimek K. 1991. Funkcjonowanie koryt rzecznych w warunkach zagospodarowania. Dorzecze Górnej Wisły. red. Dynowska I. Maciejewski M. Warszawa-Kraków. 243. GDOŚ Europejska Sieć Ekologiczna Natura 2000 2001. url: http://natura2000.gdos. gov.pl/natura2000; [dostęp 01.02.2012] Klimek K. Łajczak A. 1991.Transport materiału dennego. Dorzecze Górnej Wisły. red. Dynowska I. Maciejewski M. Warszawa-Kraków. 249-254 PKN. 2008. PN EN 14614. Jakość wody. Wytyczne do oceny hydromorfologicznych cech rzek. Warszawa. RZGW 2008. Klasyfikacja Scalonych Jednolitych Części Wód Powierzchniowych. Kraków. Wyżga B. Kaczka R. Zawiejska J. 2003. Gruby rumosz drzewny w ciekach górskich-formy występowania, warunki depozycji i znaczenie środowiskowe. Folia Geographica. Vol. XXXIII-XXXIV. 117-138. Wyżga B. 2008a. Wcinanie się rzek polskich Karpat w ciągu XX wieku. Stan Środowiska rzek południowej Polski i możliwości jego poprawy-wybrane aspekty red. Wyżga B. IOP PAN. Kraków. 7-39. Wyżga B. Zawiejska J. Radecki-Pawlik A. Amirowicz A. 2008b. Ocena hydromorfologicznej jakości rzeki górskiej na przykładzie Czarnego Dunajca. Stan Środowiska rzek południowej Polski i możliwości jego poprawy-wybrane aspekty red. Wyżga B. Instytut Ochrony Przyrody PAN. Kraków. 103-118. Adres do korespondencji: mgr inż. Agnieszka Hawryło, mgr inż. Małgorzata Leja Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] Opiekunowie naukowi: prof. dr hab. inż. Wojciech Bartnik prof. dr hab. inż. Alicja Michalik, dr hab. inż. Leszek Książek 91 Agnieszka Listosz EPISTEME 14/2012 s. 93-99 ISSN 1895-4421 BIOMASA NADZIEMNA TRZCINNIKA PIASKOWEGO NA GRUNTACH ZDEGRADOWANYCH PRZY ZAKŁADACH AZOTOWYCH „PUŁAWY” S.A W KONTEKSCIE WYKORZYSTANIA NA CELE ENERGETYCZNE THE SUPERFICIAL BIOMASS OF WOOD SMALL-REED ON THE SOIL DEGRADED AT ZAKŁADY AZOTOWE „PUŁAWY” S.A. IN THE CONTEXT OF USING TO ENERGY PURPOSES Abstrakt. Trzcinnik piaskowy (Calamagrostis epigejos (L.) Roth), to gatunek pospolicie występujący zwłaszcza na niżu Polski. Opanowuje łatwo gleby piaskowe: nieużytki, grunty rolne na których zaniechano użytkowania, często występuje również w lasach wówczas, gdy nieprawidłowo prowadzone są powierzchnie odnowień. Celem badań było określenie ilości biomasy nadziemnej i wartości energetycznej trzcinnika piaskowego porastającego zdegradowane grunty przy Zakładach Azotowych „Puławy” S.A. Określono wysokość i suchą masę części nadziemnych trzcinniczyska oraz obliczono zagęszczenie łanu w gramach suchej masy na 1 dm3 objętości trzcinniczyska. Stwierdzono decydujący wpływ zagęszczenia na wielkość plonu biomasy nadziemnej. W latach 2005, 2007 i 2011 sucha masa trzcinnika, w przeliczeniu na 1 ha wynosiła, odpowiednio: 1,88; 3,08; 3,95 ton. Przyjmując wartość opałową 1 kg suchej masy trzcinnika na poziomie 16 MJ∙kg-1 – uzyskano wartość energetyczną plonu z 1 ha, w poszczególnych latach badań zawierającą się w przedziale od 30,1 do 63,2 GJ∙ha-1, średnio z trzech lat 47,5 GJ∙ha-1. Słowa kluczowe: biomasa, trzcinnik piaskowy, grunty zdegradowane Summary. The wood small-reed (Calamagrostis epigejos (L.) Roth) is a species commonly occurring especially in the Polish lowlands. It easily seizes sandy soils: wastelands, agricultural soils whose cultivation was halted, frequently occurs also in the forests when there are inappropriately led new plantations. The aim of the research was to ascertain the amount of aboveground biomass levels and the energy value of wood small-reed growing over the areas degraded at the Zakłady Azotowe “Puławy” S.A. The height and the dry mass of the superficial parts of the wood small-reed area were measured, and the canopy of density was calculated in grams dry mass per 1 dm3 volume of wood small-reed area. It was a decisive influence of the density on value aboveground biomass yield. In the years 2005, 2007 and 2011 the dry masses of reed, per hectare, were accordingly: 1,88; 3,08; 3,95 tonnes. By adopting the average fuel value of dry mass of reed at the level of 16 MJ∙kg-1 – obtained the energy value of a single hectare crop, during the years of the research containing in the range 30,1 and 63,2 GJ∙ha-1, an average of three year: 47,5 GJ∙ha-1. Key words: biomass, wood small-reed, degraded soil 93 Agnieszka Listosz WSTĘP Trzcinnik piaskowy to gatunek pospolity zwłaszcza na niżu Polski. Zaliczany jest do roślin o niewielkich wymaganiach siedliskowych. Jest światłolubny, ale występuje także w miejscach o umiarkowanym zacienieniu [Falkowski 1982]. Czyż i in. [2005] podkreślają ekspansywność tej trawy. Rozprzestrzenianiu jej sprzyjają niewielkie wymagania w stosunku do siedliska oraz właściwości allelopatyczne. Trzcinnik piaskowy opanowuje łanowo gleby piaskowe: nieużytki, grunty rolne na których zaniechano użytkowania, w lasach np. nieprawidłowo prowadzone powierzchnie odnowień. Jak podają Patrzałek i in. [2011], w siedliskach antropogenicznych, powstających na nieużytkach poprzemysłowych i zdegradowanych gruntach rolnych, jest on dominującym i długotrwałym komponentem zbiorowisk roślinnych. Podkreśla się, że trzcinnik piaskowy współcześnie zyskuje miano rośliny charakterystycznej dla stanowisk trudnych oraz nieużytków, a także ekstensywnych łąk i odłogowanych pól [Gorzelak 2004]. Kozłowski i Swędrzyński [2010] oraz Patrzałek i in. [2011] zwracają uwagę na możliwość pozyskiwania nadziemnych pędów trzcinnika piaskowego w aspekcie wykorzystania na cele energetyczne, w procesie spalania. Celem badań była ocena wielkości suchej masy części nadziemnych trzcinnika piaskowego na zdegradowanych, wylesionych glebach piaskowych przy Zakładach Azotowych „Puławy” S.A., pod kątem możliwości pozyskiwania biomasy na cele energetyczne. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano na zdegradowanych, wylesionych wydmach, po północno- wschodniej stronie Zakładów Azotowych „Puławy” S.A. Teren ten został wylesiony w latach 1968-1971 z powodu dewastacji ekosystemu leśnego przez imisje (głównie azotowe) i odwodnienie ujęciami wód podziemnych [Kowalkowski i in. 1999, Siuta 1987]. Występujące tu gleby to industroziemy i urbanoziemy wytworzone z utworów o składzie granulometrycznym piasku luźnego [Pranagal i Słowińska-Jurkiewicz 2007], przekształcone w efekcie zabiegów rekultywacyjnych: usuwanie karp drzew, ulepszanie przez dodawanie m.in. odpadów paleniskowych z węgla kamiennego, budowę dróg i instalacji podziemnych deszczowni. Według Hodary i Świcy [2007] gęstość tych gleb (w warstwie 0-35 cm) wynosiła 1,23-1,28 Mg∙m-3, porowatość ogólna 0,362-0,525 m3∙m-3, a przepuszczalność wodna była duża w warstwie 0-10 cm (7 m∙d-1) oraz bardzo duża w warstwie 25-35cm (22 m∙d-1). Jak podają Kowalkowski i in. [1999] gleby te charakteryzują się rozregulowaniem równowagi biochemicznej oraz zaburzonym obiegiem składników pokarmowych. Pogorszeniu ule94 Biomasa nadziemna trzcinnika piaskowego na gruntach zdegradowanych... gła również zdolność zatrzymywania wód opadowych. Procesy niszczenia gleb wzmagane są głębokim odwodnieniem, będącym skutkiem eksploatacji systemu ujęć głębinowych, zainstalowanych na wydmach. Według Falkowskiej i Filipka [2009] gleby w pobliżu Zakładów charakteryzują się silnym zakwaszeniem, związanym z dużą imisją związków o charakterze kwasotwórczym. Falkowska i Filipek [2009] zwracają uwagę na dużą zmienność (sezonowa i zależne od głębokości) zawartości mineralnych form azotu, szczególnie N-NO3: 5,6-65,1 mg∙kg-1 w warstwie 0-5 cm i 0,1-65,6 mg∙kg-1, w warstwie 5-20 cm. Według Bielińskiej i Domżała [2007] gleby w strefie wylenionej przy Zakładach w warstwie 5-20 cm cechuje odczyn bardzo kwaśny (pH 3,4-4,3), mała pojemność sorpcyjna (6 mmol H+∙kg-1), zawartość C org. 0,92%, stosunek C:N – 18 oraz zawartość: N-NH4 około 65 mg∙kg-1, N-NO3: około 12 mg∙kg-1, P 13 mg∙kg-1, K 20 mg∙kg-1, Mg 5,5 mg∙kg-1. Obszar na którym prowadzono badania – około 100 ha wydm dostępnych do zbioru maszynowego (deniwelacje terenu do 15 m)– jest pokryty wieloletnim trzcinniczyskiem. Lokalnie w łanie trzcinnika występuje domieszka innych roślin zielnych, z reguły nie przekraczająca 10 % w pokryciu powierzchni. Do analiz ilościowych i jakościowych biomasy nadziemnej trzcinnika wykorzystano wyniki badań własnych wykonanych w 2011 r. oraz wyniki badań z roku 2005 [Węgorek 2006] i niepublikowane z 2007 r. Próby pobierano w październiku, w 2005 r. z 5 stanowisk, w 2007 z 6, a w 2011 z 14. Rośliny ścinano na wysokości około 5 cm nad ziemią, z powierzchni 1 m2, w 3 powtórzeniach. Określono suchą masę po wysuszeniu w temperaturze 105 °C – metodą suszarkową, a następnie przeliczono na 1 ha. W latach 2005 i 2011 w każdym stanowisku mierzono wysokość roślin łatą mierniczą, z dokładnością do 5 cm, w celu obliczenia zagęszczenia łanu (runi). Obliczając zagęszczenie roślin na stanowiskach w gramach suchej masy na dm3 dzielono plon suchej masy z 1 m2 przez objętość porostu roślinnego na danym stanowisku. Wyniki pomiarów przy pomocy programu Excel podano analizie statystycznej. Oznaczono związki korelacyjne pomiędzy wielkością plonu, a zagęszczeniem łanu oraz między wielkością plonu, a wysokością. Istotność współczynnika korelacji sprawdzono przy pomocy testu t-Studenta (dla poziomu istotności α=0,05). WYNIKI I DYSKUSJA Zróżnicowanie trzcinniczyska pod względem zagęszczenia oraz wysokości było bardzo duże (Rys. 1). Zagęszczenie oraz wysokość trzcinnika piaskowego w latach 2005 i 2011, w poszczególnych stanowiskach kształtowało się odpowiednio na poziomie: 0,21 g·dm-3 i 80-110 cm oraz 0,46 g·dm-3 i 50-140 cm. Również plonowanie trzcinniczyska w latach badań było zróżnicowane. 95 Agnieszka Listosz (gs.m.∙dm ) -3 (m) (t∙ha ) 4,5 -1 1 0,90 3,95 0,9 0,85 0,8 3,5 3,03 0,7 3 0,6 2,5 0,46 0,5 1,88 2 0,4 0,3 0,2 4 1,5 0,21 1 0,5 0,1 0 0 zagęszczenie wysokość sucha masa Rys. 1. Parametry charakteryzujące biomasę nadziemną trzcinnika piaskowego: plony suchej masy (t·ha-1), zagęszczenie (g·dm-3), wysokość (m) Uzyskane plony suchej masy w 2005 roku wahały się od 1,05 do 3,11 t·ha-1, w 2007 roku od 0,75 do 2,28 t·ha-1, a w 2011 roku od 1,21 do 5,87 t·ha-1. Na rycinie 1 przedstawiono wybrane parametry trzcinniczyska, w latach badań, jako wielkości średnie. Różnica średnich wysokości trzcinniczyska w latach 2005 i 2011 wynosiła prawie 5%, ale średnie zagęszczenie kształtowało się na poziomie 0,34 g·dm3 . Średni plon trzcinnika w 2011 r. wynosił 3,95 t s.m.×ha-1 i był o 110% większy w stosunku do średniej wielkości plonu w 2005 r. (1,88 t s.m.×ha-1). Opracowanie statystyczne cech trzcinniczyska, określanych w latach 2005 i 2011 wykazuje, że decydujący wpływ na wielkość plonów suchej masy miało z reguły zagęszczenie, a w mniejszym stopniu wysokość łanu (Tab. 1). Obliczona korelacja pomiędzy wielkością plonu suchej masy, a zagęszczeniem wynosi rxy= 0,89 co wskazuje na silną dodatnią zależność między plonem, a zagęszczeniem (Tab. 1). W przypadku korelacji pomiędzy plonem a wysokością zależność jest mniejsza. Zagęszczenie oraz wysokość łanu to parametry bezpośrednio wpływające na wielkość plonu biomasy. Są one zależne od warunków wzrostu roślin. W wypadku prezentowanych badań własnych, warunki siedliskowe były szczególnie niekorzystne z racji właściwości utworów glebowych (piaski wydmowe) i głębokiego odwodnienie (ujęcia wód podziemnych) [Kowalkowski i in. 1999; Pranagal i Słowińska-Jurkiewicz 2007]. W takich warunkach, średni plon trzcinnika (z trzech lat) – 2,97 t s.m.×ha-1, w porównaniu do średnich plonów siana uzyskiwanych z polskich łąk – 5 t s.m.×ha 1 [Sawicki i Kościk 2003], można uznać za wysoki. Należy jednak nadmienić, że niepo96 Biomasa nadziemna trzcinnika piaskowego na gruntach zdegradowanych... 0,39 0,15 3,41 1,51 0,87 0,18 19 0,89 0,79 Plon suchej masy zagęszczenie Plon suchej masy wysokość 19 0,48 Wartość krytyczna testu (significance level α=0,05) Critical value of the test (significance level α=0,05) 1,51 R (X,Y) Wartość testu istotności Value of the significance test 3,41 N Odchylenie standardowe Standard deviation Średnia arytmetyczna Aritmetic mean SR Współczynnik korelacji Pearsona Pearson coefficient of corelation R2 Liczebność grupy Number of group Oznaczenie Signature Korelacja Correlation Współczynnik determinacji Coefficient of determination równywalnie wyższe plony otrzymuje się z łąk w dobrych warunkach (nawet do 15 t s.m.×ha-1), czy podczas intensywnej uprawy traw gatunków introdukowanych – 20-30 t s.m.×ha-1 [Sawicki i Kościk 2003]. S t tαkr 8,464 2,110 2,366 2,110 0,23 Tab. 1. Wybrane miary statystyczne badanych parametrów trzcinnika Na znaczne zróżnicowanie wielkości masy nadziemnej trzcinnika piaskowego wskazują wyniki badań zamieszczane w literaturze przedmiotu. Według Sobczaka [1976], na tzw. gruntach trudnych do zalesienia, sucha masa części nadziemnych trzcinnika wynosiła 1,62-2,09 t×ha-1. Patrzałek i in. [2011] uzyskali plony trzcinnika w zakresie 4,5-11,4 ts.m.×ha-1, a według badań Kozłowskiego i Swędrzyńskiego [2010] – w niektórych stanowiskach plon trzcinnika piaskowego osiągał 6,47 t s.m.×ha-1. Badania prowadzone przez Patrzałek i in. [2011] nad przydatnością trzcinnika do celów energetycznych wykazały, że wartość opałowa 1 kg części nadziemnych tej rośliny wynosi 16,0 MJ×kg-1. Przyjmując tę wielkość do obliczeń, można uznać, iż wartość energetyczna plonu trzcinnika brutto w warunkach badań własnych zawierała się w przedziale od 30,1 GJ×ha-1 w 2005 r., do 63,2 w 2011 r., natomiast średnio z trzech lat badań – 47,5 GJ×ha-1. Dla porównania, wartość energetyczna słomy owsa uprawianego na glebie kompleksu żytniego dobrego, według Kowalczyk-Juśko [2009] wynosi 43,2 GJ×ha-1. 97 Agnieszka Listosz WNIOSKI • Plony biomasy nadziemnej trzcinnika piaskowego cechowało duże zróżnicowanie zarówno przestrzenne (w obrębie strefy zdegradowanej), jak i pomiędzy kolejnymi latami badań. • Średnio z trzech lat badań, uzyskano 2,97 t s.m.×ha-1, co w warunkach silnie zdegradowanych wydm można uznać za plon stosunkowo wysoki. • O wielkości plonów decydowało zagęszczenie łanu trzcinniczyska. • Wartość energetyczna brutto plonu trzcinnika piaskowego wynosiła średnio 47,5 GJ×ha-1. LITERATURA Bielińska E.J. Domżał H. 2007. Właściwości fizykochemiczne i chemiczne gleb. [w:] Ocena przeobrażeń środowiska glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica, 145: 65-77. Czyż H. Trzaskoś M. Kitczak T. 2005. Zbiorowiska trawiaste w warunkach skrajnie suchych. Łąkarstwo w Polsce, 8: 35-44. Falkowska K. Filipek T. 2009. Dynamika zmian zawartości azotu mineralnego w wierzchniej warstwie gleb rejonu oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych, 40: 96-102. Falkowski M. (red.) 1982. Trawy polskie. Wyd. PWRiL, Warszawa: 169-175. Gorzelak A. 2004. Trzcinniki – biologia i zwalczanie. Wyd. Centrum Informacyjne Lasów Państwowych, Warszawa: 11-25. Hodara J. Świca M. 2007. Właściwości fizyczne gleb. [w:] Ocena przeobrażeń środowiska glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica, 145: 49-64. Kowalczyk-Juśko A. Kościk B. Kwapisz M. 2009. Możliwości i ograniczenia wykorzystywania odpadów z rolnictwa na cele energetyczne. Południowo-Wschodni Oddział Polskiego Towarzystwa Inżynierii Ekologicznej z siedzibą w Rzeszowie – Polskie Towarzystwo Gleboznawcze, Oddział w Rzeszowie-Zeszyty Naukowe, 11: 155-160. 98 Biomasa nadziemna trzcinnika piaskowego na gruntach zdegradowanych... Kowalkowski A. Kopron H. Lewandowska J. Jedliczko S. Płecha R. 1999. Możliwości przywracania funkcji leśnych w długotrwale niezrównoważonym ekosystemie leśnym Nadleśnictwa Puławy. [w:] Funkcjonowanie gleb leśnych na terenach zagrożonych i trendy jego zmian, Warsztaty Naukowe, Puławy: 49-63. Kozłowski S. Swędrzyński A. 2010. Możliwości wykorzystania trzcinnika piaskowego w kontekście jego biologicznych, chemicznych i fizycznych właściwości. Łąkarstwo w Polsce, 13: 117-126. Patrzałek A. Kozłowski S. Swędrzyński A. Trąba Cz. 2011. Trzcinnik piaskowy jako potencjalna roślina energetyczna. Monografia, Wyd. Politechniki Śląskiej, Gliwice: ss.54. Pranagal J. Słowińska-Jurkiewicz A. 2007. Pokrywa glebowa obszaru badań. [w:] Ocena przeobrażeń środowiska glebowego i stabilności ekosystemów leśnych w obszarze oddziaływania Zakładów Azotowych „Puławy” S.A., Acta Agrophysica, Rozprawy i Monografie, 2: 11-27. Sawicki B. Kościk K. 2003. Trawy i zbiorowiska trawiaste. [w:] Rośliny energetyczne, Wyd. Akademii Rolniczej w Lublinie: 111-135. Siuta J. 1987. Ekologiczne skutki uprzemysłowienia Puław. Wyd. Instytut Ochrony Środowiska, Warszawa: ss.263. Adres do korespondencji: mgr inż. Agnieszka Listosz Katedra Melioracji i Budownictwa Rolniczego Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Leszczyńskiego 7, 20-069 Lublin e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Tadeusz Węgorek 99 Mateusz Malinowski EPISTEME 14/2012 s. 101-108 ISSN 1895-4421 UWARUNKOWANIA WYTWARZANIA PALIW ALTERNATYWNYCH ZE ZMIESZANYCH ODPADÓW KOMUNALNYCH THE RESTRICTIONS OF MIXED MUNICIPAL WASTE TREATMENT TO ALTERNATIVE FUEL Abstrakt. Postęp cywilizacyjny oraz związany z nim wzrost konsumpcji powodują powstawanie coraz większych ilości odpadów komunalnych. Jednym z najważniejszych wyzwań stawianych współczesnej inżynierii jest zapobieganie ich nadmiernemu powstawaniu, następnie ponowne użycie, racjonalne wykorzystanie i ostateczne unieszkodliwienie. Odpady komunalne stanowią nieograniczone źródło zasobów energetycznych. Mogą być one spalane bezpośrednio w formie zmieszanej w spalarniach odpadów lub stanowić „surowiec” do wytwarzania paliw alternatywnych. Wytwarzanie paliw alternatywnych z odpadowej frakcji palnej i spalanie ich w cementowniach przyczynia się między innymi do zmniejszenia ilości odpadów deponowanych na składowiskach. W pracy przedstawiono analizę możliwości uzyskiwania frakcji palnej w wyniku przetwarzania zmieszanych odpadów komunalnych w procesie R15. Badania przeprowadzono w roku 2011 na terenie firmy MIKI Recykling. Analizie poddano odpady z dwóch rejonów Krakowa oraz obszarów wiejskich (gminy Liszki i Mogilany). Z analizy przeprowadzonych pomiarów wynika, że ze zmieszanych odpadów można uzyskać od 27% do 50% paliwa alternatywnego w zależności od charakteru miejsca ich gromadzenia i zbierania. Słowa kluczowe: odpady komunalne, frakcja odpadów palnych, paliwo alternatywne Summary. Civilization progress and the associated with them increase of consumption, generate increasing amounts of municipal waste. One of the main challenges of today engineering is to prevent the waste excessive formation, next re-use of them, recycle and final disposal. Mixed municipal waste are an unlimited source of energy resources. Waste can be combusted directly in the mixed form in waste incinerators or waste can be a „raw material” for the production of alternative fuels. Production of alternative fuels from combustible waste fraction and incineration them in the cement plants reduces the amount of waste deposited in landfills. This paper presents an analysis of possibilities of obtaining combustible waste fraction as a result of the R15 process. The research was conducted in 2011 in MIKI Recycling company. The analysis covered waste from two areas of Krakow city and the two rural communes: Liszki and Mogilany. The study shows that the mixed municipal waste may be obtained from 30% to 50% alternative fuel, depending on the characteristic of their place of gathering and collecting. Key words: municipal waste, combustible wastes, alternative fuel 101 Mateusz Malinowski WSTĘP W Polsce w 2010 roku zebrano ponad 10 mln Mg odpadów komunalnych, z czego 86% zdeponowano na składowiskach [Ochrona środowiska 2010]. Od lipca 2013 roku w pełni zacznie obowiązywać nowy system gospodarowania odpadami, zgodnie z Ustawą o utrzymaniu czystości i porządku w gminach [Dz. U. 2011. Nr 152, poz. 897]. Nowy system głównie ze względu na preferencyjne stawki opłat za wywóz odpadów, ma spowodować zwiększenie się ilości odpadów zbieranych selektywnie. Zwiększenie ilości selektywnie zbieranych odpadów może nastąpić również w wyniku planowanego podniesienia stawek opłaty marszałkowskiej za składowanie odpadów. Równocześnie, ze względu na objęcie wszystkich mieszkańców kraju obowiązkiem oddawania odpadów i odprowadzania do gminy opłaty za ich zbiórkę i transport, prognozowane jest zwiększenie się całkowitej masy zbieranych zmieszanych odpadów komunalnych. W 2010 roku systemem odbierania odpadów było objętych niecałe 80% mieszkańców kraju [Ochrona środowiska 2010]. Zgodnie z zapisami ustawy, samorządy gminne przejmują obowiązki właścicieli nieruchomości w zakresie gospodarowania odpadami, a także stają się odpowiedzialne za budowę i utrzymanie infrastruktury wspomagającej procesy recyklingu i unieszkodliwiania odpadów. Nowy system gospodarowania odpadami wprowadzany jest stopniowo od 1 stycznia 2012 roku. Jak wynika z analiz prowadzonych w gminach, które od kilku lat posiadają taki system zarządzania strumieniem odpadów na swoim terenie, masa zbieranych odpadów w Polsce w 2014 roku może zwiększyć się nawet o 51% w stosunku do aktualnie zbieranej masy i wynosić ponad 15,2 mln Mg.rok-1 [Malinowski 2011]. Taki strumień odpadów wymaga zapewnienia odpowiedniej infrastruktury, która będzie mogła przetworzyć go (poddać odzyskowi, recyklingowi lub ponownemu przetworzeniu) lub zagospodarować. Za niewykonanie obowiązku ograniczenia do 2020 roku składowania odpadów ulegających biodegradacji o 65% w stosunku do ilości odpadów zdeponowanych w 1995 grożą Polsce wysokie kary mogące sięgać 300 tys. euro dziennie. Jedną z alternatyw umożliwiających rozwiązanie tego problemu jest wykorzystanie palnych właściwości odpadów w cementowniach [Pawlak i in. 2011]. Z szacunków Stowarzyszenia Producentów Cementu w Polsce wynika, że na roczną produkcję klinkieru potrzebne jest 45500 tys. GJ ciepła, z czego 50% mogłoby pochodzić z odpadów (paliwa alternatywnego produkowanego z odpadów) [SPC, 2008]. Przy takich założeniach przemysł cementowy mógłby spalić 1,13 mln Mg paliw alternatywnych. W krajach Europy zachodniej nawet 70% ciepła wytwarzane jest w cementowniach ze spalania paliw alternatywnych, w Polsce aktualnie jest to 15 do 25% w zależności od rejonu Polski [Duda, Lepucki 2009]. Dodatkową zaletą przetwarzania odpadów na paliwo jest fakt, iż w procesie termicznego unieszkodliwiania odpadów w spalarni konwencjonalnej powstaje ok. 30% żużli, które należy zdeponować na składowiska, natomiast 102 Uwarunkowania wytwarzania paliw alternatywnych... w procesie współspalania paliw alternatywnych w piecu cementowym problem ten znika, gdyż pozostałości po spaleniu stają się składnikiem klinkieru. Niemal wszystkie odpady posiadające odpowiednią minimalną wartość energetyczną (powyżej 18 MJ.kg-1) mogą być używane do produkcji paliw alternatywnych [Duda, Lepucki 2009]. Należą do nich zarówno tworzywa sztuczne, papier, tekstylia, zużyte opony lub inne odpady gumowe, zużyte farby i rozpuszczalniki, jak i osady z oczyszczalni ścieków, czy odpady zwierzęce (np. tłuszcze). W procesie przygotowania paliwa alternatywnego (proces R15) wykorzystuje się te frakcje, których nie da się poddać recyklingowi na przykład ze względu na poziom zanieczyszczeń. W przypadku zmieszanych odpadów komunalnych samo wydzielenie frakcji palnej nie predysponuje jej do zastosowania w piecu cementowym. Paliwo powinno charakteryzować się homogenicznością w całej masie, małą ilością substancji niepalnych. Ograniczenia dotyczą także zawartości alkaliów, chloru, fluoru, metali ciężkich np. rtęci oraz związków aromatycznych. Szczególnie dotyczy to chloru, który w sposób negatywny wpływa na proces wypalania i elementy pieca cementowego [Pawlak i in. 2011]. Kluczowymi parametrami paliw alternatywnych decydującymi o ich przydatności do spalania w piecach cementowych są [SPC 2008]: • wartości opałowa > 20 GJ.Mg-1 • wilgotność < 15% • zawartość chloru < 0,8 % • zawartość siarki < 1% • zawartość metali ciężkich < 2.500 mg . kg-1 • zawartość popiołu <15% W Polsce produkuje się dwa rodzaje paliwa alternatywnego z przeznaczeniem do odzysku energii głównie w piecach cementowych i wapienniczych. Pierwszy typ to PASi – paliwo alternatywne impregnowane o kodzie 191211, które uzyskuje się głównie z odpadów niebezpiecznych. Drugi typ – PASr, to stałe paliwo alternatywne rozdrobnione o kodzie 191210 otrzymywane z odpadów innych niż niebezpieczne, w tym ze zmieszanych odpadów komunalnych i przemysłowych. Eko-przedsiębiorstwa, zbierające i przetwarzające odpady komunalne na paliwa alternatywne, takie jak np. REMONDIS podają, że z 1 Mg zmieszanych odpadów komunalnych można uzyskać około 30% paliwa alternatywnego (odpadów palnych) [www.remondis.pl]. Celem przeprowadzonych badań było określenie rzeczywistych możliwości uzyskania paliwa alternatywnego ze zmieszanych odpadów komunalnych. Badania miały na celu określenie ilościowych (masowych) ograniczeń związanych z produkcją paliw alternatywnych wynikających z właściwości zbieranych zmieszanych odpadów. 103 Mateusz Malinowski MATERIAŁ I METODA Badania przeprowadzono w trzech różnych środowiskach (3 różne trasy przejazdów śmieciarek): miejskim, ze zwartą zabudową jednorodzinną (Kraków – Wola Justowska), wiejskim (gmina Liszki i Mogilany) oraz śródmiejskim z ponad 50% udziałem firm i instytucji (centrum Krakowa). Każda z analizowanych tras charakteryzuje się innymi wskaźnikami nagromadzenia odpadów, gęstością usypową, składem morfologicznym, sitowym, etc. (Tab. 1). W okresie od grudnia 2010 do grudnia 2011 w kolejnych kwartałach wykonano analizę masową uzyskiwanych frakcji z mechanicznego rozdziału zebranych zmieszanych odpadów komunalnych, które stanowiły surowiec do produkcji paliwa alternatywnego (191210). Jednostka Wskaźniki nagromadzenia Gęstość usypowa kg os rok m os rok Tereny wiejskie 90 – 110 0,3 – 0,5 220 – 280 Tereny miejskie 180 – 330 1,5 – 1,9 160 – 240 Tereny miejskie nasycone obiektami infrastrukturalnymi 220 – 400 1,8 – 2,5 110 – 180 . . -1 3. . -1 kg.m3 Tab. 1. Wybrane właściwości technologiczne odpadów komunalnych. Źródło: opracowanie własne na podstawie [Szlaińska, d’Obyrn 2005] Pomiary wykonano w instalacji przetwarzania odpadów MIKI Recykling w Krakowie. Przedsiębiorstwo MIKI przetwarza odpady w procesie R15 - przetwarzanie odpadów w celu ich przygotowania do odzysku (w tym do odzysku energetycznego), zgodnie z załącznikiem 5 do Ustawy o odpadach z dnia 27 kwietnia 2001r. [Dz. U. 2010. Nr 185, poz. 1243]. W każdym kwartale (porze roku) wykonano dwie analizy dla każdej z trzech tras (6 w kwartale, 24 analizy w ciągu roku). Pomiary wykonywano dla całej masy odpadów przywiezionych przez śmieciarki w wybrane wcześniej dni, tak aby uniknąć odpadów, których skład morfologiczny lub sitowy byłby zniekształcony przez okresy świąteczne lub urlopowe itp. Średnia masa przeanalizowanych jednorazowo odpadów wynosiła 3,5 Mg. Niewielka liczba wykonanych pomiarów wynikała z potrzeby zatrzymywania ciągłego procesu produkcji paliwa, tak aby możliwe było przetworzenie w instalacji odpadów tylko z wybranych śmieciarek. Zmieszane odpady po rozładowaniu na placu magazynowym kierowano do rozdrabniacza wstępnego (Hammel), następnie poddawano je separacji magnetycznej oraz ręcznemu wybieraniu szkła i metalu. Na separatorze sitowym firmy Doppstadt wydzielano ze strumienia frakcję mineralną, popiół, gruz, odpady organiczne, stłuczkę szklaną i inne odpady o średnicy < 50 mm (frakcja pod-sitowa). Następnie, z wykorzystaniem separatora balistycznego, 104 Uwarunkowania wytwarzania paliw alternatywnych... wydzielano frakcję lekką – palną (papier, karton, tekstylia i tworzywa sztuczne), które stanowiły pre-RDF (Refuse Derived Fuel) – ostateczny wsad do produkcji paliwa. Frakcję ciężką (tzw. nad-sitową) stanowiły głównie: zawilgocony papier i karton, środki ochrony intymnej, ciężkie zanieczyszczenia mineralne, duże elementy organiczne. Tak wyselekcjonowane odpady ważono z dokładnością do 1kg. WYNIKI W wyniku selekcji zmieszanych odpadów komunalnych wydzielono 5 frakcji: frakcja pre-RDF (stanowiąca paliwo alternatywne), frakcja metali (suma metali wybranych ręcznie i oddzielonych na separatorze), frakcja szkła (białe i kolorowe), frakcja pod-sitowa (frakcja o uziarnieniu do 50 mm), frakcja nad-sitowa (o uziarnieniu powyżej 50 mm, ale nienadająca się do przetworzenia na paliwo). W tabelach 2, 3 i 4 przedstawiono procentowe zestawienie mas wyselekcjonowanych odpadów w różnych porach roku. W wyniku analizy stwierdzono prawidłowości dotyczące zmienności procentowego udziału masowego pre-RDF, jak i pozostałych frakcji odpadów. Największe ilości paliwa alternatywnego ze zmieszanych odpadów uzyskiwane są w okresie letnim (lipiec, sierpień, wrzesień), w którym równocześnie zawartość frakcji pod-sitowej (zawierającej w tym okresie głównie odpady organiczne) jest najniższa. Najmniej paliwa alternatywnego można uzyskać w okresie zimowym (styczeń, luty, marzec). W porównaniu do okresu letniego masa uzyskanej frakcji paliwa alternatywnego była mniejsza o 4 do 8% w okresie zimowym. W okresie zimowym wzrastała zawartość frakcji pod-sitowej zawierającej wówczas głownie popiół. Tendencja ta występuje we wszystkich analizowanych przypadkach, zaś najsilniej uwidacznia się na terenach miejskich z zabudową jednorodzinną oraz na terenach wiejskich. Zima Wiosna Lato Jesień Średnia [%] [%] [%] [%] [%] Pre-RDF 34,04 38,71 42,38 36,09 37,80 Metal 2,58 1,52 2,13 2,33 2,14 Szkło 4,23 1,80 3,72 3,68 3,36 Frakcja pod-sitowa 43,45 41,99 36,54 42,89 41,22 Frakcja nad-sitowa 15,70 15,98 15,22 15,01 15,48 Suma 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Pora roku / Frakcja Tab. 2. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z krakowskich osiedli 105 Mateusz Malinowski Zima Wiosna Lato Jesień Średnia [%] [%] [%] [%] [%] Pre-RDF 48,59 50,61 52,08 48,68 49,99 Metal 3,45 2,68 2,86 3,02 3,01 Szkło 3,52 3,13 6,83 5,28 4,69 Frakcja pod-sitowa 33,10 31,30 25,40 31,40 30,30 Frakcja nad-sitowa 11,34 12,28 12,83 11,62 12,02 Suma 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Pora roku / Frakcja Tab. 3. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z krakowskich firm Zima Wiosna Lato Jesień Średnia [%] [%] [%] [%] [%] Pre-RDF 24,57 26,34 30,44 27,03 27,10 Metal 2,55 2,39 3,47 2,83 2,81 Szkło 2,70 2,29 4,37 6,21 3,89 Frakcja pod-sitowa 61,43 57,92 47,57 54,00 55,23 Frakcja nad-sitowa 8,74 11,06 14,14 9,94 10,97 Suma 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 Pora roku / Frakcja Tab. 4. Udział procentowy frakcji odpadów komunalnych z obszarów wiejskich Najwięcej frakcji paliwa alternatywnego uzyskuje się z odpadów powstających w centrach miast, w których występuje bardzo duże nasycenie obiektami infrastrukturalnymi. W składzie morfologicznym odpadów komunalnych z tych obszarów przeważają papier, karton, gazety i tworzywa sztuczne. Ponieważ w zakładach usługowych i innych obiektach infrastruktury nie ma obowiązku prowadzenia selektywnej zbiórki odpadów, powstające zmieszane odpady komunalne trafiają do śmieciarek. Ta sytuacja determinuje ponad 50% udział frakcji pre-RDF w kwartałach wiosna i lato (Tab. 3). Na osiedlach domów jednorodzinnych i terenach wiejskich, z których odpady były poddane analizie, firma MIKI Recykling prowadzi tzw. selektywną zbiórkę odpadów. Odpady użyteczne (metal, szkło, papier i plastik) zbierane są oddzielnie w różnokolorowych workach. Zebrane w ten sposób odpady są 106 Uwarunkowania wytwarzania paliw alternatywnych... sprzedawane do recyklingu i nie są przetwarzane na paliwo alternatywne. Na obszarach tych znacznie większy jest udział frakcji pod-sitowej co powoduje obniżony poziom uzysku frakcji pre-RDF (Mogilany – frakcja pod-sitowa w jednym z transportów zimowych stanowiła aż 71%). Średni roczny uzysk paliwa alternatywnego na terenach miejskich osiedli domów jednorodzinnych wynosi 37,8%, zaś na terenach wiejskich zaledwie 27,1% (Tab. 2 i 4). Przyjmując za KPGO 2014, że masa odpadów wytwarzanych na obszarach wiejskich stanowi 28% całego strumienia, zaś pozostała część powstaje na obszarach miejskich, można przyjąć iż średnia ważona masa uzyskiwanego paliwa alternatywnego z 1 Mg zmieszanych odpadów komunalnych wynosi 377 kg. Na tej podstawie można oszacować, że do wyprodukowania 1,13 mln Mg paliwa alternatywnego należy przetworzyć ponad 3 mln Mg odpadów. DYSKUSJA I WNIOSKI • Przetwarzanie zmieszanych odpadów komunalnych na paliwa alternatywne jest szczególnie uzasadnione w przypadku odpadów z rejonów typowo miejskich oraz odpadów z obiektów infrastruktury, co pozwala na zredukowanie masy tych odpadów nawet o 34% do 52%. Jest to bezpośrednia korzyść dla środowiska, ponieważ po spaleniu odpadów w piecach cementowych nie pozostanie żaden produkt uboczny, a także korzyść dla przedsiębiorcy, który nie poniesie opłaty za umieszczenie tej masy odpadów na składowisku. • Wytwarzanie frakcji paliw alternatywnych ze zmieszanych odpadów ograniczone jest głównie miejscem generowania i zbierania tych odpadów oraz w mniejszym stopniu porą roku. Czynniki te determinują różnice w składzie morfologicznym odpadów. Jednym z kolejnych ograniczeń w uzyskiwaniu paliwa jest skuteczność prowadzonej selektywnej zbiórki odpadów. Im jest ona efektywniejsza tym, mniej frakcji odpadów palnych wyrzucanych jest do pojemników na zmieszane odpady komunalne. • Najmniejsze procentowe udziały frakcji paliwa alternatywnego otrzymano podczas przetwarzania zmieszanych odpadów komunalnych z terenów wiejskich, największą masę zaś z silnie zurbanizowanych terenów nasyconych infrastrukturą społeczną. • Uzyskane poziomy odzysku frakcji pre-RDF w badaniach prowadzonych na instalacji firmy MIKI Recykling są znacznie wyższe niż podawane przez firmy konkurencyjne. 107 Mateusz Malinowski LITERATURA Duda J., Lepucki M. 2009. Nowe możliwości wykorzystania paliw z odpadów w procesie wypalania klinkieru. Gliwice, Wyd. KTiUZO. s. 191 – 199. Malinowski M. 2011. Changes in municipal waste management following the amendment of the act on maintaining the cleanliness and order in communes. Infrastructure and ecology of rural areas. Nr 12/2011, s. 103 – 116. Pawlak B., Hoppe G., Gaca J. 2011, Produkcja paliw alternatywnych dla cementowni. Gospodarka odpadami komunalnymi. Tom VII Koszalin, s. 63 – 69. Ochrona środowiska 2010. GUS. Warszawa, s. 336 – 338. Stowarzyszenie Producentów Cementu (SPC), 2008. Paliwo alternatywne na bazie sortowanych odpadów komunalnych dla przemysłu cementowego. Kraków, s. 3. Szalińska E., d’Obyrn K. 2005. Odpady komunalne – zbiórka, recykling unieszkodliwianie, Wyd. PK w Krakowie, s. 55. Ustawa o odpadach [tj. Dz. U. 2010. Nr 185, poz. 1243] Ustawa o utrzymaniu czystości i porządku w gminach [t.j.Dz. U. 2011. Nr 152, poz. 897] www.remondis.pl/rmpl/dla-prasy/informacje-prasowe/newsdetail/odpady-zrodlem-energii [dostęp: 22.01.12] Adres do korespondencji: mgr inż. Mateusz Malinowski Instytut Inżynierii Rolniczej i Informatyki Zakład Infrastruktury Technicznej i Ekoenergetyki Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 116b, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Stanisław Gruszczyński 108 Weronika Maślanko Joanna Sender EPISTEME 14/2012 s. 109-120 ISSN 1895-4421 STAN EKOLOGICZNY JEZIORA KRASNE W OPARCIU O WSKAŹNIKI MAKROFITOWE ORAZ ANALIZA STRUKTURY UŻYTKOWANIA JEGO ZLEWNI KRASNE LAKE’ ECOLOGICAL STATE BASED ON MACROPHYTES INDEXES AND ANALYSIS OF LAND USE IN THE CATCHMENT AREA Abstrakt. Duże zainteresowanie turystów Jeziorem Krasne oraz bezpośredni wpływ zlewni jeziora spowodowało podjęcie badań w celu określenia stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech wskaźników makrofitowych. Mimo ponad 8-krotnego wzrostu liczby turystów nad badanym jeziorem na przestrzeni prawie 25 lat oraz osiągnięcia jednego z najwyższych wskaźników obciążenia jezior ruchem turystycznym, w badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz Ceratophylletum demersi. Stwierdzono, że okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany w strukturze jakościowej i ilościowej makrolitów, jednak zastosowane wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan ekologiczny badanego jeziora. Słowa kluczowe: fitolitoral, makrofity, jezioro Krasne, Pojezierze Łęczyńsko – Włodawskie, wskaźniki makrofitowe. Abstrakt. Duże zainteresowanie turystów Jeziorem Krasne oraz bezpośredni wpływ zlewni jeziora spowodowało podjęcie badań w celu określenia stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech wskaźników makrofitowych. Mimo ponad 8-krotnego wzrostu liczby turystów nad badanym jeziorem na przestrzeni prawie 25 lat oraz osiągnięcia jednego z najwyższych wskaźników obciążenia jezior ruchem turystycznym, w badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz Ceratophylletum demersi. Stwierdzono, że okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany w strukturze jakościowej i ilościowej makrolitów, jednak zastosowane wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan ekologiczny badanego jeziora. Słowa kluczowe: fitolitoral, makrofity, jezioro Krasne, Pojezierze Łęczyńsko – Włodawskie, wskaźniki makrofitowe. 109 Weronika Maślanko, Joanna Sender WSTĘP Mezoregion Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego w całości zaliczany jest do makroregionu Polesia Lubelskiego. Otoczenie z trzech stron przez tereny bardziej wypiętrzone, takie jak Grab Włodawski, Zaklęsłość Sosnowicka i Pagóry Chełmskie sprawia, że mezoregion ten położony jest w charakterystycznej, podmokłej depresji morfologicznej. Pojezierze Łęczyńsko - Włodawskie jest największym w Polsce zgrupowaniem jezior występujących poza obszarami uformowanymi przez morfogenezę glacjalną ostatniego zlodowacenia. W obrębie tego wybitnie bogatego przyrodniczo terenu znajduje się 60 jezior naturalnych, których wiek ocenia się na 11 300 lat [Wilgat 1954, Wilgat i in. 1991, Harasimiuk i in. 1998, Chmielewski 2005]. Jeziora zasiedla specyficzna wodna roślinność zwana makrofitami. Makrofity to morfologicznie bardzo zróżnicowana grupa roślin [Hartog, Segal 1964, Cook 1983, Wołek 1996]. Należą do nich wszystkie krajowe ramienice (Charophyta), część mszaków (Bryophyta), nieliczne paprotniki (Pteridophyta) oraz niewielka grupa roślin nasiennych (Spermatophyta) [Szmeja 2006]. Ze względu na różne wymagania makrofity podzielono na: amfifity, helofity, nimfeidy, elodeidy, isoetidy oraz pleuston [Bernatowicz, Wolny 1974]. Makrofity spełniają szereg ważnych funkcji ekologicznych w zbiornikach wodnych, m.in. wpływają na żyzność wód oraz skład gatunkowy organizmów roślinnych i zwierzęcych. Stanowią miejsce żerowania, rozrodu oraz refugia dla wielu wodnych bezkręgowców oraz ryb, a także sprzyjające siedliska dla awifauny [Kornijów, Radwan 2000]. Ich obecność wpływa na wzbogacenie różnorodności biologicznej ekosystemów [Sender 2009, 2011, Maślanko i in. 2011a]. Pomimo objęcia obszaru Polesia Lubelskiego różnorodnymi formami ochrony przyrody, takimi jak: park narodowy, parki krajobrazowe, rezerwaty przyrody czy statusem Rezerwatu Biosfery UNESCO „Polesie Zachodnie”, z uwagi na silną antropopresję w tym regionie stan ekologiczny wielu jezior użytkowanych rekreacyjnie oraz niekontrolowane rozprzestrzenianie się zabudowy letniskowej powinny być stałym obiektem badań i monitoringu. Duże zainteresowanie turystów badanym jeziorem oraz wpływ zlewni na stan ekologiczny jeziora spowodowało podjęcie badań mających na celu określenie stanu ekologicznego jeziora w oparciu o porównanie trzech makrofitowych wskaźników oceny stanu ekologicznego jezior. Ponadto dokonano porównawczej analizy zagospodarowania zlewni jeziora Krasne w okresie prawie 20 lat ukazującej kierunki przekształceń tego obszaru. OBSZAR BADAŃ Badania przeprowadzono w głębokim, mezotroficznym jeziorze Krasne w mezoregionie Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego na Polesiu Lubelskim 110 Stan ekologiczny jeziora Krasne... . Jezioro Krasne jest położone w zlewni rzeki Tyśmienicy, administracyjnie w gminie Uścimów. Znajduje się na obszarze parku krajobrazowego „Pojezierze Łęczyńskie”. Jest jeziorem dimiktycznym, o leszczowo-sielawowym typie rybackim. Objętość jeziora wynosi 8180 tys. m3, natomiast głębokość maksymalna 34 m, a średnia 10,8 m. Linia brzegowa jeziora wynosi 3514 m. Zasilane jest wodami gruntowymi, opadowymi i wodą z kanału Wieprz - Krzna, doprowadzaną grawitacyjnie przy pomocy rowu. Brzegi jeziora są piaszczyste, co niewątpliwie wpływa na jego atrakcyjność wśród turystów. W latach 90-tych jezioro Krasne zostało zakwalifikowane do II klasy czystości, natomiast na początku XXI w. już do III klasy czystości, czyli do wód silnie zanieczyszczonych [Raport… 1998, 2003]. Wg Raportu… z 2003 roku jezioro zostało przyporządkowane do I kategorii odporności na degradację. Nad jeziorem Krasne na przestrzeni prawie 25 lat ponad 8 krotnie wzrosła liczba turystów [Chmielewski, Jankowska 2009]. Jezioro uzyskało jeden z najwyższych wskaźników obciążenia jezior Pojezierza Łęczyńsko - Włodawskiego ruchem turystycznym [Maślanko i in. 2011], z liczbą turystów nawet do 3200 osób w sezonie. MATERIAŁ I METODY Analizy florystyczne przeprowadzone zostały w okresie wegetacyjnym 20072009, z aktualizacją badań terenowych w 2011 r. Do określenia ekologicznej struktury makrofitów zastosowano powszechnie przyjętą w Europie Środkowej metodę fitosocjologiczną Brauna-Blanqueta [1951]. Jednostki fitosocjologiczne (określone na podstawie gatunków dominujących) wyróżniono stosując układ systematyczny i nomenklaturę Matuszkiewicza [2008]. Zdjęcie fitosocjologiczne obejmowało listę wszystkich gatunków stwierdzonych w obrębie fitocenozy z uwzględnieniem ich liczby [Szmeja 2006]. W celu określenia stanu ekologicznego jeziora zastosowano trzy wskaźniki: polski, niemiecki oraz angielski [Palmer 2001, Stelzer i in. 2005, Ciecierska i in. 2006, 2010, Ciecierska 2008, Kolada i in. 2011]. Do obliczenia procentowego udziału poszczególnych zbiorowisk roślinnych jeziora Krasne wykorzystano oprogramowanie ArcGIS 10.0. Zlewnia jeziora została wyznaczona na podst. mapy topograficznej w skali 1:25000 w programie ArcGIS 10.0 w celu przeprowadzenia analizy struktury jej użytkowania. Analizę struktury użytkowania zlewni jeziora Krasne dokonano metodą fotointerpretacyjnej analizy retrospektywnej [Chmielewski i in. 1996], z wykorzystaniem zdjęć lotniczych z roku 2007 r. i zdjęć satelitarnych z roku 2009. Dokonano porównania obecnej struktury użytkowania zlewni jeziora Krasne z jego zagospodarowaniem w latach 90-tych XX w. [Harasimiuk i in. 1998]. Mapy struktury obecnego użytkowania zlewni jeziora Krasne oraz pomiary powierzchni poszczególnych wydzieleń wykonano w środowisku ArcView. 111 Weronika Maślanko, Joanna Sender WYNIKI I DYSKUSJA Na podstawie przeprowadzonych analiz obliczono obecną powierzchnię jeziora tj. 73,2 ha. Uległa ona w stosunku do lat 90-tych ubiegłego wieku nieznacznemu zmniejszeniu o ok. 1,72 ha. Natomiast powierzchnia zlewni jeziora Krasne oszacowana została na 328,85 ha (Tab. 1). Parametry morfometryczne Wartość Powierzchnia jeziora [ha] 73,2 Powierzchnia lustra wody [ha] 55,32 Przezroczystość [m] 2,5 Powierzchnia fitolitoralu [ha] 17,88 [%] 24,4 Powierzchnia zlewni [ha] 328,85 Tab. 1. Charakterystyka podstawowych parametrów morfometrycznych badanego jeziora W badanym jeziorze oznaczono 11 zbiorowisk wchodzących w skład fitolitoralu jeziornego, wśród których największą powierzchnię zajmowały Phragmitetum australis oraz Ceratophylletum demersi (Rys. 1). Zajmowały one łącznie 17,88 ha, co stanowiło 24,4% powierzchni całego jeziora. W pasie roślinności otaczającej jezioro oznaczono zbiorowisko Salicetum pentandro - cinereae, które z uwagi na siedlisko występowania nie zostało włączone do roślinności budującej fitolitoral jeziorny. Zbiorowisko stanowiące pas roślinności o powierzchni 7,08 ha pełni rolę strefy buforowej otaczającej jezioro Krasne – na długości 3,05 km, wzdłuż prawie całej linii brzegowej (Rys.1). Fitocenoza Pow. [ha] Udział [%] Ceratophylletum demersi 3,95 22,1 Charetum fragilis 0,87 4,9 Eleocharitetum palustris 0,11 0,6 Juncus conglomeratus 0,27 1,5 Myriophyllo - Littorelletum 0,86 4,8 Myriophyllum spicati 1,47 8,2 Nitellopsidetum obtusae 1,79 10,0 Phragmitetum australis 5,85 32,8 Scirpetum lacustris 0,22 1,2 Hydrocharitetum morsus - ranae 1,97 11,0 Typhetum angustifoliae 0,52 2,9 Razem: 17,88 100 Tab. 2. Powierzchnia i udział poszczególnych zbiorowisk roślinnych w tworzeniu fitolitoralu jeziora Krasne [ha, %] 112 Stan ekologiczny jeziora Krasne... Rys. 3. Rozmieszczenie zbiorowisk roślinnych jeziora Krasne W badanym jeziorze rozwinęły się dwie grupy makrofitów: wynurzone i zanurzone. Zdecydowaną większość w tworzeniu fitolitoralu stanowiły elodeidy, zajmując 61% jeziornego fitolitoralu, co z punktu widzenia ekologicznego jest korzystne ze względu na dobre warunki świetlne umożliwiające rozwój tej grupie roślin. Natomiast helofity jako nieuzależnione od warunków świetlnych panujących w wodzie, zajmowały powierzchnię 6,97 ha, co stanowiło 39% (Tab. 3). Typ roślinności Jez. Krasne ha % pow. fitolitoralu % pow. jeziora z fitolitoralem 6,97 38,98 9,5 Elodeidy 10,91 61,02 14,9 Razem 17,88 100 24,4 Helofity Tab. 3. Powierzchnia i udział poszczególnych zbiorowisk roślinnych w fitolitoralu jeziora Krasne, zarówno w odniesieniu do samego fitolitoralu, jak i jeziora wraz z fitolitoralem Wśród elodeidów obliczono stosunek zajmowanej powierzchni przez Chareta do Potametea. Duży udział wśród grupy elodeidów miały ramienice, stanowiły bowiem 25%, co również wskazuje na dobry stan ekologiczny wód badanego jeziora [Pełechaty, Pukacz 2006, Pełechaty i in. 2007]. 113 Weronika Maślanko, Joanna Sender Na podstawie uzyskanych wartości wskaźników makrofitowych miary stanu ekologicznego jeziora, badane jezioro wykazało dobry stan ekologiczny (Tab. 4). Wartości wskaźnika TRS wskazywały nawet na oligotroficzny charakter wód tego zbiornika, podobnie jak w latach 50-tych XIX w. [Fijałkowski 1959]. Natomiast w latach 90-tych jezioro to było zaliczane do jezior o charakterze mezotroficznym [Harasimiuk i in.1998]. Powierzchnia ograniczona izobatą 2,5 m [ha] 14,09 Powierzchnia fitolitoralu [ha] 17,88 Liczba zespołów (S) 11 Wskaźnik zróżnicowania fitocenotycznego (H) 1,1 Wskaźnik zasiedlenia (Z) 1,26 Wskaźnik maksymalnego zróżnicowania fitocenotycznego (Hmax) 2,39 Makrofitowy Indeks Stanu Ekologicznego (ESMI) 0,52 Reference Index (RI) 0,74 Trophic Ranking Score (TRS) 6,9 Tab. 4. Referencyjne wskaźniki zróżnicowania fitocenotycznego jeziora Krasne Analizując zmiany w układzie roślinności na przestrzeni 50 lat (1959 – 2011) na analizowanym transekcie E – SSW nastąpiła znaczna przebudowa struktury makrofitów (Rys. 2). Zbiorowisko Ranunculo – Juncetum zostało całkowicie wyparte przez Salicetum pentandro – cinereae, natomiast zbiorowisko Myriophyllo – Littorelletum sięgające obecnie do nieco ponad 2m głębokości wyparło całkowicie Eleocharitetum palustris i Charetum asperii. W latach 50-tych na brzegu wschodnim Ceratophylletum demersi zalegało znacznie płyciej (1,5-3m) niż obecnie (5-7m). Jako nowe zbiorowisko na tym brzegu pojawiło się Hydrocharitetum morsus - ranae (na głębokości 2-6m). Z brzegu południowo - zachodniego wyznaczonego transektu całkowicie ustąpiło Plantagineto Lolietum na rzecz Salicetum pentandro - cinereae, natomiast Elocharitetum palustris zostało całkowicie wyparte przez Phragmitetum australis. Na podobnej głębokości nadal znajdowało się Myriophyllum spicati. Schodzące do głębokości ponad 3 m w latach 50-tych Ceratophylletum demersi zostało zastąpione przez Charetum fragilis (obecny zasięg do 7 m). Na obu brzegach analizowanego transektu zanotowano całkowity zanik Plantagineto Lolietum oraz Ranunculo - Juncetum w wyniku ekspansji Salicetum pentandro - cinereae. 114 Stan ekologiczny jeziora Krasne... Rys. 2. Układ zbiorowisk roślinnych na analizowanym transekcie florystycznym (nomenklatura wg Matuszkiewicza, 2008): a) w roku 1959 [Fijałkowski 1959], b) w roku 2011 W trakcie analiz struktury użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne w okresie prawie 20 lat stwierdzono znaczne zmiany. W porównywanym okresie czasu w zlewni jeziora Krasne powstały 3 nowe zbiorniki wodne, tworząc z już istniejącymi kompleks sąsiadujących ze sobą 6 stawów. Utworzenie nowych stawów wraz z rozwijającą się roślinnością szuwarową wpływa na zwiększenie bioróżnorodności tego obszaru, stanowiąc potencjalnie nowe refugia lęgowe dla wielu gatunków. Zbiorowiska zaroślowe w zlewni zwiększyły swą powierzchnię o ok. 6,17 ha. Powierzchnia łąk zredukowana została o ponad 8 ha, co wskazuje na wykorzystanie ich pod zabudowę rekreacyjną, nowe stawy oraz pola uprawne nawet znajdujących się w bliskim sąsiedztwie jeziora powierzchni łąkowych (Tab. 4). Jezioro Krasne posiada dwa dostępne dla turystów piaszczyste brzegi o powierzchni 0,47 ha (od strony północnej) i 0,06 ha (od strony południowo – wschodniej). Łączna długość piaszczystych plaż nad jeziorem Krasne wynosi 299,2 m. Stanowi to jedynie 8,5% całej linii brzegowej, umożliwiając swobodny (nieograniczony) rozwój roślinności fitolitoralowej na pozostałej długości brzegów. Piaszczyste brzegi jeziora, pozbawione roślinności szuwarowej i wykorzystywane rekreacyjnie, bezpośrednio sąsiadują z zabudową letniskową i rekreacyjną stwarzając dogodną bazę noclegową i wypoczynkową dla turystów (Rys. 3). 115 Weronika Maślanko, Joanna Sender Formy użytkowania ziemi w zlewni Zmiany powierzchni (ha) Zmiany powierzchni Obecny udział w zlewni [%] 1990 wg Wilgata 2007/2009 Lustro wody jeziora Krasne 74,92 73,2 -1,72 22,3 Inne zbiorniki wodne 23,16 28,94 5,78 8,8 Zbiorowiska szuwarowe b.d. 8,88 b.d. 2,7 Zbiorowiska zaroślowe 1,15 7,32 6,17 2,2 Torfowiska z sukcesją 0 0,07 0,07 0,02 Łąki 36,64 28,41 -8,23 8,6 Kompleksy leśne 40 45,9 5,9 14 Zieleń produkcyjna 0,32 0,24 -0,08 0,07 Pola uprawne 96,41 96,17 -0,24 29,2 Pojedyncze gospodarstwo rolne b.d. 0,15 b.d. 0,05 Zwarta zabudowa wiejska 4,67 9,21 4.54 2,8 Zabudowa letnia i rekreacyjna 1,35 30,35 29 9,3 RAZEM X 328,85 X 100 Tab. 4. Zmiany struktury użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne w latach 90-tych i obecnie Wg analiz porównawczych lesistość zlewni jeziora Krasne niewiele się zwiększyła. Zabudowa wiejska (wieś Krasne) tworząc zwarty pierścień otacza zachodni brzeg jeziora. Najbardziej naturalny i najmniej podatny na wpływ antropogeniczny wydaje się być wschodni brzeg jeziora, otoczony dużym kompleksem leśnym, wychodzącym ponad granice zlewni, o pow. 51ha. Zabudowa letniskowa i rekreacyjna w zlewni jeziora Krasne rozwinęła się głównie przy piaszczystych brzegach jeziora, a także towarzysząc zwartej zabudowie wiejskiej (przy wsi Krasne) (Rys. 3). W latach 90-tych XX w. zabudowa ta zajmowała ok. 1,35 ha, a już pod koniec I dziesięciolecia XXI w. – 30,35 ha. Intensywna rozbudowa bazy letniskowo – rekreacyjnej jest częstym zjawiskiem nad jeziorami użytkowanymi turystycznie na Pojezierzu Łęczyńsko – Włodawskiego w okresie kilkudziesięciu lat [Chmielewski, Chmielewski 2009]. Część północną oraz zachodnią badanej zlewni stanowią wielkoobszarowe pola uprawne zajmujące łącznie 96,17 ha. Analizując formy użytkowania zlewni jeziora Krasne można stwierdzić, że dominującymi są wciąż rolnictwo (29,2 %), a w ostatnim dwudziestoleciu również rekreacja (9,3%). 116 Stan ekologiczny jeziora Krasne... WNIOSKI • W użytkowanym typowo rekreacyjnie jeziorze zidentyfikowano aż 11 zbiorowisk makrofitów, zajmujących łącznie 17,88 ha. Największą powierzchnię zajmowało Phragmitetum australis (5,85 ha) oraz Ceratophylletum demersi (3,95 ha). W jeziorze dominowała roślinność zanurzona. • W okresie 50 lat nastąpiły wyraźne zmiany w strukturze jakościowej i ilościowej makrofitów. • Zastosowane do oceny stanu ekologicznego jeziora wskaźniki makrofitowe wskazały na dobry stan badanego jeziora. • Dominującymi formami użytkowania ziemi w zlewni jeziora Krasne są rolnictwo i rekreacja. Od lat 90-tych XX w. nastąpiło ponad 20-krotne zwiększenie powierzchni wykorzystywanej pod zabudowę letniskową i rekreację. Rys. 3. Obecna struktura użytkowania ziemi w zlewni jez. Krasne 117 Weronika Maślanko, Joanna Sender LITERATURA Bernatowicz S., Wolny P. 1974. Botanika dla limnologów i rybaków. Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i leśne, Warszawa. Braun-Blanquet J. 1951. Pflanzensoziologie. Springer Verlag, Wien. Chmielewski T. J., Olenderek H., Sielewicz B. 1996. Fotointerpretacyjna analiza retrospektywna zmian struktury ekologicznej Kampinoskiego Parku Narodowego w ostatnim 40-leciu. [w:] Kistowski M. (red.): Badania ekologiczno – krajobrazowe na obszarach chronionych. Uniwersytet Gdański, Polska Asocjacja Ekologii Krajobrazu, Gdańsk: 125-129. Chmielewski T. J., Jankowska P. 2009. Changes in the level and structure of tourism on selected lakes of Łęczna – Włodawa Lakeland from 1985 to 2008. [In:] Chmielewski T.J., Sławiński C. eds. Nature and Landscape Monitoring System in the West Polesie Region. Lublin: 1-270. Chmielewski Sz., Chmielewski T.J. 2009. Analiza zmian struktury użytkowania ziemi w latach 1952-2007. [w:] Chmielewski T.J. red. Ekologia krajobrazów hydrogenicznych Rezerwatu Biosfery „Polesie Zachodnie”. Lublin: 1-344. Ciecierska H., Kolada A., Soszka H., Gołub M. 2006. Methodological improvements in the macrophyte-based biological monitoring of surface waters – a pilot study of waters representing selected categories and types. Stage II. Methods for field investigations of macrophytes for the purpose of routine water monitoring, and macrophyte-based assessment and classification of the ecological status of waters. Institute of Environmental Protection, Warszawa (in Polish). Ciecierska H. 2008. Macrophytes as indicators of the ecological status of lakes. Monographs and Dissertations, 139. University of Warmia and Mazury in Olsztyn (in Polish). Ciecierska H., Kolada A., Soszka H., Gołub M. 2010. A Method for Macrophyte Based Assessment of the Ecological Status of Lakes, Developed and Implemented for the Purpose of Environmental Protection in Poland. BALWOIS 2010 – Ohrid, Republic of Macedonia – 25, 29 May 2010. Cook R. E. 1983. Clonal plant populations. Ann. Sci., 71 (1983), 244–253. Fijałkowski D. 1959. Szata roślinna Jezior Łęczyńsko – Włodawskich i przylegających do nich torfowisk. Annales UMCS, Lublin, Sec. B., vol. 14,3: 131-206. Harasimiuk M., Michalczyk Z., Turczyński M. red. 1998. Jeziora łęczyńsko – włodawskie. Monografia przyrodnicza. Biblioteka Monitoringu Środowiska Lublin: 1-176. Hartog C., Segal S. 1964. A New classification of the water plant communities. Acta Bot. Neerl.,13, 3,367−393. 118 Stan ekologiczny jeziora Krasne... Kolada A., Ciecierska H., Ruszczyńska J., Mjelde M., Dziedzic J., Dynowski P., Jasnorzewski A. 2011. Makrofity. [w:] Soszka H. red. Ocena stanu ekologicznego wód zlewni rzeki Wel. Olsztyn, 169- 185. Kornijów R., Radwan S. 2000. Zasady zrównoważonego użytkowania i ochrony jezior położonych na terenach wiejskich. [w:] Problemy ochrony i użytkowania obszarów wiejskich o dużych walorach przyrodniczych. Wyd. UMCS, Lublin. Maślanko W., Tajchman K., Chmielewski T.J. 2011. Selected indexes of anthropogenic load of environment in the West Polesie Biosphere Reserve. Teka Komisji Ochrony i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego.Tom VIII, Lublin: 86-96. Maślanko W., Sender J., Kułak A. 2011a. Hydrobotaniczna charakterystyka oczek wodnych w dolinie rzeki Ciemięgi na odcinku Jastków – Snopków. Nr 12 . t. 1. Matuszkiewicz W. 2008. Przewodnik do oznaczania zbiorowisk roślinnych Polski. PWN, Warszawa. Palmer M. 2001. An approach to the use of macrophytes for monitoring standing waters. Freshwater Forum, Vol 16, No 1, 82-90. Pełechaty M., Pukacz A. 2006. Flora i roślinność ramieniowa jezior Poligonu Wojskowego Wędrzyn oraz Łagowskiego Parku Krajobrazowego (środkowo-zachodnia Polska) na tle stanu roślinności wodnej i szuwarowej. Ekologia i Technika, 14, 6: 237-245 Pełechaty M., Pełechata A., Pukacz A. 2007. Flora i roślinność ramieniowa na tle trofii jezior Pojezierza Lubuskiego (środkowozachodnia Polska). Uniwersytet Adama Mickiewicza w Poznaniu. Bogucki Wydawnictwo Naukowe, Poznań. Raport o stanie środowiska województwa lubelskiego za rok 1998. Biblioteka Monitoringu Środowiska, Lublin. 1999, 1-256. Raport o stanie środowiska województwa lubelskiego w 2002 roku. Biblioteka Monitoringu środowiska Lublin 2003, 1-256. Grzywna 123-135 Sender J. 2009. Changes in structure of macrophyte communities in the chosen lakes of Łęczna-Włodawa Lake District. Ecohydrology & Hydrobiology. Vo. 9, No 2-4, 237-245. Sender J. 2011. Directions of changes in the macrophyte structure of two depression reservoirs in Łęczna-Włodawa Lakeland. Teka Komisji Ochrony i Kształtowania Środowiska Przyrodniczego.T. VIII,Lublin:151-158. Stelzer D.,Schneider S.,Melzer A.2005. Macrophyte-Based Assessment of Lakes – a Contribution to the Implementation of the European Water Framework Directive in Germany. Internat. Rev. Hydrobiol.90,2:223-237. 119 Weronika Maślanko, Joanna Sender Szmeja J. 2006. Przewodnik do badań roślinności wodnej. Wyd. Uniwersytetu Gdańskiego. Wilgat T. 1954. Jeziora łęczyńsko - włodawskie. Annales UMCS, s. B, t. VII, 37-122. Wilgat T., Michalczyk Z., Turczyński M., Wojciechowski K. 1991. Jeziora łęczyńsko – włodawskie. Studia Ośrodka Dokumentacji Fizjograficznej, t. XIX, PAN. O. Kraków, 23-140. Wołek J. 1996. Occurrence and distribution of aquatic and rushes vegetation in the Czorsztyn – Niedzica Sromowe Wyżne reservoirs before water damming (in Polish). Fragm. Flor. Geobot. ser. Polonica 3, 189–203. Adres do korespondencji: Weronika Maślanko, Joanna Sender Zakład Ekologii Krajobrazu i Ochrony Przyrody Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Dobrzańskiego 37, 20-262 Lublin e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Tadeusz J. Chmielewski, prof. nadzw. UP 120 Agnieszka Ozimek Małgorzata Koncewicz-Baran EPISTEME 14/2012 s. 121-128 ISSN 1895-4421 WPŁYW NAWOŻENIA KOMPOSTAMI Z DODATKIEM ODPADÓW BIODEGRADOWALNYCH NA ZAWARTOŚĆ MANGANU W GLEBIE I ROŚLINACH EFFECT OF COMPOST BIODEGRADABLE WASTE FERTILIZATION ON THE MANGANESE CONTENT IN SOIL AND PLANTS Abstrakt. Celem badań prowadzonych w oparciu o dwuletnie doświadczenie wazonowe było określenie wpływu kompostu z dodatkiem odpadów biodegradowalnych na zawartość manganu w biomasie roślin oraz formy przyswajalne tego pierwiastka w glebie. Dla porównania wprowadzono nawożenie czystymi chemicznie solami (NPK) oraz obornikiem od trzody chlewnej. Największe plony biomasy, przy założonych dawkach nawożenia, uzyskano w obydwu latach doświadczenia w obiektach, w których zastosowano obornik. Największe ilości manganu zawierały rośliny w obiektach, w których zastosowano sole mineralne. Zawartość manganu w biomasie z obiektu z wprowadzonym kompostem z dodatkiem mączki mięsno-kostnej była zbliżona do ilości w biomasie z obiektu z obornikiem. Po drugim roku badań najwięcej manganu przyswajalnego, wyekstrahowanego roztworem 0,01 mol ∙ dm-3 CaCl2, oznaczono w glebie z dodatkiem soli mineralnych. Duża zawartość tej formy manganu była również w glebie z obiektu, w którym zastosowano obornik oraz kompost z dodatkiem mączki mięsno-kostnej. Słowa kluczowe: kompost, mangan, gleba, roślina Summary. The aim of research conducted on the basis of a two-year pot experiment was to determine the effect of the addition of compost biodegradable waste at the manganese content in the plant biomass and absorbed forms this element in the soil. For comparison, chemically pure salts fertilization (NPK) and manure from pigs. The highest yields of biomass, with established doses of fertilization, were obtained in both years of experience in facilities that use organic materials. The greatest amount of manganese contained in the plant premises, using mineral salts. The manganese content in the biomass of the object with the introduction of compost with the addition of meat and bone meal was similar to the amount of biomass from the facility with manure. After the second year of the study most of available manganese, the extracted solution of 0.01 mol ∙ dm-3 CaCl2, were determined in soil supplemented with mineral salts. High content of this form of manganese was also in the soil from the facility, which uses manure and compost with the addition of meat and bone meal. Key words: compost, manganese, soil, plant 121 Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran WSTĘP Kompostowanie odpadów, w tym odpadów biodegradowalnych, przynosi wielostronne korzyści dla poprawy stanu środowiska. W ostatnich latach proces jest wykorzystywany do zagospodarowania i redukcji odpadów trafiających na składowiska. W wyniku prawidłowo przeprowadzonego procesu kompostowania, może powstać nawóz organiczny, który po zastosowaniu powinien zwiększać zasobność gleby w próchnicę, makro i mikroelementy. Jego działanie nawozowe zarówno na glebę, jak i rośliny jest rozłożone czasie [Jakubus 2009, Jasiewicz i Baran 2009]. W trakcie procesu kompostowania następuje kompleksowanie metali ciężkich z ustabilizowaną materią organiczną, co powoduje występowanie matali w stabilnych chemicznie połączeniach i mniejszą ich przyswajalność przez rośliny [Jakubus 2009]. Stosując doglebowo komposty należy zwrócić uwagę na analizę form metali przyswajalnych dla roślin, gdyż ogólna zawartość składnika nie ma diagnostycznego znaczenia dla odżywiania roślin. Roztwór ekstrakcyjny 0,01 mol ∙ dm-3 CaCl2 pełniący funkcję „fizjologicznego” roztworu glebowego może być przydatny do oceny dostępności składników pokarmowych dla roślin [Burzyńska 2009, Jakubus 2009]. MATERIAŁ I METODY Wpływ kompostu z dodatkami odpadów biodegradowalnych na zawartość manganu w glebie i roślinach oceniano w doświadczeniu wazonowym. Doświadczenie prowadzono w dwóch sezonach wegetacyjnych w latach 2010 – 2011 w hali wegetacyjnej w Krakowie – Mydlnikach. Materiał glebowy – piasek gliniasty mocny pylasty [wg BN-78/9180-11], pobrano z warstwy ornej 0-20 cm gruntu ornego stacji doświadczalnej Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie - Mydlnikach. Wybrane właściwości materiału glebowego oznaczono przed rozpoczęciem badań metodami powszechnie stosowanymi w chemii rolnej [Ostrowska i in. 1991]. Kwasowość hydrolityczna gleby wynosiła 19,4 mmol(+)·kg-1 s.m., zawartość węgla organicznego 7,90 g·kg-1 s.m., zaś ogólna zawartość azotu wynosiła 1,16 g·kg-1 s.m. Ogólna zawartość manganu w glebie wynosiła 323,3 mg·kg-1 s.m. W doświadczeniu wazonowym wykorzystana została frakcja przesiewowa kompostu (Ø cząstek > 1cm). Charakterystykę materiałów organicznych wprowadzonych do gleby w doświadczeniu podano w tabeli 1. Schemat eksperymentu obejmował 9 obiektów prowadzonych w 4 powtórzeniach: bez nawożenia (0), z dodatkiem soli mineralnych (M), z dodatkiem obornika od trzody chlewnej (OB), z dodatkiem kompostu kontrolnego (KK), z dodatkiem kompostu z papierem gazetowym (KG), z dodatkiem kompostu z folią biodegradowalną (KF), z dodatkiem kompostu z mączką mięsno-kostną (KM), z dodatkiem kompostu z przepracowanym olejem jadalnym (KO). 122 Wpływ nawożenia kompostami z dodatkiem odpwadów... Wraz z materiałami organicznymi wprowadzono następujące ilości manganu w przeliczeniu na wazon poszczególnych obiektów: OB: 25,49 mg, KK: 8,83 mg, KG: 7,10 mg, KF: 7,96 mg, KM: 4,50 mg, KO: 8,06 mg. Oznaczenie obornik kompost kontrolny kompost + papier gazetowy Sucha masa (g ∙ kg-1) 160 594 613 572 646 549 pH H2O 7,73 7,66 7,78 7,63 6,37 7,76 Materia organiczna (g ∙ kg-1 s.m.) 840 434 467 515 481 448 Przewod. elektrol. (mS·cm ) 4,03 8,40 6,85 6,81 9,98 5,58 C organiczny (g ∙ kg s.m.) 169,29 169,30 195,0 206,55 180,21 163,14 N (g ∙ kg s.m.) 36,72 21,94 20,11 21,66 27,60 20,81 P (g ∙ kg s.m.) 11,72 3,76 4,05 3,96 9,47 5,42 -1 -1 -1 -1 kompost kompost + folia + mączka biodegr. mięs.-kost. kompost + olej jadalny K (g ∙ kg s.m.) 18,44 9,47 8,07 9,56 14,67 10,51 Mn (mg ∙ kg-1 s.m.) 226,7 275,85 213,41 260,88 212,92 262,15 -1 Tab. 1. Wybrane właściwości fizyczne i chemiczne materiałów użytych w doświadczeniu wazonowym Przed założeniem doświadczenia materiał glebowy w ilości 5,50 kg powietrznie suchej masy umieszczono w wazonach z tworzywa sztucznego i stopniowo nawilżano, doprowadzając go do wilgotności 30% maksymalnej pojemności wodnej. Następnie wprowadzono obornik, materiały organiczne oraz sole mineralne i wymieszano je z glebą. W pierwszym roku doświadczenia zastosowano dawkę azotu na poziomie 0,15 g N ∙ kg-1 s.m. gleby. Dawkę azotu wprowadzono w 80% z materiałami organicznymi i w 20% w formie wodnego roztworu NH4NO3 (poza NPK i kontrolą). Fosfor w glebach wszystkich obiektów (poza kontrolą), uzupełniono do jednakowego, najwyższego poziomu 0,049 g P ∙ kg-1 s.m. gleby, wprowadzonego z nawożeniem, a potas do 0,18 g K ∙ kg-1 s.m. gleby. Fosfor wprowadzono formie wodnego roztworu Ca(H2PO4)2 ∙ H2O, a potas w formie wodnego roztworu KCl. Rośliną uprawianą w pierwszym roku badań był rzepak jary odmiany „Feliks”. Rośliny zbierano w końcowej fazie kwitnienia z podziałem na części nadziemne oraz korzenie. Zebrany materiał roślinny suszono w temperaturze 70 °C w suszarce z przepływem powietrza i określono plon suchej masy. Następnie rośliny zmielono w młynku laboratoryjnym i poddano analizom chemicznym. Po zbiorze roślin w każdym roku pobierano próbki materiału glebowego. W drugim roku badań we wszystkich obiektach, oprócz kontrolnego zastosowano nawożenie uzupełniające azotem, fosforem i potasem w formie 123 Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran związków soli mineralnych, jakie zastosowano w roku pierwszym. Ilości nawozów wynosiły: 0,15 g N ∙ kg-1 s.m. gleby, 0,051 g P ∙ kg-1 s.m. gleby oraz 0,24 g K ∙ kg-1 s.m. gleby. Azot został wprowadzony w dawce podzielonej: 80% dawki wprowadzono 9 dni przed siewem nasion, pozostałe 20% dawki w fazie strzelania w źdźbło. Rośliną testową był owies nagoziarnisty odmiany „Siwek” [IUNG, 2005]. Rośliny zbierano w fazie dojrzałości mlecznej ziarna z podziałem na części nadziemne i korzenie, suszono w temperaturze 70 °C i określono plon suchej masy. W materiale roślinnym zarówno po I, jak i po II roku badań oznaczono: zawartość ogólną manganu po mineralizacji próbki w piecu muflowym (450 o C przez 5 godz.) i roztworzeniu pozostałości w rozcieńczonym (1:2) kwasie azotowym (V); następnie oznaczono metodą ICP-OES na aparacie Perkin Elmer Optima 7300DV, a uzyskane wyniki przeliczono na absolutnie suchą masę materiału roślinnego. W materiale glebowym oznaczono: zawartość formy ogólnej manganu po spopieleniu substancji organicznej w piecu muflowym (temp. 500 °C przez 8 godz.) i mineralizacji próbek w mieszaninie (2:1) stężonych kwasów azotowego (V) i nadchlorowego (VII) metodą ICP-OES na aparacie Perkin Elmer Optima 7300DV, zawartość form przyswajalnych manganu po ekstrakcji roztworem CaCl2 o stężeniu 0,01 mol ∙ dm-3 – metodą ICP-OES. Uzyskane wyniki poddano ocenie statystycznej z uwzględnieniem analizy wariancji jednoczynnikowej (czynnik: nawożenie). Istotność różnic pomiędzy średnimi arytmetycznymi oszacowano za pomocą testu Duncana przy poziomie istotności α < 0,05. WYNIKI I DYSKUSJA Największy plon biomasy zarówno rzepaku jarego, jak i owsa uzyskano w przypadku obiektu z wprowadzonym obornikiem (Tab. 2). Podobne wyniki w plonowaniu życicy wielokwiatowej uzyskały Kalembasa i Wiśniewska [2007]. Plony biomasy z obiektów z wprowadzonymi kompostami kształtowały się na nieco niższym poziomie. W pierwszym roku badań nie wykazano różnic w plonach biomasy rzepaku z obiektów z wprowadzonymi kompostami oraz solami mineralnymi. W drugim roku badań ujawniło się działanie następcze materiałów organicznych, a plony owsa z obiektów z zastosowanym nawożeniem obornikiem oraz kompostami były istotnie większe od plonów z obiektu, w którym zastosowano nawożenie solami mineralnymi (Tab. 2). W porównaniu z zastosowanymi doglebowo materiałami organicznymi i obornikiem, nawożenie solami mineralnymi znacznie zwiększyło zawartość manganu w biomasie zarówno rzepaku jarego, jak i owsa, co potwierdzają badania innych autorów [Gondek 2008, Gondek i Koncewicz-Baran, 2011]. 124 Wpływ nawożenia kompostami z dodatkiem odpwadów... Owies Obiekt* Rzepak jary części nadziemne 0 19,64 c** 3,34c 22,99c 26,75b 3,51b 30,26c M 37,15ab 8,12d 45,27a 44,38c 5,01c 49,38d OB 47,44d 6,11b 53,56d 51,88d 7,50a 59,38e KK 38,36ab 5,68ab 44,04ab 50,13a 7,07a 57,20b KG 38,78 5,46 44,25 50,0 6,97 a 56,97ab KF 36,54a 5,36a 41,90b 49,25a 6,99a 56,23ab KM 39,96b 5,75ab 45,71a 48,63a 6,63a 55,25a KO 38,58ab 5,41a 43,99ab 48,88a 7,14a 56,02ab korzenie suma części nadziemne korzenie suma g s.m.∙ wazon-1 ab a ab a Tab. 2. Ilość biomasy części nadziemnych i korzeni rzepaku jarego i owsa (g s.m. ∙ wazon-1). * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce: 0 – bez nawożenia, M - z dodatkiem soli mineralnych, OB - z dodatkiem obornika od trzody chlewnej, KK - z dodatkiem kompostu kontrolnego, KG - z dodatkiem kompostu z papierem gazetowym, KF - z dodatkiem kompostu z folią biodegradowalną, KM - z dodatkiem kompostu z mączką mięsno-kostną, KO - z dodatkiem kompostu z przepracowanym olejem jadalnym. ** - Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie Obiekt* Biomasa owsa z obiektów z wprowadzonymi kompostami zawierała około 5-krotnie więcej manganu w porównaniu z biomasą rzepaku (Tab. 3). Zawartość manganu w korzeniach owsa była większa niż zawartość tego pierwiastka w częściach nadziemnych. Korzenie owsa mają bardzo dużą zdolność pobierania składników pokarmowych znajdujących się w glebie w formie trudno dostępnej dla roślin. Pod tym względem owies dominuje nad innymi zboża [IUNG, 2005]. Znaczne ilości manganu w biomasie owsa dalekie były od zawartości toksycznych. Kabata-Pendias [1999] podaje zawartość 500 mg Mn ∙ kg-1 s.m. za stężenie toksyczne dla większości gatunków. W korzeniach rzepaku oznaczono dużo mniejsze ilości Mn niż w częściach nadziemnych. Rzepak jary części nadziemne Owies korzenie części nadziemne korzenie mg Mn ∙ kg a.s.m. -1 0 26,39a** 11,64a 67,86b M 325,91 44,38 479,79 460,85f OB 92,03d 23,50b 300,86e 258,79ab KK 38,41 14,45 193,58 252,26ac e ab c a 109,02e f a 125 Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran KG 41,36b 14,38a 187,63a 227,93c KF 36,42ab 13,64a 205,46a 263,82ab KM 55,67c 14,21a 279,62d 297,13d KO 37,93ab 12,58a 244,65c 283,95bd Tab. 3. Zawartość manganu w biomasie rzepaku jarego oraz owsa (mg ∙ kg-1 a.s.m.). * - Obiekty doświadczenia jak w metodyce i Tab. 2. ** Średnie oznaczone tymi samymi literami w kolumnach nie różnią się istotnie wg testu Duncana przy α < 0,05; czynnik: nawożenie Zastosowane nawożenie mineralne przyczyniło się do zwiększenia zawartości przyswajalnych form manganu w badanej glebie (Rys. 1), zarówno w pierwszym, jak i drugim roku badań. Zawartość manganu przyswajalnego, ekstrahowanego roztworem CaCl2 o stężeniu 0,01 mol ∙ dm-3, w glebie nawożonej solami mineralnymi, wynosiła 55,23 mg ∙ kg-1 s.m. w pierwszym roku, (co stanowiło 17% zawartości ogólnej), w drugim roku zawartość ta zmalała do 42,64 mg Mn ∙ kg-1 s.m. gleby (14% zawartości ogólnej Mn). Po zastosowaniu materiałów organicznych, zawartość mobilnych form manganu była istotnie mniejsza od zawartości oznaczonej w glebach z obiektów nawożonych solami mineralnymi (Rys. 1). W przypadku zastosowanych kompostów zawartość manganu przyswajalnego wynosiła w pierwszym roku badań od 23,87 (KG) do 28,34 mg ∙ kg-1 s.m. gleby (KM). Stanowiło to odpowiednio 8 i 9% zawartości ogólnej Mn i były to zawartości istotnie mniejsze w porównaniu z zawartościami w glebie z wprowadzonym obornikiem (35,36 mg Mn ∙ kg-1 s.m.). W drugim roku wyekstrahowano mniejsze zawartości manganu przyswajalnego w każdym z obiektów, zwłaszcza z gleby bez nawożenia (0) (Rys. 1). Zastosowane w procesie kompostowania dodatki odpadów biodegradowalnych na ogół nie modyfikowały w istotny sposób zawartości form przyswajalnych manganu w glebie. Rys. 1. Zawartość Mn przyswajalnego, wyekstrahowanego z gleby roztworem CaCl2 o stężeniu 0,01 mol·dm-3, po 1 i 2 roku badań 126 Wpływ nawożenia kompostami z dodatkiem odpwadów... WNIOSKI • Najlepszy efekt, wyrażony ilością biomasy, uzyskano w obydwu latach doświadczenia w obiekcie, w którym zastosowano nawożenie obornikiem. Nawożenie gleby kompostami z dodatkiem odpadów biodegradowalnych pozwoliło na osiągnięcie plonów biomasy rzepaku na poziomie zbliżonym do obiektów z wprowadzonym, równoważnym nawożeniem mineralnym już w pierwszym roku badań. • Istotnie większe zawartości manganu zawierała biomasa owsa w porównaniu z biomasą rzepaku, które były jednak znacząco mniejsze od zawartości uważanej za ograniczającą wzrost. • Zastosowane dodatki odpadów biodegradowalnych nie różnicowały w istotny sposób zawartości manganu w biomasie roślin rzepaku i owsa, jak również form przyswajalnych tego pierwiastka w glebie. • Najwięcej form przyswajalnych manganu oznaczono w glebie z obiektu, w którym zastosowano nawożenie mineralne. 127 Agnieszka Ozimek, Małgorzata Koncewicz-Baran LITERATURA BN-78/9180-11 Gleby i utwory mineralne. Podział na frakcje i grupy granulometryczne. Burzyńska I. 2009. Wpływ zróżnicowanego nawożenia na zawartość łatwo rozpuszczalnego manganu i cynku w glebie łąkowej. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541: 81-87. Charakterystyka i technologia uprawy odmian owsa. 2005. IUNG Puławy, IHAR Radzików, COBORU Słupia Wielka. Gondek K. 2008. Contents of manganese in maize and soil fertilized with organic materials. Ecological Chemistry and Engineering A, 15(10): 1057-1066. Gondek K., Koncewicz-Baran M. 2011. Manganese content in biomass of spring wheat, soil and soil effluents after fertilization with municipal sewage sludge and kompost of municipal waste. Pol. J. Environ. Stud. 20(6): 1481-1489. Jakubus M. 2009. Zawartość Fe i Mn w glebie ekstrahowane roztworami o różnej sile jonowej podczas rozkładu kompostu. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541: 121-131. Jasiewicz Cz., Baran A. 2009. Wpływ odpadów organicznych na przyswajalność mikroelementów w glebie lekkiej. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 541: 147-156. Kabata-Pendias A., Pendias H. 1999. Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 388 ss. Kalembasa D., Wiśniewska B. 2007. Wpływ nawożenia obornikiem, kompostami i wermikompostami obornikowymi na plon i zawartość azotu w życicy wielokwiatowej (Lolium Multiflorum Lam.) oraz w glebie. Acta Sci. Pol., Agricultura 6 (2): 39-45. Ostrowska A., Gawliński A., Szczubiałka Z. 1991. Metody analizy i oceny gleby i roślin. Wydawnictwo Instytutu Ochrony Środowiska, Warszawa, ss. 325. Adres do korespondencji: mgr inż. Agnieszka Ozimek, mgr inż. Małgorzata Koncewicz-Baran Katedra Chemii Rolnej i Środowiskowej Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Michał Kopeć 128 Krzysztof Stasiak Karolina Piekarska Ignacy Kitowski EPISTEME 14/2012 s. 129-136 ISSN 1895-4421 THE BREEDING POPULATION OF MAGPIE PICA PICA IN CHEŁM (EASTERN POLAND) – A COMPARISON OF SURVEYS OF 1991 AND 2011 POPULACJA LĘGOWA SROKI PICA PICA NA OBSZARZE CHEŁMA (WSCHODNIA POLSKA) – PORÓWNANIE BADAŃ Z LAT 1991 I 2011 Summary. Magpie Pica pica is one of the species, which populated the urban environment relatively late. Paper compares the size of breeding population of magpie in Chełm (eastern Poland) in 1991 and 2011 and selected aspects of ecology of the species. In 1991 magpies were occupying nesting almost only in the city suburbs and no evidence of nesting in the inner city was found. The survey from 2011 revealed a significant decline in number of birds territories (n=27) comparing to 1991 (n=79). Same time the species was locked on nesting in the inner city. The most used magpies nesting habitat in 1991 were orchards and industrial area, and in 2011 meadows, orchards and neighborhood blocks of flats. In 1991 the most frequently used plants were poplars Populus spp and willows Salix spp, and in 2011 willows and hawthorns Crataegus spp. Key words: Magpie, Pica pica, nest, city Abstrakt. Sroka Pica pica należy do gatunków, które relatywnie późno zasiedliły środowisko miejskie. Praca porównuje liczebności populacji lęgowej sroki na obszarze miasta Chełma (wschodnia Polska), w roku 1991 i w roku 2011, oraz wybrane aspekty ekologii tego gatunku. W 1991 r. sroka zasiedlała niemal wyłącznie obrzeża miasta, natomiast nie odnotowano jej w śródmieściu. Podczas kontroli w 2011 r. wykazano spadek liczby zajmowanych rewirów (n=27), względem 1991 r. (n=79). Wtedy też stwierdzono przypadki gniazdowania w strefie śródmiejskiej. Najczęściej wybieranymi siedliskami były w 1991 r. sady i tereny przemysłowe, a w 2011 r. łąki, sady i osiedla bloków. W roku 1991 sroki najchętniej gnieździły się na topolach Populus spp. i wierzbach Salix spp., a w 2011 na wierzbach i głogu Crataegus spp.. Słowa kluczowe: sroka, Pica pica, gniazdo, miasto 129 Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski INTRODUCTION In opposite to region’s capital, Lublin, in other cities of Lublin Region there was no research held regarding magpie Pica pica. In many other Polish cities this kind of research was made during the species’ colonization and are continued nowadays [Okulewicz 1971, Klejnotowski 1974, Harmata 1985, Jerzak et al. 2009]. After the bird’s population was increasing in cities during latter half of the 20th century, a decrease of attention on this species was noted [Jerzak et al. 2009]. The species can be considered as a good model for describing behaviour and to follow processes within city birds’ populations, for it’s been living in urban area for a long time. The aim of the present study was to test two hypothesis. First one was the process of settling the inner part of the town by magpie would provide to increase of the species breeding density in 20 years period. The second hypothesis claimed that the breeding density increase would provide to changes in most commonly used nesting places and nesting habitats. To test those hypothesis, two surveys in 1991 and in 2011 were conducted. STUDY AREA AND METHODS Chełm is a town situated in eastern Poland, about 20 km from the Ukrainian Republic border. It lies upon the Uherka river, a left-bank tributary of the Bug river. The city is placed in the western part of the Volhynian Polesie, on the south-eastern edge of Chełm Hills. The city has several parks, and two cemeteries. The city area and the number of inhabitants remained practically unchanged between 1991 and 2011 and have been approximately 35.3 km2 and 67 thousand inhabitants [Urząd Statystyczny w Chełmie 1998, Urząd Statystyczny w Lublinie 2010]. According to Górski [1997], the area of Chełm town was divided into urban zone and suburban zone. Urban zone takes approximately 20 km2, which is 57,0 % of the city. Suburban zone takes 15.3 km2. The urban zone was the part of Chełm with predominantly built-up areas with a highly developed transport infrastructure. The suburban zone was the rest of the town, with lose buildings and barely developed transport infrastructure. The inner city is defined as the oldest, central part of Chełm, within 2 km from the highest point of the town, which is Górka Chełmska. Spring nest counts were held between the end of March and mid May, before or during the trees’ foliage development. Autumn counts were held since mid November, just after leaf fall. In spring, each newly-built nest was accepted as a breeding pair. During autumn surveys, intact nests situated at least 50 meters from each other, have been treated as different nesting pairs. If the group of nests has been found and only one was undamaged, it has been treated as one nesting territory. Same protocols were used during surveys in 1991 and in 2011. 130 The breeding population of magpie Pica Pica... RESULTS During surveys held in 1991, 79 breeding pairs of magpie were found in the whole Chełm area, which gives density of 2,2 pairs/km2. In the urban zone 32 pairs were found (1,6 pairs/km2). In the suburban zone 47 nesting pairs were found, which means 3,1 pairs/km2. The survey from 2011 revealed a noticeably decline in number of the birds’ territories, only 27 breeding pairs were found over the town (0,7 pairs/km2). In the urban zone 15 pairs were found, which is 0,75 pairs/km2. Another 12 pairs were found in the suburban zone and the breeding density there was 0,8 pairs/km2. Up to 27,5% of 109 magpies’ nests found in 1991 were placed in orchards in the suburbs. It was the most commonly used nesting habitat (Tab. 1). The second mostly chosen habitat was industrial area with manufactures, railways, railway stations and magazines, where 24,8% of birds have brood. In housing estate 13,8% of nests were located and only in 3,7% birds have chosen city parks. Jointly 23,8% of breeding pairs were found in shrub on fields, meadows, allotment gardens and small anthropogenic woods. Birds were found also on farmyards located inside the city borders. The important result of the 1991 survey is that, no nests on the neighborhood blocks of flats were found. The inner city wasn’t occupied by the species then. It was settled in 1997. In 1991, 109 nests were found, however the number of territories was estimated at 79, because in some cases, more than one nest was placed in one pair’s territory. The localisations of whole 109 nests were used to assess breeding habitats used by magpies. Habitat 1991 2011 N % N % Orchards 30 27,5 5 18,5 Industrial area 27 24,8 3 11,1 Housing estate 15 13,8 2 7,4 Fields 11 10,0 2 7,4 Allotment gardens 7 6,4 1 3,7 Meadows 6 5,5 6 22,2 Farmyard 5 4,6 2 7,4 Neighborhood blocks of flats - - 5 18,5 Parks 4 3,7 - - Small anthropogenic woods 4 3,7 1 3,7 Total 109 100 27 100 Tab. 1. Breeding habitats of magpie Pica pica in Chełm 131 Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski To further analyzes, only 79 settled nests were taken. In 2011 only 27 magpies nests were locked on. All of them were occupied. The ��������������������� mostly used nesting area were meadows covered with small shrubs, adjacent to watercourses, especially Uherka river, where 22,2% of nests were located, and 18,5% of nests were built in neighbourhood blocks and orchards. Jointly 40,7% of nests were placed in other habitats, e.g. housing estate or industrial area. In 1991 almost 39% of all nests sites were found in those places (Tab. 1). In 2011 the non-significant decrease of importance of orchards (Fisher test, one cut, p=0,24) industrial area (Fisher test, one cut, p = 0,10) and housing estate (Fisher test, one cut, p=0,24), as a breeding habitat for magpies was noted. 1991 Tree and shrub species 2011 N % N % Populus spp. 32 29,3 2 7,4 Willow Salix spp. 15 14,0 7 26,0 Common plum Prunus domestica 13 11,9 2 7,4 Poplar Ash Fraxinus excelsior 8 7,3 3 11,1 Mirabelle plum Prunus domestica L. subsp. syriaca 8 7,3 - - Cherry Cerasus vulgaris 7 6,4 - - Maple Acer platanoides 5 4,6 - - Peartree Pyrus spp. 5 4,6 4 14,8 Hawthorn Crataegus spp. - - 5 18,5 Blackthorn Prunus spinosa 4 3,7 - - Black Alder Alnus glutinosa 3 2,8 - - Lilac Syringa vulgaris 1 0,9 - - Bird Cherry Cerasus avium 1 0,9 - - Walnut Juglans regia 1 0,9 - - Common Elder Sambucus nigra 1 0,9 - - Black Locust Robinia pseudoacacia 1 0,9 - - Ash Maple Acer negundo 1 0,9 1 3,7 Small-lived Lime Tilia cordata 1 0,9 2 7,4 European Larch Larix decidua 1 0,9 1 3,7 Downy Birch Betula pubescens 1 0,9 - - 79 100 27 100 TOTAL Tab. 2. Tree and shrub species used for magpies’ Pica pica nest sites in Chełm 132 The breeding population of magpie Pica Pica... In 1991 magpies were building nests on poplars Populus sp. (29,3%) and willows Salix sp. (14,0%) most frequently (Tab. 2). From nests located on poplars only 29,0% were built on lombardy poplars Populus nigra var. italica. Commonly used trees were also plums Prunus spp., especially common plums Prunus domestica. Mirabelle plums Prunus domestica var. syriaca (n=9) and blackthorns Prunus spinosa (n=4) were rarely chosen. In 2011 the most commonly chosen trees for the birds to build nests on were willows Salix spp. (26,0%) and hawthorns Crataegus spp. (18,2%) (Tab. 2). Significant decrease of nests number on plums Prunus spp. between study periods was noted: 22,9% in 1991 vs. 7,4% in 2011 (Fisher test, one cut, p=0,0001) (Tab. 2). The significant decrease of the role of poplar Populus spp. as the nesting tree for magpie was noted (Fisher test, one cut, p=0,0001) (Tab. 2). The role of peartrees Pyrus spp. has not changed (Fisher test, one cut, p=0,165, respectively). The significant increase of number of nests found on willows Salix spp. was noted (Fisher test, one cut, p=0,0001, respectively), which corresponds with high number of nests found in river Uherka valley. In early 90’s birds built their nests on side branches more frequently (63,3%) than near the tree-trunk (36,7%). In 2011 the proportion has changed and the trunk-locations were found more often (55,6%) than those on branches (44,4%) but differences were not statistically important (χ2=0.27, df=1, p=0.603). In 1991 the average height of the nest location was 9,3 ± 5,8 m, with the median of 8,5 m. The range was 1,8 to 22 m. In 2011 the average height was 8,9 ± 7,2 m, with the median of 8,0 m (range 2,5 to 20 m). The difference in average nesting height in 1991 and in 2011 was also not significant (Z=1,453, n1= 79, n2 = 27). DISCUSSION AND CONCLUSIONS • Nesting in cities can give magpies some measurable benefits. Analysis made by Jerzak [2001] in Zielona Góra shows a higher nesting success and earlier nesting period beginning, observed in magpies city population, than in other areas. • There’s only fragmentary information of a beginning of magpies’ presence in cities of Lubelszczyzna, because there’s only few data about the exact moment of invasion. In Lublin it was in 80’s of the 20th century [Biaduń 2004]. In 50’s magpie was present in Poznań [Klejnotowski 1974], in 60’s it settled Olsztyn [Okulewicz 1971], and Kraków [Harmata 1985] and in early 80’s it was present in Zielona Góra [Jerzak et al. 2009]. • Revealed magpies breeding densities in Chełm in comparison with other Polish cities (e.g. Zielona Góra, where the breeding density was 16,9 pairs/km2) are low values, and corresponds merely with breeding density in agricultural landscape [Jerzak 2005]. 133 Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski • The process of settling the inner city of Chełm wasn’t associated with the breeding density increase. This means the first hypothesis wasn’t confirmed. • Nests located on a greater height are safer and the breeding success of birds reaches higher values in comparison with those nesting lower [Antonov & Atanasova 2001]. In the city landscape magpies prefer to build nests higher than in other areas [Mitrus & Woźniak 2002]. • Quantitative research of the use of specific trees by birds to nest on, held in context of tree diversity in city areas [Jerzak 1997, Antonov & Atanasova 2002], has revealed the bird mostly likes poplars, especially lombardy poplar. This results from height of the tree and characteristic monopodial shape of the crown with thin upwarded branches. Antonov & Atanasova [2002] points the fact of protective role of this kind of treecrown toward ground predators. Despite of that lombardy poplar seems to be one of the less important trees for the species in Chełm. Some authors confirm the most preferred tree for the bird to build nests is the white poplar Populus alba [Górska & Górski 1997, Jerzak 1997, 2001, Barszcz 1998, Mitrus & Woźniak 2002, Meissner & Duś 2005]. This has been corroborated during our surveys. In the period between surveys the number of nests located on poplars has decreased. • Generally, changes of the birds nesting places and breeding habitats were observed. Thus, the second hypothesis was confirmed. • Research held in Chełm in 2011 has shown a considerable decline of the species (threefold) comparing to 1991, which corresponds with trends in other Polish cities, where a clear downward trend was observed [Biaduń 2009, Jerzak et al. 2009]. Some authors attribute this state of affairs the influence of such predators as the hooded crow Corvus cornix, jay Garrulus glandarius or stone marten Marten foina [Jerzak et al. 2009]. Despite of the downward trend, magpies managed to settle the inner part of Chełm. 134 The breeding population of magpie Pica Pica... REFERENCES Antonov A. Atanasova D. 2002. Nest-site selection in the Magpie Pica pica in a highdensity urban population of Sofia (Bulgaria). Acta Ornithologica, 37: 55-66. Barszcz P. 1998. Zagęszczenie i umiejscowienie gniazd sroki Pica pica w Krakowie-Krowodrzy. Chrońmy Przyrodę Ojczystą 54: 119-124. Biaduń W. 2004. Ekspansja wybranych gatunków ptaków na terenach osiedli mieszkaniowych w Lublinie. [w:] Indykiewicz P. Barczak T. Fauna miast Europy XXI wieku. Wydawnictwo LOGO, Bydgoszcz, 419-424. Biaduń W. 2009. Dynamika populacji sroki Pica pica w Lublinie w okresie ostatnich 25 lat. [in:] Wiącek J. Polak M. Kucharczyk M. Grzywaczewski G. Jerzak L. (eds.) Ptaki - Środowisko - Zagrożenia - Ochrona: wybrane aspekty ekologii ptaków. Lubelskie Towarzystwo Ornitologiczne. Lublin, 351-356 Górski W. 1997. Urban and rural populations of magpies in Koszalin region, NW Poland. Acta Ornithologica 32 : 51–59. Górska E. Górski W. 1997. Nest sites of the Magpie Pica pica in urban and rural habitats in the Koszalin Region, NW Poland. Acta Ornithologica 32: 45-50. Harmata W. 1985. Sroka Pica pica w Krakowie, jej znaczenie i rola w środowisku miejskim. Chrońmy Przyrodę Ojczystą 4: 24-31. Jerzak L. 1997. Magpie Pica pica nest sites in urban habitats in Poland. Acta Ornithologica 32, 1: 69 -76. Jerzak L. 2001. Synurbanization of the magpie in the Palearctic. [in:] Marzluf J.M. Bowman R. Donnelly R. (eds.). Avian ecology and conservation in an urbanizing world. Kluwer Academy Publishers. 403 - 425. Jerzak L. 2005. Sroka Pica pica w Polsce – przegląd badań. [Magpie Pica pica in Poland-current state of knowledge] [in:] Jerzak L. Kavanagh B.P. Tryjanowski P. (eds.) Ptaki krukowate Polski [Corvids of Poland]. Bogucki Wydawnictwo Naukowe Poznań. 36-51. Jerzak L. Bocheński M. Ciebiera O. Słoma J. 2009. Wybrane parametry biologii lęgowej, miejskiej i niemiejskiej populacji sroki Pica pica [in:] Wiącek J. Polak M. Kucharczyk M. Grzywaczewski G. Jerzak L. (eds.) Ptaki - Środowisko - Zagrożenia - Ochrona: wybrane aspekty ekologii ptaków. Lubelskie Towarzystwo Ornitologiczne. Lublin. 351-356. Klejnotowski Z. 1974. Urbanizacja sroki Pica pica (L) w Polsce. Rocznik Akademii Rolniczej w Poznaniu 56, Ornitologia Stosowana 7: 77-88. 135 Krzysztof Stasiak, Karolina Piekarska, Ignacy Kitowski Meissner W. Duś U. 2005. Liczebność i rozmieszczenie gniazd sroki Pica pica w wybranych dzielnicach Gdańska [Number and distribution of Magpie Pica pica nests in selected districts of Gdańsk] [in:] Jerzak L. Kavanagh B.P. Tryjanowski P. (eds.). Ptaki krukowate Polski [Corvids of Poland]. Bogucki Wydawnictwo Naukowe Poznań. 517-522. Mitrus C. Woźniak B. 2002. Liczebność i preferencje siedliskowe sroki Pica pica w Białej Podlaskiej w latach 1998–1999. Notatki Ornitologiczne 43: 262- 266. Okulewicz J. 1971. Ptaki miasta Olsztyna i okolic. Acta Ornithologica 13: 127-171. Urząd Statystyczny w Chełmie. 1998. Rocznik Statystyczny Województwa Chełmskiego. Urząd Statystyczny w Chełmie. Chełm. Urząd Statystyczny w Lublinie. 2010. Rocznik Statystyczny Województwa Lubelskiego. Urząd Statystyczny w Lublinie. Lublin. Postal address: Krzysztof Stasiak1, Karolina Piekarska2, dr Ignacy Kitowski1 1 Department of Zoology, Animal Ecology and Wildlife Management University of Life Sciences in Lublin, Akademicka 13, 20-950 Lublin, Poland. 2 ul Sierakowskiego 6a, 24-100 Puławy e- mail: [email protected], [email protected], [email protected] Supervisor: dr hab. prof. nadzw. Jacek Łętowski 136 Ewelina Szwaj EPISTEME 14/2012 s. 137-145 ISSN 1895-4421 BIORÓŻNORODNOŚĆ RYJKOWCÓW (CURCULIONOIDEA) KSEROTERMICZNYCH OBSZARÓW LUBELSZCZYZNY WEEVILS BIODIVERSITY OF XEROTHERMIC AREAS OF THE LUBLIN REGION Abstrakt. Ryjkowce (Curculionoidea) to jedna z liczniejszych nadrodzin chrząszczy obejmująca ponad 40 000 gatunków. Wśród nich około 1052 gatunków notowanych jest z terenu Polski. Liczne obserwacje i badania pozwoliły na sformułowanie spostrzeżeń, iż szczególne bogactwo gatunkowe ryjkowców związane jestz siedliskami kserotermicznymi, stąd wielu badaczy wybiera tę grupę jako reprezentacyjną dla całej fauny chrząszczy związanych z tymi siedliskami. Celem badań było przeprowadzenie oceny fauny ryjkowców muraw kserotermicznych na wybranych stanowiskach, znajdujących się na obszarze parków krajobrazowych i rezerwatów Lubelszczyzny oraz na terenach nie objętych żadnymi formami ochrony (Bychawa, Łysaków, Łęczna, Gródek, Kąty, Spiczyn, Wólka). Materiał zbierany był za pomocą czerpaka entomologicznego w miesiącu intensywnego pojawów owadów (lipiec) w 2011 r. W wyniku badań stwierdzono 316 okazów ryjkowców przynależących do 56 gatunków z 3 rodzin, mianowicie: Apionidae, Nanophyidae i Curculionidae. Bioróżnorodność fauny ryjkowców pozwoli na ocenę wybranych muraw kserotermicznych pod kątem bogactwa przyrodniczego oraz ukierunkowanie niezbędnych działań ochrony czynnej na tych obszarach. Słowa kluczowe: ryjkowce, ekologia, murawa kserotermiczna, bioróżnorodność Summary. Weevils (Curculionoidea) is one from numerous superfamily including beetles above 40 000 species. Among them of about 1052 species are given from the area of Poland. Numerous observation and examinations allowed for formulating observations, that special species richness of weevils is connected with xerothermic areas, and therefore many researchers are choosing this group as representative for the fauna of beetles connected with these areas. The purpose of the study was presentation diversifying of the fauna of xerothermic weevils on selected areas, which being positions in the area of landscape parks and reserves of the Lublin region and on areas not embraced with no forms of protection (Bychawa, Łysaków, Łęczna, Gródek, Kąty, Spiczyn, Wólka). Collected material was in favour with ude of the entomological net in July in 2011. As a result of the study, 316 specimens of weevils were obtained. The insects of the weevils belonging to 56 species from 3 families, namely: Apionidae, Nanophyidae and Curculionidae. Biodiversity of the weevils fauna will allow for the evaluation of selected xerothermic grass in terms of the natural richness and directing necessary actions of the active protection in these areas. Słowa kluczowe: weevils, ecology, xerotermic grass, biodiversity 137 Ewelina Szwaj WSTĘP Ciepłolubne zbiorowiska, dość częste na słonecznych zboczach całej Wyżyny Lubelskiej, a unikatowe w skali naszego kraju są jednymi z najcenniejszych elementów krajobrazu Lubelszczyzny. O ich wyjątkowym charakterze świadczy przede wszystkim bioróżnorodność flory i fauny wykazywana w trakcie inwentaryzacji przyrodniczej. Pomimo, iż jednym z priorytetowych zadań Unii Europejskiej jest ochrona szaty roślinnej tych niezwykle cennych ekosystemów, stan zachowania muraw kserotermicznych jest zagrożony. Znaczne zubożenie powierzchni muraw poprzez intensywne zalesianie czy silną antropopresję oraz szybka sukcesja roślinności drzewiastej, na omawianych siedliskach są czynnikami wpływającymi na zmianę szaty roślinnej oraz na liczbę notowanych gatunków bezkręgowców. Dotyczy to zwłaszcza owadów, wśród których licznie występujące chrząszcze okazały się gatunkami wskaźnikowymi kserotermicznych stanowisk. Jedną z liczniejszych nadrodzin chrząszczy są ryjkowce (Curculionoidea), których liczbę na świecie określa się na ponad 40 000 gatunków. Wśród nich około 1052 gatunków podawanych jest z terenu Polski [Wanat i Mokrzycki 2005]. Są to typowe fitofagi. Zamieszkują one zróżnicowane biotopy, żerują na różnych częściach drzew, krzewów, roślin uprawnych muraw kserotermicznych i psammofilnych, suchych łąk, ugorów i ciepłych zarośli, wilgotnych środowisk łęgowych, wilgotnych łąk i torfowisk aż do partii górskich. [Bogdanowicz i in. 2004]. Liczne obserwacje i badania pozwoliły na sformułowanie spostrzeżeń, iż szczególne bogactwo gatunkowe ryjkowcowatych związane jest z siedliskami kserotermicznymi, stąd wielu badaczy wybiera tę grupę jako reprezentacyjną dla całej fauny chrząszczy związanych z tymi siedliskami [Mazur 2001]. Celem prowadzonych badań było poznanie składu fauny ryjkowcowatych wybranych muraw kserotermicznych Lubelszczyzny oraz ocena jej struktury jakościowej i ilościowej na poszczególnych siedliskach. Ustalenie bioróżnorodności owadów pozwoli na ocenę wybranych kserotermicznych obszarów Wyżyny Lubelskiej pod względem bogactwa przyrodniczego. Umożliwi stwierdzenie zmian zachodzących na omawianych terenach i wpływ dotychczasowych form ochrony oraz właściwe ukierunkowanie niezbędnych działań ochrony czynnej na tych obszarach. MATERIAŁ I METODY Badaniami objęto osiem muraw kserotermicznych o zróżnicowanym podłożu i składzie florystycznym z terenu Wyżyny Lubelskiej (Bychawa, Ciechanki Łańcuchowskie, Gródek, Kąty, Łysaków, Nasutów, Spiczyn, Wólka) (Rys. 1). Tereny te znajdują się w strefach objętych różnymi formami ochrony: 138 Bioróznorodność ryjkowców (Curculion-Oidea)... Bychawa – rezerwat Podzamcze, woj. lubelskie, powiat lubelski, Ciechanki Łańcuchowskie – Nadwieprzański Park Krajobrazowy, woj. lubelskie, powiat łęczyński, Gródek – Nadbużański Obszar Chronionego Krajobrazu. woj. lubelskie, powiat hrubieszowski, Kąty – specjalny obszar ochrony siedlisk, woj. lubelskie, powiat zamojski, Nasutów – Kozłowiecki Park Krajobrazowy, woj. lubelskie, powiat lubelski, Spiczyn – Nadwieprzański Park Krajobrazowy, woj. lubelskie, powiat łęczyński. Terenami niechronionych są: Łysaków – murawa kserotermiczna, woj. podkarpackie, powiat stalowowolski, Wólka (wąwóz Lipniak) – murawa kserotermiczna, woj. lubelskie, powiat lubelski. Próby pobierano w miesiącu intensywnego pojawu owadów – lipcu 2011 r., w dni słoneczne i bezwietrzne między godziną 10.00 a 16.00. Do odłowu owadów stosowano czerpak entomologiczny ilościowy (w seriach 8 x 25). Zebrany materiał zatruwano oparami octanu etylu, przebierano i przechowywano w suchych warunkach. Wszystkie próby zostały zetykietowane z podaniem nazwy miejscowości. Owady należące do nadrodziny ryjkowców Curculionoidea oznaczono do gatunku. Rys. 1. Rozmieszczenie stanowisk, na których prowadzono badania w lipcu 2011 r. WYNIKI W rezultacie przeprowadzonych badań na wybranych ośmiu stanowiskach Lubelszczyzny w lipcu 2011 r. stwierdzono 316 okazów ryjkowców reprezentowanych przez 56 gatunki. Należały one do rodzin: Apionidae (19 gatunków), Nanophyidae (1) i Curculionidae (36). Wśród odłowionych okazów wykazano dwa zagrożone gatunki, tj. Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864) i Datonychus paszlavskyi (Kuthy, 1890) (Tab. 1). Na obszarze kserotermicznego rezerwatu Podzamcze w Bychawie odłowiono 22 okazy ryjkowcowatych, które zaliczono do 7 gatunków. Najliczniejszym w próbie był gatunek Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) (13 osobn.). Odnotowano 3 gatunki rzadkie: Squamapion elongatum (Germar, 1817), Cleopomiarus graminis (Gyllenhal, 1813) i Larinus turbinatus Gyllenhal, 1835 (Tab. 1). 139 Ewelina Szwaj W Ciechankach Łańcuchowskich odłowiono 9 ryjkowców, które należały do 3 gatunków. Najliczniej występująca była Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) (6 osobn.). Pozostałe 2 gatunki, tj. Sitona sulcifrons (Thunberg, 1798) i Protapion apricans (Herbst, 1797) wystąpiły w liczbie odpowiednio 6 i 1 okazów. W Gródku badaniami objęto 2 murawy kserotermiczne. Na jednej z nich zebrano 16 osobników z 7 gatunków, wśród których najliczniejszym okazał się rzadki, kserotermiczny gatunek Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864) (6 osobn.), natomiast na drugiej odłowiono 67 osobników Curculionoidea zaliczonych do 14 gatunków. W próbie przeważał kserotermiczny Stenopterapion tenue (Kirby, 1808) (18 osobn.), a następnie licznym był oligofag żerujący na roślinach zielnych Catapion jaffense (Desbrochers, 1895) (15 osobn.). Na murawach kserotermicznych w Gródku odnotowano sześć gatunków ryjkowców: Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864), Ceutorhynchus pulvinatus Gyllenhal, 1837, Tychius quinquepunctatus (Linnaeus, 1758) (stanowisko 1) oraz Squamapion elongatum (Germar, 1817), Cleopomiarus graminis (Gyllenhal, 1813) i Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 (stanowisko 2). Wymienione gatunki uważane są za rzadko występujących w naszym kraju. W Kątach odłowiono 29 osobników ryjkowców, które reprezentowały 12 gatunków. Wśród nich przeważał rzadki, kserotermiczny gatunek Tychius schneideri (Herbst, 1795) (6 osobn.), monofag żerujący na Anthyllis vulneraria L. Natomiast Stenopterapion intermedium (Eppelsheim, 1875) oraz T. junceus (Reich, 1797) wykazano odpowiednio w liczbie 4 i 5 okazów. W próbie odłowionej na murawie kserotermicznej w Łysakowie stwierdzono 10 osobników ryjkowców z 9 gatunków. Wśród nich 3 gatunki były rzadko notowane w Polsce: Sitona languidus Gyllenhal, 1834, Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 i T. schneideri (Herbst, 1795). Dwa z nich są monofagami, tj. Sitona languidus, żerujący na Coronilla varia L. oraz Tychius schneideri – biologicznie związany z Anthyllis vulneraria L. Na obszarze murawy kserotermicznej w Spiczynie zebrano 28 osobników ryjkowców należących do 9 gatunków. Wśród nich licznie występowały kserotermiczne oligofagi, natomiast w przeważającej liczbie odłowiono Rhinoncus castor (Fabricius, 1792) (9 osobn.) – monofaga związanego z Rumex acetosella L. Odnotowano również dwa gatunki: Apion cruentatum Walton, 1844 i Baris artemisiae (Herbst, 1795), które zaliczane są do rzadko występujących w naszym kraju. 140 Spiczyn 9 1 Wólka Nasutów Łysaków Kąty Gródek (stan. 2) Gródek (stan. 1) Ciechanki Łańcuchowskie Gatunek Bychawa Bioróznorodność ryjkowców (Curculion-Oidea)... APIONIDAE Apion cruentatum Walton, 1844 Catapion jaffense (Desbrochers, 1895) 15 Catapion seniculus (Kirby, 1808) Ceratapion onopordi (Kirby, 1808) 3 1 3 Eutrichapion viciae (Paykull, 1800) 1 4 Ischnopterapion loti (Kirby, 1808) 2 Oxystoma craccae (Linnaeus, 1767) 1 1 Perapion curtirostre (Germar, 1817) 6 Protapion apricans (Herbst, 1797) 1 1 Protapion filirostre (Kirby, 1808) 4 2 21 1 8 Protapion fulvipes (Geoffroy, 1785) 1 Protapion ononidis (Gyllenhal, 1827) 2 Pseudoperapion brevirostre (Herbst, 1797) 8 Pseudoprotapion astragali (Payykull, 1800) 2 Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864) 6 Pseudostenapion simum (Germar, 1817) Squamapion elongatum (Germar, 1817) 5 2 7 Stenopterapion intermedium (Eppelsheim, 1875) Stenopterapion tenue (Kirby, 1808) 4 2 18 3 NANOPHYIDAE Nanophyes marmoratus (Goeze, 1777) 1 CURCULIONIDAE Baris artemisiae (Herbst, 1795) 1 Ceutorhynchus pulvinatus Gyllenhal, 1837 1 Ceutorhynchus typhae (Herbst, 1795) Cleopomiarus graminis (Gyllenhal, 1813) Cleopomiarus micros (Germar, 1821) 2 1 1 1 3 141 Ewelina Szwaj Datonychus paszlavszkyi (Kuthy, 1890) 1 Eusomus ovulum Germar, 1824 1 2 Hypera plantaginis (De Geer, 1775) 1 Hypera arator (Linnaeus, 1758) 1 Hypera nigrirostris (Fabricius, 1775) 1 Hypera viciae (Gyllenhal, 1813) Larinus turbinatus Gyllenhal, 1835 1 1 Marmaropus besseri Gyllenhal, 1837 2 Mecinus pascuorum (Gyllenhal, 1813) 1 Miarus ajugae (Herbst, 1795) 1 1 1 1 Parafoucartia squamulata (Herbst, 1795) 4 1 Polydrusus inustus Germar, 1824 2 1 Pseudorchestes ermischi (Dieckmann, 1958) 2 Rhinoncus castor (Fabricius, 1792) 31 Sibinia pellucens (Scopoli, 1772) 9 1 Sibinia pyrrhodactyla (Marsham, 1802) 1 Sitona humeralis Stephens, 1831 1 Sitona languidus Gyllenhal, 1834 Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) Sitona sulcifrons (Thunberg, 1798) 1 13 6 9 2 1 2 4 1 Sitona gressorius (Fabricius, 1792) 3 Sitona griseus (Fabricius, 1775) 2 Sitona macularius (Marsham, 1802) 1 1 Strophosoma capitatum (De Geer, 1775) 2 Strophosoma faber (Herbst, 1785) 3 Tanymecus palliatus (Fabricius, 1787) 1 Trachyphloeus bifoveolatus (Beck, 1817) 2 Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 3 Tychius junceus (Reich, 1797) Tychius quinquepunctatus (Linnaeus, 1758) Tychius schneideri (Herbst, 1795) 1 1 5 1 6 1 2 1 15 1 Tab. 1. Zestawienie liczbowe gatunków i okazów ryjkowców odłowionych na murawach kserotermicznych Lubelszczyzny w lipcu 2011 r. Gatunek zagrożony (EN) wg kategorii zagrożeń na Czerwonej Liście Zwierząt Ginących i Zagrożonych w Polsce 142 Bioróznorodność ryjkowców (Curculion-Oidea)... W zbiorowiskach kserotermicznych w okolicach Wólki (wąwóz Lipniak) odłowiono 64 osobniki ryjkowców należących do 15 gatunków. Najliczniejszym w próbie był Protapion apricans (Herbst, 1797) (21 osobn.). Licznie występował również Tychius junceus (Reich, 1797) (15 osobn.) oraz Protapion filirostre (Kirby, 1808) (8 osobn.). Odnotowano jeden rzadki gatunek - Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851. DYSKUSJA I WNIOSKI Badania przeprowadzone na wybranych murawach kserotermicznych Wyżyny Lubelskiej w miesiącu intensywnego pojawu owadów (lipiec) w 2011 r. pozwoliły na ustalenie składu gatunkowego oraz ilości ryjkowców, które zostały wybrane jako organizmy wskaźnikowe informujące o tendencji przyrodniczych na omawianych siedliskach. Jak już zaznaczono w „Wynikach”, w rezultacie przeprowadzonych odłowów odnotowano 316 osobników ryjkowców, należących do 56 gatunków z 3 rodzin (Tab. 1). Wśród odłowionych chrząszczy przeważały formy łąkowe: Rhinoncus castor (Fabricius, 1792) (40 osobn.), Sitona lineatus (Linnaeus, 1758) (34 osobn.), Protapion apricans (Herbst, 1797) (23 osobn.), Stenopterapion tenue (Kirby, 1808) (23 osobn.) i Tychius junceus (Reich, 1797) (22 osobn.). Wśród odnotowanych ryjkowców były gatunki charakterystyczne dla zbiorowisk kserotermicznych (formy kserotermiczne i termofilne), przeważały oligofagi roślin zielnych. Odnotowano także 7 monofagów (Pseudoprotapion astragali, Marmaropus besseri, Mecinus pascuorum, Pseudorchestes ermischi, Rhinoncus castor, Sitona languidus, Tychius schneideri), żerujących na roślinach ściśle związanych z kserotermicznymi murawami (Astragalus glycyphyllus L., Rumex acetosa L., Plantago lanceolata L., Centaurea scabiosa L., Rumex acetosella L., Coronilla varia L., Anthyllis vulneraria L.), co zwraca uwagę na konieczność ochrony termofilnej fauny w aspekcie utrzymania bogactwa przyrodniczego. Na badanych siedliskach odłowiono 16 gatunków rzadko występujących na terenie Polski, z których 4 występowały dość licznie: Apion cruentatum Walton, 1844 w liczbie 10 osobników, Squamapion elongatum (Germar, 1817) (9), Tychius schneideri (Herbst, 1795) (7), Pseudoprotapion ergenense (Becker, 1864) (6) oraz Tychius aureolus Kiesenwetter, 1851 (6). Na szczególną uwagę zasługuje Pseudoprotapion ergenense, którego stwierdzono jedynie na stanowisku nr 1 w Gródku. Liczba odłowionych ryjkowców na tym stanowisku oraz fakt, iż na analogicznym stanowisku nr 2 w Gródku osobników 143 Ewelina Szwaj tego gatunku nie odnotowano może wskazywać na występowanie warunków środowiskowych sprzyjających rozwojowi tego gatunku na stanowisku nr 1 (zespół Inuletum ensifoliae). Najwięcej, tj. 78 osobników zebrano na śródleśnej murawie mezokserotermicznej w Nasutowie. Śródleśna lokalizacja oraz specyficzne warunki mikroklimatyczne tworzą swoistą enklawę dla rozwoju chrząszczy. Ryjkowce liczne były także na siedliskach w Gródku (stanowisko 1 – 67 osobników) oraz Wólce (64 osobniki). Na tych murawach odnotowano również najwięcej gatunków ryjkowców. Duża liczba gatunków na stanowisku 1 w Gródku oraz znaczna różnica pomiędzy liczbą chrząszczy uzyskanych na stanowisku 1 i 2 potwierdza pogląd, iż postępująca eutrofizacja gleb w pobliżu murawy na stanowisku 2 wpływa na zmiany struktury faunistycznej tego siedliska [Trąba 2010]. Natomiast duża liczba odłowionych osobników i gatunków na stanowisku w Wólce (wąwóz Lipniak) daje podstawę do stwierdzenia, iż tor motokrosowy, który został utworzony na tych terenach i zabiegi związane z jego utrzymaniem wpływają pozytywnie na zmiany struktury roślin i zwierząt. Na szczególną uwagę zasługuje również stanowisko kserotermiczne w Łysakowie, na którym 10 odłowionych osobników reprezentowało 9 gatunków ryjkowców. W tym przypadku liczba odłowionych owadów nie wskazuje jednoznacznie na bogactwo faunistyczne tego miejsca. Murawa kserotermiczna na tym terenie, o wyjątkowych walorach przyrodniczych, jest najdalej na południe wysuniętym stanowiskiem badań, na którym okres wegetacyjny roślin jest przyspieszony w stosunku do pozostałych stanowisk, co zapewne mogło wpłynąć na liczbę odnotowanych chrząszczy. Przeprowadzone badania potwierdzają pogląd, iż fauna ryjkowców zasiedlających zbiorowiska kserotermiczne na Wyżynie Lubelskiej jest bardzo bogata. Podobnie na innych obszarach, jak np. w rezerwacie biosfery „Tatry”, fauna ryjkowców jest obfita i różnorodna [Knutelski 2005]. Na podstawie oceny liczby odławianych osobników i gatunków wnioskować można o kondycji przyrodniczej badanych zbiorowisk kserotermicznych. Duża bioróżnorodność przejawiająca się w składzie gatunkowym i liczebności okazów odławianej fauny wskazuje na bogactwo gatunkowe wybranych ciepłolubnych muraw oraz ukierunkowują właściwą ochronę. Badania potwierdzają pogląd, iż ochrona siedlisk kserotermicznych jest niezwykle ważna dla zachowania bogactwa flory i fauny muraw kserotermicznych. Jednocześnie wszelkie podejmowane działania, również na terenach nieobjętych ochroną, będące przejawami aktywności człowieka mogą uchronić te siedliska przed szybka sukcesją. W omawianym przypadku właściwy kierunek presji antropogenicznej jest pożądanym elementem mogącym aktywnie ograniczać proces zaniku tych wyjątkowych zbiorowisk. 144 Bioróznorodność ryjkowców (Curculion-Oidea)... LITERATURA Bogdanowicz W., Chudzicka E., Pilipiuk I., Skibińska E. 2004. Fauna Polski. Charakterystyka i wykaz gatunków. Muz. i Inst. Zool. PAN. Warszawa: 61 – 71. Knutelski S. 2005. Różnorodność, ekologia i chorologia ryjkowców rezerwatu biosfery “tatry” (Coleoptera: Curculionoidea). Monografie Faunistyczne, tom 23, Inst. Zool. Syst. i Ewolucji Zwierząt PAN. Kraków: 340 ss. Mazur M. 2001. Ryjkowce kserotermiczne Polski (Coleoptera: Nemonychidae, Attelabidae, Apionidae, Curculionidae). Studium zoogeograficzne. Monografie Fauny Polski, tom 22, Kraków: 7 – 9, 15 – 23, Pawłowski J., Kubisz D., Mazur M. 2002. Coleoptera Chrząszcze. [w:] Czerwona lista zwierząt ginących i zagrożonych w Polsce. Z. Głowaciński (red.). Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków. 155 ss. + supl. 74 ss. Trąba C. 2010. Różnorodność florystyczna i stan zachowania muraw kserotermicznych w okolicach Czumowa koło Hrubieszowa [w]: H. Ratyńska, B. Waldon (red). Ciepłolubne murawy w Polsce – stan zachowania i perspektywy ochrony. Wyd. UKW. Bydgoszcz: 446 – 457, Wanat M., Mokrzycki T. 2005. A New checklist of the weevils of Poland (Coleoptera: Curculionoidea). Genus, 16 (1): 69 – 117. Adres do korespondencji: mgr inż. Ewelina Szwaj Katedra Zoologii, Ekologii Zwierząt i Łowiectwa Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Jacek Łętowski 145 Krzysztof Wąs EPISTEME 14/2012 s.147-159 ISSN 1895-4421 ANALIZA WARUNKÓW CIEPLNO-WILGOTNOŚCIOWYCH W OKRESIE LATA W PASYWNYM PREFABRYKOWANYM BUDYNKU SZKIELETOWYM ANALYSIS OF HYGROTHERMAL����������������������������� CONDITIONS������������������ ���������������������������� INSIDE A PREFABICATED FRAME PASSIVE HOUSE IN THE SUMMER PERIOD Abstrakt. W sytuacji szybko rosnących cen nośników energii, coraz droższa staje się eksploatacja budynków, dlatego konieczne jest poszukiwanie nowoczesnych, energooszczędnych rozwiązań, które pozwolą w znaczny sposób ograniczyć zapotrzebowanie na energię w tym sektorze. Budownictwo pasywne pozwala na znaczne obniżenie kosztów eksploatacji poprzez odpowiednie zaprojektowanie bryły budynku oraz systemów grzewczo-wentylacyjnych. W artykule poddano analizie warunki cieplno-wilgotnościowe panujące w jednorodzinnym budynku pasywnym. Celem badań było sprawdzenie, czy wysoka izolacyjność przegród minimalizująca straty ciepła w okresie zimowym nie sprawia, że budynek przegrzewa się w okresie letnim. Badania wykazały, iż rozpatrywanym okresie pomiary temperatury i wilgotności w zdecydowanej większości mieściły się akceptowanych zakresach. Wyniki pracy stanowią wkład w badania nad szerszym zastosowaniem budownictwa pasywnego w Polsce. Słowa kluczowe: budownictwo szkieletowe, budownictwo pasywne, temperatura i wilgotność w budynkach Summary. With the increasing costs of energy carriers, building operation becomes more and more expensive. Therefore it is necessary to search for new, energy efficient solutions which would significantly contribute to limiting energy demand in this sector. Passive building systems make it possible to decrease operation costs substantially through proper design of the body of the building and heating and ventilation systems. The article analyses hygrothermal conditions inside a single-family passive house. The aim of the research was to verify whether high insulation properties of partitions, minimising heat losses in the winter period, do not make the house to overheat in the summer. The studies revealed that temperature and humidity values in the period under examination mostly remained within the range of acceptable values. The results of the study contribute to the development of passive buildings in Poland. Key words: wooden frame buildings, passive houses, temperature and humidity in buildings 147 Krzysztof Wąs WSTĘP Znaczący wzrost konsumpcji energii na przestrzeni ostatnich kilkudziesięciu lat oraz podwyższające się ceny jej nośników doprowadziły obecnie do rozpowszechniania się działań mających na celu racjonalne wykorzystanie zasobów energetycznych. Przyczyną takiego stanu rzeczy jest między innymi intensywny rozwój gospodarczy i cywilizacyjny państw oraz kurczące się zasoby surowców naturalnych. Dodatkowo korzystanie na szeroką skalę z tzw. „paliw kopalnych” powoduje duże spustoszenie w środowisku naturalnym, między innymi poprzez emisje znacznych ilości CO2 oraz innych gazów zanieczyszczających atmosferę. Jednym z pierwszych działań podjętych na forum międzynarodowym w celu ograniczenia emisji zanieczyszczeń było podpisanie porozumienia w tej sprawie na konferencji w Kioto w grudniu 1997 r. Kolejnym ważnym krokiem mającym na celu ograniczenie konsumpcji energii szczególnie w sektorze mieszkaniowym i usługowym, było wprowadzenie na terenie Unii Europejskiej dyrektywy 2002/91/WE. Jej głównym założeniem „jest promowanie poprawiania charakterystyki energetycznej budynków we Wspólnocie, z uwzględnieniem warunków klimatycznych zewnętrznych i lokalnych oraz wewnętrznych wymagań klimatycznych oraz opłacalności.” [Dyrektywa 2002]. Budownictwo pasywne, które z założenia spełnia wysokie standardy energooszczędności wychodzi naprzeciw tej idei. Pozwala ono ograniczyć nawet kilkukrotnie zapotrzebowanie na energię konieczną do ogrzewania w stosunku do tradycyjnego budynku. Aby budynek mógł być nazwany budynkiem pasywnym, musi spełnić szereg restrykcyjnych założeń [Wnuk 2006]; między innymi jego zapotrzebowanie na energię do ogrzewania nie może przekroczyć 15 kWh∙m-2∙rok-1, a współczynnik przenikania ciepła U dla przegród nie może być większy niż 0,15 W∙m-2∙K-1. Dlatego ważne jest dokładne poznanie funkcjonowania tego typu budynków, w celu optymalizacji ich mikroklimatu tak, aby połączyć ich doskonałe parametry energooszczędne z komfortem zamieszkiwania. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań jest prefabrykowany budynek pasywny o konstrukcji szkieletowej drewnianej zlokalizowany w miejscowości Boruszowice w województwie śląskim. Budynek zamieszkiwany jest na stałe przez pięcioosobową rodzinę. Przegrody w obiekcie posiadają doskonałe właściwości izolacyjne. Budynek posiada różne rodzaje przegród zewnętrznych, a ich średni współczynnik przenikania ciepła wynosi U = 0,08 W∙m-2∙K-1. System wentylacyjny to instalacja nawiewno-wywiewna wyposażona w gruntowy wymiennik ciepła oraz rekuperator przeciwprądowy. Badany obiekt posiada szereg czujników monitorujących różne parametry w budynku. W niniejszym artykule skoncentrowano się na wynikach pomiarów dwóch termohigrometrów typu LB-710HS mierzących temperaturę i wilgotność w dwóch 148 Analiza warunków cieplno-wilgotnościowych... pomieszczeniach: salonie połączonym z kuchnią zlokalizowanym na parterze budynku oraz sypialni znajdującej się na pierwszym piętrze. Pomieszczenia te wybrano, ponieważ w typowym układzie funkcjonalnym budynku jednorodzinnego są to miejsca najczęściej użytkowane. Dodatkowo dla poznania temperatury i wilgotności względnej panującej na zewnątrz budynku zainstalowano termohigrometr typu LB-710R w przydomowej stacji meteorologicznej. Obydwa typy urządzeń do pomiaru temperatury wykorzystują termometr rezystancyjny typu PT1000, natomiast pomiar wilgotności względnej realizowany jest przy pomocy wilgotnościomierza pojemnościowego [Recknagel i in. 1994]. Pomiary rejestrowane są w odstępach sześciominutowych, jednak na potrzeby opracowania danych uśredniono wyniki do wartości godzinowych. Rozpatrywany okres badań to ciąg pomiarowy trwający od 11 lipca 2011 do 10 września 2011 roku. Jako punkt odniesienia, w celu określenia dopuszczalnych temperatur, w obiekcie przyjęto klasyfikacje dopuszczalnych temperatur według normy [PN-EN 15251:2007]. Rozpatrywany budynek zaklasyfikowano do kategorii drugiej w celu przyjęcia przeciętnych wartości temperatury w okresie letnim tj. zakres 20‑26°C. Natomiast wilgotność względna powietrza wewnętrznego nie powinna przekraczać 70%. WYNIKI Na wykresie poniżej (Rys. 1) zaprezentowano rozkład temperatur w rozpatrywanym okresie w salonie i sypialni oraz wartości temperatury zewnętrznej. Rys. 1. Temperatura powietrza - parter, piętro oraz temperatura zewnętrzna [°C] Kolejny wykres (Rys. 2) przedstawia rozkład wilgotności względnej w rozpatrywanym okresie w salonie i sypialni oraz wartości wilgotności względnej panującej na zewnątrz budynku. 149 Krzysztof Wąs Rys. 2. Wilgotność względna powietrza - parter, piętro oraz wilgotność zewnętrzna [%] DYSKUSJA I WNIOSKI Wartość temperatury w salonie w badanym okresie wynosiła średnio 23,7°C. W przypadku sypialni usytuowanej na pierwszym piętrze temperatura powietrza wewnętrznego wynosiła średnio 23,4°C. Procentowy udział poszczególnych temperatur w rozpatrywanym okresie zaprezentowano na Rys. 3. Rys. 3. Procentowy udział występowania poszczególnych temperatur [%] Na podstawie (Rys. 3) można stwierdzić, iż najczęściej występującymi temperaturami w rozpatrywanym okresie były temperatury w przedziale 2224°C. Stanowią one 83,7% temperatur zaobserwowanych dla salonu i 69,3% temperatur zaobserwowanych dla sypialni. Natomiast temperatury powyżej 26°C to 5,1% dla salonu i 6,0% dla sypialni. Rozpatrując analogicznie rozkład wilgotności względnej w opracowywanym okresie przedstawiono (Rys. 4) procentowy udział występowania poszczególnych przedziałów wilgotności. W przypadku salonu, wilgotność względna z przedziału 50-65 stanowi 66,1%, natomiast w przypadku sypialni głów150 Analiza warunków cieplno-wilgotnościowych... ny zakres wilgotności względnej to 55-70 i stanowi on 66% wartości wilgotności zaobserwowanych w badanym okresie. Przekroczenia wilgotności względnej powyżej 70%, to dla salonu i sypialni odpowiednio 1,5% i 0,8%. Rys. 4. Procentowy udział występowania poszczególnych przedziałów wilgotności względnej [%] Zaprezentowane wyniki badań pozwalają stwierdzić, iż w rozpatrywanym okresie badań tj. 11.07.2011-10.09.2011r. warunki cieplno-wilgotnościowe panujące we wnętrzu badanego budynku pasywnego można uznać za dobre. W zdecydowanej większości rozpatrywanego okresu temperatura i wilgotność nie przekraczały zakładanych przedziałów. Pomimo występujących niejednokrotnie wysokich temperatur zewnętrznych sięgających niekiedy 34°C budynek nie ulegał nadmiernemu przegrzewaniu. Uzasadnieniem tego stanu może być zastosowanie gruntowego wymiennika ciepła, który pozwala na schłodzenie powietrza nawiewanego do pomieszczeń na skutek przepuszczenia go przewodami przez znacznie chłodniejszy grunt. Dodatkowo wysoka izolacyjność przegród chroni przed wysoką temperaturą zewnętrzną. Wilgotność względna rzadko przekraczała założony próg, niemniej jednak szczególnie na piętrze przez około 24% zakładanego okresu przyjmowała wartości bliskie założonej granicy. Spowodowane może to być kilkoma czynnikami między innymi: niekorzystnymi warunkami atmosferycznymi, faktem niedawnego oddania budynku do użytku i w konsekwencji wysokiej wilgotności wewnętrznej obiektu. Inną możliwą przyczyną zaobserwowania wilgotności w takiej wartości może być niewystarczająca wentylacja pomieszczeń. Badany budynek posiada dobre parametry cieplno-wilgotnościowe powietrza. Obawy związane z możliwym jego przegrzewaniem z uwagi na wysoką izolacyjność przegród są nieuzasadnione. Jak pokazują wyniki pomiarów, przez zdecydowaną większość rozpatrywanego okresu budynek zachowuje prawidłową temperaturę i wilgotność powietrza wewnętrznego a zastosowane systemy są efektywne. 151 Krzysztof Wąs LITERATURA Dyrektywa 2002/91/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 16 grudnia 2002 r. w sprawie charakterystyki energetycznej budynków PN-EN 15251: 2007 Kryteria środowiska wewnętrznego, obejmujące warunki cieplne, jakość powietrza wewnętrznego, oświetlenie i hałas. Wyd. PKN Recknagel H. Sprenger E. Honmann W. Schramek R. 1994 Poradnik Ogrzewanie i Klimatyzacja Wydawnictwo EWFE. Gdańsk Wnuk R. 2006. Budowa domu pasywnego w praktyce. Wydawnictwo Przewodnik Budowlany. Warszawa Adres do korespondencji: Krzysztof Wąs Wydział Inżynierii Środowiska i Geodezji Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jan Radoń prof. UR 152 II. TECHNOLOGIA ŻYWNOŚCI Mariusz Adamski Katarzyna Pisarska EPISTEME 14/2012 s.155-160 ISSN 1895-4421 WYSTĘPOWANIE ENDOSYMBIOTYCZNYCH BAKTERII W KOMÓRKACH BOCZNIAKA (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM) THE PRESENCE OF ENDOSYMBIOTIC BACTERIA IN OYSTER MUSHROOM (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM) CELLS Abstrakt. W literaturze opisano kilka przypadków endosymbiozy wśród grzybów. Celem niniejszej pracy była izolacja endosymbiontów boczniaka, analiza zróżnicowania, oraz ocena ich potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu. Przebadano 9 linii boczniaka pochodzących z różnych rejonów świata. Za pomocą mikroskopu florescencyjnego i specyficznego znacznika stwierdzono obecność bakterii wewnątrz komórek wszystkich linii boczniaka. Endosymbionty izolowano na zmodyfikowanym podłożu TSB. Izolaty poddano analizie z wykorzystaniem technik PCR. Wykorzystano primery SMY-F511 i SMY-F1382 dla markera 16S rDNA oraz PolF i PolR dla genu nifH. Przeprowadzono próbę hodowli izolatów na różnych podłożach. Pośród 9 izolatów endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości produktu PCR. Badania z markerem genu nifH dały wynik negatywny. Pojedyncze kolonie endosymbiontów obserwowano jedynie na podłożu TSA w obecności grzybów lub ekstraktu z grzybni. Słowa kluczowe: boczniak, endosymbionty, endobakterie, grzyby Summary. Few papers reported presence of endosymbionts in fungal cells. The aim of this study was to isolate oyster mushrooms endosymbionts, analyse their diversity, and evaluation of their potential ability to nitrogen fixation. Nine oyster mushroom lines originating from different regions of the world were studied. Bacteria living inside cells of all oyster mushroom were revealed using a fluorescent microscope and specific dye. Endosymbionts were isolated on a modified TSB medium. The isolates were analyzed using PCR techniques. Primers SMY-F511 and SMY-R1382 for 16S rDNA and PolF and PolR for nifH gene were used. Among the nine isolates of endosymbionts six different sizes of the PCR product were distinguished. The study of nifH gene marker gave negative result. Single endosymbionts colonies were observed only on TSA medium in the presence of mycelium or the extract from mycelium. Key words: oyster mushroom, endosymbionts, endobacteria, fungi 155 Mariusz Adamski, Katarzyna Pisarska WSTĘP Zjawisko endosymbiozy jest dość dobrze poznane w królestwie roślin oraz zwierząt. Niewiele natomiast wiadomo o występowaniu i funkcji endosymbiotycznych bakterii w komórkach grzybów. Dotychczas tego typu zależność opisano u nielicznych gatunków grzybów. Obecność endosymbiontów obserwowano głównie u grzybów ektomikoryzowych z rodzaju Gigasporaceae [Bianciotto i in. 1996, Bonfante 2003, Cruz i in. 2008]. Stwierdzono tu obecność nowego gatunku „Candidatus Glomeribacter gigasporum” wspomagającego proces tworzenia mikoryzy. Komórki patogena upraw Rhizopus microsporus są również zasiedlane przez endosymbionty. Bakterie z rodzaju Burkholderia są niezbędne gospodarzowi do rozmnażania wegetatywnego. Produkują one również ryzoksynę, główną substancję odpowiedzialną za patogeniczność tego gatunku [Partida-Martinez i in. 2007]. Wśród grzybów wyższych stwierdzono występowanie endosymbiotycznych bakterii podstawczaka Laccaria bicolor [Bertaux i in. 2003]. Opisane bakterie to obligatoryjne endosymbionty a próby ich hodowli na podłożach kończyły się niepowodzeniem lub, jak w przypadku endosymbiontów R. microsporus, były ograniczone czasowo. Stwierdzono również, że wewnątrzkomórkowe bakterie zasiedlające grzyby z rodzaju Gigasporacea mają zdolność do wiązania wolnego azotu. Zaopatrują w ten sposób gospodarza w przyswajalne związki azotowe i wspomagają jego rozwój [Bianciotto i in. 2003]. Literatura przedmiotu donosi o występowaniu bakterii związanych z tylko jednym szczepem boczniaka Pleurotus ostreatus [Yara i in. 2006]. Nie stwierdzono natomiast czy te mikroorganizmy są endosymbiontami czy jedynie bakteriami związanymi z grzybem. Celem niniejszej pracy było potwierdzenie endosymbiotycznej natury bakterii związanych z boczniakiem, izolacja endosymbiontów, analiza zróżnicowania, oraz ocena ich potencjalnej zdolności do wiązania wolnego azotu. MATERIAŁY I METODY Przebadano 9 linii boczniaka pochodzących z różnych rejonów świata: PxS, PB 63S, P USA S, P Bo6 S – Poznań; P234, P112, PSC - Lublin; PB8, PB7’96 – Tokyo. Linie zostały udostępnione przez Katedrę Technologii Owoców, Warzyw i Grzybów Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie. Do analiz wykorzystano grzyby z 7 dniowej hodowli prowadzonej na podłożu cebulowym [za Kulnianin, dane niepublikowane] w 28ºC. W celu stwierdzenia obecności endosymbiontów w komórkach grzybów zebraną grzybnię każdego izolatu roztarto w sterylnym 1 cm3 0,1M MgSO4. Pobrano po 50 μl zawiesiny i barwiono znacznikiem fluorescencyjnym wg. 156 Występowanie endosymbiotycznych bakterii... protokołu (Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Bacteria, Biotium). Obserwacje prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse 90i z wykorzystaniem standardowych filtrów. Izolację endosymbiontów przeprowadzono z wykorzystaniem dwóch metod. Pierwsza polegała na inokulacji roztartą zawiesiną z grzybni płynnego podłoża TSB (Fluka) z dodatkiem 50 ppm nystatyny (Polfa Kraków). Druga metoda podzielona została na dwa etapy. W pierwszym przeprowadzono hodowlę grzybów jak opisano powyżej. Z hodowli pobrano krążek grzybni wraz z podłożem i umieszczono na zmodyfikowanym podłożu TSA (Fluka) grzybnią do podłoża. Płytki inkubowano 14 dni w 28ºC. W drugim etapie pobrano fragment podłoża (50 mm2) zawierającego endosymbionty i inokulowano nim płynne podłoże TSB (50 cm3) z dodatkiem 1% ekstraktu z boczniaka oraz 1% Tween 20 (Schuchardt, Munchen). Próby inkubowano 14 dni w 28ºC stacjonarnie. Do dalszych analiz wykorzystano izolaty uzyskane za pomocą drugiej metody. Ektrakt z boczniaka uzyskano przez zhomogenizowanie 250 g owocników boczniaka z uprawy towarowej w 1000 cm3 0,1M MgSO4. Zawiesina następnie poddana została fitracji przez filtr celulozowy (Filtrak) w celu usunięcia resztek grzybni. Przesącz filtrowano przy wykorzystaniu filtra 0,2 μm (Sartorius Stedim Biotech ). Uzyskano w ten sposób 700 cm3 sterylnego ekstraktu z boczniaka. W celu potwierdzenia przynależności izolatów do domeny bakterii namnożone mikroorganizmy poddano izolacji DNA. Izolacji dokonano za pomocą kitu Genomic Mini AX Bacteria (AA Biotechnology). Do reakcji PCR wykorzystano primery SMY-F511 i SMY‑R1382 [Yara i in. 2006] oraz bufor 5x Hot FIREPol Blend Master Mix (Solid Biodyne). Produkt reakcji poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym (45 min., 100V). Żel barwiono roztworem bromku etydyny. Masy prążków zanalizowano przy użyciu programu GelixOne 1D Software (Biostep GmbH, Niemcy). W celu identyfikacji genu nifH wykorzystano primery PolF i PolR [Poly i in. 2001] oraz bufor 5x Hot FIREPol Blend Master Mix (Solid Biodyne). Produkt reakcji poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym (60 min., 100V). Żel bawiono jak opisano powyżej. Szczep referencyjny stanowił Azospirillum barsieliense 35Bb [Król i Perzyński 2005]. W celu określenia zdolności izolatów do wzrostu na różnych podłożach wykorzystano podłoża TSA, MPA oraz King B. Wszystkie analizy przeprowadzone zostały w 4 wariantach: czyste podłoża, podłoża z dodatkiem 1% Tween 20, podłoża z dodatkiem 1% ekstraktu z boczniaka oraz podłoża z obydwoma dodatkami. 157 Mariusz Adamski, Katarzyna Pisarska WYNIKI • W obrazie mikroskopowym stwierdzono obecność bakterii wewnątrz komórek wszystkich analizowanych linii boczniaka. Były one widoczne w postaci ruchliwych jasnozielonych punktów wewnątrz komórek grzybni. • Obydwie metody izolacji endosymbiontów doprowadziły do uzyskania po jednym homogennym izolatcie dla każdej linii boczniaka. Izolaty uzyskane za pomocą pierwszej metody były zanieczyszczone martwą grzybnią z zawiesiny z której były izolowane, dlatego do dalszych analiz wykorzystano czyste izolaty uzyskane za pomocą drugiej metody. Zostały oznaczone przez dodanie litery „b” do nazwy linii z której zostały wyizolowane. • Pośród 9 izolatów endosymbiontów wyróżniono 6 różnych wielkości produktu PCR dla 16S rDNA (862 pz – P234.b, PxS.b; 839 pz – PB8.b, PSC.b; 809 pz – P Bo6 S.b, P USA S.b; 829 pz – PB 63S.b; 819 pz – PB7’96.b; 799 pz – P112.b) [Rys. 1]. Rys. 1. Elektroforeza produktów reakcji PCR z primerami dla 16S rDNA. Ścieżka 1: marker Ideal (DNA Gdańsk) • Badania z markerem genu nifH, kodującego reduktazę nitrogenazy wchodzącą w skład kompleksu nitrogenzy, we wszystkich przypadkach dały wynik negatywny (obraz nie zamieszczony). • Wzrost pojedynczych, niewielkich kolonii endosymbiontów obserwowano jedynie na podłożu TSA z dodatkiem 1% Tween 20 i ekstraktu z boczniaka. 158 Występowanie endosymbiotycznych bakterii... DYSKUSJA I WNIOSKI Obserwacje żywych bakterii w komórkach boczniaka dowodzą ich bezwzględnie endosymbiotycznej natury. Mimo udanej izolacji bakterie te nie były zdolne do rozwoju na podłożach bez obecności grzyba lub jego ekstraktu. Obecność produktu PCR uzyskanego w reakcji z bakteryjnymi primerami potwierdza ich bakteryjną naturę. Zróżnicowanie wielkości produktu może sugerować zróżnicowanie gatunkowe uzyskanych izolatów. Zróżnicowanie to równocześnie nie było zależne od pochodzenia badanej linii grzybów. Brak genu nifH wskazuje, iż bakterie te nie funkcjonują jako symbionty zaopatrujące gospodarza w azot. Mechanizm wzajemnych zależności endosymbiont – grzyb pozostaje nieznany. LITERATURA Bertaux J., Schmid M., Prevost-Boure N.C., Churin J.L., Hartmann A., Garbaye J., Frey-Klett P. 2003. In situ identification of intracellular bacteria related to Paenibacillus spp. in the mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N. Appl Environ Microbiol. Jul; 69(7): 4243-8. Bianciotto V., Bandi C., Minerdi D., Sironi M., Tichy H.V., Bonfante, P. 1996. An obligately endosymbiotic mycorrhizal fungus itself harbors obligately intracellular bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3005–3010. Bianciotto V., Lumini E., Bonfante P., Vandamme P. 2003. ’Candidatus glomeribacter gigasporarum’ gen. nov., sp. nov., an endosymbiont of arbuscular mycorrhizal fungi. Int J Syst Evol Microbiol. Jan; 53(Pt1):121-4. Bonfante P. 2003. Plants, mycorrhizal fungi and endobacteria: a dialog among Cells and genomes. The Biological Bulletin, 204: 215-20. Cruz A.F., Horii S., Ochiai S., Yasuda A., Ishii T. 2008. Isolation and analysis of bacteria associated with spores of Gigaspora margarita. ���������������������� Journal of Applied Microbiology, 104: 1711-1717. Król M.J., Perzyński A. 2005. Wykorzystanie benzenu jako jedynego źródła węgla w wiązaniu wolnego azotu przez bakterie z rodzaju Azospirillum i Pseudomonas stutzeri. Pamiętnik Puławski, 140:103-116. Partida-Martinez L.P., Groth I., Schmitt I., Richter W., Roth M., Hertweck C. 2007. Burkholderia rhizoxinica sp. nov. and Burkholderia endofungorum sp. nov., bacterial endosymbionts of the plantpathogenic fungus Rhizopus microsporus. Int J Syst Evol Microbiol, 57Pt 11): 2583-90. 159 Mariusz Adamski, Katarzyna Pisarska Poly F., Monrozier L.J., Bally R. 2001. Improvement in the RLPH procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil., Res. Microbiol. 152: 95‑103. Yara R., Maccheroni W. Jr, Horii J., Azevedo J.L. 2006. A bacterium belonging to the Burkholderia cepacia complex associated with Pleurotus ostreatus. J Microbiol. Jun, 44(3): 263-8. Adres do korespondencji: mgr Mariusz Adamski, mgr Katarzyna Pisarska Zakład Mikrobiologii Rolniczej, Katedra Ochrony Roślin Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25/27, 50-375 Wroclaw e-mail: [email protected] *Stypendysta programu „Przedsiębiorczy doktorant - inwestycja w innowacyjny rozwój regionu”, realizowanego w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytet VIII Regionalne Kadry Gospodarki, Działanie 8.2 Transfer Wiedzy, Poddziałania 8.2.2 Regionalne Strategie Innowacji Opiekun naukowy: prof. dr hab. Stanisław J. Pietr 160 Iwona Cieślik Barbara Mickowska Katarzyna Kluz Władysław Migdał EPISTEME 14/2012 s.161-167 ISSN 1895-4421 PRÓBA ZASTOSOWANIA CHROMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ DO ANALIZY AMIN BIOGENNYCH W MIĘSIE RYB ATTEMPT TO APPLY ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY FOR THE ANALYSIS OF BIOGENIC AMINES IN FISH MEAT Abstrakt. Celem pracy było zbadanie możliwości wykorzystania chromatografii jonowymiennej do oznaczenia zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Doświadczenie polegało na przygotowaniu ekstraktów, wykonaniu analiz chromatograficznych na kolumnie kationitowej z zastosowaniem po-kolumnowego systemu derywatyzacji z detekcją spektrofotometryczną. W badanych próbkach (liofilizat z filetu mintaja) wykazano obecność trzech amin biogennych: putrescyny (1,16 x 10-3 mg·g-1- 3,20 x 10-3 mg·g-1) spermidyny (1,47 x 10-3 mg·g-1- 3,27 x 10-3 mg·g-1) oraz sperminy (5,64 x 10-3 mg·g-1- 11,2 x 10-3 mg·g-1). Stwierdzono, iż chromatografia jonowymienna pozwala na oznaczanie zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Istotnym czynnikiem wpływającym na wynik analizy jest dobór odpowiednich parametrów ekstrakcji amin z badanych próbek. Słowa kluczowe: aminy biogenne, mięso ryb Summary. The aim of this study was to try to determine biogenic amines in fish meat using ion exchange chromatography. The experiment consisted in the preparation of extracts, chromatographic analysis performed on the cation exchange column with post-column derivatization system and spectrophotometric detection. In the studied samples (lyophilisate from pollock fillet) detected the presence of three biogenic amines: putrescine (1,16 x 10-3 mg·g-1- 3,20 x 10-3 mg·g-1), spermidine (1,47 x 10-3 mg·g1 - 3,27 x 10-3 mg·g-1) and spermine (5,64 x 10-3 mg·g-1- 11,2 x 10-3 mg·g-1). It can be concluded that the ion exchange chromatography enables for the determination of biogenic amines in fish meat. An important factor influencing on the analysis is the selection of appropriate parameters of the extraction of amines from samples. Key words: biogenic amines, fish meat 161 Iwona Cieślik, Barbara Mickowska, Katarzyna Kluz, Władysław Migdał WSTĘP Aminy biogenne są zasadami organicznymi o małej masie cząsteczkowej. Występują zarówno w komórkach roślinnych, zwierzęcych, jak i bakteryjnych. Powstają w wyniku dekarboksylacji aminokwasów, a niektóre także w wyniku aminacji i transaminacji odpowiednich ketonów i aldehydów [Berthold i Nowosielska 2008]. Spożycie żywności o wysokim stężeniu amin biogennych może być szkodliwe dla zdrowia. Wzrost ich stężenia może być spowodowany obecnością bakterii odpowiedzialnych za dekarboksylację aminokwasów, a co za tym idzie – jest oznaką psucia się danego produktu żywnościowego. Znajomość czynników wywołujących powstawanie amin w żywności oraz kontrola ich poziomu jest bardzo ważna z punktu widzenia jakości i bezpieczeństwa żywności [Libudzisz 2008]. Aminy takie jak dopamina czy serotonina pełnią funkcję neuroprzekaźników w ośrodkowych układzie nerwowym. Za regulację ciśnienia tętniczego odpowiedzialne są fenyloetyloamina, tyramina i histamina. Dwie pierwsze podwyższają ciśnienie krwi, natomiast ostatnia powoduje obniżenie ciśnienia tętniczego krwi [Silla Santos 1996]. Aminy biogenne takie jak putrescyna, kadaweryna czy spermidyna mogą działać jak wolne rodniki, hamując utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Efekt ten skorelowany jest z liczbą grup aminowych w cząsteczce [Stadnik i Dolatowski 2010]. W wielu badaniach stwierdzono ich obecność w komórkach nowotworowych. Wiąże się to z oddziaływaniem czynników nitrozujących występujących w żywności na aminy i powstawaniem rakotwórczych N-nitrozoamin. Dlatego niezwykle ważna w terapii nowotworowej jest kontrola diety chorego pod względem zawartości poliamin. Aminy biogenne (histamina, putrescyna, kadaweryna, spermina, spermidyna) występują głównie w rybach, takich jak: makrele, tuńczyki, śledzie, sardynki [Silla Santos 1996] MATERIAŁ I METODY Odczynniki. Wszystkie używane odczynniki były czystości analitycznej i pochodziły z Sigma-Aldrich (USA). Aparatura. Chromatograficzny analizator aminokwasów z przystawką do derywatyzacji po-kolumnowej i detektorem spektrofotometrycznym (Ingos, Czechy). Metody. Do analiz najbardziej odpowiednie okazały się próbki liofilizatu mięsa mintaja, które przed liofilizacją było kilkukrotnie rozmrażane i zamrażane. Ekstrakty otrzymane z pozostałych gatunków ryb (panga, tilapia, pstrąg, karp, szczupak, sandacz) nie spełniały warunków do analizy chromatograficznej. Główną przyczyną było zżelowanie próbek, taka konsystencja uniemożliwiała zadozowanie ich na kolumnę chromatograficzną. 162 Próba zastosowania chromatografii jonowymiennej... Do badań pobierano 1 g liofilizatu próbki mięsa mintaja pochodzącego z tego samego filetu. Następnie przeprowadzono ekstrakcję w czterech wariantach: przy użyciu 0,1 M HCl – w końcowej objętości 80 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja I), buforu cytrynianowo – sodowego pH 2.2 (0,0067 M kwas cytrynowy, 0,02 M NaCl, pH 2.2) w końcowej objętości 80 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja II), buforu cytrynianowo – sodowego pH 2.2 (0,067 M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2)– w końcowej objętości 55 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja III) oraz ten sam bufor w objętości 40 ml·g-1 liofilizatu (ekstrakcja IV). Po dodaniu ekstrahentu próbki wytrząsano z użyciem mechanicznej wytrząsarki przez 1 godzinę, wirowano w wirówce laboratoryjnej oraz zlewano otrzymane supernatanty. Czynności te powtarzano trzykrotnie. Po ostatnim odwirowaniu supernatant liofilizowano. Po liofilizacji próbki rozpuszczano w 1 ml wody dejonizowanej. Następnie powstały roztwór filtrowano przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm (Millipore, USA). Przed aplikacją do analizatora otrzymane próbki rozcieńczano 10 – krotnie wodą lub buforem do próbek (0,067 M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2). Przygotowane próbki analizowano na kolumnie jonowymiennej o wymiarach 3,7 x 60 mm, wypełnionej silnym kationitem z sulfonowanego polistyrenu OSTION Lg ANB (Spolchemie, Spolek pro chemickou a hutní výrobu AS, Ústí nad Labem, Czechy). Elucję prowadzono przy użyciu buforów cytrynianowo-sodowo-potasowych o rosnącej sile jonowej oraz wzrastającym pH. Detekcję produktów po-kolumnowej reakcji ninhydrynowej prowadzono spektrofotometrycznie przy długości fali 570 nm (aminy biogenne dają dodatni wynik w reakcji ninhydrynowej). System chromatograficzny skalibrowano używając roztworu wzorcowego, będącego mieszaniną siedmiu amin biogennych, o stężeniu każdej aminy wynoszącym 500 nmol/ml. Na podstawie przeprowadzonych analiz chromatograficznych obliczono zawartość oznaczonych amin biogennych w poszczególnych próbkach. WYNIKI I DYSKUSJA Kalibrację systemu chromatograficznego przeprowadzono używając roztworu zawierającego mieszaninę siedmiu amin biogennych: histaminy, tyraminy, putrescyny, kadaweryny, agmatyny, spermidyny oraz sperminy (o stężeniu każdej aminy wynoszącym 500 nmol/ml). Tab. 1 przedstawia czasy retencji poszczególnych amin biogennych wchodzących w skład roztworu wzorcowego. Przykładowy chromatogram roztworu wzorcowego przedstawiono na Rys. 1. 163 Iwona Cieślik, Barbara Mickowska, Katarzyna Kluz, Władysław Migdał Czas retencji [min] Amina biogenna 15.12 histamina 24.69 tyramina 31.89 putrescyna 42.39 kadaweryna 69.66 agmatyna 73.76 spermidyna 85.47 spermina spermine 85.47 agmatine 69.66 spermidine 73.76 cadaverine 42.39 putrescine 31.89 histamine 15.12 tyramine 24.69 Tab. 1. Parametry retencyjne analiz chromatograficznych wzorcowej mieszaniny amin biogennych 2.00000 1.00000 0.00000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Rys. 1. Chromatogram roztworu wzorcowego mieszaniny amin biogennych o stężeniu 500 nmol/ml Na podstawie uzyskanych chromatogramów zidentyfikowano aminy biogenne obecne w analizowanych próbkach oraz oznaczono ich zawartość, w celu porównania odzysku amin w zależności od zastosowanej metody ekstrakcji. Zastosowanie ekstrakcji I dało dużo mniejszy odzysk wszystkich wykrytych amin biogennych niż pozostałe ekstrakcje, odpowiednio: putrescyna 1,16 x 10-3 mg·g-1, spermidyna 1, 47 x 10-3 mg·g-1 oraz spermina 5,64 x 10-3 mg·g-1. Przy zastosowaniu ekstrakcji III odzysk putrescyny oraz sperminy (odpowiednio 2,57 x 10-3 mg·g-1 i 7,53 x 10-3 mg·g-1) okazał się niższy niż w przypadku ekstrakcji II (odpowiednio 3,20 x 10-3 mg·g-1 i 8,68 x 10-3 mg·g-1). Natomiast w przypadku spermidyny, stężenia tej aminy w przypadku ekstrakcji III i ekstrakcji II były porównywalne, odpowiednio 2,36 x 10-3 mg·g-1 i 2,38 x 10-3 mg·g-1. Użycie ekstrakcji IV dało najlepszy efekt, w przypadku spermidyny i sperminy odzysk był najwyższy (3,27 x 10-3 mg·g-1 i 11,2 x 10-3 mg·g-1), niestety w analizowanym ekstrakcie w ogóle nie wykryto obecności putrescyny (Rys. 2, 3). 164 spermidine 73.60 putrescine 31.58 0.70 0.60 spermine 85.72 Próba zastosowania chromatografii jonowymiennej... 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 agmatine 73.35 spermine 85.35 Rys. 2. Analiza chromatograficzna amin biogennych ekstrahowanych z liofilizowanego mięsa mintaja [ekstrakcja II] 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Rys. 3. Analiza chromatograficzna amin biogennych ekstrahowanych z liofilizowanego mięsa mintaja [ekstrakcja IV] 165 Iwona Cieślik, Barbara Mickowska, Katarzyna Kluz, Władysław Migdał Po porównaniu wyników analiz z użyciem buforu cytrynianowo–sodowego rozcieńczonego i nierozcieńczonego jako ekstrahenta stwierdzono, że wydajność ekstrakcji sperminy i spermidyny zwiększyła się, gdy stężenie soli w buforze było wyższe (ekstrakcja IV). Zadowalający odzysk tych amin uzyskano również stosując ekstrakcję II, ponadto w tym przypadku ekstrahowała się także putrescyna (Tab. 2). AMINA BIOGENNA PUTRESCYNA SPERMIDYNA SPERMINA Ekstrakcja I 0,1 M HCl, 80 ml/1g liofilizatu 1,16 x 10-3 mg·g-1 1,47 x 10-3 mg·g-1 5,64 x 10-3 mg·g-1 Ekstrakcja II, 10-krotnie rozc. bufor*, 80 ml/1g liofilizatu 3,20 x 10-3 mg·g-1 2,38 x 10-3 mg·g-1 8,68 x 10-3 mg·g-1 Ekstrakcja III bufor*, 55 ml/1g liofilizatu 2,57 x 10-3 mg·g-1 2,36 x 10-3 mg·g-1 7,53 x 10-3 mg·g-1 Ekstrakcja IV bufor*, 40 ml/1g liofilizatu Nie stwierdzono 3,27 x 10-3 mg·g-1 11,2 x 10-3 mg·g-1 Tab. 2. Zawartość amin biogennych w próbkach mięsa mintaja w zależności od zastosowanego roztworu do ekstrakcji. *Bufor cytrynianowo-sodowy (0,067 M kwas cytrynowy, 0,2 M NaCl, pH 2.2) Według danych literaturowych, w makrelach, śledziach, tuńczyku i sardynkach oprócz histaminy zostały wykryte także inne aminy, w tym putrescyna, kadaweryna, tyramina, spermina i spermidyna. W badaniach przeprowadzonych na rybach fermentowanych Ghananiam wykryto śladowe ilości putrescyny, tyraminy, agmatyny i tryptaminy [Silla Santos 1996]. Po fermentacji ryb stwierdzono także wzrost zawartości spermidyny [Broczek i in. 2003]. Spermina i spermidyna są naturalnie występującymi aminami w mięsie. Zawartość spermidyny w mięsie wynosi zazwyczaj poniżej 5 mg·g-1 [Kalač 2006], a naturalna zawartość sperminy jest wysoka, waha się w granicach 20-60 mg·kg-1 [Kalač i Krausová 2005]. W przeprowadzonych badaniach oznaczone zawartości tych amin biogennych były śladowe i nie stanowią zagrożenia dla zdrowia człowieka. Również stwierdzona zawartość putrescyny nie stanowi zagrożenia dla naszego zdrowia. WNIOSKI Wyniki przeprowadzonych badań pozwalają stwierdzić, iż chromatografia jonowymienna może być wykorzystana do oznaczania zawartości amin biogennych w mięsie ryb. Istotnym czynnikiem determinującym wyniki analizy jest dobór odpowiednich metod i parametrów ekstrakcji amin z badanych próbek. Zastosowana metoda pozwoliła na oznaczenie spermidyny, sperminy oraz putrescyny w testowej próbce filetu rybnego. 166 Próba zastosowania chromatografii jonowymiennej... LITERATURA Berthold A. i Nowosielska D. 2008. Aminy biogenne w żywności. Medycyna Weterynaryjna, 64 (6):745-748. Broczek M., Rautenstrauch D., Windyga B., Śnieżyńska H., Jędra M., Badowski P., Karłowska B. 2003. Zawartość histaminy i tyraminy w zależności od jakości mikrobiologicznej śledzi solonych, przechowywanych w różnych temperaturach. Roczniki PZH, 4: 87-95. Kalač P. 2006. Biologically active polyamines in beef, pork and meat products. A review. Meat Science, 73: 1-11. Kalač P., Krausová P. 2005. A review of dietary polyamines: Formation, implications for growth and health and occurrence in food. Food Chemistry, 90: 219-230. Libudzisz Z. 2008. Mikrobiologia techniczna – Mikrobiologia w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji żywności (tom 2). Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa. Silla Santos M.H. 1996. Biogenic amines: their importance in foods. International Journal of Food Microbiology, 29: 213-225. Stadnik J. i Dolatowski Z. 2010. Biogenic amines in meat and fermented meat products. Acta Scientarium Polonorum. Technologia Alimentaria, 9 (3): 251-261. Adres do korespondencji: mgr inż. Iwona Cieślik, dr Barbara Mickowska Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych, Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected], [email protected], [email protected] inż. Katarzyna Kluz Małopolskie Centrum Monitoringu Żywności, Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Władysław Migdał 167 Anna Dudzińska Magda Filipczak-Fiutak Jacek Domagała EPISTEME 14/2012 s.169-176 ISSN 1895-4421 WPŁYW PRESURYZACJI NA PRZEŻYWALNOŚĆ MIKROFLORY JOGURTOWEJ EFFECTS OF PRESSURIZATION ON VIABILITY OF YOGURT MICROFLORA Abstrakt. Celem pracy było określenie wpływu presuryzacji, w warunkach różnych wysokości ciśnienia hydrostatycznego, na przeżywalność mikroflory jogurtowej. Ciśnieniowaniu poddano dwa produkty: mleko kozie (350 MPa i 500 MPa), z którego następnie wyprodukowano jogurt oraz jogurt (150 MPa i 250 MPa) uzyskany z mleka koziego. Presuryzację prowadzono przez 15 min w temp. 25°C. W wytworzonych metodą termostatową jogurtach zbadano przeżywalność drobnoustrojów z gatunku: S. thermophilus i L. delbrueckii ssp. bulgaricus. W ciśnieniowanych jogurtach zaobserwowano spadek liczebności mikroorganizmów obu gatunków wraz ze wzrostem ciśnienia. W jogurtach otrzymanych z mleka presuryzowanego w 350 MPa ilość żywych komórek była większa, a w 500 MPa mniejsza niż w jogurcie kontrolnym, co sugeruje, że obróbka mleka przerobowego umiarkowanie wysokim ciśnieniem stymuluje wzrost bakterii kwasu mlekowego. Słowa kluczowe: presuryzacja, wysokie ciśnienie hydrostatyczne, mikroflora jogurtowa Summary. The aim of a study was to determine the influence of pressurization, in terms of different heights of hydrostatic pressure, on viability of yogurt microflora. Two products were treated at high pressure: goat’s milk (350 MPa and 500 MPa) which was used to manufacture yogurt and yogurt (150 MPa and 250 MPa) obtained from goat’s milk. High-pressure treatments were applied for 15 min at 25°C. In these set style yogurts the viability of microbes of the species: S. thermophilus and L. delbrueckii ssp. bulgaricus was investigated. In pressurized yogurts bacterial counts of both starter cultures tended to decrease with increasing pressure. In yogurts from milk treated at 350 MPa, the number of viable cells was higher and at 500 MPa lower than in control yogurt. It suggests that moderately high pressure treatment of processing milk stimulates growth of lactic acid bacteria. Key words: pressurization, high hydrostatic pressure, yogurt microflora 169 Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała WSTĘP W ostatnim czasie wzrasta zainteresowanie wpływem presuryzacji na mleko i przetwory mleczne. Zastosowanie ciśnienia od 300 do 600 MPa jest skuteczną metodą inaktywacji mikroorganizmów, w tym najbardziej szkodliwych patogenów żywności. Wysokie ciśnienie wpływa również na właściwości fizyko - chemiczne i technologiczne mleka [Trujillo i in. 2002]. Micele kazeinowe rozpadają się na mniejsze cząstki [Schmidt i Koops 1977], białka serwatkowe, a zwłaszcza najbardziej wrażliwa β - laktoglobulina, ulegają denaturacji, a następnie agregacji i interakcji z kazeiną [Funtenberger i in. 1997, Lopez-Fandino i in. 1997], natomiast kuleczki tłuszczowe - w zależności od temperatury - łączeniu lub dezintegracji nie uszkadzając otoczek [Gervilla i in. 2001]. Ciśnienie 100 - 400 MPa wywołuje krystalizację tłuszczu mlecznego [Buchheim i Abou El-Nour 1992]. Jednocześnie obróbka wysokociśnieniowa nie wywiera szkodliwego wpływu na istotne cechy jakościowe, takie jak: smak, zapach, zawartość witamin i składników odżywczych. Presuryzacja poprawia koagulację podpuszczkową oraz kwasową mleka, zwiększa sztywność, wytrzymałość i odporność na synerezę żelu jogurtowego. Opisany wpływ obróbki wysokociśnieniowej na składniki mleka znajduje coraz szersze zastosowanie w przemyśle mleczarskim. Umożliwia wytwarzanie bezpiecznych mikrobiologicznie i minimalnie przetworzonych produktów mlecznych o wysokiej jakości odżywczej, ulepszonych cechach sensorycznych, nowej teksturze i przedłużonej trwałości [Johnston i in. 1993, Trujillo i in. 2002]. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus oraz Streptococcus salivarius ssp. thermophilus są typowymi szczepami stosowanymi do produkcji jogurtu. Rola obu drobnoustrojów polega ogólnie na zakwaszeniu mleka oraz syntezie związków aromatycznych. Zarówno S. thermophilus jak i L. delbrueckii ssp. bulgaricus wykorzystują laktozę w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa na skutek czego utworzony pirogronian zostaje ostatecznie zredukowany do kwasu mlekowego [Zourari i in. 1992]. W wyniku syntezy odmiennych związków, istnieje wzajemna zależność pomiędzy wzrostem wymienionych szczepów. Oznacza to, że L. delbrueckii ssp. bulgaricus stymuluje paciorkowce poprzez uwolnienie aminokwasów i peptydów na skutek proteolizy, natomiast sam stymulowany jest przez dwutlenek węgla i kwas mrówkowy wytwarzane przez S. thermophilus. Taka współzależność wzrostu może zostać zahamowana przez różne czynniki, jak wysoka liczba komórek somatycznych w mleku lub obecność nadtlenku wodoru, antybiotyków, detergentów oraz bakteriofagów. Także niektóre zabiegi technologiczne prowadzone podczas produkcji jogurtu mogą skutkować zmniejszeniem liczby drobnoustrojów. Z drugiej strony kultury starterowe można stymulować na niektórych etapach przetwarzania mleka (obróbka cieplna, wzbogacanie mleka białkami) [Tamime i Robinson 2007, Serra i in. 2009]. 170 Wpływ presuryzacji na przeżywalność mikroflory jogurtowej... Badania opisane w niniejszym artykule zostały przeprowadzone w celu określenia wpływu wysokiego ciśnienia hydrostatycznego na przeżywalność bakterii z gatunku L. delbrueckii ssp. bulgaricus i S. thermophilus w presuryzowanym jogurcie oraz jogurcie wyprodukowanym z presuryzowanego mleka. MATERIAŁ I METODY Materiał badawczy stanowiły dwa rodzaje jogurtów wyprodukowane w warunkach laboratoryjnych metodą termostatową: • presuryzowany jogurt otrzymany z mleka koziego, • jogurt otrzymany z presuryzowanego mleka koziego. Doświadczenie przeprowadzono w następujących etapach: • wytworzenie jogurtu oraz przygotowanie mleka do presuryzacji, • odpowiednia obróbka wysokociśnieniowa obu produktów, • wyprodukowanie jogurtu z presuryzowanego mleka, • analizy mikrobiologiczne otrzymanych jogurtów. Materiał kontrolny stanowił jogurt nie poddany presuryzacji na żadnym etapie produkcji. Produkcja jogurtu. Surowe mleko kozie z okresu późnej laktacji poddano pasteryzacji w temperaturze 85°C przez 15 minut, następnie schłodzono do temperatury 44°C, po czym zaszczepiono szczepionką jogurtową YC - 180, w ilości 2% w przeliczeniu na zakwas roboczy, rozpuszczoną w peptonie. Całość dokładnie wymieszano i rozlano do jałowych opakowań jednostkowych. Próbki umieszczono w cieplarce w temperaturze 44°C do momentu uzyskania pH 4,7. W przypadku presuryzowanego jogurtu ciśnieniowanie prowadzono po inkubacji i jednodniowym przechowywaniu produktu w warunkach chłodniczych (5 - 8°C). W przypadku jogurtu otrzymanego z presuryzowanego mleka, obróbka wysokociśnieniowa mleka nastąpiła po jego pasteryzacji i również jednodniowym przechowywaniu chłodniczym (5 - 8°C). Analizy mikrobiologiczne wykonano po 48 godzinach chłodniczego przechowywania jogurtów od zakończenia inkubacji. Schemat technologiczny produkcji obu jogurtów przedstawiono na Rys. 1. 171 Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała PRESURYZOWANY JOGURT OTRZYMANY Z MLEKA KOZIEGO JOGURT OTRZYMANY Z PRESURYZOWANEGO MLEKA KOZIEGO Rys. 1. Schemat technologiczny produkcji presuryzowanego jogurtu z mleka koziego oraz jogurtu z presuryzowanego mleka koziego Obróbka wysokociśnieniowa. Presuryzację prowadzono w Instytucie Wysokich Ciśnień PAN w Warszawie. Produkty umieszczono w pojemnikach wykonanych z rozciągliwego materiału, nie pozostawiając wewnątrz pęcherzyków powietrza. Tak przygotowane próbki wprowadzono do komory wysokociśnieniowej wypełnionej glikolem propylenowym i wodą w stosunku 1:1. Po zamknięciu tłoka w komorze wygenerowano odpowiednio wysokie ciśnienie. Dla jogurtu zastosowano pojemniki propylenowe o pojemności 120 cm3 oraz ciśnienie 150 MPa i 250 MPa. Mleko umieszczono w pojemnikach polietylenowych o pojemności 500 cm3 i poddano presuryzacji przy ciśnieniu 350 MPa i 500 MPa. Próbki ciśnieniowano przez 15 minut w temperaturze 25°C. Badania wykonano w trzech powtórzeniach. Presuryzowane produkty przechowywano w temperaturze 5 - 8°C przez około 24 godziny. 172 Wpływ presuryzacji na przeżywalność mikroflory jogurtowej... Analiza mikrobiologiczna. Badania mikrobiologiczne wykonano zgodnie z Polską Normą [PN-A-86034-15] oznaczając charakterystyczne dla jogurtu drobnoustroje z gatunku Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus oraz Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Z odpowiednich rozcieńczeń badanych próbek jogurtów oraz jogurtu kontrolnego wykonano posiew wgłębny do dwóch równoległych płytek Petriego dla każdego drobnoustroju. Do izolacji L. delbrueckii ssp. bulgaricus zastosowano pożywkę MRS zakwaszoną do pH 5,4 o temperaturze 45°C. Płytki inkubowano w pozycji odwróconej, w temperaturze 37°C przez 72h w warunkach beztlenowych. W przypadku S. thermophilus użyto agar M-17 o pH uregulowanym do 7,2 i temperaturze 45°C. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48h w warunkach tlenowych. Wyniki obliczeń mikrobiologicznych przedstawiono jako log10 jednostek tworzących kolonie (jtk) na gram jogurtu. WYNIKI I DYSKUSJA Ponieważ przeżywalność kultur starterowych jest istotnym czynnikiem decydującym o bezpieczeństwie oraz jakości jogurtu [Ancos i in. 2000], w doświadczeniu dokładnie zbadano wpływ presuryzacji mleka przeznaczonego do produkcji jogurtu jak i presuryzacji samego jogurtu na liczbę drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus oraz L. delbrueckii ssp. bulgaricus w gotowym produkcie. Na Rys. 2 przedstawiono liczebność drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus oraz Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus w jogurcie kontrolnym, jogurcie otrzymanym z koziego mleka presuryzowanego w 350 MPa i 500 MPa oraz jogurcie presuryzowanym w 150 MPa i 250 MPa otrzymanym z koziego mleka. Na podstawie przeprowadzonych badań jogurtu kontrolnego stwierdzono większą liczbę żywych komórek bakterii z gatunku S. thermophilus (8,67 log jtk · g-1) w porównaniu z L. delbrueckii ssp. bulgaricus (8,19 log jtk · g-1). Paciorkowce zdominowały mikroflorę jogurtową przewyższając trzykrotnie liczbę pałeczek kwasu mlekowego. Jak twierdzą Laye i in. [1993] duży stosunek paciorkowców do pałeczek mlekowych jest korzystny przy tworzeniu pożądanego smaku i tekstury jogurtu, chociaż stosunek zbliżony do 1 uważany jest za optymalny. Jak wykazano w wielu publikacjach wysokie ciśnienie wywiera istotne zmiany w składnikach mleka [Schmidt i Koops 1977, Funtenberger i in. 1997, Lopez-Fandino i in. 1997, Gervilla i in. 2001], a przez to może wpływać na aktywność drobnoustrojów wprowadzonych do niego podczas produkcji mlecznych napojów fermentowanych. W jogurcie otrzymanym z mleka 173 Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała presuryzowanego w 350 MPa liczba żywych komórek S. thermophilus była większa (o 0,10 jednostek log jtk · g-1) niż w jogurcie kontrolnym. Z kolei poddanie mleka obróbce w 500 MPa nieznacznie ograniczyło aktywność tych drobnoustrojów w porównaniu z jogurtem nieciśnieniowanym. Podobnie, w przypadku komórek Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, zastosowanie do produkcji jogurtu mleka potraktowanego umiarkowanie wysokim ciśnieniem (350 MPa) stymulowało wzrost omawianych mikroorganizmów - zanotowano większą liczbę o 0,18 jednostek log jtk · g-1 w porównaniu z jogurtem niepresuryzowanym. Natomiast w mleku poddanym obróbce w 500 MPa wzrost pałeczek mlekowych był mniej intensywny skutkując mniejszą liczbą bakterii niż w produkcie kontrolnym. Rys. 2. Liczebność drobnoustrojów z gatunku S. thermophilus (A) oraz Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (B) w jogurcie kontrolnym (a), jogurcie otrzymanym z koziego mleka presuryzowanego w 350 MPa (b) i 500 MPa (c) oraz jogurcie presuryzowanym w 150 MPa (d) i 250 MPa (e) otrzymanym z koziego mleka Wielu naukowców donosiło o niszczącym działaniu wysokiego ciśnienia na różne rodzaje mikroorganizmów [Trujillo i in. 2002], dlatego w przeprowadzonym doświadczeniu zbadano również wpływ presuryzacji jogurtu na przeżywalność typowych dla tego produktu drobnoustrojów. W ciśnieniowanym jogurcie liczba żywych komórek obu gatunków mikroorganizmów była znacznie niższa (zwłaszcza przy ciśnieniu 250 MPa), w porównaniu zarówno do próbki kontrolnej, jak i napojów otrzymanych z presuryzowanego mleka. Największy spadek przeżywalności mikroflory jogurtowej zaobserwowano przy ciśnieniu 250 MPa. Szczególnie intensywna redukcja nastąpiła w liczebności komórek S. thermophilus, co wskazuje na dużą wrażliwość drobnoustroju na wysokie ciśnienia. Przy ciśnieniu 150 i 250 MPa liczba żywych komórek paciorkowców zmniejszyła się odpowiednio o 0,34 i 2,26 jednostek log jtk · g-1, natomiast dla pałeczek kwasu mlekowego zaobserwowano, w takich samych warunkach, spadek o 0,41 i 1,14 jednostek log jtk · g-1. 174 Wpływ presuryzacji na przeżywalność mikroflory jogurtowej... W przeciwieństwie do uzyskanych wyników, Tanaka i Hatanaka [1992] nie stwierdzili zmian w przeżywalności bakterii kwasu mlekowego po poddaniu pełnotłustego jogurtu działaniu ciśnienia 300 MPa, natomiast Ancos i in. [2000] wykazali większą odporność Streptococcus thermophilus niż Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus na 15 minutowe działanie ciśnienia 300 i 400 MPa w temperaturze 20°C oraz brak istotnych zmian przy ciśnieniu 100 i 200 MPa. WNIOSKI • W jogurcie kontrolnym, ciśnieniowanym w 150 MPa oraz wytworzonym z ciśnieniowanego mleka (350 MPa i 500 MPa) dominowały bakterie z gatunku S. thermophilus nad L. delbrueckii ssp. bulgaricus. Odwrotna zależność występowała w jogurcie ciśnieniowanym w 250 MPa. • Największą liczbą bakterii kwasu mlekowego charakteryzował się jogurt otrzymany z mleka presuryzowanego w 350 MPa, co sugeruje, że obróbka mleka przerobowego umiarkowanie wysokim ciśnieniem może stymulować kultury starterowe. Jednak wyższe ciśnienie powoduje ograniczenie ich wzrostu. • Presuryzacja jogurtu powoduje spadek liczebności mikroflory jogurtowej wraz ze wzrostem ciśnienia. Najmniej paciorkowców oraz pałeczek mlekowych zawierał jogurt ciśnieniowany w 250 MPa. • Stwierdzono, że większą wrażliwość na działanie wysokiego ciśnienia wykazuje S. thermophilus w porównaniu z L. delbrueckii ssp. bulgaricus. LITERATURA Ancos de B. Cano M. P. Gomez R. 2000. Characteristics of stirred low-fat yoghurt as affected by high pressure. International Dairy Journal, 10: 105-111. Buchheim W. Abou El-Nour A. M. 1992. Induction of milkfat crystallization in the emulsified state by high hydrostatic pressure. Fat Science and Technology, 94: 369-373. Funtenberger S. Dumay E. M. Cheftel J. C. 1997. High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SH/S–S interchange reactions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 912-921. Gervilla R. Ferragut V. Guamis B. 2001. High hydrostatic pressure effects on colour and milk-fat globule of ewe’s milk. Journal of Food Science, 66 (6): 880-885. 175 Anna Dudzińska, Magda Filipczak-Fiutak, Jacek Domagała Johnston D. E. Austin B. A. Murphy R. J. 1993. Properties of acid-set gels prepared from high pressure treated milk. Milchwissenschaft, 48: 206-209. Laye I. Karleskind D. Morr C. V. 1993. Chemical, microbiological and sensory properties of plain nonfat yogurt. Journal of Food Science, 58: 999-995. Lopez-Fandino R. Ramos M. Olano A. 1997. Rennet coagulation of milk subjected to high pressures. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 3233-3237. Schmidt D. G. Koops J. 1977. Properties of artificial casein micelles. Netherlands Milk and Dairy Journal, 31: 342-357. Serra M. Trujillo J. A. Guamis B. Ferragut V. 2009. Flavour profiles and survival of starter cultures of yoghurt produced from high-pressure homogenized milk. International Dairy Journal, 19: 100-106. Tamime A. Y. Robinson R. K. 2007. Yoghurt science and technology. Woodhead Publishing Ltd. Cambridge. Tanaka T. Hatanaka K. 1992. Application of hydrostatic pressure to yoghurt to prevent its after-acidification. Journal of Japanese Society of Food Science and Technology, 39: 173-177. Trujillo J. A. Capellas M. Saldo J. Gervilla R. Guamis B. 2002. Applications of highhydrostatic pressure on milk and dairy products: a review. ���������������������� Innovative Food Science and Emerging Technologies, 3: 295-307. Zourari A. Accolas J. P. Desmazeaud M. J. 1992. Metabolism and biochemical characteristics of yoghurt bacteria. A review. Lait, 72: 1-34. 1995. Instrukcje technologiczne do produkcji artykułów mleczarskich. Oficyna Wydawnicza HOŻA. Warszawa. 1998. Polska Norma PN-A-86034-15. Mleko i przetwory mleczne. Badania mikrobiologiczne. Jogurt; oznaczanie liczby charakterystycznych drobnoustrojów. Adres do korespondencji: mgr inż. Anna Dudzińska, mgr inż. Magda Filipczak-Fiutak Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jacek Domagała, prof. UR 176 Agnieszka Dylewska EPISTEME 14/2012 s.177-184 ISSN 1895-4421 WPŁYW CZASU OGRZEWANIA ROZTWORÓW KONCENTRATU BIAŁEK SERWATKOWYCH NA NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE I LEPKOŚĆ INFLUENCE OF HEATING TIME OF WHEY PROTEIN CONCENTRATE SOLUTIONS ON SURFACE TENSION AND VISCOSITY Abstrakt. Koncentrat białek serwatkowych WPC 80 stosowany jest często jako preparat zaspokajający zapotrzebowanie organizmu na białko, szczególnie przy intensywnym wysiłku fizycznym. Bogaty w aminokwasy egzogenne stanowi produkt metabolicznie aktywny, wykazuje działanie antykataboliczne oraz anaboliczne. Przeprowadzono modelowe badania z użyciem WPC 80 (w 15%-owym roztworze wodnym). Roztwory ogrzewano w temp. 80°C i pobierano próby po różnym czasie ogrzewania (od 5 do 80 min, co 5 min). Próbka nieogrzewana stanowiła próbę referencyjną. Przeprowadzono oznaczenia napięcia powierzchniowego z użyciem tensjometru optycznego (Theta optical tensiometer, KSV Instruments) oraz pomiary lepkości z użyciem lepkościomierza ultradźwiękowego (ultrasonic viscometer, Unipan 505). Przeprowadzono analizę statystyczną wyników z użyciem programu STATISTICA 10. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona między zmiennymi, wyznaczono linie regresji. Słowa kluczowe: koncentrat białek serwatkowych, napięcie powierzchniowe, lepkość Summary. Whey protein concentrate WPC 80 is often used as a specific satisfying the need of organism on proteins, especially with intensive physical efforts. Rich with exogenous aminoacids, forms a metabolically active product and demonstrates anticatabolic and anabolic activity. Model research was engaged using WPC 80 (in 15% water solutions). Solutions were heated in temperature 80°C and the samples were collected after different time of heating (from 5 to 80 minutes, every 5 minutes). The unheated sample represented referential sample. The assays of surface tension using optical tensiometer (Theta optical tensiometer, KSV Instruments) and viscosity measurements using ultrasonic viscometer (Unipan 505) were carried out. Statistical analyses were executed using the program STATISTICA 10. Pearson’s Correlation coefficient was calculated among the variables, regression lines were determined. Key words: whey protein concentrate, surface tension, viscosity 177 Agnieszka Dylewska WSTĘP Koncentrat białek serwatkowych (WPC) to źródło wysokiej jakości białek mające zastosowanie w przemyśle spożywczym. Białka serwatkowe posiadają wyższą wartość biologiczną niż np. białka jaj czy soi [Smithers 2008]. Białka mleczne w formie rozpuszczalnej i zdyspergowanej w roztworze są szeroko doceniane jako składniki żywności, posiadają bardzo dobre właściwości powierzchniowo czynne oraz właściwości stabilizacji koloidów. WPC stosuje się w produkcji żywności funkcjonalnej. Enzymatyczne hydrolizaty WPC stosowane są głównie jako źródło azotu w żywności dla dzieci oraz w żywieniu dojelitowym [González-Tello i in. 2007]. Koncentrat białek serwatkowych może mieć zastosowanie w odżywkach dla dzieci, bezpośrednio lub jako dodatek do zwykłych koncentratów mlecznych, dzięki czemu otrzymany produkt ma mieć skład jak najbardziej zbliżony do mleka kobiecego [Westergaard 2004]. Zarówno koncentraty białek serwatkowych jak i izolaty tych białek używane są jako emulgatory i stabilizatory ze względu na ich właściwości międzyfazowe i żelowanie [Nicorescu i in. 2008]. Prozdrowotne właściwości koncentratu białek serwatkowych oraz napojów z nich otrzymywanych związane są głównie z wysoką zawartością rozgałęzionych aminokwasów egzogennych (izoleucyny, leucyny i waliny), które stymulują syntezę białek mięśniowych [Katsanos i in. 2006]. W związku z tym WPC jest chętnie spożywany przez sportowców i osoby aktywne fizycznie. Aminokwasy te dostarczają energię do mięśni i przyspieszają syntezę kwasu glutaminowego i alaniny podczas stresu (m.in. intensywnych ćwiczeń fizycznych czy urazów) [Pescuma i in. 2010]. Napoje dla sportowców należą do żywności funkcjonalnej i mają zapewniać odpowiednią hydratyzację, być szybko absorbowane w organizmie i poprawiać osiągi sportowe. Ponadto, sportowcy odczuwają mniejszy ból mięśni spożywając napoje z dodatkiem białek serwatkowych i cukrów niż napojów zawierających tylko cukry [Millard-Stafford i in. 2005]. Białka serwatkowe odzyskuje się przemysłowo w procesie ultrafiltracji i ze względu na zróżnicowanie wielkości cząstek są oddzielane od laktozy i składników mineralnych, które następnie przechodzą przez membranę do permeatu. Retentat suszy się zwykle w suszarkach rozpyłowych, w celu wyprodukowania WPC o stężeniu białek w zakresie 35-80% [Yee i in. 2007; Pescuma i in. 2010]. Oznaczanie napięcia powierzchniowego jest wymagane do projektowania i kontrolowania procesów związanych z przepływem ciepła i masy. Aby dobrze zaprojektować proces suszenia rozpyłowego, pomiar właściwości fizycznych jest niezbędny do wyliczenia średniej średnicy kropli oraz składu granulometrycznego substancji. Ciśnienie przepływu oraz przepływ masowy przesączu są funkcją gęstości cieczy i lepkości, które z kolei zależą od stężenia i temperatury. Proces ultrafiltracji dla roztworów koncentratu o stężeniach 10-20% musi być tak 178 Wpływ czasu ogrzewania roztworów koncentratu białek... przeprowadzony, aby uniknąć zarówno zmian mikrobiologicznych jak i fizykochemicznych. Odpowiednie suszenie rozpyłowe ma na celu zapobieganie przed tymi zmianami [González-Tello i in. 2007]. MATERIAŁ I METODY Do badań zastosowano WPC 80 (SM Spomlek, Radzyń Podlaski). Sporządzono 15%-owe roztwory WPC w temperaturze 25ºC. Roztwory były następnie mieszane przez 1h z użyciem mieszadeł magnetycznych. W dalszej kolejności roztwory ogrzewano w temperaturze 80ºC i pobierano próby po różnym czasie ogrzewania (od 5 do 80 min, co 5 min). Próbka nieogrzewana stanowiła próbę referencyjną. Przeprowadzono oznaczenia napięcia powierzchniowego z użyciem tensjometru optycznego (Theta optical tensiometer, KSV Instruments) oraz pomiary lepkości z użyciem lepkościomierza ultradźwiękowego (ultrasonic viscometer, Unipan 505). Pomiary wykonano w pięciu powtórzeniach. Przeprowadzono analizę statystyczną wyników z użyciem programu STATISTICA 10. Obliczono współczynnik korelacji Pearsona między zmiennymi, wyznaczono linie regresji. WYNIKI I DYSKUSJA Rys. 1 przedstawia zależność napięcia powierzchniowego 15% ogrzewanych roztworów WPC w funkcji czasu. Wyniki wskazują jednoznacznie na wzrost wartości napięcia powierzchniowego z upływem czasu ogrzewania. Wpływ ogrzewania białek serwatkowych na ich właściwości strukturalne i chemiczne jest często rozpatrywanym zagadnieniem ze względu na obecność tego procesu w przetwórstwie żywności. Budowa strukturalna łańcuchów polipeptydowych ulega wyraźnej zmianie; następuje odsłonięcie grup hydrofobowych, co może być procesem odwracalnym lub nie w zależności od typu powstałych mostków S-S. Dłuższe ogrzewanie indukuje również agregację globularnych białek serwatkowych. Kinetyka denaturacji i agregacji białek zależy od warunków ogrzewania (temperatury, szybkości ogrzewania) oraz czynników jak pH, siła jonowa czy stężenia białek [Nicorescu i in. 2008]. LaClair i Etzel [2010] podkreślają także, iż otrzymanie napojów o długim okresie przydatności do spożycia na bazie białek serwatkowych jest dużym wyzwaniem ze względu na możliwość denaturacji i agregacji białek podczas ogrzewania, skutkujące zmętnieniem roztworu lub powstaniem białego osadu, co konsumenci postrzegają jako wady produktu. W powyższych badaniach pojawienie się osadu zaobserwowano po 60 min ogrzewania w temp. 80ºC. González-Tello i in. [2007] zbadali napięcie powierzchniowe (σ) roztworów białek serwatkowych w temperaturze 25ºC. W tej temperaturze, dla stężenia 179 Agnieszka Dylewska 5%, zanotowano krytyczne napięcie powierzchniowe równe σc = 42,5 mN/m. Dla stężeń białek ≥10%, średnia arytmetyczna napięcia powierzchniowego wynosiła 46,3 mN/m. Ogólnie, wartości σ uzyskane przez naukowców dla stężeń 1-30% były niższe niż w przedstawionych powyżej badaniach ze względu na niższą temperaturę (25 ºC), w której nie zachodzi jeszcze proces denaturacji białka. Nicoresceu i in. [2008] oznaczyli napięcie powierzchniowe 2% roztworów izolatu białek serwatkowych w temperaturze 100ºC w funkcji czasu. Naukowcy stwierdzili, iż nieogrzewane roztwory białek wykazują niższe napięcie powierzchniowe niż próbki po ogrzaniu, co jest potwierdzone również w powyższych badaniach (dla próby referencyjnej σ = 49,71). 60 napięcie powierzchniowe [mN/m] 59 58 57 56 55 54 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 czas [min] Średnia Średnia±Odch.std Rys. 1. Wpływ czasu ogrzewania 15% roztworów WPC na napięcie powierzchniowe Wyk. 1 jest to wykres rozrzutu wartości napięcia powierzchniowego roztworów WPC względem czasu. Odnotowano wysoki współczynnik korelacji Pearsona pomiędzy zmiennymi (r = 0,9084). W związku z silną korelacją dodatnią wyznaczono linię regresji, którą opisuje równanie: y = 0,0322x + 56,389. Współczynnik determinacji (R2) wyniósł 0,8252. Rys. 2 przedstawia zależność lepkości 15% roztworów WPC w funkcji czasu. Widoczny jest wzrost lepkości roztworów w czasie ogrzewania. Agregacja ogrzewanych białek w niskich stężeniach białka wpływa zazwyczaj na zwiększanie wartości lepkości [Purwanti i in. 2011]. Prawdopodobnie rozfałdowanie i agregacja białek w wysokiej temperaturze spowodowały wzrost lepkości badanych roztworów w czasie. 180 Wpływ czasu ogrzewania roztworów koncentratu białek... 59,5 napięcie powierzchniowe [mN/m] 59,0 58,5 58,0 57,5 57,0 56,5 56,0 55,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 czas [min] Wyk. 1. Wykres rozrzutu wartości napięcia powierzchniowego 15% roztworów WPC względem czasu ogrzewania w temperaturze 80°C 3,0 2,8 2,6 lepkość [mPa s g cm-3] 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 czas [min] Średnia Średnia±Odch.std Rys. 2. Wpływ czasu ogrzewania 15% roztworów WPC na lepkość 181 Agnieszka Dylewska Wyk. 2 obrazuje wykres rozrzutu wartości lepkości roztworów WPC względem czasu. Współczynnik korelacji Pearsona między zmiennymi był tu jeszcze wyższy niż w przypadku zależności napięcia powierzchniowego od czasu i wyniósł 0,9370. Występuje silna korelacja dodatnia między zmiennymi. Linię regresji opisuje równanie: y = 0,011 x + 1,3735; R2 = 0,8779. Wyk. 3 przedstawia wykres rozrzutu między wartościami lepkości a napięciem powierzchniowym roztworów. Współczynnik korelacji Pearsona był wyższy niż 0,8, co świadczy również o silnej korelacji dodatniej. Linię regresji opisuje zależność: y = 0,2767 x -14,1362. R2 = 0,6922. Wyk. 2. Wykres rozrzutu wartości lepkości 15% roztworów WPC względem czasu ogrzewania w temperaturze 80°C 2,6 2,4 lepkość [mPa s g cm-3] 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 czas [min] 2,6 2,4 lepkość [mPa s g cm-3] 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 55,5 56,0 56,5 57,0 57,5 58,0 napięcie powierzchniowe [mN/m] 182 58,5 59,0 59,5 Wyk. 3. Wykres rozrzutu wartości lepkości 15% roztworów WPC względem napięcia powierzchniowego Wpływ czasu ogrzewania roztworów koncentratu białek... WNIOSKI • Wraz ze wzrostem czasu ogrzewania zaobserwowano wzrost napięcia powierzchniowego 15% roztworów WPC w temperaturze 80 ºC. Wzrost napięcia powierzchniowego związany jest ze zmianą konformacji białek i ich agregacją. • Wraz ze wzrostem czasu ogrzewania zanotowano wzrost wartości lepkości 15% roztworów WPC. • Zaobserwowano silną korelację dodatnią między napięciem powierzchniowym a lepkością ogrzewanych roztworów WPC. LITERATURA Smithers G. W. 2008. Whey and whey proteins – from ‘gutter-to-gold’. Int Dairy J. 18, 695-704. González-Tello P., Camacho F., Guadix E. M., Luzón G., González P. A. 2009. Density, viscosity and surface tension of whey protein concentrate solutions. J Food Process Eng. 32, 235-247. Westergaard V. 2004. Milk powder technology. Evaporation and spray-drying (5th ed.) Copenhagen: Niro A/S. Nicorescu I., Loisel C., Vial C., Riaublanc A., Djelveh G., Cuvelier G., Legrand J. 2008. Combined effect of dynamic heat treatment and ionic strength on denaturation and aggregation of whey proteins – Part I. Food Res Int. 41, 707-713. Katsanos C. S., Kobayashi H., Sheffield-Moore M., Aarsland A., Wolfe R. R. 2006. A high proportion of leucine is required for optimal stimulation of the rate of muscle protein synthesis by essential aminoacids in the elderly. Am J of Physiol Endocrinol and Metab. 291, E381-E387. Pescuma M., María Hébert E., Mozzi F., Font de Valdez G. 2010. Functional fermented whey-based beverage using lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol. 141, 73-81. Millard-Stafford M., Warren G., Thomas L. Doyle J., Snow T., Hitchcock K. 2005. Recovery from run training: efficacy of a carbohydrate-protein beverage? Int J Sport Nutr Exerc. 15, 610-24. Yee K. W. K., Wiley D. E., Bao, J. Whey protein concentrate production by continuous ultrafiltration: Operability under constant operating conditions. J Memb Sci 290, 125-137. 183 Agnieszka Dylewska LaClair C. E., Etzel M. R. 2010. Ingredients and pH are key to clear beverages that contain whey protein. J Food Sci 75, 21-27. Purwanti N., Smiddy M., Jan van der Goot A., de Vries R., Alting A., Boom R. 2011. Modulation of rheological properties by heat-induced aggregation of whey protein solution. Food Hydrocolloid. 25, 1482-1489. Adres do korespondencji: mgr inż. Agnieszka Dylewska Zakład Technologii Mleka i Hydrokoloidów Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin e-mail: [email protected] 184 Agnieszka Gębusia Ewa Cieślik Anna Kościej Agnieszka Siembida EPISTEME 14/2012 s.185-192 ISSN 1895-4421 OCENA WIEDZY ORAZ POBRANIA KWASU FOLIOWEGO PRZEZ MIESZKANCÓW WOJEWÓDZTWA MAŁOPOLSKIEGO ASSESSMENT OF KNOWLEDGE AND INTAKE OF FOLIC ACID BY THE INHABITANTS THE MALOPOLKA REGION Abstrakt. W pracy podjęto próbę oszacowania spożycia kwasu foliowego oraz poziomu wiedzy żywieniowej na temat skutków jego niedoboru w diecie. Badaniem ankietowym objęto 126 mieszkańców województwa małopolskiego, w wieku 18-45 lat. Narzędzie badawcze stanowił kwestionariusz ankiety skonstruowany specjalnie dla celów badawczych. Ankietowane osoby, wśród skutków niedoboru kwasu foliowego, najczęściej wybierali wady wrodzone cewy nerwowej. W badanej grupie, aż 70% osób nie stosowało suplementacji kwasem foliowym w postaci tabletek, a 58% nie przyjmowało żadnych suplementów witaminowych. Ponad 60% respondentów umiało wskazać przynajmniej jeden produkt spożywczy będący dobrym źródłem tej witaminy. Jednocześnie wykazano niski poziom spożycia produktów bogatych w foliany. Słowa kluczowe: kwas foliowy, wiedza żywieniowa, suplementy diety Summary. The aim of the study was the assessment of knowledge and intake of folic acid consumption with food and supplements and awareness about the effects of its deficiency in the diet. The survey included 126 residents of the Małopolska region at the age of 18-45 years. The study was performed using a questionnaire prepared for these tests. Respondents, among the effects of folic acid deficiency, most often pointed neural tube defects. In the examined group as much as 70% of people did not use folic acid supplementation, and 58% did not have any vitamin supplements. Over 60% could identify at least one food product that is a good source of folic acid. Simultaneously, the study showed low level of consumption of foods rich in folate. Key words: folic acid, nutrition knowledge, dietary supplements 185 Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida WSTĘP Prawidłowy sposób odżywiania jest bezpośrednim czynnikiem odpowiadającym za utrzymanie dobrego samopoczucia i stanu zdrowia w każdym wieku. Polega on na systematycznym dostarczaniu odpowiednio zbilansowanych składników odżywczych, zarówno z dietą jak i jej suplementami. Do składników diety, których najczęściej dostarczamy w niedostatecznej ilości należą foliany. Obejmują one liczną grupę związków zaliczanych do witamin grupy B, które różnią się stanem utlenienia pierścienia pirazynowego, rodzajem jednowęglowych fragmentów oraz ilością reszt kwasu glutaminowego. Kwas foliowy (kwas pteroilomonoglutaminowy) jest najbardziej utlenionym stałym związkiem folianów. Organizm człowieka nie potrafi go syntetyzować, z tego względu kwas foliowy powinien być regularnie dostarczany z dietą lub suplementami witaminowymi. Zgodnie z najnowszymi zaleceniami Instytutu Żywności i Żywienia z 2008 roku, dawka pokrywająca zapotrzebowanie kobiet w wieku rozrodczym to 600 mg dziennie na poziomie RDA. W przypadku wcześniejszego wystąpienia wad cewy nerwowej płodu kobieta, w kolejnej ciąży pod opieką lekarza, powinna przyjmować nawet 10-krotnie większą dawkę. Dawka pokrywająca zapotrzebowanie osób powyżej 19 roku życia wynosi 320 mg (na poziomie EAR), a 400 mg (na poziomie RDA), jednak należy również uwzględnić czynniki ograniczające wchłanianie folianów. Działanie kwasu foliowego zmniejszają środki przeciwbólowe, leki przeciwpadaczkowe, kortyzon, sulfamidy i antybiotyki oraz antagoniści kwasu foliowego. Na niedobory folianów narażone są także kobiety stosujące doustne środki antykoncepcyjne, osoby nadużywające alkoholu i palacze papierosów [Jarosz i Bułhak-Jachymczyk 2008, Okumura i Tsukamoto 2011, Duda i Saran 2008]. Kwas foliowy jest witaminą rozpuszczalną w wodzie, wrażliwą na wysoką temperaturę i światło. Ulega zniszczeniu nawet na skutek zbyt długiego przechowywania produktów spożywczych. Należy zatem pamiętać, iż w procesie przetwarzania żywności (gotowania, pieczenia, smażenia) oraz jej długiego przechowywania, straty folianów mogą sięgać od 40 do nawet 70 % [Czeczot 2008]. Z tego względu najlepszym sposobem na dostarczenie organizmowi odpowiedniej ilości tej witaminy jest spożywanie produktów zbożowych (z pełnego ziarna zbóż) oraz surówek z różnorodnych warzyw, przyrządzonych bezpośrednio przed podaniem. Najkorzystniejszą obróbką termiczną żywności jest gotowanie na parze lub w niewielkiej ilości wody. Wykazano także, iż obecność witaminy C w produktach spożywczych znacznie zmniejsza straty kwasu foliowego [McKillop i in. 2002; McNulty i Pentieva 2004]. Kwas foliowy z pożywienia jest wchłaniany w przewodzie pokarmowym człowieka w około 50-90% [Melse-Boonstra 2002; Molloy 2002]. Do najczęściej wymienianych skutków niedostatecznej podaży kwasu foliowego i jego pochodnych należą: powstawanie wad cewy nerwowej oraz zaburzeń 186 Ocena wiedzy oraz pobrania kwasu foliowego... w działaniu układu nerwowego, niedokrwistość megaloblastyczna, miażdżyca i związane z nią dysfunkcje układu sercowo-naczyniowego. Obserwacje żywieniowe i epidemiologiczne wskazują także coraz częściej na korelację niedoboru folianów z występowaniem zmian nowotworowych oraz rozwojem chorób neurodegeneracyjnych. Biorąc pod uwagę tylko częściowe przyswajanie dostępnych z pożywienia folianów, ich niestabilność podczas przechowywania i obróbki termicznej oraz ich istotne funkcje w organizmie człowieka, celowe jest zwrócenie uwagi na konieczność spożywania suplementów tej witaminy. Celem przeprowadzonego badania było określenie poziomu wiedzy dotyczącej roli kwasu foliowego i skutków jego niedoboru, a także oszacowanie poziomu pobrania kwasu foliowego z produktów spożywczych i suplementów. MATERIAŁ I METODYKA Badania ankietowe przeprowadzono w 2011 roku z udziałem losowo wybranej grupy 126 osób w wieku 18-45 lat, zamieszkujących na terenie województwa małopolskiego. W badanej grupie znalazło się 75% kobiet oraz 25% mężczyzn. Narzędzie badawcze stanowił kwestionariusz ankiety sporządzony specjalnie do celów tego badania. Kwestionariusz zawierał 14 pytań. Były to zarówno pytania zamknięte, jak i otwarte, a także wielokrotnego wyboru. Pytania dotyczyły wiedzy na temat znaczenia kwasu foliowego w organizmie człowieka oraz skutków jego niedoboru, pobrania folianów z żywnością, a także nawyków związanych ze stosowaniem suplementów diety. Respondentów zapytano także o częstotliwość spożycia wybranych grup produktów. Uzyskane wyniki poddano analizie w programie Microsoft Office Excel 2007. WYNIKI I DYSKUSJA Wśród przebadanych osób prawie 60% odpowiedziało, że nie stosuje żadnych suplementów diety. Ich przyjmowanie zdeklarowało zaledwie nieco ponad 40% badanych. Osoby wzbogacające dietę wybierały zróżnicowane preparaty, były to zarówno kompleksy witaminowo-mineralne jak i wybrane witaminy (Rys. 1). W zakresie opinii na temat stosowania suplementów diety większość (57%) badanych odpowiedziała, że jest to wskazane dla utrzymania dobrego stanu zdrowia. Jednocześnie 28% osób uznała stosowanie suplementów diety za modne, a 15% za niepotrzebne/zbędne. Badania Jarosza [2008] wykazały, że 22% Polaków (w tym 16% mężczyzn i 28% kobiet) w ciągu roku zażywało, co najmniej 1 suplement diety. Wśród osób stosujących preparaty 29% deklarowało, że przyjmuje je niemal codziennie przez cały rok. Przyjmo187 Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida wane są one głównie z powodu zmęczenia, osłabienia lub choroby. Młodzi stosowali je dla wspomagania organizmu w okresie zwiększonego wysiłku (czynnikiem różnicującym była nie tylko płeć, ale również podjęty kierunek studiów), a także jako preparaty poprawiające urodę, podczas gdy osoby w zaawansowanym wieku zażywali je w celu wzmocnienia serca, kości i stawów [Jarosz 2008, Sigłowa i in., 2009]. Rys. 1. Wybór respondentów dotyczący stosowania preparatów farmakologicznych Zdecydowana większość ankietowanych (78%) uważała, że wzbogacanie diety w preparaty kwasu foliowego i innych witamin z grupy B jest ważne dla zdrowia. Jednakże aż 18% przyznało, że nie wie czy ma to jakiś wpływ na organizm. W badanej grupie aż 70% osób odpowiedziało, że nie stosuje suplementów kwasu foliowego jako samodzielnego preparatu (Rys. 1). Może to wynikać z faktu, że duża grupa osób zażywała kompleksy witaminowo-mineralne, które zawierają w składzie także kwas foliowy. Natomiast 30% badanych przyznało, że zażywa kwas foliowy w postaci tabletek. Odpowiedzi takiej udzielały tylko kobiety. Zapytane o motywy takiego postępowania odpowiadały, że skłoniła je do tego obecna lub planowana ciąża. Wykazano także, iż suplementy witamin z grupy B-complex nie cieszą się popularnością wśród respondentów. Przyjmowało je zaledwie 15% przebadanych. Badania Chłopickiej i in. [2004], przeprowadzone wśród młodych kobiet zamieszkujących Polskę południową w roku 2002/2003, wykazały znacznie wyższą popularność uzupełniania diety preparatami witaminowo-mineralnymi, w szczególności zawierającymi w swoim składzie kwas foliowy. Spożywanie powyższych preparatów zadeklarowało wówczas prawie 80 % kobiet. Natomiast Grochans i in. [2005] oraz Twarduś i in. [2003] wykazali znikomą częstotliwość stosowania suplementów kwasu foliowego. Kolejne pytanie dotyczyło wpływu witamin z grupy B (witaminy B6 i B12) oraz witaminy C na przyswajalność kwasu foliowego. Niespełna 40% ankietowanych osób wiedziało, że witaminy te wspomagają wchłanianie kwasu foliowego. Niestety prawie 60% osób przyznało, że nie potrafi odpowiedzieć na to pytanie. 188 Ocena wiedzy oraz pobrania kwasu foliowego... Ankietowanych poproszono następnie o wskazanie produktów będących dobrym źródłem kwasu foliowego. Wyniki przedstawiono na Rys. 2. W odpowiedzi na to pytanie respondenci mogli wskazać kilka odpowiedzi. Znacząca grupa badanych wybrała prawidłowo przynajmniej jeden produkt obfitujący w kwas foliowy. Najczęściej wskazywane były nasiona roślin strączkowych (70%) oraz ciemnozielone warzywa liściowe (60%). Połowa ankietowanych osób wskazała wątróbkę, a 1/3 żółtko jaja oraz ryby morskie. Podobne wyniki otrzymano w badaniach Ehmke i Kunachowicz [2011], natomiast niższy poziom wiedzy dotyczącej źródeł folianów stwierdzono wśród respondentów Wyki i Mikołajczak [2007]. Następnie badane osoby zapytano także o częstotliwość spożycia wybranych produktów. Odpowiedzi na to pytanie przedstawiono na Rys. 3. Rys. 2. Opinia respondentów na temat źródeł kwasu foliowego W znaczącej ilości odpowiedzi, prawidłowe wskazanie obfitego źródła folianów nie korelowało z częstotliwością jego spożywania przez respondentów. Badani pomimo posiadanej wiedzy nie wykazywali prawidłowych nawyków żywieniowych związanych ze spożyciem wybranych produktów. Również badania Dybkowskiej i in. [2007] wśród mieszkańców Warszawy jak i Bronkowskiej i Biernat [2008] wśród mieszkańców Dolnego Śląska wykazały niedoborowe ilości przyjmowanych folianów. Ostatnie pytanie dotyczyło skutków niedoboru kwasu foliowego. Również tutaj ankietowani mogli wybrać kilka odpowiedzi. Najwięcej, bo 75% osób wskazało wady wrodzone cewy nerwowej. Pozostałe skutki deficytu folianów były mniej znane. Niecałe 40% badanych osób wskazało choroby degeneracyjne układu nerwowego, 1/3 osób wymieniła anemię, a zaledwie 20% osób choroby układu krążenia. 189 Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida Rys. 3. Częstotliwość spożycia wybranych grup produktów Rys. 4. Skutki niedoboru kwasu foliowego w opinii respondentów WNOSKI • Pomimo posiadanej wiedzy dotyczącej skutków niedoborów kwasu foliowego zaledwie 40% respondentów stosowało suplementy diety. • Najistotniejszym powodem motywującym kobiety do przyjmowania preparatów kwasu foliowego była ciąża lub jej planowanie w najbliższym czasie. • W zakresie świadomości dotyczącej konsekwencji niedoboru kwasu foliowego aż 75% respondentów zaznaczyło wrodzone wady cewy nerwowej, 40% choroby degeneracyjne układu nerwowego, 1/3 osób wskazała anemię, a zaledwie 20% choroby układu krążenia. • Posiadana wiedza przebadanych osób w zakresie obfitych źródeł kwasu foliowego nie korelowała z częstotliwością spożycia produktów spożywczych będących źródłem folianów. 190 Ocena wiedzy oraz pobrania kwasu foliowego... LITERATURA Bronkowska M, Biernat J. 2008. Podaż kwasu foliowego i cyjanokobalaminy w całodziennych racjach pokarmowych kobiet z terenu Dolnego Śląska. Roczn PZH, 59: 203-9. Chłopicka J., Zachwieja Z., Kowalski W. 2004. Folic acid supplement use among women in Southern Poland. First Int. Conf. on Folates Analysis, bioavailability and health, 11-14 February, 176-178. Czeczot H. 2008. Kwas foliowy w fizjologii i patologii. Postepy Hig Med Dosw. 62: 405-419. Duda G., Saran A. 2008. Polskie rekomendacje dotyczące spożycia witamin i składników mineralnych przez osoby w starszym wieku. Farmacja Współczesna, 1, 16-23. Dybkowska E, Świderski F, Waszkiewicz-Robak B. 2007. Zawartość witamin w diecie dorosłych mieszkańców Warszawy. Roczn PZH, 58: 211-5. Ehmke vel. Emczyńska E., Kunachowicz H. 2011. Badanie ankietowe wśród kobiet w wieku rozrodczym dotyczące pierwotnej profilaktyki wad cewy nerwowej. Hygeia Public Health, 46(1): 47-50. Grochans E., Ćwiek D., Czajka R., Augustyniak K., Szych Z. 2005. Analiza wybranych czynników wpływających na stan zdrowia kobiet w okresie przedkoncepcyjnym. An��� nales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska, 60 (16): 134. Jarosz M. 2008. Suplementy diety a zdrowie. Porady lekarzy i dietetyków. PZWL, W-wa. Jarosz M., Bułhak-Jachymczyk B. 2008. Normy żywienia człowieka. Podstawy prewencji otyłości i chorób niezakaźnych, PZWL, Warszawa. McKillop D.J., Pentieva K., Daly D., McPartlin J.M., Hughes J., Strain J.J., Scott J.M., McNulty H. 2002. The effect of different coooking methods on folate retention in various foods that are amongst the major contributors to folate intake in the UK diet. Br. J. Nutr., 88: 681–688. McNulty H., Pentieva K. 2004. Folate bioavailability. Proc. Nutr. Soc. 63: 529-536. Melse-Boonstra A., de Bree A., Verhoef P., Bjorke-Monsen A.L., Verschuren W.M. 2002. Dieatry monoglutamate and poliglutamate folate are associated with plasma folate concentrations in Dutch men and women aged 20–65 years. J. Nutr., 2002; 132: 1307–1312. Molloy A.M. 2002. Folate bioavailability and health. Int. J. Vitam. Nutr Res., 72: 46–52 191 Agnieszka Gębusia, Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Siembida Okumura K.,Tsukamoto H. 2011. Folate in smokers. Clinica Chimica Acta 412, 521–526. Sigłowa A., Bertrandt B., Conder M., Bertrandt K., Lisiecka A., Kubiak P., Urbańska A. 2009. Suplementacja diety wśród studentów. Żyw Nauka. Technol. Jakość, 4:236–249. Twarduś K., Perek M, Krzeczowska B. 2003. Wiedza, postawy i zachowania studentek w zakresie profilaktyki wad cewy nerwowej. Annales Universitatis Mariae Curie-Skłodowska, 58: (13) 268. Wyka J., Mikołajczak J. 2007. Podaż kwasu foliowego w racjach pokarmowych wrocławianek w wieku 20-25 lat oraz ocena wiedzy o jego znaczeniu dla zdrowia. Roczniki PZH, 58 (4): 633-640. Adres do korespondencji: Ewa Cieślik, Anna Kościej, Agnieszka Gębusia, Agnieszka Siembida Katedra Technologii Gastronomicznej i Konsumpcji Uniwersytet Rolniczyw Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik 192 Justyna Górecka EPISTEME 14/2012 s.193-203 ISSN 1895-4421 WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE MODELOWYCH PRODUKTÓW MIĘSNYCH, WYPRODUKOWANYCH Z WSTĘPNIE UTRWALONEGO MIĘŚNIA NAJDŁUŻSZEGO GRZBIETU DZIKA PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF MODEL MEAT PRODUCTS, PRODUCED FROM INITIAL STABILIZED THE LONGISSIUMUS DORSI MUSCLE OF WILD BOAR Abstrakt. Dziczyzna ze względu na tradycyjne metody jej pozyskania i obróbki wstępnej narażona jest na zaawansowane zmiany biochemiczne i mikrobiologiczne. W przeprowadzonych badaniach podjęto próbę zwiększenia trwałości mięsa z dzika poprzez wprowadzenie na powierzchnię przechowywanych mięśni substancji bakteriostatycznych. Celem pracy była ocena wpływu zastosowania czynników bakteriostatycznych podczas składowania mięśnia najdłuższego grzbietu dzików na właściwości fizykochemiczne i teksturę ogrzewanych, modelowych produktów mięsnych, wyprodukowanych z tego surowca. Wykonano następujące analizy: wyciek termiczny, zawartość suchej substancji, tłuszczu, zdolności utrzymywania wody i liczby TBA. Ponadto oznaczono trwałość barwy oraz przeprowadzono badania profilu tekstury. Zastosowanie substancji bioaktywnych na powierzchnię przechowywanych mięśni, a także temperatury bliskiej krioskopowej skutkowało zachowaniem ich przydatności do produkcji modelowych produktów mięsnych nawet po 28 dobach składowania. Słowa kluczowe: dziczyzna, substancje bakteriostatyczne, przechowywanie chłodnicze, modelowe produkty mięsne Summary. The game meat from traditional obtaining methods and pre-treatment to advanced biochemical and microbiological changes is exposed. In studies the attempt to increase the sustainability meat of wild boar by introducing bacteriostatic substance on the surface stored muscles were investigated. The aim of this study was to evaluate the impact of the application during the storage of muscles longissimus dorsi bacteriostatic agents on the physicochemical properties and texture profile analysis of model meat products, produced from experimental materials. The drip loss, dry matter content, fat content, water holding capacity and the value of TBA was performed. Color stability and texture profile analysis were determined. The use of bioactive substances on the surface of storage muscles, and temperatures close cryoscopic point resulted in preservation of their usefulness for the model meat products, production even after 28 days of storage. Key words: venison, bacteriostatic substances, refrigerated storage, model meat products 193 Justyna Górecka WSTĘP Podczas podziału tusz zwierząt dzikich na elementy zasadnicze uzyskuje się pewną ilość mięsa drobnego, które może być zagospodarowane m.in. do produkcji kiełbas [Czerwińska 2010; Paleari i in. 2003]. Ze względu na warunki pozyskania i wstępnej obróbki dziczyzna jest surowcem specyficznym [Hoffman i Wiklund 2006; Marchioni i Felicio 2003]. Jest on narażony na szybką utratę świeżości, pogorszenie wyróżników sensorycznych, technologicznych, na zaawansowane zmiany biochemiczne i mikrobiologicznych, a nawet dyskwalifikację całej lub części tuszy [Szmańko i Górecka 2009]. Metod pozyskiwania dziczyzny praktycznie zmienić nie można. Należy natomiast stworzyć warunki sprzyjające mniejszej dynamice niepożądanych zmian, np. poprzez wykorzystanie czynników bakteriostatycznych w trakcie przechowywania surowca. Celem badań była ocena wpływu zastosowania czynników bakteriostatycznych podczas składowania mięśnia najdłuższego grzbietu dzików na właściwości fizykochemiczne i teksturę modelowych produktów mięsnych, wyprodukowanych z tego surowca. MATERIAŁY I METODY Materiałem doświadczalnym były modelowe, mięsne przetwory homogenizowane wyprodukowane w warunkach laboratoryjnych z mięśnia najdłuższego grzbietu dzików, wstępnie utrwalonych eksperymentalnymi substancjami biologicznie aktywnymi wyizolowanych z jaj, przechowywanych w temp. 3±1ºC lub -3±1°C, przez 0, 14, 21 i 28 dób. Surowiec pochodzący od 15. osobników o masie tusz w skórze około 70-90 kg, pozyskanych w lasach północno-zachodniej Polski zakupiono w zakładzie przetwórstwa dziczyzny. Zastosowano następujące substancje bakteriostatyczne: techniczny preparat inhibitorowo-lizozymowy, preparat lizozymu oraz preparat cystatyny. Charakterystyka tych substancji obejmowała oznaczenie: inhibującej aktywności cystatyny wobec papainy [Siewiński 1991] oraz aktywności lizozymu metodą spektrofotometryczną [Canfield 1963]. Substancje bioaktywne na powierzchnię mięśni nanoszono w sposób gwarantujący równomierne ich rozprowadzenie, a także uniemożliwiający wystąpienie krzyżowego zakażenia mikrobiologicznego prób (metoda będzie przedmiotem patentowania). Po eksperymentalnym okresie przechowywania mięso z poszczególnych grup doświadczalnych rozdrabniano, następnie homogenizowano z dodatkiem: 15% wody, 2% peklosoli, 0,2% polifosforanów oraz 0,03% askorbinianu sodu. Tak przygotowanym farszem napełniano polipropylenowy pojemniki, o średnicy 30 mm. Próby ogrzewano w temp. 85ºC do temp. 72ºC w centrum geometrycznym batonów, następnie schładzano w temp. 2ºC przez 24 godz. 194 L1 5 L2 6 L3 7 C 8 MS 9 CHŁ 10 KRIO Aktywność właściwa lizozymu [j/mg białka] 4 Aktywność właściwa cystatyny [j/mg białka] T3 938,00 - 6390,00 5,40 x 10-6 202,20 - 3,24 x 10-3 - - Chłodnicze przechowywanie - - - Przechowywanie w temperaturze bliskiej krioskopowej - - - Poziom preparatu [g/cm2] 3 15,01 Cystatyna Chłodnicze przechowywanie T2 Ekstrakt rozmarynu: 3,24 x 10-4 g/cm2 2 4,05 x 10-4 Mleczan sodu: 1,62 x 10-3 g/cm2 T1 Lizozym Skrót grupy 1 Grupa doświadczalna Techniczny preparat inhibitorowolizozymowy Lp. Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych... Mleczan sodu 6,08 x 10-4 8,11 x 10-4 1,08 x 10-4 1,62 x 10-4 2,16 x 10-4 Tab. 1. Charakterystyka zastosowanych czynników bakteriostatycznych Badania fizykochemiczne modelowych przetworów mięsnych obejmowały oznaczenie zawartości: suchej substancji i wody wg PN ISO 1442:2000, tłuszczu wg PN ISO 1444:2001, kwasowości czynnej badanej bezpośrednio w przetworach [PN ISO 2917:2000] oraz zdolności utrzymywania wody wg Grau-Hamma w modyfikacji Szmańko [1987]. Przebieg zmian o charakterze oksydacyjnym został określony poprzez oznaczenie zawartości aldehydu malonowego [Mei i in. 1998]. Oznaczenie parametrów tekstury wykonywano przy pomocy urządzenia do badań wytrzymałościowych firmy Zwick/Roell, typ Z010. Próbki w kształcie walca, o średnicy 27 mm i wysokości 15 mm, poddawano testom dwukrotnego ściskania przy 70% deformacji niszczącej (czas relaksacji międzykompresyjnej wynosił 30 sek.), prędkość przesuwu głowicy ściskającej ustalono na 60 mm/min. [Bourne 1982]. Analizowano następujące parametry profilu tekstury: twardość [N], żuwalność [Nm], sprężystość [mm] oraz spoistość [-]. 195 Justyna Górecka Pomiar barwy modelowych wyrobów mięsnych przeprowadzono w systemie CIELab przy zastosowaniu kolorymetru odbiciowego MINOLTA CR 200b. Trwałość barwy została ustalona na podstawie zmian parametrów L*a*b* barwy [Hunter i Harold 1987] zapakowanych próżniowo plastrów modelowych produktów mięsnych po 3, 6, 12 i 24 godzinach ekspozycji na działanie światła białego o natężeniu 250 lx. Stabilność barwy modelowych przetworów obliczano wg następującego wzoru: ΔEx (oznacza ΔE3 lub ΔE6 lub ΔE12 lub ΔE24) - stabilność barwy modelowych produktów mięsnych po 3, 6, 12 lub 24 godzinach ekspozycji na działania światła białego o natężeniu 250 lx. L*0, a*0, b*0 - wartości parametrów barwy L*, a*, b* modelowych produktów mięsnych niepoddanych na działanie światła białego. L*x, a*x, b*x - wartości parametrów barwy L*, a*, b* modelowych produktów mięsnych po 3, 6, 12 lub 24 godzinach ekspozycji na działanie światła białego o natężeniu 250 lx. Wyniki badań poddano dwuczynnikowej analizie wariancji przy przedziale ufności 95%. O zmienności poszczególnych parametrów wnioskowano w oparciu o test Duncana przy wykorzystaniu programu STATISICA 9.0. Analiza statystyczna obejmowała wyliczenie: wartości średnich, odchyleń standardowych i najmniejszych istotnych różnic (NIR). WYNIKI I DYSKUSJA Zawartość suchej substancji oraz tłuszczu w modelowych produktach mięsnych skorelowana była z zawartością tych składników w mięśniu najdłuższym grzbietu dzików. W miarę upływu czasu przechowywania surowca użytego do produkcji modelowych przetworów poszczególnych grup doświadczalnych obserwowano statystycznie istotny wzrost zawartości suchej substancji w doświadczalnych produktach z 24,31% do 30,58%, natomiast ilość tłuszczu zmieniała się w zakresie od 0,67% do 3,94%. W miarę upływu czasu przechowywania we wszystkich grupach eksperymentalnych zaobserwowano statystycznie istoty wzrost wycieku termicznego. Modelowe, ogrzewane przetwory mięsne wytwarzane z surowca przechowywanego w temperaturze bliskiej krioskopowej (-3ºC), w porównaniu z wyrobami wyprodukowanymi z mięśni utrwalonych preparatem lizozymu, niezależnie od ilości zastosowania tej substancji, charakteryzowały się dwukrotnie mniejszymi ubytkami podczas obróbki cieplnej. Po 28. dobach przechowywania dla grupy KRIO wyciek ten wynosił 8,88%, natomiast dla L3 - 18,76% (Tab. 2). 196 8,79B 0,45 0,45 0,67 0,79 1,52 0,45 0,65 0,84 0,47 0,40 3,84 3,84 3,84 x 54,19bB 3,84 53,32bB 3,84 58,32cC 3,84 53,43bC 3,84 58,30cC 3,84 56,83cC 3,84 52,94bB 3,84 50,13aA sd 49,39aA x 53,09B 0,60 53,09B 0,96 53,09B 1,08 53,09C 0,99 53,09A 1,16 53,09B 0,96 53,09B 0,75 53,09B sd 53,09B x 8,88aB 0,66 13,62bD 1,53 15,73cD 0,78 14,89bcD 0,42 18,76eD 0,65 17,71dC 0,88 17,10dD 0,81 14,10bC sd 16,55dD x 5,43aA 1,18 11,14bC 0,75 13,08cC 0,66 12,05bC 0,52 12,66bC 0,69 12,62bB 0,62 15,13dC 0,66 11,51bB 0,48 11,74bC sd 12,52bB x 5,13aA 8,79B 0,45 7,89bA 8,79A 0,45 11,00cB 8,79A 0,45 10,29cB 8,79A 0,45 10,95cB 0,45 7,95bA 0,45 11,77cB 0,45 11,52cB 0,45 10,56cB sd 8,89bA 8,79A KRIO 8,79A CHŁ 8,79A MS 8,79A C sd 2,80 2,67 2,64 4,24 3,32 3,55 2,66 2,83 3,09 4,17 48,97aA 53,88cB 3,48 1,50 3,00 2,56 x 51,14cA 53,23cB 4,21 46,89abA 50,13bB 2,96 50,01cA 52,86cA 3,85 45,78abA 49,81aA 3,59 51,37cA 52,31cB 3,42 47,70bA 49,47aA 3,06 44,74aA 48,73aA sd 49,88cA x 47,25bA 28 L3 x 14 21 L2 53,58cB Zdolność utrzymywania wody [%], n=15 0 L1 13,79bC 28 T3 53,09B 21 T2 53,11bB 14 T1 51,15cA Wyciek termiczny [%], n=5 0 Warianty doświadczalne 8,79A Okres przechowywania [doby] Wyróżnik Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych... sd 3,60 2,67 3,11 2,87 2,93 3,03 2,81 3,63 3,27 2,72 Tab. 2. Wyciek termiczny oraz zdolność utrzymywania wody modelowych produktów mięsnych [%].x - średnie wartości w poszczególnych grupach; sd –odchylenie standardowe. a, b, c… - średnie wartości w tych samych wierszach oznaczone różnymi małymi literami różnią się istotnie przy p≤0,05. A, B, C… - średnie wartości w poszczególnych kolumnach oznaczone różnymi dużymi literami różnią się istotnie przy p≤0,05 197 Justyna Górecka Największą zdolnością utrzymywania wody cechowały się próby wytwarzane z mięsa stabilizowanego wyłącznie mleczanem sodu oraz modelowe wyroby wyprodukowane z surowca składowanego w temperaturze bliskiej krioskopowej (Tab. 2). Wysokie wartości omawianego wyróżnika stwierdzono także w przypadku grup T1 oraz L3, które po 28. dobach przechowywania kształtowały się odpowiednio na poziomie: 51,15% i 51,37%. 46,62aB 1,25 37,44aAB 2,98 37,10abAB 0,96 33,32A KRIO 1,40 33,32A 0,96 39,78bcB 44,75aC 1,21 1,62 62,82cC 1,55 41,22abB 1,55 33,32A 0,96 53,85eB 43,19aC 1,63 1,81 57,29bD 1,75 62,59eC 1,70 33,32A 0,96 34,55aA 1,04 60,76bD 0,91 37,61aB 56,55bC 0,95 1,90 33,32A 0,96 42,66cB 1,07 1,42 44,49aD 1,82 2,11 1,35 48,97bcC 33,32A 0,96 46,41dB 2,12 CHŁ 46,70aC 57,90dC MS 1,90 0,80 33,32A 0,96 48,51dB 2,45 C 1,16 50,47cB L3 sd 28 1,38 33,32A 0,96 38,12bB 1,19 33,32A 0,96 41,65cB 33,32A L2 x sd 198 L1 47,55aC 21 41,49abB x 1,17 sd T3 2,55 Twardość [N] 14 T2 43,11bB x 0,96 sd T1 41,66bC x 0 Warianty doświadczalne 1,02 Okres przechowywania [doby] 41,48abB Wyróżnik Wstępne utrwalanie mięśnia najdłuższego grzbietu dzików preparatem lizozymu, niezależnie od poziomu zastosowania tej substancji biologicznie aktywnej, skutkowało statystycznie istotnie większymi wartościami twardości i żujności modelowych wyrobów mięsnych, w porównaniu z produktami pozostałych grup doświadczalnych (Tab. 3). Analizując zmienność wyników parametrów profilu tekstury doświadczalnych produktów mięsnych zaobserwowano, że największą twardością odznaczały się wyroby wytworzone z mięśni stabilizowanych wyłącznie mleczanem sodu, po 14 i 28 dobach przechowywania, wynosiła ona odpowiednio: 53,85 i 62,82 N. Twardość innych grup eksperymentalnych zmieniała się w zakresie od 34,55 N do 47,55 N. 0,01 0,74aA 0,78aB 0,79aB 0,76aAB 0,78aB 0,82cC 0,78aB 0,76aAB sd 0,03 0,00 0,03 0,03 0,06 0,03 0,01 0,01 0,03 0,02 0,02 0,01 21 0,02 x 0,03 0,76aA 0,82bcC 0,82bC 0,79aB 0,81bC 0,78aB sd 0,82bC 0,81aA 0,80bA 0,03 0,84bcB 0,81bA 0,84bB 0,84bB 0,83bB 0,81bA 0,02 0,02 0,01 0,02 0,03 0,01 14 0,02 x 0,82C sd 0,81bcA 0,83c 0,83c 0,08 0,08 0,83c 0,83b 0,08 0,08 0,83b 0,83b 0,83b 0,83b 0,83c 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 x 0,02 sd 0,79bB 26,25bcC 28,53cdC 0,89 1,56 30,97dcB 22,27aB 0,49 2,77 36,86eC 34,02eB 34,65eC 25,76bcB 23,99abA 2,07 0,57 1,32 1,81 1,47 x 23,30abA 0,87 1,14 1,03 1,48 1,22 1,10 1,21 0,84 1,27 1,61 sd 1,90 23,95cAB 23,96cA 32,68cB 19,28aA 32,90eB 33,03eB 30,49dB 21,33abA 23,40bcA 22,79bcA x 0,83a 20,22bA 0,63 1,26 20,97bA 22,98cA 15,24aA 0,94 1,87 27,24eA 25,20dA 27,55eA 20,84bA 22,40bcA 21,55bcA 1,33 1,38 2,49 1,22 0,73 1,26 sd 0,03 0,03 28 x 0,74aA sd 0,03 0 x 0,08 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 2,64 sd 0,84aB 26,27B 26,27AB 26,27C 26,27C 26,27A 26,27A 26,27A 26,27B 26,27B 26,27B x 0,03 0 0,80aBC 28 0,03 21 0,72bA Żuwalność [Nm] 14 0,03 Spoistość [-] Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych... 199 0,94c 0,03 0,79bC 0,02 0,78bC 0,76aD 0,02 0,02 0,94c 0,78bC 0,77bC 0,68aB 0,02 0,01 0,02 0,03 0,94b 0,76aA 0,77aC 0,76aD 0,02 0,05 0,02 0,03 0,94c 0,75bA 0,77bC 0,68aB 0,03 0,02 0,04 0,03 0,94b 0,03 0,76aA 0,01 0,73aC 0,01 0,78aC 0,73aC 0,03 28 0,05 0,94b 0,03 0,77aB 0,01 0,77aD 0,01 0,76aC 0,02 0,63aA 0,04 sd 0,01 0,94b 0,03 0,79aC 0,02 0,01 0,67aB sd 0,02 0,78aC 0,03 0,77bB 0,02 0,03 0,78bC 0,02 0,78bC 0,01 x 0,67aB 0,71bA x 21 0,74bB sd 0,02 x 0,74bB 14 0,02 Sprężystość [mm] sd 0,03 0 0,01 0,94c 0,94c x 0,94c Justyna Górecka Tab. 3. Parametry profilu tekstury modelowych produktów mięsnych, n=10. Oznaczenia jak w Tab. 2 Najmniejsze wartości żujności oznaczono w próbach stabilizowanych technicznym preparatem inhibitorowo - lizozymowym oraz preparatem cystatyny (Tab. 3). Zauważono, że najmniejszą spoistością po 28. dobach przechowywania charakteryzowały się wyroby wytwarzane z surowca utrwalonego technicznym preparatem inhibitorowo - lizozymowym (T1 - 0,72, T2 i T3 - 0,74), natomiast najwyższą wartość tego wyróżnika stwierdzono dla mięsnych produktów modelowych wyprodukowanych z mięśni stabilizowanych mleczanem sodu (0,84). Modelowe przetwory wykonane z surowca utrwalonego preparatem lizozymu, po 28. dobach przechowywania, cechowały się wyższymi wartościami sprężystości (L1 - 0,77 mm, L2 i L3 - 0,73 mm), podobnie jak produkty wytworzone z surowca utrwalonego wyłącznie mleczanem sodu oraz mięśni składowanych w temperaturze bliskiej krioskopowej (0,76 mm). Podobną tendencję w kształtowaniu się wartości parametrów tekstury przeprowadzonych na wędlinach średnio rozdrobnionych, składowanych w temp. 3ºC i -3ºC, odnotowano w innych badaniach własnych [Górecka i in. 2011a i 2011b]. 200 Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych... Zaobserwowano, że modelowe wyroby mięsne wyprodukowane z surowca utrwalonego preparatem lizozymu oraz mleczanem sodu poddane działaniu światła białego o natężaniu 250 lx charakteryzowały się mniejszą trwałością barwy w porównaniu próbami pozostałych grup eksperymentalnych. Modelowe przetwory wytworzone z surowca wstępnie stabilizowanego ekstraktem rozmarynu, w porównaniu z innymi próbami, nietraktowanymi tą substancją, cechowały się ciemniejszą barwą, co potwierdza wyniki badań Yu i wsp. [2002]. Czas przechowywania miał istotny wpływ na trwałość barwy modelowych produktów mięsnych. Jednym ze wskaźników stopnia zaawansowania procesów oksydacji frakcji lipidowej w produktach żywnościowych jest poziom zawartości aldehydu malonowego. Najmniejsza zawartość produktów reagujących z kwasem 2-tiobarbiturowym została oznaczona w modelowych produktach mięsnych wyprodukowanych z mięśni przechowywanych w stanie głębokiego schłodzenia oraz utrwalonych mleczanem sodu (0,10 µg MDA/g produktu). Największą natomiast dynamikę utleniania lipidów zaobserwowano w próbach z mięśni stabilizowanych technicznym preparatem inhibitorowo-lizozymowym w ilości 4,05 x 10-4 g/cm2 (0,16 µg MDA/g produktu). WNIOSKI • Modelowe produkty mięsne wyprodukowane z mięśnia najdłuższego grzbietu dzików przechowywanych w temperaturze bliskiej krioskopowej (-3ºC), w porównaniu z wyrobami pozostałych grup eksperymentalnych, charakteryzowały się mniejszym wyciekiem termicznym i większą zdolnością utrzymywania wody. • Najmniejszą trwałością barwy charakteryzowały się modelowe wyroby mięsne, do produkcji których użyto mięśnia najdłuższego grzbietu dzików wstępne utrwalonych preparatem lizozymu oraz stabilizowanych wyłącznie mleczanem sodu. • Stwierdzono wpływ czasu składowania surowca, niezależnie od zastosowanych na powierzchnię mięśnia najdłuższego grzbietu dzików substancji bakteriostatycznych, oraz warunków przechowywania na wzrost twardości i żujności, a także obniżenie spoistości i sprężystości modelowych produktów mięsnych. • Zastosowanie eksperymentalnych substancji biologicznie aktywnych na powierzchnię mięśnia najdłuższego grzbietu dzików, a także składowanie ich w temperaturze bliskiej krioskopowej skutkowało zachowaniem ich technologicznej przydatności do 28 doby przechowywania. 201 Justyna Górecka LITERATURA Bourne M. 1982. Food texture and viscosity: Concept and measurement. Academic Press, New York. Canfield R.E. 1963. The amino acid sequence of egg white lysozyme. J. Biol. Chem. 238, 2698-2707. Czerwińka D. 2010. Wykorzystanie dziczyzny w przetwórstwie mięsa. Gospodarka Mięsna: 1, 10-12. Górecka J. Szmańko T., Bilyk O., Kęsy Z., Świątkowski G. 2011a Sensory and rheological properties of the grill sausages, packed in vacuum or modified atmosphere and cool storage or at near cryoscopic temperature. Product Development & Quality Assurance. Wrocław, 126-143. Górecka J., Szmańko T., Wereszczyński J. 2011b. Jakość kiełbas homogenizowanych przechowywanych w temperaturze bliskiej krioskopowej. Zeszyt Naukowy Lwowskiego Narodowego Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej i Biotechnologii im. Grzyckiego we Lwowie, 13, 4 (50), 154-162. Hoffman LC, Wiklund E. 2006. Game and vinison – meat for the modern consumer. Meat Science, 74, 197-208. Hunter R.S., Harold R.W. Eds. 1987. The measurement of appearance. Sec. Ed. A Wiley-Interscience Publication John Wiley & Sons., New York Marchiori A., Felicio P. 2003. Quality of wild boar meat and commercial pork. Scientia Agricola 60, 1, 1-5. Mei L., Cromwell G.L., Crum A.D., Decker E.A. 1998. Influence of dietary β-alanine and histidine on the oxidaive stability of pork. Meat Science, 49, 55-64. Paleari M.A., Moretti M.V., Berenta T.M., Mentasti T, Bersami C. 2003. Credit products from different animal species. Meat Science. 63, 485-489. PN ISO 1442. 2000. Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie zawartości wody (metoda odwoławcza). PN ISO 1444. 2001. Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie zawartości tłuszczu. PN-ISO 2917:2000. Mięso i przetwory mięsne. Pomiar pH. Metoda odwoławcza. Siewiński M. 1991. Method of purification of thiol proteinase inhibitors from human urine. Cancer Biochemistry Biophysics, 12, 33-44. Szmańko T. 1986. Urządzenie do pomiaru zdolności utrzymania wody. Wzór użytkowy nr 40767. Urząd Patentowy PRL Warszawa. 202 Właściwości fizykochemiczne modelowych produktów mięsnych... Szmańko T., Górecka J. 2009. Uwarunkowania sanitarne jakości dziczyzny. Prace Instytutu Zarządzania i Inżynierii Rolnej PWSZ w Sulechowie: 3, 85-90. Yu L., Scanlin J., Schmidt G. 2002. Rosemary extracts as inhibitor soft lipid oxidation and colour change in cooked turkey products during refrigerated storage. J. Food Sci, 67, 582-585. Adres do korespondencji: Justyna Górecka Katedra Technologii Surowców Zwierzęcych i Zarządzania Jakością Wydział Nauk o Żywności Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Tadeusz Szmańko Badania wykonano w ramach realizacji projektu nr POIG.01.03.01-00-133/08pt. „Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji jaj (OVOCURA)”. Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego realizowany w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013. 203 Dorota Kowalewska EPISTEME 14/2012 s.205-214 ISSN 1895-4421 WPŁYW KULTURY STARTOWEJ NA PROCESY LIPOLIZY W SERACH MIĘKKICH Z MLEKA KROWIEGO IMPACT OF THE START CULTURE ON THE LIPOLYSIS PROCESSES IN COW MILK SOFT CHEESES Abstrakt. Celem pracy było określenie wpływu stosowanej kultury startowej na procesy lipolizy w serach miękkich. Sery wyprodukowano z mleka krowiego w laboratorium w skali półtechnicznej. Używano dwie kultury startowe: termofilną i mezofilną. Sery przechowywano w temperaturze 4°C przez okres 7 i 14 dni. W serach świeżych oznaczono skład podstawowy (zawartość wody, białka, tłuszczu, soli) oraz profil kwasów tłuszczowych. W serach świeżych i przechowywanych oznaczono pH, wolne grupy aminowe a celem określenia przemian lipolitycznych frakcji tłuszczowej badanych serów dokonano analizy zawartości wolnych kwasów tłuszczowych. Rodzaj zakwasu wywarł wysoko istotny wpływ na zawartość białka i związków azotowych rozpuszczalnych. Zawartość wody była wyższa w serach wyprodukowanych przy użyciu zakwasu termofilnego. Rodzaj stosowanej kultury startowej wpłynął na ilość uwalnianych kwasów tłuszczowych. W serach wyprodukowanych przy użyciu zakwasu mezofilnego stwierdzono istotnie mniej wolnego kwasu masłowego a więcej palmitynowego, oleinowego i linolowego. Słowa kluczowe: mleko krowie, sery miękkie, kwasy tłuszczowe, lipoliza Summary. The purpose of the thesis was to determine the impact of the used start culture on the lipolysis processes in soft cheeses. The cheeses were made from cow milk in a laboratory, in half-technical scale. Two start cultures were used: thermophilic and mesophilic. The cheeses were stored in the temperature of 4°C for the period of 7 and 14 days. Both in milk and in fresh cheeses basic composition was marked (content of water, protein, fat and salt) and, both in fresh cheeses and during storage, pH, content of soluble nitric compounds and free amino groups were marked. Also, the profile of fatty acids was marked and, in order to determine lipolytic changes of the fatty fraction of the tested cheeses, the analysis of the contents of free fatty acids was carried out. The kind of the starter made a highly significant impact on the content of protein and soluble nitric compounds. The content of water was higher in the cheeses made with the use of thermophilic starter. The kind of the used start culture influenced the amount of the released fatty acids. In the cheeses made with the use of mesophilic starter, claimed was the significantly higher share of caproic acid, as well as significantly more free acid: butyric acid, cetylic acid, oleic acid and linolic acid. Key words: cow milk, soft cheeses, fatty acids, lipolysis 205 Dorota Kowalewska WSTĘP Tłuszcz mlekowy stanowi 20-60% s.m. sera, odgrywa istotna role w formowaniu smaku i zapachu a także jest odpowiedzialny za konsystencję sera [Cichosz 1997]. Procesy hydrolizy tłuszczu mlekowego mają miejsce w kolejnych etapach pozyskiwania i przerobu mleka oraz w trakcie dojrzewania sera. Lipoliza jest nieunikniona ze względu na obecność endogennych lipaz mlekowych oraz enzymów bakteryjnych ale także jest oczekiwana przez konsumentów, bo miedzy innymi dzięki lipolizie w procesie dojrzewania sery podpuszczkowe dojrzewające nabierają smaku i odpowiedniej tekstury. W serach miękkich niedojrzewających przemiany te są znacznie mniejsze i zachodzą głównie podczas procesu technologicznego, tym niemniej mogą mieć wpływ na cechy organoleptyczne i trwałość tego rodzaju serów. W produkcji rzemieślniczej prowadzono badania nad zastosowaniem kultur termofilnych do wyrobu serów miękkich, lecz nie oceniano wpływu tej szczepionki na zakres lipolizy. Z uwagi na to celem badań było określenie wpływu rodzaju kultury startowej na proces lipolizy i parametry jakościowe serów miękkich niedojrzewających. MATERIAŁ I METODY Materiałem do badań było mleko od krów rasy fryzyjskiej pochodzące z Rodzinnego Gospodarstwa Ekologicznego ,,Figa” w Mszanie. Po przewiezieniu w warunkach chłodniczych do laboratorium, mleko zostało poddane odpowiednim analizom chemicznym a następnie dalszemu przerobowi. Po normalizacji mleka do zawartości tłuszczu 2,9% mleko poddano pasteryzacji w temp. 72 °C przez 15 s a następnie szybko ochłodzono do temp. 32 ±1°C. Mleko podzielono na dwie części: do jednej dodano 1,5% zakwasu mezofilnego CH-N-19, do drugiej 1,5% zakwasu termofilnego YoFlex. Dodano roztwór podpuszczki w takiej ilości aby uzyskać skrzep po 1,5h. Po uzyskaniu odpowiednią zwięzłości skrzepu krojono go na sześciany o bokach 2 cm. Po 30 minutach napełniano nim formy, które pozostawiono do odcieknięcia na 24 godziny. Podczas ociekania serów odwracano co 4 godziny. Po wyjęciu z form sery solono w solance o zawartości soli 16% i pH około 5,1 w temperaturze 16-18°C przez 15-20 minut. Po obeschnięciu serów, pakowano je w folię, analizowano następnego dnia i po przechowywaniu w temp. 4°C. Produkcję i analizę serów wykonano w trzech seriach. Zakres analiz. Analiza serów świeżych: • Oznaczanie zawartości wody [PN-73/A-86232] • Oznaczanie zawartości soli [PN-73/A-86232] 206 Wpływ kultury startowej na procesy lipolizy... • Oznaczanie pH [PN-73/A-86232] • Oznaczanie zawartości tłuszczu metodą Gerbera [PN- ISO 488: 2002]. • Oznaczanie zawartości związków azotowych ogółem [PN-ISO 6658:1998] • Oznaczanie WKT metodą chromatografii gazowej [wg Huerta-Gonzales i Wilbey 2001] • Profil kwasów tłuszczowych oznaczono przy użyciu chromatografu gazowego (gaz nośny hel 40 psi) w kolumnie BPX 70 (60x0,22 mm), grubość fazy 0,25 µm. Analizy wykonywano w programie temperatury: 140°C (1 min)-1,5°C/min-210°C (5 min). Temperatura dozownika wynosila 220°C a detektora 240°C. Dozowanie dzielnikowe 100:1. • Wolne grupy aminowe oznaczono wg metody z użyciem aldehydu ortodiftalowego OPA [Church i in. 1983] • Oznaczenie zawartości związków azotowych rozpuszczalnych [PN-73 A-86232]. Analiza serów po 7 i 14 dniach przechowywania: • Oznaczenie zawartości związków azotowych ogółem [PN-ISO 6658:1998] • Oznaczenie WKT metodą chromatografii gazowej [wg Huerta-Gonzales i Wilbey 2001] • Oznaczenie pH [PN-73/A-86232] • Wolne grupy aminowe oznaczono wg metody z użyciem aldehydu ortodiftalowego OPA[wg Church i in. 1983] • Oznaczenie zawartości związków azotowych rozpuszczalnych [PN-73 A-86232]. Analiza statystyczna. Doświadczenie wykonano w trzech powtórzeniach. Uzyskane wyniki opracowano statystycznie przy zastosowaniu programu Statistica 8.0 Przeprowadzono jedno i dwuczynnikową analizę wariancji a istotność różnic pomiędzy średnimi oszacowano za pomocą testu Duncana. WYNIKI I DYSKUSJA Jednoczynnikowa analiza wariancji wykazała, że rodzaj zakwasu wywarł wysokoistotny wpływ na zawartość wody, białka i związków azotowych rozpuszczalnych. W serach wyprodukowanych z udziałem kultury termofilnej stwierdzono wyższą zawartość wody (66,03% wobec 61,42%), zawartość białka była więc niższa. Wynika to z faktu, że mikroflora zakwasu termofilnego wytwarza więcej polisacharydów w związku z tym trudniej zachodzi synereza, co automatycznie wpływa na zawartość wody i tym samym skutkuje niższą zawartością białka (Tab. 1). 207 Dorota Kowalewska RODZAJ KULTURY WSKAŹNIK JAKOŚCI MEZOFILNA TERMOFILNA Woda [%] a 61,42 ±6,31 66,03a±2,70 Tłuszcz[%] 16,50 ±2,50 16,77±1,75 Sól [%] 1,11±0,52 0,89±0,25 pH 5,01±0,24 5,13±0,38 Białko [%] 16,57A±1,90 11,28A±0,30 Związki azotowe rozpuszczalne w % N ogółem 3,61A± 0,14 4,94A± 0,45 Wolne grupy aminowe [µmol/g] 6,25±0,87 6,61±1,51 Tab. 1. Wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów jakościowych serów miękkich A-stwierdzona statystycznie wysoko istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach a- stwierdzona statystycznie istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach. Sery to produkty zawierające dużą ilość białka . Jego zawartość zależy od rodzaju i typu sera a więc od zawartości w nich wody, tłuszczu i soli [Zmarlicki 1997]. Zawartość białka w serach miękkich powinna zawierać się w przedziale pomiędzy 16-22% [Pijanowski 1984, Renner 1993]. Sery z dodatkiem zakwasu mezofilnego zawierały 16,75% białka, natomiast z dodatkiem zakwasu termofilnego 11,28%. Wyższą zawartość związków azotowych rozpuszczalnych stwierdzono w serach wyprodukowanych z uzyciem zakwasu termofilnego. Wynika to z większych właściwości proteolitycznych kultur termofilnych w porównaniu z kulturami mezofilnymi. Zawartość tłuszczu w obu rodzajach sera była podobna. Analiza statystyczna nie wykazała istotnego wpływu stosowanej kultury na kwasowość czynną. RODZAJ KULTURY Wskaźnik Jakościowy Czas przechowywania [dni] MEZOFILNA TERMOFILNA Kwasowość czynna, pH 1 7 14 5,01±0,24 4,81±0,16 4,80±0,01 5,13±0,38 4,76±0,13 4,49±0,20 Związki azotowe rozpuszczalne % N ogółem 1 4,48 ± o,23 4,72 ± 0,25 7 4,97 ± 0,14 5,04± 0,35 14 1 7 14 5,78±5,78 5,97±0,32 6,15±0,09 6,29±0,25 5,57 ± 0,52 6,20±0,10 6,23±0,21 6,22±0,30 Wolne grupy aminowe [µmol/g] Tab. 2. Wartości średnie i odchylenia standardowe parametrów jakościowych serów przechowywanych przez 14 dni w temp. 4°C 208 Wpływ kultury startowej na procesy lipolizy... Z analizy statystycznej wynika, że rodzaj zakwasu nie wpłynął na badane parametry, jednak dość znaczący wpływ wywarł czas przechowywania na zmiany wyróżników jakościowych (Tab. 3). Kwasowość czynna serów z kulturą termofilną podczas przechowywania przez 14 dni w temp. 4°C w obniżyła się o 12,8% podczas gdy w przypadku kultury mezofilnej obniżyła się tylko o 4,19% (Tab. 2). Ze względu na większe właściwości proteolityczne kultury mezofilnej w temp. 4°C ilość związków azotowych rozpuszczalnych wyrażonych w % N ogółem wzrosła w serach z kulturą mezofilną o 29%, w przypadku kultury termofilnej tylko o 18%; podobnie w przypadku serów z dodatkiem zakwasu mezofilnego zaobserwowano wzrost zawartości wolnych grup aminowych o 5,97% (Tab. 2). WSKAŹNIK JAKOŚCIOWY RODZAJ KULTURY CZAS PRZECHOWYWANIA MEZOFILNA TERMOFILNA 1 7 14 pH 4,87 4,79 5,07aA 4,78a 4,65A Azot rozpuszczalny w % N ogółem 51,88 51,11 46,03A 50,01a 58,44Aa Wolne grupy aminowe [μmol/g] 6,13 6,22 6,09 6,19 6,25 Tab. 3. Średnie najmniejszych kwadratów parametrów jakościowych serów miękkich z mleka krowiego Tłuszcz Profil kwasów tłuszczowych w serach był podobny (Tab. 4), niezależnie od rodzaju użytego zakwasu, natomiast udział poszczególnych wolnych kwasów (WKT) był zróżnicowany (Tab. 5). Najwięcej w badanych produktach znajdowało się kwasu palmitynowego 26%, oleinowego 22%, stearynowego 14-15% oraz mirystynowego około 10% (Tab. 3). Według Jansena [cytat za Cichosz 2007] w tłuszczu mleka krowiego jest około 400 kwasów tłuszczowych, wiele z nich występuje w nieznacznych stężeniach. Według Żegarskiej [1998] wszystkie rodzaje tłuszczu zawierają w swym składzie najwięcej kwasu palmitynowego, który także jest głównym kwasem nasyconym tłuszczu mlekowego; stanowi około 25-30% ogólnego składu kwasów tłuszczowych. Tłuszcz mlekowy zawiera około 30% kwasów monoenowych, głównie oleinowego. Zawartość kwasu laurynowego i mirystynowego wynosi od około 13% (okres żywienia pastwiskowego) do około 16% (okres żywienia oborowego) [Ziajka 2008]. W serach wyprodukowanych z użyciem kultury mezofilnej zwartość kwasu laurynowego i mirystynowego wyniosła 12,17% i była wyższa niż w serach wyprodukowanym przy użyciu kultury termofilnej dla której wartości te wynosiły 11,46%. 209 Dorota Kowalewska Kwasy Tłuszczowe RODZAJ KULTURY MEZOFILNA TERMOFILNA Kwas masłowy C 4:0 3,03±0,15 3,05±0,24 Kwas kapronowy C 6:0 2,0±0,09 1,84±0,14 Kwas kaprylowy C 8:0 1,05±0,05 0,95±0,08 Kwas kaprynowy C 10:0 2,26±0,05 2,05±0,12 Kwas oleokaprynowy C 10:1 0,19±0,01 0,17±0,02 Kwas laurynowy C 12:0 2,59±0,00 2,35±0,13 Kwas mirystynowy C 14:0 9,58±0,08 9,11±0,38 Kwas oleomirystynowy C 14:1 0,58±0,01 0,55±0,02 Kwas palmitynowy C 16:0 25,95±0,34 26,08±0,04 Kwas C 16:1n-9 0,32±0,00 0,30±0,01 Kwas C 16:1n-9 1,27±0,01 1,27±0,01 Kwas margarynowy C 17:0 0,86±0,01 0,90±0,01 Kwas oleomargaryn owy C 17:1 0,29±0,01 0,29±0,00 Kwas stearynowy C 18:0 13,99±0,02 14,55±0,63 Kwas oleinowy C 18:1n-9 21,59±0,10 22,04±0,34 Kwas wakcenowy C 18:1n-7 5,45±0,09 5,62±0,24 Kwas linolowy C 18:2n-6 1,88±0,01 1,92±0,06 Kwas C 18:3n-6 0,13±0,00 0,14±0,00 Kwas α- linolenowy C 18:3n-3 1,32±0,01 1,37±0,02 Sprzężony kwas linolenowy CLA 1,57±0,04 1,61±0,01 Kwas arachidowy C20:0 0,18±0,01 0,19±0,01 Kwas C20:1 0,11±0,00 0,10±0,00 Lotne C4-C10 8,53±0,35 8,06±0,6 Nienasycone 34,7±0,29 35,38±0,73 Jednonienasycone 31,37±0,27 31,95±0,65 Wielonienasycone 3,33±0,2 3,43±0,08 Nasycone 61,49±0,8 61,07±1,78 Tab. 4. Profil kwasów tłuszczowych w serach świeżych z mleka krowiego wyprodukowanych z dwoma rodzajami kultur startowych. (wartości średnie ±odchylenia standardowe) 210 Wpływ kultury startowej na procesy lipolizy... Kwas tłuszczowy 4:0 6:0 8:0 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 RODZAJ KULTURY Czas przechowywania [dni] MEZOFILNA 1 0,21±0,02 0,24±0,11 7 0,35±0,17 0,38±0,84 MEZOFILNA 14 0,18±0,13 1,44±0,74 1 5,49±2,51 6,10±0,71 7 10,57±9,06 17,31±1,50 14 6,09±10,31 35,24±10,32 1 0,59±0,36 0,44±0,74 7 0,89±0,79 0,58±0,19 14 0,41±0,34 0,53±0,34 1 1,60±0,85 1.04±0,19 7 2,34±2,30 1,14±0,36 14 1,00±0,96 0,76±0,26 1 2,12±0,96 1,58±0,29 7 2,62±2,49 1,49±0,43 14 1,38±0,46 1,08±0,21 1 5,39±1,86 14,18±0,81 7 5,80±5,19 3,47±1,13 14 3,87±1,18 2,00±0,78 1 16,81±5,37 13,31±1,49 7 17,58±12,48 9,81±2,90 14 28,98±19,16 7,32±0,87 1 7,09±2,42 5,76±0,2 7 5,93±4,52 4,21±0,92 14 10,47±7,02 3,51±0,92 1 14,70±6,19 10,36±1,97 7 12,91±9,19 8,23±2,75 14 18,54±11,42 4,45±0,91 1 0,77±0,26 0,43±0,54 7 0,75±0,60 0,49±0,83 14 0,78±0,35 0,15±0,21 Tab. 5. Procentowy udział wolnych kwasów tłuszczowych w serach miękkich z mleka krowiego wyprodukowanych z użyciem dwóch kultur startowych i przechowywanych przez 14 dni w temp. 4°C 211 Dorota Kowalewska Porównując profil kwasów tłuszczowych w serach z zakwasem mezofilnym i termofilnym stwierdzono istotne różnice w zawartości kwasu laurynowego, którego poziom był wyższy w serach wyprodukowanych z dodatkiem kultury mezofilnej. Przyczyna różnic może wynikać z innych szlaków metabolizowania kwasu laurynowego przez mikroflorę poszczególnych kultur startowych. Natomiast w grupie kwasów wielonienasyconych stwierdzono wyższy ich poziom w serach wyprodukowanych z udziałem kultury termofilnej. W serach wyprodukowanych z dodatkiem kultury mezofilnej w większości przypadków stwierdzono przyrost udziału wszystkich wolnych kwasów po 7 dniach przechowywania, natomiast po 14 dniach wartości te uległy dość znacznemu zmniejszeniu. Wyjątkiem jest kwas palmitynowy (C16:0) i linolowy (C18:2), których udział po 1, 7 i 14 dniach przechowywania uległ wyraźnemu wzrostowi. W serach z zakwasem termofilnym po 7 i 14 dniach przechowywania nastąpił wyraźny spadek udziału kwasu palmitynowego. Natomiast udział kwasu linolowego po 7 dniach zwiększał się, ale po 14 dniach obserwowano zmniejszenie jego udziału (Tab.5). Wyniki analizy statystycznej wskazują, że poza wolnym kwasem masłowym, którego w serach wyprodukowanych z zastosowaniem kultury mezofilnej było istotniej mniej, udział wolnych kwasów tłuszczowych takich jak palmitynowy, oleinowy i linolowy był istotnie większy w serach z tą kulturą. Rodzaj WKT RODZAJ KULTURY CZASPRZECHOWYWANIA (dni) MEZOFILNA TERMOFILNA 1 7 14 4:0 0,25a 0,69a 0,22A 0,37b 0,81Ab 6:0 7,39a 19,56a 5,80A 13,94 20,67A 8:0 0,63 0,51 0,51 0,73 0,47 10:0 1,65 0,98 1,32 1,74 0,88 12:0 2,05 1,38 1,85 2,06 1,23 14:0 5,02 3,22 4,79 4,63 2,93 16:0 21,12a 10,15a 15,06 13,70 18,15 18:0 7,83 4,51 6,42 5,07 7,02 18:1 15,38a 7,68a 12,52 10,57 11,49 18:2 0,77a 0,34a 0,60 0,60 0,46 Tab. 6. Średnie najmniejszych kwadratów zawartości WKT w serach miękkich z mleka krowiego wyprodukowanych z dwoma rodzajami kultur startowych. A-stwierdzona statystycznie wysoko istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach, a- stwierdzona statystycznie istotna różnica miedzy średnimi oznaczonymi tymi samymi literami w wierszach 212 Wpływ kultury startowej na procesy lipolizy... WNIOSKI • Sery wyprodukowane z kulturą mezofilną charakteryzują się wyższą zawartością białka i niższym poziomem związków azotowych rozpuszczalnych. • W trakcie chłodniczego przechowywania serów wyprodukowanych z użyciem kultury termofilnej zwiększa się udział wolnego kwasu masłowego i kapronowego a w przypadku użycia kultury mezofilnej zwiększa się udział kwasu palmitynowego, oleinowego i linolowego. • Użycie kultury termofilnej do produkcji serów miękkich skutkuje zwiększeniem w ich składzie zawartości wody. LITERATURA Cichosz G.,1997. Czynniki determinujące cechy sensoryczne serów dojrzewającychLipoliza Przegląd Mleczarski 10, 325-329. Church F.C., Swaisgood H.E., Porter D.H., Catgnani G.L., 1983. Spectrophotometric assai using o-phtaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. Journal of Dairy Sci. 66, 1219-1227 Cichosz G.,2007. Prozdrowotne właściwości tłuszczu mlekowego. Przegląd Mleczarski 10, 4-6. Huerta-Gonzales L., Wilbey R.A., 2001. Determination free fatty acids produced in filled-milk emulsions as a result of the lipolytic activity of lactic acid bacteria. Food Chemistry, 72, 301-307. Pijanowski E., 1984. Zarys chemii i technologii mleczarstwa Tom I. PWRiL, Warszawa Renner E., 1993. Nutritional aspects of cheese. Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1.General Aspects P.F. Fox (Ed.), p.345—363. Elsevier Applied Science, London and New York. Ziajka s., 2008. Mleczarstwo. Tom I. Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego, Olsztyn. Zmarlicki S., 1997: Ćwiczenia z analizy mleka i produktów mleczarskich. Skrypt SGGW, Warszawa. Żegarska Z.,1978. Tłuszcz mlekowy jako składnik diety człowieka. Przegląd Mleczarski 10, 369-371. 213 Dorota Kowalewska Adres do korespondencji: Dorota Kowalewska Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Monika Wszołek 214 Karolina Królikowska Sławomir Pietrzyk Teresa Fortuna EPISTEME 14/2012 s.215-222 ISSN 1895-4421 WPŁYW WYBRANYCH SKŁADNIKÓW MINERALNYCH NA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE UTLENIONEJ SKROBI KUKURYDZIANEJ THE INFLUENCE OF SELECTED MINERALS ON PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF OXIDISED MAIZE STARCH Abstrakt. Celem pracy była ocena wpływu wybranych składników mineralnych na właściwości fizykochemiczne skrobi utlenionych. Materiałem badawczym była skrobia kukurydziana utleniana chloranem(I) sodu, a następnie modyfikowana z jonami metali: potasu, magnezu, miedzi i żelaza. W otrzymanych skrobiach modyfikowanych określono: zawartość grup karboksylowych, karbonylowych, wbudowanych składników mineralnych, zdolność wiązania wody i rozpuszczalność w wodzie w temp. 60 i 80 oC, parametry barwy L*a*b*. Ponadto wyznaczono: lepkość graniczną, charakterystykę kleikowania oraz przeprowadzono test ekstruzji wstecznej. Na podstawie wyników stwierdzono, iż najlepiej wbudował się potas, a najgorzej magnez. Wbudowane metale wpłynęły w większości przypadków na zwiększenie zdolności wiązania wody i rozpuszczalności w wodzie uzyskanych skrobi. Modyfikacje z metalami wpłynęły również na zmiany parametrów barwy i właściwości reologiczne otrzymanych skrobi. Słowa kluczowe: skrobia kukurydziana utleniona, składniki mineralne Summary. The aim of this study was to assess the influence of selected minerals on physicochemical properties of oxidized starch. Maize starch was oxidized with sodium chlorate(I), and then modified with metal ions: potassium, magnesium, copper and iron. In modified starches following analyses were conduced: the content of carboxyl and carbonyl groups, mineral elements, water-binding capacity and solubility in water at 60 and 80 °C, and color parameters L*a*b*. Moreover there was determined: intrinsic viscosity, gelatinization characteristics and back-extrusion test was performed. Potassium reacted with starch the most easily as compared to other elements. The least reactive element in compared to the maize oxidized starch was magnesium. Metal ions were received in most cases to increase the water binding capacity and water solubility of starch obtained. Modifications of the metals also contributed to changes in color parameters and rheological properties of oxidized starch. Key words: oxidized maize starch, minerals 215 Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna WSTĘP Wszechstronność oraz użyteczność skrobi wynika nie tylko z faktu, że jest naturalnym i tanim surowcem, ale też ze względu na jej budowę i właściwości fizykochemiczne. Skrobia dzięki swojej specyficznej budowie łatwo podlega reakcjom z różnymi substancjami chemicznymi. Proces utleniania jest jednym z najpowszechniej stosowanych metod chemicznej modyfikacji skrobi [Śmigielska i in. 2005]. Przez wiele lat skrobie utlenione ze względu na swoje właściwości teksturotwórcze stosowane były jako składnik budyniów, kremów budyniowych, mieszanek ciast w proszku. Zawartość w skrobi utlenionej oprócz grup hydroksylowych reaktywnych grup karboksylowych i karbonylowych umożliwia wiązanie przez nią jonów metali. Dzięki temu istnieje możliwość wykorzystywania skrobi jako nośnika składników mineralnych do wzbogacania żywności [Bączkowicz i in. 2010]. Celem niniejszej pracy była ocena wpływu wybranych składników mineralnych na właściwości fizykochemiczne skrobi utlenionych. MATERIAŁ BADAWCZY Sporządzano 40 % zawiesinę wodną skrobi kukurydzianej (Cargill, Poland) do której dodawano stopniowo wodnego roztworu NaOCl w ilości 20 gCl/ kg s.s. skrobi Modyfikację wykonano w temp. 20 ±2 °C, mieszając zawiesinę skrobi w środowisku alkalicznym (pH = 10,0) przez 50 min. Następnie mieszaninę reakcyjną neutralizowano 1 M roztworem H2SO4 do pH = 7,0, przemywano, suszono w temp. 20°C 48 godzin, rozdrabniano i przesiewano przez sita mechaniczne [Forsell i in. 1997]. Skrobię utlenioną następnie modyfikowano z metalami: potasem, magnezem, miedzią i żelazem zgodnie z poniższą metodyką. 100 g skrobi mieszano z 250 cm3 wody przez 5 minut i filtrowano. Następnie do skrobi dodano 200 cm3 roztworu z odpowiednim metalem (dla potasu - mieszaniny 1 % w/w KCl i 0,05 M KOH w stosunku 1:1 i pH 12; dla magnezu - mieszaniny 1 % w/w MgCl2 i nasyconego Mg(OH)2 w stosunku 1:1 i pH 8.5; dla miedzi – roztworu 3,96 % w/w CuSO4 dla żelaza - roztworu 1% w/w FeSO4) i mieszano 5 minut. Po tym czasie zawiesinę skrobi filtrowano i ponownie dodano 200 cm3 w/w roztworów i ponownie mieszano 5 minut. Czynność tą jeszcze raz powtórzono. Następnie skrobię przemywano wodą destylowaną do zaniku reakcji na chlorki (w przypadku skrobi modyfikowanej magnezem i potasem) oraz do zaniku reakcji na siarczany (w przypadku skrobi modyfikowanej z miedzią i żelazem), suszono 48 godzin i przesiewano. Efektywność procesów utleniania została sprawdzona poprzez wyznaczenie w skrobiach modyfikowanych zawartości grup karboksylowych [ISO 11214] i karbonylowych [Whistler i in. 1967]. 216 Wpływ wybranych skłądników mineralnych... METODYKA BADAŃ W celu wyznaczenia właściwości fizykochemicznych skrobi modyfikowanych oznaczono: 1. Zawartość wbudowanych składników mineralnych za pomocą atomowego spektroskopu absorpcyjnego (Avanta Sigma, GBC, Australia), wcześniej skrobię mineralizowano w mieszaninie stężonych kwasów azotowego(V) i siarkowego(VI) w temp. 250 °C; 2. Parametry barwy w systemie CIE L*a*b* (geometria pomiarowa d/8°, illuminant D65, obserwator 10°) przy użyciu spektrofotometru Color 5i (X-Rite, USA). Bezwzględną różnicę barwy (DE) pomiędzy skrobią wyjściową, a skrobiami wzbogacanymi wyliczono według równania: 3. Zdolność wiązania wody i rozpuszczalność w wodzie w temp. 60 i 80 °C zmodyfikowaną metodą Leach’a [Richter i in. 1968]; 4. Lepkość graniczną w temp. 25 °C skrobi rozpuszczonej w 0,5 M KOH. Czas swobodnego opadania roztworu skrobi o stężeniach w zakresie 0,0006-0,01 g/cm3 był mierzony przy użyciu wiskozymetru kapilarnego Ubbelode (k=0,009631) z automatycznym systemem pomiaru czasu ViscoClock (Schott Instruments, Niemcy). Na podstawie zależności ηsp/c względem c wyznaczono lepkość graniczną stosując równanie Huggins’a: ηsp/c = [η] + k’·[η]2·c, gdzie: ηsp – lepkość właściwa, c – stężenie [g/cm3], [η] –lepkość graniczna [cm3/g], k’ – stała Huggins’a; 5. Charakterystykę kleikowania 5 % (w/w) zawiesin skrobiowych przy użyciu Rapid Visco Analyser (Perten Instruments, Warriewood, Austarlia). Próbki ogrzewano od temp. 50 °C do temp. 95 °C, przetrzymywano w temp. 95 °C przez 5 min., chłodzono do temp. 50 °C i na koniec przetrzymywane w temp. 50 °C przez 5 min. Z wiskogramów odczytano: temperaturę kleikowania (Tp), lepkość maksymalną w czasie ogrzewania (PV), lepkość w temp. 95 °C (HPV), lepkość końcową w temp. 50 °C (FV), spadek lepkości przy ogrzewaniu wartość: PV–HPV (BD), wzrost lepkości w trakcie chłodzenia wartość: FV-HPV (SB); 6. Test ekstruzji wstecznej wykonano za pomocą teksturometru EZ Test-500N (Schimadzu, Japonia) używając jako elementu pomiarowego walca o wysokości 3 mm i średnicy 30 mm. Do naczyńka pomiarowego o średnicy wewnętrznej 32 mm, odważono 30 g żelu. Głębokość zanurzenia elementu pomiarowego w próbce wynosiła 30 mm, a prędkość zanurzania – 10 mm/ min. Wyznaczono trzy wielkości: pracę wykonaną przez element pomiarowy P (N·mm), siłę maksymalną Fmax (N) oraz siłę średnią Fśr (N) potrzebną do przeciśnięcia próbki przez szczelinę pomiędzy naczyńkiem, a elementem 217 Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna pomiarowym. W celu określenia istotności różnic w badanych parametrach zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji i test Tukeya na poziomie istotności a=0,05. WYNIKI I DYSKUSJA Skrobia utleniona zawierała 0,036 ±0,004 % grup karboksylowych i 0,029 ±0,004 % grup karbonylowych. Zawartość grup karboksylowych była mniejsza niż 1,1 %, więc mogą one być stosowane w przemyśle spożywczym [Rozporządzenie Ministra Zdrowia 2010]. W Tab. 1 przedstawiono zawartości wbudowanych składników mineralnych w skrobiach utlenionych. Spośród zastosowanych do modyfikacji jonów metali najlepiej wbudował się potas, którego zawartość po modyfikacji wynosiła 61,09 mg/100g. Najmniej reaktywnym pierwiastkiem okazał się magnez którego zawartość w skrobi wzbogacanej tymi jonami wynosiła 14,94 mg/100g. Zawartość pozostałych dodanych pierwiastków (miedzi i żelaza) była na podobnym poziomie od 35,18 do 38,92 mg/100g. Lepsze wbudowanie potasu do skrobi utlenionych w porównaniu do pozostałych pierwiastków było spowodowane jego wartościowością. Podobne wyniki uzyskali także inni badacze [Bączkowicz i in. 2010]. Skrobia Potas Magnez [mg/100g s.s] [mg/100g s.s] Miedź Żelazo [mg/100g s.s] [mg/100g s.s] Utleniona 0,23 ±0,03 1,51 ±0,19 lod lod Utleniona i modyfikowana z K 61,09 ±5,10 lod lod lod Utleniona i modyfikowana z Mg lod 14,94 ±0,89 lod lod Utleniona i modyfikowana z Cu lod lod 35,18 ±0,65 lod Utleniona i modyfikowana z Fe lod lod lod 38,92 ±1,31 Tab. 1. Zawartość potasu, magnezu, miedzi i żelaza w modyfikowanej skrobi kukurydzianej, lod- poniżej poziomu oznaczalności W Tab. 2 przedstawiono wartości parametrów barwy. Stwierdzono, że największą jasnością (L*) charakteryzowały się skrobia niewzbogacona oraz skrobia wzbogacona jonami magnezu, natomiast najmniejszą skrobia modyfikowana jonami żelaza. Przeprowadzone modyfikacje jonami miedzi i żelaza istotnie wpłynęły na zmiany wartości parametrów a* i b*. W przypadku skrobi modyfikowanej jonami miedzi stwierdzono większy udział barwy zielonej w porównaniu do pozostałych skrobi, natomiast modyfikacja jonami żelaza wpłynęła na zwiększenie udziału barwy czerwonej. Wartości parametru b* dla tych skrobi były również najwyższe. W przypadku skrobi kukurydzianej modyfikowanej jonami żelaza wartość bezwzględnej różnicy barwy wynosiła powyżej 3,5, oznacza to, że obserwuje się wyraźne odchylenie barwy w odniesieniu do wzorca. 218 Wpływ wybranych skłądników mineralnych... Skrobia Parametry barwy ΔE L* a* b* Utleniona 94,68±0,09a -0,49±0,03a 1,98±0,02a wzorzec Utleniona i modyfikowana z K 94,06±0,08 -0,44±0,05a 1,80±0,05a 0,65 Utleniona i modyfikowana z Mg 94,50±0,06a -0,47±0,03a 1,71±0,03a 0,33 Utleniona i modyfikowana z Cu 93,66±0,09 -1,22±0,02 2,15±0,06 1,27 Utleniona i modyfikowana z Fe 90,83±0,16 0,56±0,08 9,51±0,21 8,52 Tab. 2. Parametry barwy modyfikowanej skrobi kukurydzianej. Małymi literami oznaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05 Rozpuszczalność i zdolność wiązania wody wszystkich skrobi wzrastała wraz ze wzrostem temperatury oznaczania (Tab. 3). W temperaturze 60 oC wartość powyższych parametrów wszystkich skrobi modyfikowanych jonami pierwiastków wzrastała względem skrobi niewzbogaconej. W temperaturze 80 oC jedynie skrobia wzbogacana w potas i miedź charakteryzowała się większą rozpuszczalnością niż skrobia wyjściowa. Wzrost rozpuszczalności skrobi modyfikowanych był spowodowany głównie depolimeryzacją amylozy która zaszła w trakcie modyfikacji skrobi z metalami. Analiza zdolności wiązania wody w temperaturze 80 oC wykazała natomiast, że jedynie w skrobiach wzbogacanych jonami miedzi i żelaza zaobserwowano zmniejszenie zdolności wiązania wody w odniesieniu do skrobi niewzbogacanej. Porównywalne wartości zdolności wiązania wody skrobi utlenionej kukurydzianej uzyskali także inni autorzy [Wang i Wang 2003]. Skrobia Rozpuszczalność [%] Zdolność wiązania wody [g/g s.s] 60 oC 80 oC 60 oC 80 oC Utleniona 0,28±0,02 7,55±0,37a 1,43±0,08 10,20±0,70a Utleniona i modyfikowana z K 2,92±0,01 9,64±0,35b 3,32±0,10a 9,79±0,18ab Utleniona i modyfikowana z Mg 1,74±0,13a 8,04±0,32a 3,08±0,02a 10,24±0,25a Utleniona i modyfikowana z Cu 2,11±0,14 9,74±0,25b 3,03±0,20a 8,65±0,13b Utleniona i modyfikowana z Fe 1,44±0,07a 5,21±0,33 2,53±0,13 8,62±0,20b Tab. 3. Rozpuszczalność w wodzie i zdolność wiązania wody modyfikowanych skrobi kukurydzianych. Małymi literami znaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05 219 Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna Wartości lepkości granicznej są ściśle skorelowane z masą cząsteczkową biopolimeru i pozwalają na ocenę wpływu procesów modyfikujących na degradację polimerów skrobiowych. Modyfikacje skrobi utlenionej z magnezem i potasem spowodowały obniżenie wartości lepkości granicznej (Rys. 1), natomiast pozostałe modyfikacje nie zmieniły wartości tego parametru statystycznie istotnie. Zmniejszenie wartości lepkości granicznej preparatów skrobi modyfikowanych związane było z częściową depolimeryzacją polimerów skrobiowych w zastosowanych warunkach modyfikacji i obniżeniem masy cząsteczkowej. NIR(α=0,05) = 4,36 200 Lepkość graniczna [mPa∙s] 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Utleniona Utleniona z Utleniona z Utleniona z Utleniona z K Mg Cu Fe Rys. 1. Wartości lepkości granicznej modyfikowanych skrobi kukurydzianych Analizując przedstawione w Tab. 4 parametry charakterystyki kleikowania stwierdzono występowanie różnic we właściwościach reologicznych pomiędzy badanymi skrobiami. Wzrost lepkości we wszystkich parametrach kleikowania stwierdzono jedynie w skrobi utlenionej wzbogaconej jonami żelaza. Skrobie wzbogacane w magnez i miedź natomiast miały mniejszą lepkość we wszystkich punktach charakterystyki kleikowania niż skrobia wyjściowa. Wzbogacanie skrobi utlenionej we wszystkie składniki mineralne spowodowało zmniejszenie stabilności reologicznej w trakcie ogrzewania i przetrzymywania w temp. 95 °C, o czym świadczą wyższe wartości BD. Zastosowane modyfikacje nie wpłynęły statystycznie istotnie na zmianę temperatury kleikowania, z wyjątkiem skrobi wzbogacanej w potas. Zastosowane modyfikacje wpłynęły również na zmiany parametrów wyznaczanych za pomocą testu ekstruzji wstecznej (Tab. 5). Wzbogacanie skrobi w jony żelaza wpłynęło na wzrost wszystkich wyznaczonych parametrów, podobną tendencję zaobserwowano na podstawie analizy parametrów charakterystyki kleikowania. Pozostałe składniki mineralne natomiast obniżyły wartości pracy i siły średniej. Niskie wartości oznaczonych parametrów dla skrobi modyfikowanych obrazują, iż żele te były bardzo słabe co oznacza, że charakteryzowały się teksturą tzw. „długą”. 220 SB [mPas] PT [°C] 264,7±2,1a 244,7±0,6 20,0±1,7a 268,0±11,4 28±4,0a 87,3±0,6a Utleniona i modyfikowana z K 272,3±7,5a 216,7±3,8a 55,7±3,8 245,3±2,1a 28,7±2,5a 72,5±1,1 Utleniona i modyfikowana z Mg 242,7±10,4b 215,7±6,1a 27,0±4,4ab 228,0±7,5a 12,3±1,5 86,6±1,7a Utleniona i modyfikowana z Cu 236,3±3,1b 192,7±1,5 43,7±1,5 232,7±2,5a 40,0±1,0 85,4±0,9a Utleniona i modyfikowana z Fe 337,0±10,8 307,0±7,0 30,0±5,7b 335,3±11,2 28,3±4,5a 84,8±1,5a FV [mPas] BD [mPas] Utleniona Skrobia PV [mPas] HPV [mPas] Wpływ wybranych skłądników mineralnych... Tab. 4. Parametry charakterystyki kleikowania modyfikowanych skrobi kukurydzianych. Małymi literami znaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05 Skrobia P [N∙mm] Fmax [N] Fśr [N] Utleniona 10,72±0,34 0,55±0,03a 0,36±0,01 Utleniona i modyfikowana z K 8,94±0,32a 0,46±0,02 0,30±0,01a Utleniona i modyfikowana z Mg 8,76±0,11a 0,51±0,04a 0,29±0,01a Utleniona i modyfikowana z Cu 9,81±0,43 0,54±0,01a 0,32±0,02a Utleniona i modyfikowana z Fe 17,22±0,15 0,80±0,01 0,58±0,01 Tab. 5. Wartości pracy, średniej siły oraz siły maksymalnej uzyskane w wyniku testu ekstruzji wstecznej skrobi kukurydzianych. Małymi literami oznaczono wartości w kolumnach nieróżniące się statystycznie istotnie na poziomie α = 0,05 WNIOSKI • Spośród zastosowanych do modyfikacji składników mineralnych najlepiej wbudował się potas, najgorzej magnez. • Wbudowane metale wpłynęły zmianę zdolności wiązania wody i rozpuszczalności w wodzie oraz wartości lepkości granicznej uzyskanych skrobi. Zmiany te były uzależnione od rodzaju wbudowanego pierwiastka. • Wzbogacanie skrobi w jony żelaza wpłynęło na wzrost lepkości we wszystkich parametrach kleikowania oraz wartości uzyskanych w wyniku testu ekstruzji wstecznej. Modyfikacja tym metalem w największym stopniu wpłynęła na zmianę barwy skrobi. 221 Karolina Królikowska, Sławomir Pietrzyk, Teresa Fortuna LITERATURA Bączkowicz M., Pietrzyk S., Gałkowska D., Rożnowski J., Tartanus I., Szkabar K. 2010. Thermodynamic characteristic and susceptibility to retrogradation of starches modified by incorporation of mineral elements. Proceedings of the international Conference on Polysaccharides-Glycoscience. Prague 29.09-01.10, 173-177. Hypochlorite oxidaForsell P., Hamunen A., Antio K., Suorti T., Poutanen K. 1995. ������������������� tion of barley and potato starch. Starch/Stärke, 47: 371-377. der StärkecheRichter M., Augustat S., Schierbaum F. 1968. Ausgewählte Metoden �������������� mie. VEB Fachbuchverlag, Leipzig. Śmigielska H., Lewandowicz G., Walkowski A. 2005. Wpływ dodatku mikroelementów na właściwości użytkowe skrobi utlenionych. Folia Universitatis Agriculturae Stetinensis, 246(4): 289-302. Wang Y., Wang L. 2003. Physicochemical properties of common and waxy corn starches oxidized by different levels of sodium hypochlorite. Carbohydrate ������������������ Polymers, 52: 207–217. Whistler R. L. (red.), BeMiller E., Paschall E. F. 1967. Starch: Chemistry and Technology. Academic Press, New York, London. PN-EN ISO 11214:2001. Modified starch. Determination of carboxyl group content of oxidized starch. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 grudnia 2010 r. w sprawie specyfikacji i kryteriów czystości substancji dodatkowych. Dz. U. 91. poz. 526. Adres do korespondencji: mgr inż. Karolina Królikowska, dr inż. Sławomir Pietrzyk Katedra Analizy i Oceny Jakości Żywności Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Teresa Fortuna Praca wykonana w ramach projektu finansowanego przez MNiSzW nr NN 312 438037 222 Krzysztof Kucharczyk Monika Cioch EPISTEME 14/2012 s.223-230 ISSN 1895-4421 WPŁYW TEMPERATURY FERMENTACJI BRZECZKI PIWNEJ NA PROFIL WYBRANYCH ZWIĄZKÓW LOTNYCH PIWA THE INFLUENCE OF WORT FERMENTATION TEMPERATURE ON THE PROFILE OF SELECTED VOLATILE COMPONENTS IN BEER Abstrakt. Celem doświadczeń było określenie wpływu temperatury fermentacji brzeczki piwnej na kinetykę fermentacji, zawartość związków lotnych oraz wybrane parametry fizykochemiczne piwa. Badania wykonano w warunkach przemysłowych, a do fermentacji brzeczki, o początkowej zawartości ekstraktu 15,5oBlg, użyto czystą kulturę drożdży, Saccharomyces carlsbergensis, szczep 34/70. Temperaturę procesu fermentacji ustalano w zakresie od 8,5 do 11,50C. Podczas fermentacji i dojrzewania piwa pobierano próby, w których oznaczano ilość komórek drożdżowych, ich witalność oraz koncentrację produktów ubocznych (diketony, aldehyd octowy, estry). Doświadczenia wykazały, że zróżnicowana temperatura fermentacji brzeczki ma istotny wpływ na kinetykę procesu oraz zawartość komórek drożdży. Wraz ze wzrostem temperatury fermentacji, zwiększa się między innymi zawartość estrów, natomiast zmniejsza się zawartość aldehydu octowego oraz wicynalnych dwuketonów. Wymienione komponenty miały wpływ na cechy sensoryczne i końcową jakość piwa. Słowa kluczowe: brzeczka, temperature fermentacji, związki lotne piwa Summary. The purpose of experiments was to investigate the influence of wort fermentation temperature on the kinetics of fermentation, the contents of volatile compounds and selected volatile physicochemical parameters of beer. The study was performed in industrial conditions and in order to achieve wort fermentation with the initial 15,5°Blg extract content a pure culture of Saccharomyces carlsbergensis strain 34/70 was used. The temperature of fermentation process was fixed (in the range) from 8,5 to 11,5°C. During the fermentation and maturation of beer the samples were taken in which the number of yeast cells, their vitality and the concentration of by-products (diketones, acetaldehyde, esters) were indicated. The experiments showed that varied temperature of fermentation wort substantially affects the kinetics process and a content of yeast cells. With the increase of fermentation temperature esters are increasing whereas the content of acetaldehyde and vicinal diketones are decreasing. Enumerated components had an influence on sensory characteristics and a final quality of beer. Key words: wort, fermentation temperature, volatile components 223 Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch WSTĘP Podczas procesu fermentacji alkoholowej, drożdże piwowarskie oprócz etanolu i dwutlenku węgla, syntetyzują szerokie spektrum różnych ubocznych produktów przemiany materii, z których znaczna większość wydzielana jest do środowiska. Ilość i jakość wydzielanych z komórek produktów i metabolitów pośrednich przemian, ma wpływ na właściwości organoleptyczne gotowego produktu. Związki te, obok składników chmielu, nadają specyficzny i charakterystyczny dla tego produktu smak i aromat [Kordialik i Kuchciak 1998; Salamon 1999; Dziuba 2001, Saerens i in. 2008]. Złożony skład chemiczny brzeczki i piwa jest odzwierciedleniem wielu czynników, procesów i przemian modyfikujących, które w efekcie powinny zapewnić końcową stabilność fizyczną, chemiczną, biologiczną i sensoryczną [Kucharczyk i Tuszyński 2011]. Wiele technologicznych czynników, w tym napowietrzanie brzeczki [Verbelen i in. 2009], dozowanie drożdży [Erten i in. 2007, Verbelen i in. 2009] i temperatura fermentacji ma ważny wpływ na zawartość produktów ubocznych fermentacji a później na właściwości smakowe piwa. Celem badań było bliższe określenie wpływu temperatury fermentacji brzeczki na tworzenie wybranych komponentów lotnych piwa. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań był symultaniczny proces produkcji piwa w trzech tankofermentorach (ZKT), z których pobierano próby przez 18 dni całego cyklu produkcyjnego. Każdy tankofermentor (A, B, C) został napełniony trzema warkami brzeczki w ilości 1050 hl każda. Brzeczki HG (High Gravity 15,5°Blg) były przygotowane z tej samej partii słodu, w identycznych warunkach technologicznych. Proces fermentacji głównej prowadzono w trzech odmiennych temperaturach (°C): A (8,5), B (10) i C (11,5). Do fermentacji użyto drożdże Saccharomyces carlsbergensis zebrane po drugiej fermentacji (trzeci pasaż) w ilości 7 mln komórek na cm3 brzeczki. Podczas fermentacji i dojrzewania monitorowano ilość komórek drożdżowych w fermentującej brzeczce i piwie (Nucleocounter YC-100 firmy Chemometec). Parametry fizykochemiczne piwa odczytywano z analizatora Alcolyzer Plus firmy Anton Paar. Do analizy składu związków lotnych (aldehyd octowy, dwuacetyl, estry) zastosowano chromatografię gazową (chromatograf GC 8000 Fisons Instruments). 224 Wpływ temperatury fermentacji brzeczki piwnej... WYNIKI I DYSKUSJA Stwierdzono istotne zmiany badanych wyróżników podczas procesu fermentacji brzeczki i dojrzewania piwa na skutek zastosowania różnej temperatury procesu. Rys. 1 przedstawia zmiany zawartości liczby komórek drożdżowych w fermentującej brzeczce i dojrzewającym piwie w tankofermentorze, w zależności od temperatury fermentacji brzeczki. Rys. 1. Ilość komórek drożdżowych w fermentującej brzeczce i dojrzewającym piwie Badania wpływu temperatury fermentacji brzeczki dla 8,5; 10 i 11,5°C na przyrost biomasy drożdży w piwie potwierdzają, że liczebność komórek drożdżowych osiąga największe wartości w temperaturze 11,5°C. Do 6 dnia procesu nastąpił ponad 6-krotny wzrost liczby komórek (do 42 mln jtk·ml-1), po tym okresie miało miejsce rozpoczęcie procesu fermentacji. Podobne wyniki uzyskali Claro i in. (2007) w swoich badaniach, wykazując ścisłą zależność pomiędzy temperaturą a żywotnością oraz szybkością namnażania drożdży. We wszystkich trzech partiach piwa zaobserwowano wzrost ilości drożdży w analizowanych próbkach w końcowej fazie fermentacji, co prawdopodobnie jest wynikiem powolnej sedymentacji komórek w strefie pobierania prób. Następnie, po tym okresie odnotowano stały spadek ich zawieszenia w piwie związany z procesem schłodzania w unitanku podczas procesu dojrzewania. 225 Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch Rys. 2. Kształtowanie się zawartości aldehydu octowego w zależności od temperatury fermentacji Zmiany zawartości aldehydu octowego w czasie fermentacji i dojrzewania (Rys. 2) są m.in. uzależnione od temperatury fermentacji. Wraz ze wzrostem temperatury od 8,5 do 11,5°C następowało obniżanie zawartości aldehydu i końcowa jego ilość kształtowała się w granicach od 4,2 do 7 mg w 1 dm³. Wcześniejsze badania Ramirez i Maciejowskiego [2007] wykazały podobną tendencję zmian. W badanych próbach fermentacyjnych, zawartość aldehydu przyrastała przez pierwsze trzy dni procesu, następnie jego zawartość zmniejszała się, w zależności od temperatury procesu aż do momentu zebrania drożdży z tankofermentora. Drożdże z każdego fermentora były zbierane po 100 h od rozpoczęcia procesu dojrzewania. Fermentacja w temperaturze 8,5°C powodowała znacznie powolniejszy proces redukcji aldehydu w odróżnieniu do dwóch pozostałych prób (10 i 11,5°C). Ze względu na wolniejsze tempo przemian w tym tankofermentorze (8,5°C), drożdże zostały zebrane dopiero w dwunastym dniu od napełnienia zbiornika. Jak można zauważyć na rysunku, redukcja aldehydu octowego w sposób istotny występowała do momentu odbioru drożdży. W ostatnim dniu procesu zebrano pozostałe drożdże i osady pofermentacyjne. Na rys. 3 przedstawiono zmiany zawartości dwuacetylu w fermentującej brzeczce i dojrzewającym piwie. 226 Wpływ temperatury fermentacji brzeczki piwnej... Rys. 3. Kształtowanie się zawartości dwuacetylu w zależności od temperatury fermentacji Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że dynamika kształtowania się dwuketonów wicynalnych (identyczne zmiany obserwowano również w przypadku 2,3-pentadionu) była również uzależniona od temperatury fermentacji. Dotychczasowe badania dowodzą, że ze wzrostem temperatury fermentacji następuje obniżenie zawartości dwuacetylu i 2,3-pentadionu. Powyższą tendencję potwierdzają liczne doniesienia literaturowe [Masschelein 1986, Wieczorek 1995, Saerens i in. 2008]. W badanych tankofermentorach poziom dwuacetylu zwiększał się bardzo szybko i osiągał maksymalną zawartość od 5 do 7 dnia procesu (120-180 μg/dm³) w zależności od temperatury fermentacji. W kolejnych dniach jego poziom zmniejszał się z szybkością porównywalną do jego tworzenia. Na podstawie kształtowania się zawartości dwuacetylu można zatem stwierdzić, że wraz ze wzrostem temperatury fermentacji następuje szybsza redukcja dwuketonów wicynalnych. Należy zauważyć, że spadek zawartości dwuacetylu w młodym piwie pojawił się w momencie rozpoczęcia procesu flokulacji drożdży (Rys. 1). Na Rys. 4 przedstawiono kształtowanie się zawartości octanu etylu w trakcie procesu produkcji piwa szczególnie podczas fermentacji burzliwej. Przebieg zmian na wykresie potwierdza, że kinetyka zmian zawartości octanu etylu w piwie jest ściśle powiązana z fazami wzrostu drożdży. Na ilość octanu etylu w piwie w sposób znaczący wpływa temperatura procesu. Wraz ze wzrostem temperatury istotnie powiększa się ilość octanu etylu. Wcześniejsze prace dowodziły [Nakatani i in. 1991; Riverol i Cooney 2007], że temperatura nie ma większego wpływu na zawartość tego związku w piwie, a jedynie na zawartość octanu izo-amylu jako ważnego komponentu aromatu piwa. Różnice w obserwacjach mogą być wynikiem zwiększonej rozpuszczalności dwutlenku węgla w tankofermentorach (15 m wysokości), który w sposób istotny ogranicza ilość powstałych estrów. 227 Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch Rys. 4. Kształtowanie się zawartości octanu etylu w zależności od temperatury fermentacji Na ilość octanu etylu w piwie w sposób znaczący wpływa temperatura procesu. Wraz ze wzrostem temperatury istotnie powiększa się ilość octanu etylu. Wcześniejsze prace dowodziły [Nakatani i in. 1991; Riverol i Cooney 2007], że temperatura nie ma większego wpływu na zawartość tego związku w piwie, a jedynie na zawartość octanu izo-amylu jako ważnego komponentu aromatu piwa. Różnice w obserwacjach mogą być wynikiem zwiększonej rozpuszczalności dwutlenku węgla w tankofermentorach (15 m wysokości), który w sposób istotny ogranicza ilość powstałych estrów. WNIOSKI • Temperatura fermentacji miała istotny wpływ na proces namnożenia drożdży i kinetykę fermentacji. Zwiększenie temperatury fermentacji brzeczki z 10 do 11,50C przyczyniło się do skrócenia czasu procesu o około jedną dobę. • Wykazano wyraźny wpływ temperatury fermentacji na kształtowanie się zawartości badanych składników lotnych. Zwiększenie temperatury fermentacji z 10 na 11,50C, przyczyniło się do wzrostu zawartości estrów, a szczególnie octanu etylu. • Zwiększona temperatura fermentacji powoduje zmniejszenie ilości aldehydu octowego i wicynalnych dwuketonów o około 30% . 228 Wpływ temperatury fermentacji brzeczki piwnej... LITERATURA Akatani K. Fukui N. Nagami K. Nishigaki M. 1991. Kinetic analysis of ester formation during beer fermentation. American Society of brewing Chemists, 4: 152-157. Claro F. Rijsbrack K. Soares E. 2005. Flocculation onset In Saccharomyces cerevisiae: effect of etanol, heat and Osmolic stress. Journal of Applied Microbiology, 102: 693-700. Dziuba E. 2001. Rola drożdży w kształtowaniu cech sensorycznych piwa. Materiały VI Szkoły Technologii Fermentacji, Szczyrk , 50-74. Erten H., Tanguler H., Cakiroz H. 2007. The effect of pitching rate on fermentation and flavour compounds in high gravity brewing. Journal of Institute Brewing,113, (1), 75 – 79. Guido L.F., Rodrigues P.G., Rodrigues J.A., Goncalves C.R., Barros A.A. 2003. The impact of the physiological condition of the pitching yeast on beer flavour stability: an industrial approach. Foodchem 10: 50-57. Kordialik-Bogacka E. Kuchciak T. 1998. Substancje smakowo-zapachowe piwa (1). Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 8: 21-23. Kucharczyk K. Tuszyński T. 2011. Aldehydy i wpływ wybranych czynników na ich zawartość w piwie. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 10: 8-10. Masschelein C. 1986. The biochemistry of maturation. Journal of Institute of Brewing, 92: 213 – 219. Ramirez F. Maciejowski J. 2007. Optimal beer fermentation. The Institute of Brewing&Distilling, 113: 325-333. Riverol C. Cooney J. 2007. Estimation of ester formation Turing Beer fermentation Rusing neural networks. Journal of Food Engineering, 82: 585-588. Saerens S. Verbelen P. Vanbeneden N. 2008. Monitoring the influence of high-gravity brewing and fermentation temperature on flavour formation by analysis of gene expression levels in brewing yeast. Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 80: 1039-1051. Salamon A. 1999. Przemiany ubocznych produktów metabolizmu drożdży i możliwości regulowania ich syntezy. Materiały IBPRS, Warszawa 14.04.1999, 9-15. Verbelen P., Dekoninck T., Saerens S., Mulders S., Thevelein J. Delvaux F. 2009. Impact of pitching rate on yeast fermentation performance and Beer flavour. Applied Microbial and Cell Physiology, 82: 155-167 Verbelen P., Saerens S., Mulders S., Delvaux F., Delvaux R. 2009. The role of oxygen in yeast metabolism during high cell density brewery fermentations. Applied Microbial and cell physiology. 82:1143-1156. Wieczorek E. 1995. Dwuacetyl w piwie i metody jego oznaczania. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 11:7-8. 229 Krzysztof Kucharczyk, Monika Cioch Adres do korespondencji: mgr inż. Monika Cioch, mgr inż. Krzysztof Kucharczyk Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 31 – 149 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński 230 Gabriela Kulig Monika Halik Anna Ptaszek EPISTEME 14/2012 s.231-237 ISSN 1895-4421 WŁAŚCIWOŚCI OSMOTYCZNE WODNYCH UKŁADÓW PVP- ŻELATYNA RYB MORSKICH-WODA OSMOTIC PROPERTIES OF AQUEOUS SYSTEMS PVP-GELATIN FROM COLD WATER FISH-WATER Abstrakt. Celem pracy było określenie równowagi fazowej w układzie PVP- żelatyna ryb morskich-woda za pomocą pomiarów ciśnienia osmotycznego. W mieszaninie tych trzech składników występuje zjawisko separacji faz wynikające z niezgodności termodynamicznej między poliwinylopirolidonem a żelatyną ryb morskich. Poliwinylopirolidon (PVP) jest dodatkiem stosowanym do żywności i oznaczany jako E1200. Dobra rozpuszczalność i duża lepkość roztworów PVP powoduje jego szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym. Innym ważnym biopolimerem wykorzystanym w badaniach a stosowanym w żywności jest żelatyna. W pracy przeanalizowano zależność ciśnienia osmotycznego roztworów żelatyny rybiej, PVP oraz mieszaniny żelatyna rybia i PVP w warunkach stałej temperatury (40°C ) i stałego pH. Badania wstępne wskazują na możliwość wystąpienia separacji faz w szerokim zakresie stężeń żelatyny ryb morskich- PVP. Słowa kluczowe: PVP, żelatyna ryb morskich, równowaga fazowa, osmometria Summary. The aim of this study was to determine the phase equilibrium in the system PVP-marine fish gelatin-water by measuring osmotic pressure. The mixture of these three components is occurring phase separation resulting from the thermodynamic incompatibility between polyvinylpyrrolidone and gelatin of marine fish. Polyvinylpyrrolidone (PVP) is an additive used in food and denoted as E1200. It belongs to a biocompatible polymer and is obtained by polymerization of vinylpyrrolidone. The good solubility and high viscosity solutions of PVP makes it widely used in food industry. Another important biopolymer which used in our research is gelatin. The paper analyzes the dependence of osmotic pressure of solutions of fish gelatin, PVP, and a mixture of fish gelatin and PVP in a constant temperature (40 ° C) and constant pH. Preliminary studies indicate the possibility of phase separation in a wide concentration range of marine fish gelatin-PVP. Key words: PVP, gelatin of marine fish, the equilibrium phase, osmometriaosmo 231 Gabriela Kulig, Monika Halik, Anna Ptaszek WSTĘP W przemyśle spożywczym na co dzień wykorzystuje się znajomość interakcji pomiędzy danymi składnikami mieszaniny. Istotnym z punktu widzenia technologa jest dokładne zbadanie i poznanie tych oddziaływań kształtujących poszczególne cechy produktów żywnościowych. Jednym ze zjawisk obrazujących oddziaływania w wodnych roztworach jest osmoza zachodząca pomiędzy roztworem a czystym rozpuszczalnikiem, przy założeniu, że są one oddzielone membrana czyli przegrodą przepuszczalna tylko dla cząsteczek rozpuszczalnika. W takim układzie dochodzi do osmozy czyli wędrówki cząsteczek rozpuszczalnika do roztworu, a nie wyrównania stężenia substancji rozpuszczonej jak ma to miejsce w klasycznej dyfuzji. Membranę półprzepuszczalną, tzn. taką która przepuszcza rozpuszczalnik, a nie przepuszcza substancji rozpuszczonej, dopasowuje się w zależności do rozmiarów cząsteczek, tak aby jej pory umożliwiały jedynie przenikanie cząsteczek rozpuszczalnika. Jego przepływ zachodzi do momentu wyrównania potencjałów chemicznych rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonej po obu stronach przegrody i w efekcie do wzrostu objętości roztworu. Osmoza jest procesem samorzutnym, jednak możliwe jest jej zahamowanie jak i odwrócenie. Pomiar ciśnienia osmotycznego umożliwia określenie równowagi w układach dwu- lub więcej składnikowych. CEL PRACY Celem pracy było określenie równowagi fazowej w układzie PVP- żelatyna ryb morskich-woda za pomocą pomiarów ciśnienia osmotycznego. W mieszaninie tych trzech składników występuje zjawisko separacji faz wynikające z niezgodności termodynamicznej między poliwinylopirolidonem a żelatyną ryb morskich. Tego typu badania nie zostały dotąd wykonane, dlatego możemy uznać je za innowacyjne i wnoszący istotny wkład w naukę. MATERIAŁY I METODY Żelatyna ryb morskich (gelatin from cold water fish skin), zakupiona została w firmie Sigma-Aldrich. Jest to żółto-kremowy proszek o charakterystycznym zapachu. Do analizy użyto poliwinylopirolidonu o masie cząsteczkowej 55 kDa, który również zakupiono w firmie Sigma-Aldrich. Etap 1. Do wialek o pojemności 25 ml odważono żelatynę i PVP w proporcjach ustalonych wcześniej na podstawie badań wstępnych. Każda z seria składała się z 17 naważek. Naważki zalano 10 ml wody destylowanej, następnie mieszaninę wytrząsano przez około 3 minut, po czym wstawiono do łaźni wodnej o temperaturze 75°C aż do całkowitego rozpuszczenia. 232 Właściwości osmotyczne wodnych ukłądów PVP-żelatyna... Jednolite roztwory przelano do falkonów, dodano azydku w celu stabilizacji, szczelnie zamknięto i termostatowano w cieplarce w temperaturze 35°C przez okres 24h. Rys.1. Na fotografii przedstawiono separację faz , która nastąpiła po etapie nr.1. Była ona punktem wyjściowym do dalszym badań Etap 2. Do szklanych butelek o pojemności 50 ml odważono kolejno żelatynę, PVP w ustalonych wcześniej proporcjach, tak aby masy naważek zawarte były w przedziale od 0,12.g do 0,24 g. Zarówno dla żelatyny jak PVP sporządzono po 8 naważek. W przypadku mieszaniny PVP- żelatyna ryb morskich przyjęto stałą naważkę PVP o masie ok. 0,0610 g i zmiennej masie żelatyny w przedziale wagowym od 0,0620 g do 0,1805 g tak, żeby ich suma zawierała się w przedziale 0,12 g do 0,24 g. Naważki zalano 100 ml wody destylowanej i następnie mieszano je przy użyciu mieszadła magnetycznego w temperaturze 40°C do całkowitego rozpuszczenia. Jednolite roztwory badano z wykorzystaniem osmometru membranowego OSMOMAT 090 GONOTEC Gmbh z użyciem membrany 10kg/mol. Pomiary wykonano w pięciu powtórzeniach dla każdego roztworu. WYNIKI Na poniższych rysunkach przedstawiono zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°C i przy użyciu membrany 10kg/mol. Natomiast w tabelach zestawiono po osiem powtórzeń i warunki w jakich zostały wykonane. 233 Gabriela Kulig, Monika Halik, Anna Ptaszek Rys. 1. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°dla żelatyny rybiej 234 Właściwości osmotyczne wodnych ukłądów PVP-żelatyna... Rys. 2. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°dla PVP 235 Gabriela Kulig, Monika Halik, Anna Ptaszek Rys. 3. Zależność ciśnienia osmotycznego (π) od stężenia (c) w temperaturze 40°dla układów poliwinylopirolidon- żelatyna rybia 236 Właściwości osmotyczne wodnych ukłądów PVP-żelatyna... DYSKUSJA I WNIOSKI Z otrzymanych wyników można wnioskować, że masy molowe są zgodne z podanymi przez producenta czyli dla żelatyny ok. 90kDa, a dla PVP 55kDa. Na rysunkach 1 i 3 nachylenie krzywej, a w konsekwencji drugi współczynnik wirialu, są dodatnie. Pozwala nam to stwierdzić, że woda jest dobrym rozpuszczalnikiem dla PVP i żelatyny w badanym przedziale gdzie masy naważek zawarto od 0,12 g do 0,24 g substancji na 100 ml wody. Natomiast w przypadku mieszaniny PVP i żelatyny ryb morskich, gdzie przyjęto stałą naważkę PVP o masie ok. 0,0610 g i zmienną masę żelatyny w przedziale wagowym od 0,0620 g do 0,1805 g tak, żeby ich suma zawierała się w przedziale 0,12 g do 0,24 g , również występuje dodatnie nachylenie krzywej czyli dodatni współczynnik wirialu. Następuje natomiast wzrost masy molowej co może wskazywać na agregację łańcuchów PVP i białka w wodnym roztworze. W takim przedziale stężeń mieszaniny PVP i żelatyny woda jest dobrym rozpuszczalnikiem. Fakt powstawania aglomeratów pozwala nam przypuszczać, iż przy większych stężeniach w roztworze wodnym PVP- żelatyna prowadzi do separacji faz. LITERATURA Ptaszek A., Ptaszek P. Osmometria w badaniach właściwości biopolimerów. Laboratorium; Przegląd Ogólnopolski, 3/ 09. J. F. Rabek. 1977. Podstawy fizykochemii polimerów. Politechnika Wrocławska. Wrocław. Adres do korespondencji: mgr inż. Gabriela Kulig, mgr inż. Monika Halik Katedra Inżynierii i Aparatury Przemysłu Spożywczego Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] 237 Karolina Malecka, Ryszard Macura Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg EPISTEME 14/2012 s.239-245 ISSN 1895-4421 WYKORZYSTANIE KRIOKONCENTRACJI DO PRODUKCJI PREPARATÓW BARWIĄCYCH Z SOKU BURAKA ĆWIKŁOWEGO PODDANEGO FERMENTACJI MLEKOWEJ I AKOHOLOWEJ THE USE OF FREEZE CONCENTRATION IN THE MANUFACTURE OF PIGMENTS OBTAINED FROM RED BEET JUICE SUBJECTED TO LACTIC ACID AND ALKOHOLOIC FERMENTATIONS Abstrakt. Znaczna zawartość cukrów w korzeniach buraka ćwikłowego umożliwia utrwalanie otrzymywanego z nich soku metodą fermentacji mlekowej i alkoholowej. Utrwalony sok może z kolei stanowić surowiec do produkcji naturalnych preparatów barwiących, które coraz częściej uwzględnia się podczas produkcji żywności zamiast sztucznych barwników. Celem pracy była ocena stabilności barwników betalainowych (betacyjanów i betaksantyn) z buraka ćwikłowego w sokach poddanych fermentacji mlekowej i alkoholowej, a następnie zagęszczonych metodą kriokoncentracji. Oznaczono również temperatury krioskopowe soków poddanych fermentacji i otrzymanych z nich koncentratów. Temperatura krioskopowa po czwartym zagęszczeniu wynosiła w przypadku soku poddanego fermentacji alkoholowej -12,2 ºC, a soku poddanego fermentacji mlekowej -4,5ºC. Większą trwałość żółtych barwników zaobserwowano w soku poddanym fermentacji alkoholowej. Straty barwników czerwonych wynosiły po czwartym zagęszczeniu 24,79% w soku poddanym fermentacji alkoholowej i 15,35% po fermentacji mlekowej. Słowa kluczowe: kriokoncentracja, fermentacja mlekowa, fermentacja alkoholowa, burak ćwikłowy, barwniki betalainowe Summary. A large sugar content in roots of red beet allows to preserve its juices by means of lactic acid and alcoholic fermentations. Such preserved juice can in turn be used for the production of natural coloring preparations. The aim of the dissertation was to assess the stability of red beet betalain pigments (betacyanins, betaxantins) in juices subjected to lactic acid and alcoholic fermentations, and then freeze concentrated. Moreover, freezing temperatures of alcoholic/lactic acid fermentation juices and obtained concentrates have been determined. Thus, freezing temperatures after the fourth concentration of alcoholic fermentation juices came to -12, 2˚C, whereas in the case of lactic acid fermentation juices it amounted to -4.5˚C. Higher stability of yellow pigment has been observed in juices subjected to alcoholic fermentation. The loss of red pigments after the fourth concentration came to 24.79% in the juice subjected to alcoholic fermentation and 15.35% in the juice subjected to lactic fermentation. Key words: freeze concentration, lactic acid fermentation, alcoholic fermentation, red beet, betalain pigments 239 Karolina Malecka, Ryszard Macura, Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg WSTĘP Burak ćwikłowy stanowi surowiec wykorzystywany w przemyśle spożywczym głównie do produkcji soków, barszczu oraz naturalnych barwników [Sobkowska 1979]. Charakterystyczna barwa soku otrzymywanego z buraków ćwikłowych jest związana z obecnością w nim barwinków betalainowych, do których zalicza się czerwone betacyjany i żółte betaksantyny [Czapski i in. 2011]. Barwniki zawarte w burakach ćwikłowych są wykorzystywane między innymi do barwienia przetworów mięsnych, owocowych oraz w cukiernictwie (żelki, pianki, masy, gumy do żucia) i przemyśle mleczarskim (jogurty smakowe, lody, desery mleczne) [Sobkowska 1979, Mosiewicz 2003]. Stanowią one alternatywę dla konsumentów, którzy unikają spożywania syntetycznych dodatków. Ich wykorzystanie do produkcji żywności bywa jednak ograniczone zmianami jakim ulęgają podczas kontaktu ze światłem i wysoką temperaturą. [Daeseok i in. 1998] Zawartość cukrów prostych i sacharozy, która kształtuje się w burkach ćwikłowych na poziomie 8% [Krajewski 1991] stwarza warunki do utrwalania otrzymanych z nich soków poprzez przeprowadzenie fermentacji mlekowej i alkoholowej. Kwas mlekowy oraz alkohol etylowy, które powstają podczas fermentacji stanowią naturalny czynnik przedłużający trwałość żywności. W przypadku buraków fermentacja mlekowa wykorzystywana jest głównie do produkcji barszczu. Zastosowanie kriokoncentracji umożliwia dodatkowe utrwalenie fermentowanych soków z buraka ćwikłowego. Metoda polega na usuwaniu wody z płynnych produktów poprzez wymrażanie. Wykorzystanie podczas zagęszczania niskich temperatur wpływa na lepsze zachowanie aromatu oraz składników, w tym barwników, wrażliwych na działanie ciepła. [Liu i in. 1999, Dette i Jansen 2010]. Celem pracy była ocena stabilności barwników betalainowych (betaniny i wulgaksantyny) z buraka ćwikłowego w sokach poddanych fermentacji mlekowej i alkoholowej, a następnie zagęszczonych metodą kriokoncentracji. Oznaczono również temperatury krioskopowe soków poddanych fermentacji i otrzymanych z nich koncentratów. MATERIAŁ I METODY Do badań wykorzystano buraki czerwone (Beta Vulgaris L) zakupione w lokalnym sklepie. Buraki umyto w letniej wodzie w celu usunięcia zanieczyszczeń z powierzchni. Po osuszeniu pozbawiono je ogonka oraz korony, a następnie obrano i pokrojono na mniejsze cząstki. W sokowirówce firmy Zelmer typ 177 przygotowano z rozdrobnionego surowca sok. Otrzymany sok poddano fermentacji mlekowej i alkoholowej. 240 Wykorzystanie kriokoncentracji do produkcji preparatów barwiących... Do fermentacji mlekowej wykorzystano sok rozcieńczony wodą w stosunku 1:1, który zaszczepiono bakteriami fermentacji mlekowej Lactobacillus plantarum. Sok z dodatkiem bakterii przetrzymywano przez 48 godzin w szklanym słoju umieszczonym w cieplarce o stałej temp. 23°C. Fermentacji alkoholowej poddano nierozcieńczony sok z buraka, który zaszczepiono drożdżami Sacharomyces cerevisiae. Sok z dodatkiem drożdży przetrzymywano przez 24 godziny w szklanym słoju w temperaturze 22– 24°C. Po zakończeniu fermentacji mlekowej i alkoholowej sok zlano do czystych naczyń. Przefermentowany sok poddano zagęszczaniu przez wymrażanie. Proces kriokoncentracji przeprowadzono w kriostacie MLW MK 70, w którym czynnikiem chłodzącym był etanol o temperaturze ok. – 25°C. Próbki umieszczono w naczyniach ze stali nierdzewnej. Podczas wymrażania wody próbki poddawano intensywnemu mieszaniu. Otrzymane kryształki lodu rozdzielano przez 15 minut w wirówce z chłodzeniem przy prędkości 2000 obr/ min. Przefermentowane soki zagęszczano 4 – krotnie. Po każdym kolejnym zagęszczeniu wykonano pomiar zawartości barwników. Widma barwników zawartych w świeżym soku z buraka ćwikłowego, barszczu oraz ich koncentratach wyznaczono wykorzystując spektrofotometr Cecil CE 9500. Pomiar absorbancji wykonano dla fal o długości 476 nm, 537 nm i 600 nm. Otrzymane wartości absorbancji wykorzystano do obliczenia stężenia barwników czerwonych i żółtych metodą pośrednią według Nilssona [Wiley i in. 1978]. Zawartość barwników czerwonych wyrażono jako betaninę, a barwników żółtych jako wulgaksantynę. Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnie. Dla soku z buraka ćwikłowego poddanego fermentacji alkoholowej oznaczono również zawartość etanolu przed zagęszczeniem oraz po każdym kolejnym etapie kriokoncentracji. Dla próbek rozcieńczonego soku poddanego fermentacji mlekowej i jego koncentratów zmierzono kwasowość, wynik podano jako procentową zawartość kwasu mlekowego. Pomiar kwasowości wykonano metodą miareczkowania mianowanym 0,1 M roztworem NaOH. Miareczkowanie prowadzono do osiągnięcia pH mieszczącego się w przedziale 7,5 – 7,8. Oznaczenie zawartości alkoholu etylowego w soku poddanym fermentacji alkoholowej i jego koncentratach wykonano za pomocą areometru. Destylacji poddawano 100 cm3 soku i jego koncentratów. Po otrzymaniu ok. 75cm3 destylatu roztwór doprowadzono do temperatury 20°C i dopełniono do 100 cm3 wodą destylowaną o tej samej temperaturze. Wynik podano jako średnią z dwóch kolejnych oznaczeń. Dla próbek soku poddanego fermentacji alkoholowej i mlekowej oraz ich koncentratów wykonano po każdym kolejnym zagęszczeniu pomiar temperatury krioskopowej. 241 Karolina Malecka, Ryszard Macura, Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg Rys. 1. Zmiany temperatury krioskopowej w soku z buraka poddanym fermentacji alkoholowej na kolejnych etapach zagęszczania metodą kriokoncentracji Rys. 2. Zmiany temperatury krioskopowej w soku z buraka poddanym fermentacji mlekowej na kolejnych etapach zagęszczania metodą kriokoncentracji WYNIKI I DYSKUSJA Podczas zagęszczania soku z buraka poddanego fermentacji mlekowej i alkoholowej zaobserwowano spadek temperatury krioskopowej. W przypadku soku utrwalonego metodą fermentacji alkoholowej temperatura krioskopowa przed zagęszczeniem, przy zawartości etanolu równej 2,6% wynosiła -2,0°C. Po ostatnim zagęszczeniu zawartość etanolu wzrosła do 12,9%, a temperatura krioskopowa uległa obniżeniu do -12,2°C (Rys. 1) Pomiar temperatury krioskopowej rozcieńczonego soku z buraka poddanego fermentacji mlekowej wykonano w odniesieniu do zwartości kwasu mlekowego. Temperatura krioskopowa przefermentowanego soku przed zagęszczaniem wynosiła -0,4°C, przy zwartości kwasu mlekowego równej 0,63%. Po czwartym zagęszczeniu temperatura krioskopowa soku poddanego fermentacji mlekowej spadła do -4,5°C, a zawartość kwasu mlekowego zwiększyła się do 2,97% (Rys.2). Zawartość betacyjanów w korzeniach buraka mieści się w granicach od 0,3 do 3 mg/g świeżej masy [Czapski i in. 2009]. W korzeniu buraków z których przygotowano sok oraz barszcz zawartość czerwonych barwników wynosiła 242 Wykorzystanie kriokoncentracji do produkcji preparatów barwiących... 55,10 mg/100g świeżej masy, a żółtych 30,60 mg/100g świeżej masy. Po przeprowadzeniu fermentacji alkoholowej zaobserwowano w soku z buraka stratę barwników żółtych wielkości 25,82% oraz 8,84% w przypadku barwników czerwonych. Fermentacja mlekowa wpłynęła na zmniejszenie o 61,44% zawartości barwników żółtych i o 28,02 % barwników czerwonych. Podczas kolejnych zagęszczeń soku z buraka poddanego fermentacji mlekowej i alkoholowej obserwowano wzrost zawartości barwników betalainowych. Zagęszczenie soku z buraka poddanego fermentacji alkoholowej od zawartości etanolu równej 2,6% do zawartości etanolu wynoszącej 12,9% wpłynęło na zwiększenie ilości czerwonych barwników z 50,23 mg/100g do 187,43 mg/100g. Zawartość barwników żółtych wzrosła z 22,70 mg/100g do 92,30 mg/100g (Tab. 1) Stosunek zawartości barwników czerwonych do żółtych zmniejszył się po czwartym zagęszczeniu z 2,21 do 2,03 (Tab. 1). Zawartość alkoholu % Zawartość barwników żółtych mg/100g Zawartość barwników czerwonych mg/100g Stosunek zawartości barwników czerwonych do żółtych Świeży sok ---------- 30,60 ± 0,45 55,10 ± 0,16 1,80 Sok po fermentacji alkoholowej 2,6 22,70 ± 0,20 50,23 ± 0,50 2,21 Sok po I zagęszczeniu 4,3 34,63 ± 1,59 75,27 ± 3,18 2,17 Sok po II zagęszczeniu 8,0 51,20 ± 1,31 115,73 ± 1,02 2,26 Sok po III zagęszczeniu 12,2 81,87 ± 0,35 153,60 ± 2,29 1,88 Sok po IV zagęszczeniu 12,9 92,30 ± 1,78 187,43 ± 2,60 2,03 Tab. 1. Zawartość etanolu, barwników żółtych, czerwonych oraz stosunek barwników w soku buraczanym poddanym fermentacji alkoholowej i kriokoncentracji Zawartość czerwonych barwników w przefermentowanym rozcieńczonym soku z buraka, w którym ilość kwasu mlekowego kształtowała się na poziomie 0,63% przed zagęszczeniem wynosiła 19,83 mg/100g, a barwników żółtych 5,90 mg/100g. Po czwartym zagęszczeniu zwartość kwasu mlekowego wzrosła do 2,97%, zawartość barwników czerwonych zwiększyła się do 79,10 mg/100g, a żółtych do 26,87 mg/100g (Tab. 2). Stosunek barwników czerwonych do żółtych, który w nie zagęszczonym soku poddanym fermentacji mlekowej kształtował się na poziomie 3,36 zmniejszył się po czwartym zagęszczeniu i wynosił 2,94 (Tab. 2). 243 Karolina Malecka, Ryszard Macura, Grzegorz Fiutak, Marek Szeląg Zawartość kwasu mlekowego % Zawartość barwników żółtych mg/100g Zawartość barwników czerwonych mg/100g Stosunek zawartości barwników czerwonych do żółtych Świeży sok ---------- 15,30 ± 0,14 27,55 ± 0,29 1,80 Sok po fermentacji mlekowej 0,63 5,90 ± 0,10 19,83 ± 0,12 3,36 Sok po I zagęszczeniu 1,08 10,50 ± 0,20 35,73 ± 0,40 3,40 Sok po II zagęszczeniu 1,44 15,53 ± 0,47 51,53 ± 1,16 3,32 Sok po III zagęszczeniu 1,89 21,37 ± 0,58 67,70 ± 0,35 3,17 Sok po IV zagęszczeniu 2,97 26,87 ± 1,42 79,10 ± 0,62 2,94 Tab. 2. Zawartość kwasu mlekowego, barwników żółtych, czerwonych oraz stosunek barwników w soku buraczanym poddanym fermentacji i kriokoncentracji Stosunek barwników czerwonych do żółtych wynosił w świeżym soku 1,80. Po poddaniu soku fermentacji alkoholowej stosunek ten wzrósł do 2,21, a po fermentacji mlekowej do 3,36. Większą trwałość barwników żółtych zauważono w soku poddanym fermentacji alkoholowej. Niższa zawartość żółtych barwników w soku po fermentacji mlekowej jest związana z ich mniejszą stabilnością towarzyszącą spadkowi pH [Czapski 1979]. W otrzymanych krio-koncentratach soków określono również straty barwników podczas zagęszczania. Obliczenia zawartości barwników w soku po fermentacji alkoholowej wykonano względem zwartości etanolu. Straty barwników czerwonych wynosiły w nim łącznie, po czwartym zagęszczeniu, 24,79%, a żółtych 18,05%. Straty barwników w soku poddanym fermentacji mlekowej obliczano w stosunku do zmieniającej się zawartości kwasu mlekowego. Po czwartym zagęszczeniu wynosiły one łącznie 15,35% w przypadku barwników czerwonych i 3,73% dla barwników żółtych. WNIOSKI • Barwniki zawarte w buraku ćwikłowym są trwałe podczas zagęszczania przez wymrażanie. Zastosowanie kriokoncentracji pozwala uzyskać ich wysoką zawartość w soku z buraka poddanego fermentacji zarówno alkoholowej jak i mlekowej. • Najwyższy stosunek barwników czerwonych do żółtych zaobserwowano w soku poddanym fermentacji mlekowej. • Wyższe starty barwników żółtych i czerwonych zaobserwowano w soku z buraka, który poddano fermentacji mlekowej. 244 Wykorzystanie kriokoncentracji do produkcji preparatów barwiących... LITERATURA Czapski J. 1979. Badania nad otrzymaniem soku o dobrej jakości z buraka ćwikłowego. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 11, 23-25. Czapski J., Gościnna K., Kidoń M., 2011. Sok z buraka ćwikłowego. Wpływ masy i części korzenia buraka na wyróżniki soku. Przemysł Spożywczy, 65(11), 50-52. Czapski J., Mikołajczyk K., Kaczmarek M. 2009 Relationship between antioxidantcapacity and of Reed beet juice and contents of its betalain pigments. Polish Journal of Food and Nutrition Science, 59(2), 119-122. Daeseok H., Seok Joong K., Sang Hee K., Dong Man K. 1998. Repeated regeneration of degraded red beet juice pigments in the presence of antioxidants. Journal of Food Science, 63(1), 69-72. Dette S.S., Jansen H. 2010. Freeze concentration of blackcurrant juice. Chemical Engineering and Technology, 33( 5), 762-766. Krajewski A. 1991. Kiszone buraki ćwikłowe w przerobie przemysłowym. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 8, 13-14 Liu L, Miyawaki O., Hayakawa K. 1999. Progressive freeze-concentration of tomato juice. Food Science and Technology Research, 5(1), 108-112. Mosiewicz R. 2003. Polski paradoks. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-Warzywny, 4, 4. Sobkowska E. 1979. Burak ćwikłowy jako surowiec do produkcji soków. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo – Warzywny, 10, 25-28. Wiley R.C., Lee Y. 1978. Recovery of betalaines from red beets by a diffusion– extraction procedure. Journal of Food Science, 43, 1056 – 1058. Adres do korespondencji: mgr inż. Karolina Malecka, mgr inż. Grzegorz Fiutak, mgr inż. Marek Szeląg Katedra Chłodnictwa i Koncentratów Spożywczych Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Ryszard Macura 245 Agnieszka Siembida Anna Kościej Lidia Duda Ewa Cieślik EPISTEME 14/2012 s.247-254 ISSN 1895-4421 OSZACOWANIE SPOŻYCIA PRODUKTÓW ZAWIERAJĄCYCH FRUKTANY ESTIMATION OF INTAKE OF FOOD PRODUCTS CONTAINING FRUCTANS Abstrakt. W pracy podjęto próbę oszacowania spożycia produktów będących źródłem fruktanów oraz oceny poziomu wiedzy żywieniowej na temat tych polisacharydów. Badaniem ankietowym objęto 166 osób, w tym 86 kobiet i 80 mężczyzn, w przedziale wiekowym 8-82 lat. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą testu Chi2. Czynnikiem różnicującym badaną grupę była płeć oraz wiek respondentów. Uzyskane wyniki wskazują, iż kobiety posiadały lepszą wiedzę w zakresie źródeł fruktanów, zaś mężczyźni wykazali się lepszą wiedzą na temat ich właściwości prozdrowotnych. Zarówno kobiety jak i mężczyźni swoją wiedzę czerpią głównie z Internetu. Codziennym źródłem fruktanów w diecie kobiet były: kawa z dodatkiem cykorii, preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę oraz cebula. W racji pokarmowej mężczyzn, głównym źródłem fruktanów były czosnek oraz cebula. Słowa kluczowe: fruktany, wiedza, źródła, częstotliwość spożycia Summary. This paper attempts to estimate of intake of food products containing fructans and the level of nutrition knowledge about these polysaccharides. The study was performed among 166 persons (86 women, 80 men) aged 8-82. Results were analyzed with using the Chi2 test. Studied differentiating factors were gender and age of respondents. The results indicate that women had better knowledge about the fructans issue, while men showed better knowledge about their healthy properties. Both women and men obtained their knowledge mainly from the Internet. Daily sources of fructans in the women`s diet were: coffee with chicory, dietary supplement with inulin which reduce body mass and onion. Man’s daily diet, aimed to providing fructans, is based mainly on the garlic and onions intake. Key words: fructans, knowledge, sources, frequency of intake 247 Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik WSTĘP Obserwowany proces starzenia się społeczeństwa, w szczególności w krajach wysokorozwiniętych gospodarczo, wzrost zagrożeń cywilizacyjnych oraz kosztów leczenia, jak również większe zaufanie konsumentów do żywności w tradycyjnej postaci niż do preparatów farmaceutycznych, spowodowały nasilenie prac nad opracowywaniem produktów prozdrowotnych, tzn. żywności funkcjonalnej. Mianem żywności funkcjonalnej określane są produkty spożywcze, które mają udowodniony korzystny wpływ na jedną lub więcej funkcji organizmu, polegający na poprawie stanu zdrowia oraz samopoczucia i/lub zmniejszenia ryzyka chorób, wynikający z obecności w nich substancji bioaktywnych o określonym działaniu prozdrowotnym oraz z optymalnej fizjologicznie proporcji tych składników. W produkcji żywności funkcjonalnej nośnikami substancji bioaktywnych są zwykle te produkty spożywcze, które są często kupowane i regularnie spożywane [Cieślik 2004]. Fruktany, nazywane inaczej polifruktozylocukrami, zaliczane są do rozpuszczalnej frakcji błonnika pokarmowego. Są polimerami zbudowanymi z jednostek β-D-fruktofuranozy oraz z jednej, na ogół na końcu redukującego łańcucha, cząsteczki D-glukozy. W naturze występuje pięć różnych grup fruktanów, które rozróżnia się zgodnie z typem występujących w ich strukturze połączeń oraz położeniem cząsteczki glukozy. Są to: inuliny, neoinuliny, lewany (produkowane przez bakterie)/phlein (produkowane przez rośliny), neolewany oraz fruktany mieszane (graminan). Powód różnorodności struktur i zawartości fruktanów u poszczególnych roślin jest nieznany, aczkolwiek podsumowując wyniki licznych badań, przyjęto, iż kluczową rolę odgrywają czynniki tj.: gatunek, część morfologiczna oraz stadium rozwoju (dojrzałości) danej rośliny, a także warunki środowiska, w tym temperatura (zwłaszcza podczas wzrostu korzeni i pędów), intensywność nasłonecznienia i jego czas, tudzież dostępność pożywienia i status wodny [Cieślik i Siembida 2010]. Wśród właściwości prozdrowotnych fruktanów wymienić należy: zmniejszanie ryzyka występowania hiperglikemii, przeciwdziałanie zaparciom, stymulacje działania układu odpornościowego, regulacje gospodarki lipidowej w organizmie, zmniejszanie ryzyka występowania nowotworów jelita grubego, poprawę wchłaniania oraz stymulacje absorpcji związków mineralnych, w tym głównie Ca, Mg, Zn i Fe, a tym samym stymulacje mineralizacji kostnej oraz odporności kości na złamania [Roberfroid 2007]. Oprócz licznych właściwości prozdrowotnych, fruktany charakteryzują się również korzystnymi właściwościami technologicznymi tj.: strukturotwórczymi, zagęszczającymi, wodochłonnymi oraz zmniejszaniem wartości ener248 Oszacowanie pożycia produktów zawierających fruktany... getycznej produktów poprzez zastępowanie cukru i tłuszczu. Z tego względu fruktany mogą znaleźć zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego: mleczarstwie, cukiernictwie i piekarstwie lub w przetwórstwie owocowo-warzywnym [Cieślik i Gębusia 2011]. Przetwarzanie żywności wpływa jednak na zawartość fruktanów w produktach spożywczych. Techniki których celem jest dehydratacja (np. suszenie) zwiększają stężenie fruktanów w produkcie, z kolei przetwarzanie termiczne z udziałem wody (np. gotowanie) jest powodem zmniejszenia zawartości fruktanów w produkcie, bowiem cześć fruktanów przechodzi do wywaru. Przetwarzanie termiczne bez udziału wody (np. pieczenie, pasteryzacja) nie przyczynia się istotnie do strat fruktanów. Z tego względu, zawartość fruktanów w gotowym produkcie będzie zależeć od jego składu recepturowego, warunków przechowywania oraz zastosowanej metody obróbki termicznej [Bartnikowska 2010]. MATERIAŁ I METODY Badania ankietowe zostały przeprowadzone jesienią 2011 roku, za pomocą anonimowego kwestionariusza ankiety, specjalnie opracowanego do celów niniejszej pracy. Objęto nimi 166 osób, w tym 51,8% kobiet i 48,2% mężczyzn, w przedziale wiekowym od 8-82 lat. W badaniu uczestniczyły osoby o różnym stopniu wykształcenia i zamożności. Kwestionariusz ankiety podzielono na dwie części. Pierwsze dwa pytania miały na celu dostarczenie ogólnych informacji o ankietowanych osobach – dotyczyły płci oraz wieku respondentów. Pozostałe pytania odnosiły się do oceny stanu wiedzy żywieniowej na temat fruktanów oraz jej źródeł, a także oszacowania spożycia produktów będących źródłem fruktanów w diecie przeciętnego Polaka. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą testu Chi2, z wykorzystaniem programu Statistica v.8.0., przyjmując za granicę istotności p < 0,05. Czynnikiem różnicującym badaną grupę była płeć oraz wiek respondentów. Badaną populację podzielono na 14 grup wiekowych tj.: < 20; 20-24; 25-29; 30-34; 35-39; 40-44; 45-49; 50-54; 55-59; 60-64; 65-69; 7074; 75-79; 80-85 lat. WYNIKI I DYSKUSJA Na wstępie zwrócono się do ankietowanych z prośbą o odpowiedź na pytanie „Czy wie Pani/Pan czym są fruktany?”. Udzielone odpowiedzi wskazują, iż lepszą wiedzę w tym zakresie posiadają kobiety (30,23%) aniżeli mężczyźni (21,25%). Nie odnotowano różnic istotnych statystycznie pod względem udzielonych odpowiedzi, w zależności od płci. Jednakże wiek okazał się 249 Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik istotnym statystycznie czynnikiem różnicującym badaną grupę, ponieważ 20-24-latkowie (28,17%) wykazali się najwyższym poziomem wiedzy na temat pojęcia fruktanów. Niemniej jednak, spośród osób, które tej wiedzy nie posiadały, 20-24-latkowie (28,93%) także stanowili największą grupę. Z kolei, odpowiedzi na pytanie „Czy zna Pani/Pan prozdrowotne właściwości fruktanów?”, wykazały, iż lepszą wiedzę w tym aspekcie posiadają mężczyźni (16,28%) aniżeli kobiety (13,75%). W przypadku tego pytania, czynnikiem istotnie różnicującym badaną grupę okazała się być zarówno płeć, jak i wiek respondentów. Spośród kobiet, najlepszą wiedzę na temat właściwości prozdrowotnych fruktanów posiadają 20-24-latki (42,86%), natomiast najniższą kobiety w wieku 25-29 lat – 15% z nich nie znało odpowiedzi na to pytanie. Z kolei wśród mężczyzn, najwyższy poziom wiedzy zaprezentowali 50-54-latkowie (27,27%), a najniższy mężczyźni w przedziale 20-24 lat, wśród których 44% nie znało prozdrowotnych właściwości fruktanów. Kolejne pytanie miało na celu określenie źródeł, z których ankietowani deklarujący posiadanie wiadomości o fruktanach, czerpią swoją wiedzę. Spośród możliwych wariantów odpowiedzi, najczęściej wskazywany był Internet, zarówno w przypadku kobiet (17,35%) jak i mężczyzn (11,49%). W grupie kobiet kolejne miejsce zajmowała prasa (7%) oraz informacje pozyskiwane od znajomych (6%). Tylko 5% pań wskazało na telewizję, zaś 3% odpowiedziało, iż korzysta z innych źródeł informacji. Wśród mężczyzn prasę i telewizję, znajomych oraz inne źródło wskazało odpowiednio po 2,3%; 4,6% oraz 7% ankietowanych. Różnice w odpowiedziach, w zależności od płci oraz wieku respondentów, były nieistotne statystycznie. Druga część ankiety miała na celu oszacowanie spożywania przez ankietowane osoby produktów będących źródłami fruktanów. Respondentów poproszono o podanie informacji obejmujących tydzień poprzedzający badanie. Uzyskane wyniki przeanalizowano osobno dla osób, które uprzednio zadeklarowały posiadanie bądź też nie posiadanie wiedzy na temat fruktanów. Pierwszą grupę stanowiły osoby deklarujące znajomość definicji i roli fruktanów. W codziennej diecie kobiet źródłem fruktanów okazały się być kawa z dodatkiem cykorii (np. kawy śniadaniowe Ricore, Caro), preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę (np. Xena, Slim coffee) oraz cebula. Codzienna dieta mężczyzny, nakierowana na dostarczenie fruktanów, opierała się głównie na spożywaniu czosnku oraz cebuli. Częstotliwość spożycia poszczególnych źródeł fruktanów w całotygodniowej diecie zaprezentowano w Tab. 1. Płeć okazała się być czynnikiem istotnie różnicującym badaną grupę zarówno pod względem wyboru źródeł fruktanów jak i częstotliwości ich spożywania wraz z tygodniową dietą. 250 Oszacowanie pożycia produktów zawierających fruktany... Osoby, które uprzednio zadeklarowały brak wiedzy na temat fruktanów, z codzienną dietą dostarczały tych związków z: czosnku, cebuli oraz kawy z dodatkiem cykorii (np. kawy śniadaniowe Ricore, Caro). Wśród ogółu respondentów, najrzadziej spożywanymi produktami były: cykoria, karczochy oraz syrop z agawy. Płeć respondentów okazała się ponownie być czynnikiem istotnie różnicującym badaną grupę zarówno pod względem wyboru źródeł fruktanów w diecie jak i częstotliwości ich spożywania wraz z tygodniową dietą. Źródło fruktanów codziennie 5-6 razy 3-4 razy 1-2 razy ani razu A A A A A B B B B B A = kobiety, które zadeklarowały posiadanie wiedzy na temat fruktanów, B = kobiety, które zadeklarowały brak wiedzy na temat fruktanów cebula 1 8 0 3 12 24 12 22 1 3 czosnek 0 1 0 2 2 5 16 34 8 18 por 0 1 0 0 6 3 10 28 10 28 cykoria 0 0 0 0 3 2 2 2 21 56 karczoch 0 0 0 0 0 0 2 3 24 57 szparagi 0 0 0 1 3 2 10 17 13 40 kawa z dodatkiem cykorii 3 5 2 3 3 1 4 7 14 44 syrop z agawy 0 0 0 1 0 1 2 0 24 58 preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę 2 0 0 0 1 0 0 2 23 58 A = mężczyźni, którzy zadeklarowali posiadanie wiedzy na temat fruktanów, B = mężczyźni, którzy zadeklarowali brak wiedzy na temat fruktanów cebula 3 4 3 7 4 17 4 31 3 4 czosnek 3 4 2 1 4 11 3 24 5 23 por 1 0 0 0 3 7 5 26 8 30 cykoria 0 0 0 0 1 0 2 6 14 57 karczoch 0 0 0 0 0 0 5 3 12 60 szparagi 0 0 0 1 0 2 5 14 12 46 251 Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik kawa z dodatkiem cykorii 0 4 0 1 0 1 2 4 15 53 syrop z agawy 0 0 0 0 0 0 0 1 17 62 preparaty wspomagające odchudzanie zawierające inulinę 0 0 0 0 0 0 3 0 14 63 Tab. 1. Częstotliwość spożycia produktów będących źródłem fruktanów, wśród ankietowanych kobiet i mężczyzn, zależnie od posiadanej wiedzy na temat fruktanów Dzienne pobranie niewchłanianych fruktanów jest trudne do oszacowania, ponieważ zależy od ich typu oraz cech indywidualnych osób, które je spożywają. Jednym z najczęściej spożywanych przez respondentów źródeł fruktanów była cebula, której średnie spożycie w Polsce kształtuje się na poziomie około 20 g/dobę. Biorąc pod uwagę zawartość FOS (fruktoologisacharydów) w 100 g białej cebuli [Bartnikowska 2010], można przyjąć, iż codzienne spożywanie surowej, suszonej oraz gotowanej cebuli białej dostarczy organizmowi odpowiednio około 0,22-1,5 g; 0,94-6,38 g; 0,16-1,06 g FOS. Uważa się, że dawka FOS, korzystnie działająca na organizm człowieka wynosi 3-6 g na dobę, a w szczególnych przypadkach do 10 g [Sucharzewska 2007]. Niemniej jednak, dotychczas w Polsce nie podjęto próby oszacowania spożycia fruktanów z całodziennej racji pokarmowej. Liczne badania wskazują zaś na niedostateczne spożycie błonnika ogółem [Bolesławska i Przysławski 2007; Górecka i in. 2011; Szczepańska i in. 2010, 2011; Wyka i Żechałko-Czajkowska 2007]. Na podstawie badań Moshfegha i in. [1999] oszacowana została zwyczajowo spożywana całodobowa racja pokarmowa dorosłych Amerykanów, która wynosiła średnio ok. 2,6 g inuliny i 2,5 g oligofruktozy. Najbogatszym źródłem fruktanów w diecie Amerykanów były pszenica oraz cebula. Natomiast spożycie fruktanów wśród mieszkańców Europy Zachodniej jest nieco wyższe. Roberfroid i Slavin [2000] wykazali, że zwyczajowo spożywana całodobowa racja pokarmowa dorosłych Europejczyków zawierała 3,2-11,3 g fruktanów. Ich głównymi źródłami były: zupa cebulowa, pory, czosnek. Wyniki przeprowadzonego badania są potwierdzeniem rezultatów przytoczonych badań pod względem preferencji wyboru źródeł fruktanów w diecie. Istnieje potrzeba dalszej analizy spożywania tych produktów, w celu oszacowania dziennego spożycia ogółu fruktanów przez Polaków. WNIOSKI • Przeprowadzone badania wskazują, iż tylko 30% kobiet i niewiele ponad 20% mężczyzn potrafi wyjaśnić, czym są fruktany, zaś zaledwie 13% kobiet oraz 16% mężczyzn zdołała wskazać prozdrowotne właściwości fruktanów. 252 Oszacowanie pożycia produktów zawierających fruktany... • Płeć była czynnikiem istotnie determinującym poziom wiedzy respondentów. • Najczęściej spożywanymi produktami, będącymi źródłem fruktanów, były cebula, czosnek oraz kawa z dodatkiem cykorii. • Kobiety istotnie częściej spożywały produkty zawierające fruktany, aniżeli mężczyźni. LITERATURA Bartnikowska E. 2010. Co producent i konsument powinni wiedzieć o fruktanach. Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 2: 12-16. Bolesławska I., Przysławski J. 2007. Analiza sposobu żywienia kobiet i mężczyzn w zróżnicowanych wiekowo okresach życia – energia oraz składniki podstawowe. Roczniki PZH, 58(1): 171-176. Cieślik E. 2004. Cechy funkcjonalne żywności pochodzenia roślinnego. VI Krajowe Warsztaty Żywieniowe. Postępy w epidemiologii i ocenie żywności funkcjonalnej. Sesja I, str. 11-12. Cieślik E., Siembida A. 2010. Fruktany i ich występowanie w roślinach uprawnych. Postępy nauk rolniczych, 4: 65-78. Cieślik E. Gębusia A. 2011. Żywność funkcjonalna z dodatkiem fruktanów. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2(75): 27-37. Górecka D., Janus P. i in. 2011. Analiza spożycia błonnika pokarmowego i jego frakcji w Polsce w ostatnim dziesięcioleciu w oparciu o dane GUS. Problemy Higieny i Epidemiologii, 92(4): 705-708. Moshfegh A.J., Friday J.E. i in. 1999. Presence of inulin and oligofructose in the diets of Americans. Journal of Nutrition, 129: 1407-1411. Roberfroid M.B., Slavin J. 2000. Nondigestible oligosaccharides. Critical Review in Food Science and Nutrition, 40: 461-480. Roberfroid M.B. 2007. Inulin-Type Fructans: Functional Food Ingredients. Journal of Nutrition, 137: 2493-2502. Sucharzewska D. 2007. Właściwości i przydatność fruktanów do produkcji wyrobów ciastkarskich. Przegląd Piekarski i Cukierniczy, 7: 59-31. Szczepańska J., Wądołowska L. i in. 2010. Ocena częstości spożycia wybranych źródeł błonnika pokarmowego oraz ich związku z masą ciała studentów. Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XLIII, 3: 382- 390. 253 Agnieszka Siembida, Anna Kościej, Lidia Duda, Ewa Cieślik Szczepańska J., Wądołowska L. i in. 2011. Badanie wpływu częstości spożycia wybranych źródeł błonnika na skład ciała studentek. Problemy Higieny i Epidemiologii, 92: 103-109. Wyka J., Żechałko-Czajkowska A. 2007. Ocena sposobu żywienia studentów I roku Akademii Rolniczej we Wrocławiu. Roczniki PZH, 58(1): 327-332. Adres do korespondencji: prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik, mgr inż. Agnieszka Siembida, mgr inż. Anna Kościej, inż. Lidia Duda Małopolskie Centrum Monitoringu Żywności Katedra Technologii Gastronomicznej i Konsumpcji Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Ewa Cieślik 254 Dagmara Stangierska Monika Świątkowska EPISTEME 14/2012 s.255-262 ISSN 1895-4421 WYBRANE DETERMINANTY DECYZJI PODEJMOWANYCH PRZEZ KONSUMENTÓW NA RYNKU USŁUG GASTRONOMICZNYCH NA PRZYKŁADZIE McDONALD’S SELECTED DETERMINANTS OF CONSUMER’S DECISION ON THE FOODSERVICE MARKET – CASE McDONALD’S Abstrakt. W artykule przedstawiono wpływ wybranych czynników na decyzje konsumentów a rynku usług gastronomicznych ze szczególnym uwzględnieniem McDonald’s.Na podstawie wyników badań pierwotnych zrealizowanych w 2010 roku w formie zogniskowanych wywiadów grupowych wykazano, iż jakość oraz walory smakowe potraw serwowanych w lokalach McDonald’s należą do głównych przyczyn korzystania z usług tej sieci. W opinii klientów, sieć McDonald’s wyróżnia się powtarzalnością, przejawiającą się w stałej jakości produktów oraz zunifikowanym menu całej sieci. Wyniki badań wykazują, iż produkty oferowane w tej sieci są postrzegane jako niezdrowe, ale jednocześnie smaczne. Inne badania dotyczące sektora fast food potwierdzają, że jakość potraw oraz ich walory sensoryczne są czynnikami istotnie wpływającymi na decyzję konsumentów. Słowa kluczowe: usługi gastronomiczne, jakość, smak, McDonald’s Summary. The paper presents influence of selected determinants on consumer choice on the foodservice market. The results of primary research performed in 2010 in the form of focus group interviews showed that the quality and taste of meals offered by McDonald’s are the most important factors in choosing the services of this catering net. In the opinion of clients, McDonald’s network is distinguished by repeatability manifested in the constant quality of products and the unified menu across the network. The results show that the products offered at McDonald’s are considered as unhealthy , but tasty. Other studies on the fast food sector confirms that the quality of meals as well as their sensory attributes significantly influence the decision of consumers. Key words: foodservice, quality, taste, McDonald’s 255 Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska WSTĘP Postępująca serwicyzacja życia społeczeństwa powoduje coraz częstsze spożywanie posiłków poza domem. W ostatnich latach miał miejsce wzrost liczby transakcji przeprowadzonych w placówkach żywienia poza domem. W 2009 roku klienci indywidualni dokonali ponad 3 mld transakcji. Prognoza platformy Datamonitor [2010] na 2014 rok wskazuje, że liczba transakcji w placówkach żywienia poza domem może osiągnąć wartość 3,5 mld. W 2009 roku sektor fast food z udziałem na poziomie 39% zajmował drugą pozycję po sektorze restauracji pod względem udziałów w wartości rynku usług gastronomicznych w Polsce [Datamonitor 2010]. Mając na uwadze opisane powyżej trendy, zakłady gastronomiczne chcąc odnieść sukces na rynku muszą sprostać oczekiwaniom konsumentów poprzez oferowanie produktów atrakcyjnych o satysfakcjonującej jakości. Pojęcie jakości nie jest jednoznaczne z uwagi na jego wieloaspektowość. W literaturze można spotkać się z dwoma głównymi sposobami definiowania jakości. Pierwsze z nich utożsamia jakość produktu z jego cechami i własnościami, drugie zaś odwołuje się do określenia jakości jako stopnia zaspokojenia potrzeb użytkownika przez produkt. Na potrzeby niniejszego opracowania bardziej adekwatne jest podejście drugie, którego centralnym punktem jest utrzymanie stałej jakości surowców i powtarzalności w procesie technologicznym, co gwarantuje utrzymanie jakości produktu końcowego [Jeznach, 2008]. W tym ujęciu można mówić o jakości jako o powtarzalności, stałości parametrów procesów, cech produktów. Z drugiej strony, trudno jest określić jakie standardy są stawiane wobec jakości usługi, w tym usługi gastronomicznej, ponieważ percepcja jest kształtowana pod wpływem doświadczeń oraz oczekiwań konsumenta [Czarnecka-Skubina 2006]. Na poziom satysfakcji z usługi gastronomicznej istotnie wpływają walory sensoryczne dań, do których zalicza się: smak, zapach, wygląd zewnętrzny oraz konsystencję [Gawęcki i Mossor-Pietraszewska 2004]. Cechy sensoryczne są oceniane za pomocą zmysłów: wzroku, węchu, dotyku i smaku. Preferencje sensoryczne zależą od wrażliwości oraz indywidualnych upodobań konsumentów [Procner 2009]. McDonald’s jest jedną z najbardziej rozpoznawalnych marek gastronomicznych na polskim rynku. W ostatnich latach koncern McDonald’s promuje się poprzez podkreślanie standardów jakości oraz walorów sensorycznych swoich potraw. Celowe jest zatem poznanie opinii konsumentów na temat jakości oraz cech produktów serwowanych w lokalach tej sieci. 256 Wybrane determinanty decyzji podejmowanych przez konsumentów... MATERIAŁY I METODYKA W pracy zostały wykorzystane dane pierwotne pochodzące z badań jakościowych zrealizowanych w formie zogniskowanych wywiadów grupowych z konsumentami odwiedzającymi placówki McDonald’s. W ramach badań przeprowadzono 6 zogniskowanych wywiadów zrealizowanych w mini‑grupach (5-6 osobowych) w okresie od lutego do maja 2010 roku. W badaniu uwzględniono zarówno grupy jednorodne pod względem płci i wieku (grupy 1,2,4,5),jak również grupy mieszane (grupy 3 i 6) [Tab. 1]. Badanie zrealizowano w Warszawie, a uczestnicy zostali pozyskani metodą kuli śnieżnej. Metoda ta przyczyniła się do większej homogeniczności badanych grup pod względem sytuacji życiowej i zawodowej badanych. W przypadku grupy wiekowej 20-29 lat uczestnicy badania w większości byli studentami SGGW, natomiast badani powyżej 30 roku życia zazwyczaj posiadali wyższe wykształcenie, byli aktywni zawodowo oraz prawie wszyscy mieli dzieci. Charakterystyka uczestników badania była podobna w grupach mieszanych i jednorodnych pod względem płci. W doborze uczestników kierowano się wyłącznie dwoma kryteriami: wieku i płci. Uczestnicy Liczba uczestników Stosowane oznaczenie 1 Kobiety, 20-29 lat 6 K 20-29 2 Mężczyźni, 20-29 lat 6 M 20-29 3 Kobiety i Mężczyźni 20-29 lat 6 k- kobieta, m-dla mężczyzna, K+M 20-29 lat 4 Kobiety, powyżej 30 lat 5 K>30 5 Mężczyźni, powyżej 30 lat 5 M>30 6 Kobiety i Mężczyźni, powyżej 30 lat 6 k-kobieta, m-dla mężczyzna, K+M>30 Tab. 1. Charakterystyka badanych grup. Źródło: badania własne, 2010 Wywiady grupowe przeprowadzono w oparciu o specjalnie opracowany scenariusz, który umożliwił uzyskanie informacji na temat sposobu postrzegania firmy McDonald’si jej oferty przez konsumentów. Ze względu na charakter badań jakościowych, analiza wyników miała również charakter jakościowy [Maison 2010]. 257 Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska WYNIKI BADAŃ I ICH DYSKUSJA Jakość i powtarzalność produktów w McDonald’s. Większość uczestników badania była zdania, że McDonald’s wyróżnia się identyczną jakością oferowanych produktów, niezależnie od lokalu czy miasta. Badani uważali to za bardzo istotną cechę, ponieważ niezależnie od restauracji zamówiony produkt zawsze jest taki sam, co daje poczucie komfortu i bezpieczeństwa. Uczestnicy badania twierdzili, że ważna jest również dostępność lokali oraz zunifikowany charakter zarówno sposobu obsługi, jak i wystroju lokali. Wskazano, że restauracje przy większych trasach są dobrze oznaczone, co poza stałą jakością serwowanych potraw, zwłaszcza według mężczyzn po 30 roku życia, jest ważnym czynnikiem wyboru tych restauracji jako miejsca przerwy obiadowej w trakcie podróży czy wyjazdów. Natomiast większość kobiet zwracała uwagę na wysoki poziom czystości i schludny ubiór personelu w restauracjach McDonald’s. Wypowiedź Grupa W różnych miastach ten sam produkt smakuje tak samo K 20-29 McDonald’s jest to „dobra” jakość produktów, jest ogólnie dostępny, bezpieczny i komfortowy. M 20-29 W McDonald’s wiem przynajmniej jak dana potrawa smakuje i nie będę zaskoczona K>30 W McDonald’s zawsze smakuje tak samo. M>30 Zawsze ten sam na całym świecie, lubię, że jest przewidywalny. k,K+M>30 Tab. 2. Opinie uczestników badania dotyczące jakości i powtarzalności produktów w McDonald’s. Źródło: badania własne, 2010 Warto w tym miejscu przytoczyć inne badania charakteryzujące jakość dań dostępnych w lokalach gastronomicznych. Z badań Nowaka i wsp. [2008] wynika, że w grupach wiekowych ze zbliżonego przedziału wiekowego co w badaniach własnych, jakość posiłku była postrzegana jako cecha bardzo ważna przez osoby w wieku 30-39 lat 68,4 % (sumy ocen przyznanych temu atrybutowi) i 20-29 lat (64,4 %). Ponadto więcej mężczyzn (18,25 %) niż kobiet (11,1 %) uznało ten atrybut za nieważny, natomiast za ważny - więcej kobiet (30,1 %) niż mężczyzn (19,3 %). Wyniki badań Dąbrowskiej [2010] potwierdzają, że dla Polskich konsumentów jakość jest drugim najważniejszym po cenie czynnikiem wyboru produktów żywnościowych. Wyniki badań Adamczyk [2005] potwierdzają popularność korzystania z lokali typu fast food podczas podróży, zarówno krajowych, jak i zagranicznych. Prawie 3/4 respondentów deklarowało korzystanie z usług tego typu placówek podczas wyjazdów. Respondenci podkreślali przy tym, że głównym powodem ich wyboru jest szybkość obsługi, oraz lokalizacja. 258 Wybrane determinanty decyzji podejmowanych przez konsumentów... Cechy potraw serwowanych w McDonald’s. Większość osób uczestniczących w wywiadach, poproszona o podanie skojarzeń związanych z firmą McDonald’s, używała określeń odnoszących się w głównej mierze do samych restauracji oraz potraw w nich oferowanych. Badani we wszystkich grupach zauważali, że jest to globalna sieć restauracji oferujących dania typu fast food. Mówiąc o McDonald’s uczestnicy badania najpierw skupiali się na cechach i rodzaju oferowanych produktów, a następnie na elementach towarzyszących usłudze gastronomicznej. Produkty dostępne w restauracjach McDonald’s są określane przez większość respondentów jako niezdrowe, bardzo kaloryczne, o wysokiej zawartości tłuszczu. Określenia używane przez badanych w kontekście wartości odżywczej potraw serwowanych w restauracjach McDonald’s mają często charakter negatywny, a takie podejście jest częściej reprezentowane przez kobiety. Pomimo, iż większość badanych uważała produkty oferowane w McDonald’s za niezdrowe, jednocześnie twierdzili, że dania tam oferowane są smaczne. Badane osoby można podzielić na dwie grupy. Grupę pierwszą stanowiły osoby odwiedzające restauracje McDonald’s ze względu na rodzaj serwowanych produktów, zamawiające zestawy, porcje większe objętościowo jako substytut jednego z posiłków (np. obiadu), natomiast grupę drugą - osoby traktujące posiłki w lokalach McDonald’s jako rodzaj przekąski (lody, ciastka, frytki, shake). Grupę pierwszą stanowili głównie młodsi mężczyźni, a w skład grupy drugiej weszły przede wszystkim kobiety. Wypowiedź Grupa Ludzie uzależniają się od jedzenia z McDonalda. Nie zdają sobie sprawy, że jest niezdrowy. K 20-29 Jem tylko wybrane produkty, nigdy nie chodzę do Mc na obiad. K 20-29 Jest bardzo kaloryczne i dlatego jak zjem mam wyrzuty sumienia. k,K+M 20-29 Według mnie jedzenie w McDonald’s jest pyszne. m,K+M 20-29 Lubię tam ciasteczka, reszta mi nie odpowiada. k,K+M>30 W McDonald’s jest bardzo tłuste jedzenie m,K+M>30 Tab. 3. Opinie uczestników badania dotyczące cechy potraw serwowanych w McDonald’s. Źródło: badania własne, 2010 Badania Kowalczuk [2010] wykazały , iż głównym powodem korzystania z oferty usług gastronomicznych jest smak dań (54,3%) na drugiej pozycji znajdowała się cena (49,8%). W tych samych badaniach ankietowani jako jeden z najmniej istotnych powodów żywienia poza domem wskazali wysoką wartość odżywczą dań (3,9%) oferowanych w lokalach gastronomicznych. W badań Prybutok i wsp. [2010] wykazano największą zależność pomiędzy 259 Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska takimi cechami jak: świeżość, atrakcyjność wizualna i sensoryczna, a także szerokość asortymentu oferowanych potraw oraz napojów, a satysfakcją klientów z usługi gastronomicznej. Zbliżone opinie na temat czynników wpływający na decyzje konsumentów na rynku usług gastronomicznych uzyskał w swoich badaniach Geissler [2010] respondenci za najważniejsze uznali jakość i cechy sensoryczne żywości (53%), następnie cenę (17%), bardzo ważna okazała się też różnorodność asortymentu (11%) zajmując trzecią pozycję.W badaniach Adamczyk [2005] konsumenci za najbardziej istotny czynnik decydujący o wyborze restauracji typu fast food uznali smakowitość serwowanych dań, a także różnorodność i duży wybór potraw. Ponadto w tym samym badaniu respondenci jako negatywne atrybuty dań typu fast food podkreślali ich niezdrowy charakter. Wyniki przytoczonych badań są zbieżne z uzyskanymi w badaniach własnych, a mianowicie konsumenci w pierwszej kolejności zwracają uwagę na cechy hedonistyczne żywności oferowanej w lokalach gastronomicznych (atrakcyjność sensoryczną ), w dalszej kolejności maja znaczenie cechy utylitarne takie jak wartość odżywcza. WNIOSKI W porównaniu do innych firm z sektora gastronomicznego, McDonald’s charakteryzuje się największą rozpoznawalnością wśród konsumentów. W opinii klientów, sieć McDonald’s wyróżnia się powtarzalnością usługi gastronomiczne, przejawiającą się w stałej jakości produktów oraz zunifikowanym menu całej sieci. Jakość jest pozytywnym atrybutem usług oferowanych przez firmę McDonald’s. Cechy serwowanych produktów są kolejnym elementem charakteryzującym firmę. Dania dostępne w tej sieci są postrzegane jako smaczne, ale też niezdrowe. Konsumenci charakteryzują potrawy serwowane w lokalach McDonald’s zarówno poprzez określenia odnoszące się do wartości odżywczej, jak i walorów sensorycznych. Należy zauważyć, że pomimo dominującej negatywnej opinii na temat wartości odżywczej potraw serwowanych w McDonald’s ich walory sensoryczne są oceniane pozytywnie. 260 Wybrane determinanty decyzji podejmowanych przez konsumentów... LITERATURA Adamczyk G. 2005. Popularność restauracji typu fast food wśród mieszkańców Poznania. Stowarzyszenie Ekonomistów Rolnictwa i Agrobiznesu. Roczniki Naukowe t. VII, z.3: 7-11 Czarnecka-Skubina E. 2006. Jakość usługi gastronomicznej w aspekcie żywieniowym, technologicznym i higienicznym. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. nr 46: 25 – 34 Datamonitor 2010. Foodservice in Poland. Industry Profile. Wyd. Datamonitor, Londyn Dąbrowska A. 2010. Consumer behaviour in the market of catering services in selected countries of Central-Eastern Europe. British Food Journal t. 113, nr 1: 96-108 Gawęcki J., Mossor-Pietraszewska T. 2004. Kompendium wiedzy o żywności, żywieniu i zdrowiu. PWN, Warszawa, s. 23-56 Geissler G. L. 2010. Healthy food At work? An examination of a proposed catering service conept. Journal of Food Products Marketing, nr 16: 350-360 Jeznach M. 2008. Uwarunkowania ekonomiczno-organizacyjne i bezpieczeństwa żywności. Wyd. SGGW, Warszawa, s. 32-41 jakości Kawa M. 2008. Oddziaływanie marki na decyzje zakupowe konsumentów. Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Szczecińskiego, nr 510: 223-230 Kowalczuk I. 2010. Oferta usługowa a oczekiwania konsumentów na rynku usług gastronomicznych, w: Gastronomia w ofercie turystycznej regionu, red. Z. J. Dolatowski, D. Kołożyn-Krajewska, Wyd. Wyższa Szkola Hotelarstwa i Turystyki w Częstochowie, Częstochowa, s. 224-246 Maison D. 2010. Jakościowe metody badań marketingowych. Jak zrozumieć konsumenta. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, s. 14-23 Nowak M. i wsp. 2008. Pozycja jakości posiłków wśród czynników kształtujących preferencje nabywców usług gastronomicznych. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, nr 3: 132-40 Procner A. 2009. Technologia gastronomiczna z towaroznawstwem. cz. 1. WSIP, Warszaw, s. 37-48 Prybutok V. R. i wsp. 2010. Perceived service quality in fast-food restaurants: empirical evidence from China. International Journal of Quality & Reliability Management t. 27, nr 4: 424-437 261 Dagmara Stangierska, Monika Świątkowska Adres do korespondencji: mgr inż. Dagmara Stangierska, dr Monika Świątkowska Katedra Organizacji i Ekonomiki Konsumpcji Wydział Nauk o Żywieniu Człowieka i Konsumpcji Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie ul. Nowoursynowska 166, 02-787 Warsaw e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Barbara Kowrygo 262 Agnieszka Staszowska Anna Litwińczuk Monika Kędzierska Piotr Skałecki EPISTEME 14/2012 s.263-268 ISSN 1895-4421 ZAWARTOŚĆ MIKRO- I MAKROELEMENTÓW W TKANCE MIĘŚNIOWEJ WYBRANYCH GATUNKÓW RYB Z MORZA BAŁTYCKIEGO CONTENT OF MICRO- AND MACROELEMENTS IN THE MUSCLE TISSUE OF SELECTED FISH SPECIES FROM THE BALTIC SEA Abstrakt. Mięso ryb jest uznawane za wysokowartościowe pod względem odżywczym oraz łatwo strawne. Jednak spożycie ryb w Polsce jest niższe w porównaniu z większością krajów Unii Europejskiej. Największą popularnością wśród Polaków cieszą się ryby morskie. Celem pracy była ocena zawartości mikro- i makroelementów w mięsie trzech gatunków ryb morskich – dorsza, gładzicy i śledzia. Badaniami objęto łącznie 60 ryb pozyskanych w Morzu Bałtyckim, po 20 osobników każdego gatunku. W pobranych próbach oznaczono zawartość mikro- i makroelementów techniką płomieniowej atomowej spektrometrii absorpcyjnej z wykorzystaniem spektrometru SOLAR 939 (Unicam). Porównując zawartość składników mineralnych wykazano, że mięso pochodzące z dorsza okazało się najlepszym źródłem Fe, natomiast najwyższe stężenie Cu, Mn, Zn oraz Na oznaczono w mięsie gładzicy. Biorąc pod uwagę pozostałe makroelementy (Mg, Ca, K) stwierdzono ich najwyższą zawartość w mięsie śledzi. Słowa kluczowe: ryby morskie, mięso, mikroelementy, makroelementy Summary. Fish meat is considered as highly nutritive and easily digested. However, the fish consumption in Poland is lower than in majority countries European Union. Among Polish consumers the sea fish are the most popular. The aim of this work was to evaluate the content of micro- and macroelements in meat of 3 species of sea fish: cod, plaice, herring. The study was conducted on a total of 60 fish obtained from the Baltic Sea, i.e.: 20 fish from each species. Micro- and macroelements were determined with the usage of the flame atomic absorption spectrometry (SOLAR 939 Unicam Spectrometer). Comparing the mineral content it has been shown that meat obtained from cod was the best source of Fe, whereas the highest concentration of Cu, Mn, Zn and Na was found in the meat of plaice. The highest amounts of other macroelements (Mg, Ca, K) were determined in the herring’s meat. Key words: sea fish, meat, microelements, macroelements 263 Agnieszka Staszowska, Anna Litwińczuk, Monika Kędzierska, Piotr Skałecki WSTĘP Właściwości żywieniowe ryb i produktów rybnych czynią je bardzo cennymi artykułami spożywczymi, które korzystnie wpływają na organizm człowieka. Ryby, zwłaszcza morskie, są źródłem nie tylko niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych i pełnowartościowego białka, ale również składników mineralnych [Łuczyńska i in. 2011; Usydus i in. 2011]. Spożycie ryb w Polsce jest znacznie niższe w porównaniu z większością krajów Unii Europejskiej. W 2008 roku wynosiło zaledwie 13,01 kg/osobę, natomiast średnie spożycie ryb na świecie około 30 kg/osobę [Seremak-Bulge i in. 2008]. Niewielka konsumpcja ryb i produktów rybnych może wynikać z braku odpowiedniej informacji dla konsumenta dotyczącej ich wysokiej wartości odżywczej. Mimo to, jak pokazują badania Trondsen i in. [2004] konsumenci generalnie uważają, że spożycie ryb jest zdrowe. Zatem ze względu na wzrost świadomości konsumentów, zwiększa się zainteresowanie spożywaną żywnością, jej składem i pochodzeniem. Ryby, głównie morskie, ze względu na bogactwo składników odżywczych (PUFA, białko o wysokiej wartości odżywczej, witaminy i składniki mineralne) zalecane są w diecie każdego człowieka, a w szczególności w diecie osób zagrożonych chorobami serca i układu krążenia [Grela i in. 2010]. Według Górskiej-Warsewicz [2007] w strukturze preferencji ryb najwyższą pozycję zajmuje karp (20,4 % wskazań), następnie makrela (19,9 %), śledź (17,4 %), dorsz (16,6 %), łosoś (13,8 %), mintaj (13,5 %) oraz panga (13 %). Najczęściej konsumenci wybierają ryby mrożone – 90 % deklaracji, następnie ryby wędzone (86 %) i konserwy rybne (85 %). Ryby świeże natomiast spożywane są najczęściej przez ludność miejską. Powodów takiego stanu rzeczy należy upatrywać w dostępności tego typu asortymentu w sieciach handlowych. Dodatkowym czynnikiem ograniczającym spożycie ryb świeżych są limity połowowe na Bałtyku, dotyczy to głównie droższych gatunków ryb (dorszy, łososi). Dlatego jadłospis uzupełniają przetwory rybne, które są obecne na rynku przez cały rok [Skałecki i in. 2008]. Skład mięsa ryb zarówno pod względem ilościowym jak i jakościowym jest zróżnicowany. Wpływa na to wiele czynników, takich jak: gatunek, wiek, miejsce żerowania i rodzaj spożywanego pożywienia, a także czas i sposób połowu oraz czynniki związane z transportem [Rywotycki 2005]. Celem podjętych badań była ocena zawartości mikro- i makroelementów w mięsie trzech gatunków ryb z Morza Bałtyckiego – dorsza, gładzicy i śledzia. 264 Zawartość mikro- i makroelementów w tkance mięśniowej wybranych gatunków ryb... MATERIAŁ I METODY Materiał badawczy stanowiły trzy gatunki ryb: dorsz (Gadus morhua callarias), gładzica (Pleuronectes platessa) i śledź (Clupea harengus membras). Łącznie badaniami objęto 60 ryb, po 20 osobników każdego gatunku. Ryby zostały odłowione w Morzu Bałtyckim w 2010 roku. W celu oznaczenia składników mineralnych pobrane próbki mięsa ryb poddano mineralizacji na mokro w mieszaninie HNO3 i HClO4 zgodnie ze standardami AOAC 986.15 [2000]. W zmineralizowanych próbach oznaczono zawartość mikroelementów: cynku, żelaza, manganu i miedzi oraz makroelementów: potasu, sodu, wapnia, magnezu. Analizę mikro- i makroelementów przeprowadzono techniką płomieniowej atomowej spektroskopii absorpcyjnej (płomień powietrze-acetylen) przy użyciu spektrometru SOLAR 939 (Unicam) z zastosowaniem korekcji tła w czasie analizy oraz z uwzględnieniem limitu oznaczalności (LOQ) oraz limitu wykrywalności (LOD). W celu wyeliminowania oddziaływania fosforu, podczas analizy zawartości wapnia, do wszystkich próbek oraz wzorców dodawano chlorek lantanu. Oznaczenie ilościowe zostało przeprowadzone metodą krzywej wzorcowej. Analiza została wykonana przez Centralne Laboratorium Agroekologiczne w Lublinie. Otrzymane wyniki wyrażono w mg · kg–1 świeżej masy. Analizę statystyczną wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, wykorzystując program StatSoft STATISTICA ver. 6.0. Istotność różnic pomiędzy średnimi w poszczególnych grupach zweryfikowano testem rozstępu Duncana na poziomie istotności α = 0,01 i α = 0,05. WYNIKI I DYSKUSJA Analizując zawartość mikroelementów (Tab. 1) w mięsie badanych ryb stwierdzono, że zawartość miedzi kształtowała się na poziomie 1,16 mg · kg–1 (gładzica), 1,13 mg · kg–1 (dorsz) i 0,89 mg · kg–1 (śledź). Nieco niższe stężenie miedzi w mięsie podaje Polak-Juszczak [2009], w zakresie 0,45 – 0,70 mg · kg–1 dla śledzia oraz 0,12 – 0,25 mg · kg–1 dla dorsza. Zbliżone wyniki do uzyskanych przez Polak-Juszczak [2009] podaje również Szlinder-Richert [2011]. Zawartość manganu w mięśniach badanych ryb mieściła się w granicach od 1,07 mg · kg–1 (dorsz) do 1,61 mg · kg–1 (gładzica). Znacznie niższy zakres zawartości manganu dla mięsa śledzia pochodzącego także z Morza Bałtyckiego podaje Tahvonen i in. [2000] 0,30 – 0,63 mg · kg–1. Omawiając poziom cynku w mięsie badanych ryb stwierdzono jego najwyższe stężenie w przypadku gładzicy, podobnie jak miedzi i manganu. Badania przeprowadzone przez Szlinder-Richert [2011] potwierdzają wyniki otrzymane dla mięsa śledzia, natomiast w przypadku mięsa dorsza zarówno Szlin265 Agnieszka Staszowska, Anna Litwińczuk, Monika Kędzierska, Piotr Skałecki der-Richert [2011] jak i Polak-Juszczak [2009] podają niższe zawartości, odpowiednio 4,7 mg · kg–1 oraz 3,97 – 5,15 mg · kg–1. 1 1.0.0.1 Wyróżnienie Cu Mn Zn Fe [mg · kg świeżej masy] / [mg · kg wet weight] –1 –1 Dorsz Gadus morhua callarias x s 1,13 0,09 1,07 0,17 6,81 0,92 9,54 2,87 Gładzica Pleuronectes platessa x s 1,16 0,13 1,61 0,41 10,25 1,50 8,58 1,28 Śledź Clupea harengus membras x s 0,89 0,19 1,32 0,53 8,99 1,90 9,34 2,41 Tab. 1. Zawartość mikroelementów w mięsie badanych ryb. Różnice statystycznie istotne: a,b przy P£ 0,05; A,B przy P£ 0,01 Najwyższy poziom żelaza stwierdzono w mięsie dorsza (9,54 mg · kg–1), a najniższy w mięsie gładzicy (8,58 mg · kg–1). W mięsie śledzia zawartość tego pierwiastka wynosiła 9,34 mg · kg–1 i była wyższa w porównaniu z wynikiem uzyskanym przez Tahvonen i in. [2000], natomiast niższa niż podaje Du i in. [2012]. Oceniając stężenie magnezu (Tab. 2) stwierdzono istotnie (P≤0,05) niższą zawartość tego pierwiastka w mięsie dorsza i gładzicy w porównaniu do mięsa śledzia. Mniejsze stężenie magnezu i wapnia w mięsie śledzia bałtyckiego oznaczyli Tahvonen i in. [2000], odpowiednio dla magnezu 282 mg · kg–1 i wapnia 874 mg · kg–1. Stężenie wapnia w tkance mięśniowej śledzi było również przedmiotem badań Szlinder-Richert i in. [2011] oraz Du i in. [2012]. Oznaczyli oni zawartość tego pierwiastka na poziomie, odpowiednio 736 mg · kg–1 oraz 770 mg · kg–1. 2 Mg Wyróżnienie Ca Na K [mg · kg świeżej masy] / [mg · kg wet weight] –1 –1 Dorsz (Gadus morhua callarias) x s 303,14a 22,52 583,69 82,39 545,15A 20,38 2055,80 119,49 Gładzica (Pleuronectes platessa) x s 383,30a 74,88 981,26 127,49 670,18B 67,23 1970,88 160,89 Śledź (Clupea harengus membras) x s 432,38b 52,98 1269,91 735,32 580,94AB 52,02 2242,60 309,13 Tab. 2. Zawartość makroelementów w mięsie badanych ryb. Różnice statystycznie istotne: a,b przy P£ 0,05; A,B przy P£ 0,01 266 Zawartość mikro- i makroelementów w tkance mięśniowej wybranych gatunków ryb... W przypadku zawartości sodu odnotowano istotne (P≤0,01) różnice międzygatunkowe. Najwyższą zawartość sodu stwierdzono w mięsie gładzicy, najniższą natomiast u dorsza. Zawartość potasu nie różniła się istotnie pomiędzy gatunkami i mieściła się w zakresie od 1970,88 mg · kg–1 do 2242,60 mg · kg–1. Wykazana zawartość sodu i potasu w mięsie śledzia mieściła się w zakresach podanych przez Tahvonen i in. [2000] i wynosiła odpowiednio 580,94 mg · kg–1 oraz 2242,60 mg · kg–1. WNIOSKI • Nie wykazano istotnego zróżnicowania zawartości manganu, miedzi, cynku, żelaza oraz wapnia i potasu w tkance mięśniowej ocenianych ryb (dorsza, gładzicy i śledzia). Istotny wpływ gatunku stwierdzono w przypadku sodu i magnezu. • Najwyższy poziom miedzi, manganu, cynku, sodu stwierdzono w mięsie gładzicy, magnezu, wapnia, potasu w mięsie śledzia natomiast poziom żelaza był zbliżony w mięsie dorsza i śledzia. BIBLIOGRAFIA AOAC. 2000. Official Methods of Analysis of the AOAC 986.15. Multielement method. 17th ed. Arlington. Virginia USA Du Z-Y. Zhang J. Wang Ch. Li L. Man Q. Lundebye A-K. Froyland L. 2012. Riskbenefit evaluation of fish from Chinese markets: Nutrients and contaminants in 24 fish species from five big cities and related assessment for human health. Science of the Total Environment, 416: 187-199 Grela E.R. Pisarski R.K. Kowalczuk-Vasiliev E. Rudnicka A. 2010. Zawartość składników odżywczych, mineralnych i profil kwasów tłuszczowych w mięsie wybranych gatunków ryb w zależności od terminu odłowu. Żywność Nauka Technologia Jakość, 4 (71):63-72 Górska-Warsewicz H. 2007. Konsument na rynku ryb i przetworów rybnych. Przemysł Spożywczy, 5: 48-50 Łuczyńska J. Tońska E. Borejszo Z. 2011. Zawartość makro- i mikroelementów oraz kwasów tłuszczowych w mięśniach łososia (Salmo salar l.), pstrąga tęczowego (Oncorhynchus mykiss walb.) i karpia (Cyprinus carpio l.). Żywność Nauka Technologia Jakość, 3 (76): 162-172 Polak-Juszczak L. 2009. Temporal trends in the bioaccumulation of trace metals in herring, sprat, and cod from the southern Baltic Sea in the 1994-2003 period. Chemosphere, 76: 1334-1339 267 Agnieszka Staszowska, Anna Litwińczuk, Monika Kędzierska, Piotr Skałecki Rywotycki R. 2005. Wpływ czynników ilościowo-jakościowych, przetwórczych oraz chłodniczych kształtujących wartości surowców rybnych dla konsumentów, Chłodnictwo, XL (5): 45-48 Seremak-Bulge J. Kuzebski E. Pieńkowska B. Rakowski M. Szostak S. Hryszko K. 2008. Rynek ryb. Stan i perspektywy. Analizy rynkowe. Wydawnictwo IERiGŻ-PIB. Warszawa Skałecki P. Litwińczuk A. Florek M. Kędzierska-Matysek M. Domaradzki P. 2008. Ocena wartości użytkowej i jakości mięsa dwóch gatunków ryb morskich. Roczniki Naukowe Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, 4 (4): 169-174 Szlinder-Richert J. Usydus Z. Malesa-Ciećwierz M. Polak-Juszczak L. Ruczyńska W. 2011. Marine and farmed fish on the Polish market: Comparison of the nutritive value and human exposure to PCDD/Fs and other contaminats. Chemosphere, 85: 1725-1733 Tahvonen R. Aro T. Nurmi J. Kallio H. 2000. Mineral Content in Baltic Herring and Baltic Herring Products. Journal of Food Composition and Analysis, 13: 893-903 Consumption of seafood – the influTrondsen T. Braaten T. Lund E. Eggen A.E. 2004. ����������������������������������� ence of overweight ond health beliefs. Food Quality and Preference, 15: 361-374 Usydus Z. Szlinder-Richert J. Adamczyk M. Szatkowska U. 2011. Marine and farmed fish in the Polish market: Comparison of the nutritional value. Food Chemistry, 126: 78-84 Adres do korespondencji: dr Piotr Skałecki, mgr inż. Agnieszka Staszowska, prof. dr hab. Anna Litwińczuk, dr inż. Monika Kędzierska-Matysek Katedra Towaroznawstwa i Przetwórstwa Surowców Zwierzęcych Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Mariusz Florek 268 Marek Szeląg Karolina Malecka EPISTEME 14/2012 s.269-275 ISSN 1895-4421 WPŁYW PARAMETRÓW TECHNICZNYCH UKŁADU ROBOCZEGO KUTRA NA OGRANICZENIE PRZYROSTU TEMPERATURY I MIGRACJI ZUŻYTYCH CZĄSTEK DO ROZDRABNIANEGO SUROWCA PODCZAS KUTROWANIA INFLUENCE OF TECHNICAL PARAMETERS WORK OF CUTTER ON REDUCING TEMPERATURE RISE AND MIGRATION OF WORN PARTICLES TO THE SHREDDED RAW MATERIAL Abstrakt. W pracy przedstawiono zagadnienia dotyczące kształtowania krawędzi tnących noży kutra w odniesieniu do ilości generowanego ciepła, a także zużywania ściernego i wykruszeniowego, jako efektu procesu kutrowania. Sformułowanie: kształtowanie krawędzi tnących noży, odnosi się do kształtu geometrycznego, a także do struktury materiału, z którego wykonano noże. Za miarę generowanego ciepła przyjęto przyrost temperatury farszu mięsnego, uzyskanego przy stosowaniu: a) oryginalnego kompletu noży i kutra laboratoryjnego, b) kompletu noży według projektu autorskiego i tego samego kutra laboratoryjnego. Na podstawie obrazów mikrostruktury zużytego noża pracującego w kutrze przemysłowym dokonano analizy przyczyn zużycia ściernego powierzchni ostrza oraz powstawania mikropęknięć. Stwierdzono, iż wprowadzenie do mikrostruktury węglików pierwotnych oraz wtórnych sprzyja zwiększaniu odporności na zużycie, ale jednocześnie w przypadku ich niekorzystnej morfologii może skutkować niebezpieczeństwem występowania dużych wykruszeń noża. Słowa kluczowe: kutrowanie, temperatura farszu mięsnego, kształt ostrza zużycie ścierne, migracja cząstek Summary. The paper presents issues concerning design of the cutting edge of knife in relation to heat generated, abrasive wear and cracking, as a result of the cutting process. Formulation: shaping edge of knife, refers to geometric shape and structure material from which knives were made. As a measure of the generated heat adopted rise of meat batter temperature obtained in application of: a) original set of knives and cutter, b) designed by author set of knives and the same cutter. Based on the microstructure of cutter knife was made analysis of the causes of abrasive consumption of blade and formation of micro cracks. It was found that the introduction to microstructure of carbides primary and secondary, influences to increase in resistance to wear, but in case of unfavorable morphology can cause a danger of cracking knife. Key words: cutters, temperature of meat batter, the shape of the blade, wear abrasive, migration of particle 269 Marek Szeląg, Karolina Malecka WSTĘP Kutrowanie jest najważniejszym etapem w procesie produkcji kiełbas drobno rozdrobnionych. Podczas kutrowania następuje rozdrobnienie surowca, wyekstrahowanie i uwodnienie białek mięśniowych, zemulgowanie tłuszczu oraz – w wyniku mieszania i homogenizacji – wyrównanie przestrzennej dyspersji wszystkich składników [Pisula, Pospiecha i inni, 2011]. Podstawowymi czynnikami technicznymi wpływającymi na efekt kutrowania są: prędkość obrotowa noży i misy, kształt geometryczny krawędzi tnącej noży, kąt i stopień zużycia ostrza noży, liczba i sposób zamontowania noży na wale nożowym, stopień wypełnienia misy. Wśród szeregu problemów technologicznych związanych z zabiegiem kutrowania należy wymienić dwa podstawowe: przechodzenie produktów zużycia noży i obudowy do rozdrabnianego surowca oraz wzrost temperatury surowca podczas procesu kutrowania [Dolata 2001, Fabian 2010, ]. Wzrostem temperatury podczas procesu kutrowania zajmuje się wielu autorów [Dolata 1998, Szeląg 2011]. Natomiast problem zużycia ściernego noży i migracji cząstek metalu do farszu mięsnego wciąż oczekuje na badania eksperymentalne i opracowania naukowe charakteryzujące problem w sensie jakościowym i ilościowym. Prace mające na celu obniżenie temperatury rozdrabnianego surowca sprowadzają się do projektowania nowych kształtów elementów roboczych (noży) nie uwzględniając zmian w materiale, z którego są wykonane. W literaturze przedmiotu próżno szukać opracowań na temat migracji zużytych cząstek metalu do rozdrabnianego surowca, a jeśli już gdzieś się spotyka takie opracowania to nie są one poparte wiarygodnymi badaniami naukowymi. Celem badań było: • przeprowadzenie mikrostrukturalnej analizy stali, z której wykonano noże do kutra przemysłowego Kramer Greber (K+G 200) i określenie przyczyn zużycia ściernego, • określenie wpływu kształtu noży kutra na ograniczenie przyrostu temperatury sporządzanego farszu mięsnego, • zaprojektowanie nowego kształtu ostrza noża, z równoczesnym wyborem materiału i jego struktury wpływającego na obniżenie temperatury podczas kutrowania oraz na zmniejszenie intensywności zużywania połączonego z migracją zużytych cząstek metalu do farszu mięsnego. MATERIAŁ I METODY Badania podzielone zostały na dwie części. Pierwsza dotyczyła analizy mikrostrukturalnej noża kutra przemysłowego, a druga zaprojektowania, wykonania i przeprowadzenia badań laboratoryjnych na autorskich nożach do 270 Wpływ parametrów technicznych układu roboczego kutra... kutra laboratoryjnego. Analizę mikrostrukturalną stali, z której wykonano noże do kutra przemysłowego przeprowadzono w Katedrze Metaloznawstwa i Metalurgii Proszków Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie. Przedmiotem analizy mikrostrukturalnej był nóż pracujący przez cały cykl produkcyjny (6 miesięcy) w zakładzie przemysłowym. Z badanego noża pobrano trzy próbki przez wycięcie materiału w miejscach: 1, 2, 3, leżących w obszarze krawędzi tnącej widocznej na Rys. 1. Rys. 1. Schemat rozmieszczenia pobranych próbek do badań W celu zdiagnozowania przyczyn zużywania ściernego noży dokonano obserwacji powierzchni oraz analizy mikrostruktury na zgładach poprzecznych (prostopadłych do krawędzi ostrza). Otrzymane wyniki i ich analiza posłużyły do doboru odpowiedniego materiału i jego obróbki na zaprojektowane i wykonane noże w części laboratoryjnej badań. W drugiej części badań została przeprowadzona analiza istniejących kształtów ostrza noży do kutra i wykonany projekt autorskiego kształtu ostrza, który miał wpłynąć na obniżenie temperatury rozdrabnianego surowca. Badania polegały na sporządzeniu dwóch jednakowych farszów co do składu surowca i czasu kutrowania z wykorzystaniem dwóch różnych zestawów noży. W czasie kutrowania periodycznie dokonany został pomiar przyrostu temperatury We współpracy z firmą zewnętrzną został wykonany komplet noży do kutra laboratoryjnego według projektu autorskiego i jego efekty pracy porównane z oryginalnym kompletem zamontowanym w kutrze. Badania porównawcze przeprowadzono w Katedrze Przetwórstwa Produktów Zwierzęcych, Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie na kutrze laboratoryjnym MADO Garant MTK 661. W standardowym wyposażeniu kuter ten posiada komplet 3 sztuk noży o kształcie przedstawionym na Rys. 2, jest to kształt jednej linii łukowej. Taki mało agresywny kształt ostrza przyczynia się do wydłużenia czasu kutrowania, ale uzyskany stopień rozdrobnienia farszu nie jest zadowalający. 271 Marek Szeląg, Karolina Malecka Rys. 2. Model przestrzenny oryginalnego noża do kutra laboratoryjnego. Rys. 3. Model przestrzenny autorskiego noża do kutra laboratoryjnego Kształt ostrza zaproponowany przez autora przedstawiony na Rys. 3 składający się z bardziej agresywnych odcinków tworzących linię łamaną wpłynął na skrócenie procesu kutrowania poprzez szybsze uzyskanie porównywalnych parametrów farszu, a przede wszystkim w istotny statystycznie sposób przyczynić się do obniżenia temperatury rozdrabnianego mięsa. WYNIKI I DYSKUSJA Analiza mikrostruktury noża do kutra przemysłowego. Badana stal, z której wykonano nóż kutra przemysłowego charakteryzowała się twardością 500 HV30. Mikrostruktura w obszarze ostrza charakteryzuje się osnową martenzytyczną z wydzieleniami węglików pierwotnych oraz węglików wtórnych tworzących ciągłą siatkę po granicach byłego ziarna byłego austenitu. Pasma węglików pierwotnych są równoległe do powierzchni płaszczyzny noża, co powoduje, że są ułożone prostopadle do krawędzi tnącej ostrza (Rys. 4). Takie ułożenie węglików pierwotnych może w istotny sposób wpływać na mechanizm zużycia krawędzi tnącej ostrza. Obraz powierzchni krawędzi tnącej ostrza przedstawiono na Rys. 5. Oddziaływanie węglików pierwotnych na proces zużycia dobrze obrazują zgłady metalograficzne wykonane przy powierzchni kątowej ostrza. Węgliki te oddziaływają hamująco na zużycie (Rys. 6), jednakże wykazują one również skłonność do pękania (fragmentacji) w wyniku oddziaływania tribologicznego (Rys. 7). Pęknięcia zainicjowane w ww. węglikach mogą rozwijać się w głąb materiału. W rozwoju pęknięć w głąb materiału noża istotną rolę odgrywają wydzielenia węglików wtórnych przekazując pęknięcia od jednego do drugiego węglika wtórnego. Dekohezja następuje albo na granicy fazowej węglik pierwotny – osnowa lub w obszarze węglika pierwotnego. Tego typu pęknięcia stwarzają niebezpieczeństwo przedostania się do farszu dużych fragmentów noża. Należy więc rozważyć możliwość zastosowania do wykonania noży do kutra innego rodzaju stali, która w mikrostrukturze nie będzie zawierała 272 Wpływ parametrów technicznych układu roboczego kutra... węglików rozmieszczonych w postaci pasm. Należy przy tym zaznaczyć, że zarówno pierwotne jak i wtórne węgliki wykazują pozytywny wpływ na odporność na zużycie noża. Rys. 4. Ułożenie węglików pierwotnych w stosunku do krawędzi natarcia noża – próbka nr 2 Rys. 5. Powierzchnia tnąca ostrza noża kutra próbka nr 3 Rys. 6. Mikrostruktura w pobliżu powierzchni kątowej noża – próbka nr 2 Rys. 7. Rozwój pęknięcia w mikrostrukturze noża - próbka nr 3 273 Marek Szeląg, Karolina Malecka Wpływ kształtu ostrza noży na obniżenie temperatury podczas kutrowania W celu wykazania różnic występujących miedzy tymi dwoma kompletami noży przeprowadzono badania polegające na sporządzeniu dwóch jednakowych farszów co do składu objętości przy użyciu dwóch różnych zespołów rozdrabniających. Farsz 1 został sporządzony przy pomocy noży oryginalnych natomiast drugi z wykorzystaniem noży autorskich. Pomiar temperatury odbywał się periodycznie po 4, 8, i 14 minutach, kiedy to zakończono kutrowanie. Odpowiednio w 4 i 6 minucie dodawano lód po połowie zaplanowanej masy, a w 12 minucie dodano tłuszcz. Składnikami do sporządzanego farszu było: mięso wieprzowe (łopatka 2,5 kg), słonina (1,65 kg), lód (0,8 kg), dodatki (Vitakut VFe Parówka Burgundzka II - g·kg-1, mieszanka peklująca - g·kg-1). Surowiec został poddany procesowi rozdrobnienia na wilku laboratoryjnym i schłodzony do temperatury 0 oC. Przed rozpoczęciem rozdrabniania surowca misa kutra została schłodzona lodem łuskowym do temperatury 3,8 oC. Temperatura rozdrabnianego surowca [oC] Lp. Czas kutrowania i dodane składniki 1. Farsz I (noże oryginalne) Farsz II (noże autorskie) Temperatura mięsa przed kutrowaniem 0,0 0,0 2. Temperatura misy przed kutrowaniem 23,0 23,0 3. Temperatura misy po schłodzeniu 3,8 3,8 4. Po 4 min. dodano połowę lodu i zmierzono temp. 7,0 6,0 5. 6. 7. 8. Po 6 min. dodano resztę lodu Po 8 min. temperatura farszu wynosiła 9,5 8,5 Po 12 min. dodano tłuszcz Po 14 min. temperatura farszu wynosiła 12,5 11,1 Tab. 1. Zmiana temperatury podczas kutrowania w zależności od stosowanych noży Temperatura farszu mięsnego w badaniach laboratoryjnych przy stosowaniu noży wg projektu autorskiego, po czasie kutrowania 4, 8 i 14 minut była niższa średnio o 1,13 oC w odniesieniu do stosowanych noży oryginalnych. Natomiast największa różnica w pomiarze temperatury wynosiła 1,4 oC na korzyść noży wg projektu autorskiego po czasie kutrowania 14 minut. 274 Wpływ parametrów technicznych układu roboczego kutra... WNIOSKI • Z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że największa różnica w temperaturze farszu mięsnego przy najdłuższym czasie kutrowania wynika stąd, iż kształt geometryczny noży oryginalnych ma większą zdolność kumulowania ciepła, aniżeli noże wg projektu autorskiego. • Częściowe znaczenie na zachowanie niższej temperatury kutrowanego farszu ma także kształt samego ostrza krawędzi tnącej noża. Ostrze noża wg projektu autorskiego ma kształt klina o pochyleniu jednostronnym, natomiast nóż oryginalny posiada ostrze zakończone promieniem. • Pęknięcia i wykruszenia na ostrzu noża kutra przemysłowego powodowane są niewłaściwą strukturą materiału otrzymaną po procesie hartowania. BIBLIOGRAFIA Dolata W. 1998. Ocena efektywności pracy noży kutra o różnych kształtach krawędzi tnącej. Mięso i Wędliny. 6: 48-52. Dolata W. 2001. Wpływ warunków kutrowania surowców mięsnych i tłuszczowych na jakość farszów i wędlin. Mięso i Wędliny. 3: 26-29. Fabian M. 2010. Chłodzenie podczas kutrowania. Gospodarka Mięsna. 9: 17-23. Pisula A., Pospiecha E. 2011. Mięso – podstawy nauki i technologii. Wydawnictwo SGGW. Warszawa. Szeląg M. 2011. Analiza teoretyczna procesu kutrowania w aspekcie termodynamicznym. Inżynieria Rolnicza. 4 (129): 257-264. Adres do korespondencji: Marek Szeląg Katedra Inżynierii i Aparatury Przemysłu Spożywczego Karolina Malecka Katedra Chłodnictwa i Koncentratów Spożywczych Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 31-149 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. inż. Jan Zwolak 275 III. BIOLOGIA I BIOTECHNOLOGIA Łukasz Dyba EPISTEME 14/2012 s.279-286 ISSN 1895-4421 ANALIZA SEKWENCJI INTRONÓW GENÓW IPI I CRTISO MARCHWI CHARAKTERYZUJĄCYCH SIĘ OBECNOŚCIĄ TRANSPOZONÓW TYPU MITE SEQUENCE ANALYSIS OF CARROT IPI AND CRTISO GENE INTRONS CARRYING MITE INSERTIONS Abstrakt. Transpozony to ruchome elementy genetyczne zdolne do zmiany swej pozycji w obrębie genomu. Stanowią ważny czynnik zmienności genetycznej. Celem prowadzonych badań była analiza sekwencyjna intronów genów IPI i CRTISO marchwi zawierających insercje transpozonowe. Analizy wykonano na genomowym DNA 21 odmian marchwi (Daucus carota L. ssp. sativus) o różnym pochodzeniu. Fragmenty genów IPI i CRTISO zamplifikowano metodą PCR, sklonowano w E. coli i zsekwencjonowano. Zidentyfikowano 14 haplotypów intronu genu IPI. Dwa z nich zawierały insercję miniaturowego elementu transpozycyjnego o odwróconych powtórzeniach należącego do nadrodziny PIF/Harbinger. Pozostałe różnice między haplotypami wynikały z obecności indeli i polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Pośród 8 haplotypów genu CRTISO, dwa zawierały nieautonomiczny transpozon z nadrodziny hAT. Ponadto w intronie genu CRTISO odmiany ‘Tropical’ odnaleziono sześcionukleotydowy ślad po wycięciu transpozonu. Wykryte insercje i transpozycja wskazują na niedawną aktywność tych mobilnych elementów w genomie marchwi. Słowa kluczowe: MITE, miniaturowe elementy transpozycyjne o odwróconych powtórzeniach, transpozon, Daucus carota Summary. Transposons are mobile genetic elements capable of changing their position within the genome. They are important factors driving genetic diversity. We sequence-characterized of two carrot IPI and CRTISO gene introns harboring nonfixed transposon insertions. Analyses were performed on genomic DNAs of 21 carrot (Daucus carota L. ssp. sativus) cultivars. Fragments of IPI and CRTISO genes were amplified by PCR, cloned in E. coli, and sequenced. Fourteen haplotypes of the IPI gene intron were identified. Two of them possessed insertion of a minature inverted-repeat transposable element belonging to the PIF/Harbinger superfamily. Other differences among haplotypes resulted from indels and single nucleotide polymorphisms. Among eight haplotypes of the CRTISO gene intron, two contained a nonautonomous transposon belonging to the hAT superfamily. Additionally, a six nucleotide-long footprint resulting from the element’s transposition, was found in the CRTISO gene intron of cv. ‘Tropical’. Detected insertions and the transposition event indicate recent activity of these genetic elements in cultivated carrot. Key words: MITE, miniature inverted-repeat transposable elements, transposon, Daucus carota 279 Łukasz Dyba WSTĘP Miniaturowe elementy transpozycyjne o odwróconych powtórzeniach (MITE, ang. Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements) to elementy klasy II (transpozony DNA). Charakteryzują się wielkością do 600 pz (Feschotte i in. 2002) oraz terminalnymi odwróconymi powtórzeniami o długości 10-15 pz (Oki i in. 2008). MITE występują powszechnie u roślin, stanowią na przykład blisko jedną trzecią genomu ryżu (Juretic i in. 2004). Powstają najprawdopodobniej z elementów autonomicznych w wyniku ich wewnętrznych delecji, a następnie proliferują w genomie na drodze trans-mobilizacji (z udziałem transpozazy elementu wyjściowego) lub mobilizacji krzyżowej (dzięki transpozazom elementów spokrewnionych). Pierwszym zidentyfikowanym w genomie marchwi transpozonem był Tdc1 zlokalizowany w rejonie 5’ flankującym gen gDcPAL1 (Ozeki i in. 1997). W genomie marchwi zidentyfikowano również elementy DcMaster należące do nadrodziny PIF/Harbinger (Grzebelus i in. 2006) oraz pokrewne do nich rodziny transpozonów: KrakL1, KrakL2 oraz Midi (Grzebelus i Simon 2009). Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie intronów genów IPI oraz CRTISO marchwi pod względem insercji transpozonów, indeli oraz polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, a także wyprowadzenie haplotypów dla obu badanych genów. MATERIAŁ I METODY Badaniem objęto 21 obiektów marchwi uprawnej (Daucus carota L. ssp. sativus). Każdy obiekt reprezentowany był przez 1-3 rośliny. Źródłem materiału były kolekcje hodowlane, instytuty badawcze oraz banki genów. Obiekty obejmowały pierwsze pokolenie mieszańców F1 (‘Deep Purple’, ‘White Satin’), odmiany lokalne (Gajar IND, Gajar PAK, Long Red, Mestnaya, Panipat Special, Persia No. 242, Pusa Kesar, Shahpur Special, Syrian Purple), populacyjne (‘Blanche ½ longue des vosges’, ‘Hakata Kintoki’, ‘Himuro Fuyugosi Gosun No. 2’, ‘Nutrired’, ‘Shima Ninjin’, ‘Tropical’, ‘White Belgian’, ‘Yellow Belgian’, ‘Yellowstone’) oraz linie hodowlane (BL-JKI-2). Materiałem analitycznym było genomowe DNA wyizolowane z liofilizatów młodych liści pobranych z pojedynczych roślin w fazie wzrostu wegetatywnego. Reakcję PCR przeprowadzono z wykorzystaniem starterów flankujących rejony genów IPI (IPI3’F: 5’-CTGTACAGGGAGTCCGAGCTTATC-3’ iIPI3’rs: 5’-AGCAACTTCATCAGGGTTGG-3’) i CRTISO (CRTISO3’F: 5’-TTTGCCTCCAGATACGGATT-3’ i CRTISO3’rs: 5’-GGAAGACTGGAGACCAGGAA-3’) zawierające sekwencje intronowe. Startery kotwiczyły przy końcach 3’ egzonów sąsiadujących z analizowanymi intronami. Jako 280 Analiza sekwencji intronów genów IPI I CRTISO marchwi matrycę do reakcji PCR wykorzystano genomowy DNA analizowanych obiektów. Dla sekwencji trudno poddających się amplifikacji stosowano reakcję typu long-PCR. Reakcje PCR prowadzono w mieszaninie o objętości 20 µl (1x bufor PCR; 0,25 mM dNTP Mix; 0,5 µM startery; 0,05 u/ µl polimeraza DreamTaq lub LongPCR Enzyme Mix; 2 ng/µl DNA). Stosowano następujące warunki reakcji PCR (94°C 2 min, 35 cykli [94°C 30 s, 54°C 30 s, 68°C 2 min], 68°C 10 min) oraz long-PCR (94°C 2 min, 35 cykli [94°C 30 s, 58°C 30 s, 68°C 7 min], 68°C 15 min). Amplifikacje prowadzono w termocyklerach Mastercycler (Eppendorf). Produkty reakcji PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym, a następnie wycinano z żelu i oczyszczano korzystając z zestawu Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Oczyszczone fragmenty DNA poddawano ligacji z wektorem pGEM-T lub pGEM-T Easy (Promega). Mieszaninę ligacyjną inkubowano przez noc w temperaturze 4°C, a dalej wykorzystywano do transformacji bakterii kompetentnych E. coli JM109. Podczas klonowania stosowano selekcję na białe i niebieskie kolonie. Szalki ze stałą pożywką LB zawierającą ampicylinę w stężeniu 100 mg/l i z posianymi bakteriami po transformacji inkubowano całą noc w temperaturze 37°C. Białe kolonie pobierano i przenoszono do płynnej pożywki LB z ampicyliną (100 mg/l), po czym inkubowano całą noc na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze 37°C. Plazmidowe DNA izolowano z wykorzystaniem zestawu Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega). Wyizolowane plazmidy poddawane były reakcji sekwencjonowania techniką Sangera z wykorzystaniem starterów SP6 i T7. Sekwencje edytowano oraz analizowano w programie BioEdit. Przeprowadzono również analizę dystansu genetycznego. Nieukorzenione drzewa wygenerowano z zastosowaniem metody najbliższego sąsiada (program Neighbour z pakietu Phylip). Podczas tworzenia dendrogramów brano pod uwagę polimorfizmy pojedynczego nukleotydu i indele. WYNIKI I DYSKUSJA W wyniku reakcji amplifikacji fragmentu genu IPI otrzymano produkty wielkości ok. 1100 pz oraz ok. 600 pz. Dłuższe produkty reprezentowały sekwencje zawierające wbudowany transpozon, krótsze produkty pozbawione były insercji. Podobnie rozdział elektroforetyczny produktów PCR reprezentujących gen CRTISO wykazał obecność produktów większych (ok. 1300 pz), charakteryzujących się insercją transpozonu, oraz krótszych, o długości ok. 500 pz, pozbawionych insercji. W przypadku obu genów produkty reakcji PCR występowały w wariantach dwóch prążków w jednej ścieżce elektroforetycznej (heterozygoty) oraz jednego prążka (homo- lub heterozygoty). 281 Łukasz Dyba Sekwencjonowaniu poddano w sumie 88 produktów PCR genu IPI uzyskanych z 28 roślin należących do 18 obiektów doświadczalnych oraz 96 produktów PCR genu CRTISO uzyskanych z 28 roślin należących do 20 obiektów doświadczalnych. 829 860 862 901 902 918 936 1016-1021 - T T A G G T A C A C Del T - G T G G T G A T T T - 3 A - G C T A T T Ins T T A C G T A C A T - 822 T T 782 T G 771 A T 684 T C 715-758 C G 585 G - 582 P/H T 564 65-513 A 534 27 1 2 514 Haplotyp Stwierdzono obecność transpozonu w pozycji 65-513 pz fragmentu genu IPI. Transpozon ten charakteryzował się TSD (ang. Target Site Duplication) o sekwencji TAA i TIR (ang. Terminal Inverted Repeats) o sekwencji GGGGCCGTTTGGTTC, co pozwoliło na zakwalifikowanie go do nadrodziny PIF/ Harbinger. Wszystkie otrzymane sekwencje porównano między sobą i na tej podstawie wyprowadzono 14 haplotypów w obrębie badanych obiektów (Tab. 1). Tylko haplotypy IPI-1 i IPI-10 charakteryzowały się insercją transpozonu. 4 A - G C T A T T - T T A G G T A C A C 5 A - C C T A T T - T T A G G T A C A C - 6 A - G A C A T C - T T A G T T G C A T - 7 A - G A C A T C - T T A G T T A C A C - 8 A - G A C A T C - T T A G T T G C A T Del 9 A - G C C A T T - T T A G G T A C A C - 10 A P/H G C T A T T - T T A G T T G C A T Del 11 A - G C T A T T - T T A G G T A C A T - 12 T - G C T A T T - T T A G G T A C A C - 13 A - G C T G T T - T T A G G T A C A C - 14 A - G C T A C T - T A A G G T A C A T - Tab. 1. Haplotypy genu IPI (P/H – transpozon z nadrodziny PIF/Harbinger; Ins – insercja; Del – delecja) Podczas analizy genu CRTISO wykryto transpozon w pozycji 65-845 nt. Transpozon ten charakteryzował się TSD o sekwencji GTTGGGAT i TIR o sekwencji TAGGGCTGAGCA, co było podstawą do zakwalifikowania go do nadrodziny hAT. Nadano mu nazwę Dc-hAT1. Wyprowadzono 8 haplotypów w obrębie badanych obiektów (Tab. 2). W haplotypie CRTISO-5, w pozycji 65-70 nt, stwierdzono obecność footprintu powstałego prawdopodobnie w wyniku wycięcia transpozonu. 282 1092 1118 1132 T - G G T A Del T G - T A A T T T 1137 1062 1 2 14 933 65-845 Haplotyp Analiza sekwencji intronów genów IPI I CRTISO marchwi 3 G - G A A T T T 4 G - G G T A Del T 5 G TGGGAT T A A T T A 6 G Dc-hAT1 (del. 675-728) T A A T T A 7 G Dc-hAT1 T A A T T A 8 G Dc-hAT1 T A A T T T Tab. 2. Haplotypy genu CRTISO (Dc-hAT1 – transpozon z nadrodziny hAT; Dc-hAT1 (del.675-728) - transpozon z wewnętrzną delecją; Del – delecja) Haplotypy CRTISO-6 i CRTISO-7 są niemal identyczne, różni je tylko insercja transpozonu (Rys. 1). W haplotypie CRTISO-7 jest to pełna insercja, a w haplotypie CRTISO-6 – insercja z wewnętrzną delecją. Haplotyp CRTISO-8 również posiada insercję, ale różni się od wyżej wymienionych obecnością T w pozycji 1137 (zamiast A). Sekwencja go reprezentująca odpowiada sekwencji haplotypu CRTISO-2. Sugeruje to, iż haplotypem wyjściowym dla powyższych był haplotyp CRTISO-2, a insercja transpozonu lub insercja w połączeniu z substytucją (T/A) doprowadziły do wykształcenia odpowiednio haplotypów CRTISO-8 oraz CRTISO-6 i CRTISO-7. Haplotyp CRTISO-2 często pojawia się u roślin heterozygotycznych ze względu na insercję Dc-hAT1. Wyjątkiem jest roślina nr 1 odmiany lokalnej Gajar IND reprezentowana przez haplotypy CRTISO-1 oraz CRTISO-7. U ‘Tropical’ odnaleziono w pozycji 65-70 nt sekwencję 5’-TGGGAT-3’. Wykazuje ona duże podobieństwo do sekwencji TSD Dc-hAT1. Jak pokazano na dendrogramie (Rys. 1), haplotyp CRTISO-5 charakteryzujący się obecnością footprintu jest podobny do haplotypów z pełną insercją transpozonu i haplotypu z delecją w obrębie Dc-hAT1. Sugeruje to, że haplotyp CRTISO-5 powstał w wyniku wycięcia transpozonu Dc-hAT1 z omawianego locus. Możliwe, że haplotypem wyjściowym był CRTISO-8 reprezentowany w populacjach BL-JKI-2, ‘Shima Ninjin’ oraz ‘Tropical’. U ‘Deep Purple’ zaobserwowano delecję (53 nt; haplotyp CRTISO-6) w obrębie samego transpozonu (pozycja 675-728). Może to sugerować, że Dc-hAT1 jest elementem „młodym”, stosunkowo niedawno powstałym w genomie marchwi, aktywnym transpozycyjnie (footprint po jego wycięciu, występowanie tylko w ściśle określonych haplotypach i nie u wszystkich badanych roślin w obrębie odmian), a jego długość podlega dalszym modyfikacjom poprzez wewnętrzne delecje. 283 Łukasz Dyba Pośród sekwencji IPI nie odnotowano obecności śladów po wycięciu transpozonów, jednakże transpozony PIF/Harbinger mogą się wycinać w sposób doskonały, nie pozostawiając footprintu. Insercja transpozonu występuje tylko w dwóch haplotypach: IPI-1 oraz IPI-10 (Rys. 2). Ponieważ oba te haplotypy obecne są u ‘Hakata Kintoki’, możliwe jest, że haplotyp IPI-10 powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy haplotypem IPI-1 i IPI-6. Oprócz MITE, w analizowanym obszarze genu IPI, obecna jest także niewielka (43 nt) insercja, która jednak nie jest podobna do TSD czy TIR zidentyfikowanego elementu ruchomego. Rys. 1. Dendrogram haplotypów genu CRTISO uzyskany metodą najbliższego sąsiada (Dc-hAT1 – obecność transpozonu; Dc-hAT1 (delecja) – obecność transpozonu z wewnętrzną delecją; footprint – obecność śladu po wycięciu transpozonu) Rys. 2. Dendrogram haplotypów genu IPI uzyskany metodą najbliższego sąsiada (PIF/ Harbinger – obecność transpozonu) 284 Analiza sekwencji intronów genów IPI I CRTISO marchwi LITERATURA Feschotte C. Jiang N. Wessler SR. 2002. Plant transposable elements: where genetics meets genomics. Nat Rev Genet, 3: 329-341. Grzebelus D. Yau YY. Simon PW. 2006. Master: a novel family of PIF/Harbingerlike transposable elements identified in carrot (Daucus carota L.). Mol Gen Genomics, 275:450-459. Grzebelus D. Simon PW. 2009. Diversity of DcMaster-like elements of the PIF/Harbinger superfamily in the carrot genome. Genetica, 135: 347-353. Juretic N. Bureau TE. Bruskiewich RM. 2004. Transposable element annotation of the rice genome. Bioinformatics, 20: 155-160. Oki N. Yano K. Okumato Y. Tsukiyama T. Teraishi M. Tanisaka T. 2008. A genomewide view of miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) in rice, Oryza sativa ssp. japonica. Genes Genet Syst, 83: 321-329. Ozeki E. Davies Y. Takeda J. 1997. Somatic variation during long term subculturing of plant cells caused by insertion of a transposable element in a phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene. Mol Gen Genet, 254: 407-416. Adres do korespondencji: mgr inż. Łukasz Dyba Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Dariusz Grzebelus, dr hab. Rafał Barański 285 Agnieszka Fornal Anna Radko EPISTEME 14/2012 s.287-292 ISSN 1895-4421 OCENA POLIMORFIZMU MARKERÓW MIKROSATELITARNYCH DNA U KONIKÓW POLSKICH EVALUATION OF POLYMORPHISM OF DNA MICROSATELLITES OF POLISH KONIK Abstrakt. Tematem prezentowanej pracy była analiza polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych DNA u 118 osobników rasy konik polski. Zastosowano zautomatyzowaną technikę analizy wielkości fragmentów DNA wykorzystując komercyjny zestaw starterów przeznaczony do kontroli pochodzenia koni. Identyfikowano allele z 17 następujących mikrosatelitarnych loci: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23, HTG6, HTG7, CA425, HMS1, LEX3. Wszystkie badane mikrosatelitarne markery DNA charakteryzowały się wysokim polimorfizmem za wyjątkiem loci HTG4 i HTG6. Najwyższe wartości szacowanych parametrów Ho, PIC i PD dotyczyły locus HMS6 (Ho = 0,822, PIC = 0,728 i PD = 0,903). Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa obliczone dla zestawu 17 STR wynosiło 0,9996 dla PE1 i 0,9981 dla PE2. Słowa kluczowe: mikrosatellity, kontrola rodowodów, konie Summary. The aim of the present study was the evaluation of microsatellite DNA markers for paternity control in horses. Polymorphism of 17 microsatellite markers were studied in 118 Polish Konik. Under consideration were markers from commercially available kit for horses parentage verification (AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23, HTG6, HTG7, CA425, HMS1, LEX3). The allele identification was performed using automated DNA sizing technology. All ������������������������������������������������������� the DNA microsatellite markers were highly polymorphic except for HTG4 and HTG6 loci. The highest values of estimated coefficient of heterozygosity (Ho), the polymorphic information content (PIC) and power of discrimination (PD) parameters concerned locus HMS6 (Ho = 0,822, PIC = 0,728, PD = 0,903). The probability of sire exclusion calculated for the set of 17 STR were 0,9981 for PE1 and 0,9998 for PE2. Key words: microsatellites, parentage control, Polish Konik 287 Agnieszka Fornal, Anna Radko WSTĘP Sekwencje mikrosatelitarne, określone również jako STR (short tandem repeat), są fragmentami DNA o długości od 60 do 300 par zasad (pz), występującymi głównie w regionach niekodujących genów i rozproszonymi równomiernie w genomie co 6 do 10 tysięcy par zasad (kpz). Składają się one z 10 do 50 powtórzeń jedno- do sześcionukleotydowego motywu i charakteryzują się wysokim polimorfizmem [Tautz 1989]. Znaczący postęp w badaniach nad identyfikacją, charakterystyką i polimorfizmem sekwencji mikrosatelitarnych DNA przyniosło zastosowanie multipleksowych reakcji PCR oraz zautomatyzowanej techniki analizy wielkości fragmentów DNA. Mikrosatelity stały się powszechnie stosowanymi markerami między innymi w programach mapowania genomu [Botstein i in. 1980], analizie zróżnicowania wewnątrz i międzyrasowego [Curik i in. 2003, Groeneveld L.F. i in. 2010, Sávio P.R. i in. 2008] oraz w identyfikacji i mapowaniu loci cech ilościowych (QTLs) [Diesterbeck i in. 2007]. STR szczególne znaczenie znalazły w identyfikacji osobniczej i kontroli pochodzenia [Luís i in. 2002, Lee i Cho 2006]. W kraju przeprowadzono badania nad polimorfizmem mikrosatelitarnym DNA u koni arabskich i pełnej krwi [Gralak i in. 1998] oraz koni małopolskich [Ząbek i in. 2006]. W prezentowanej pracy przedstawiono analizę markerów mikrosatelitarnych wytypowanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki Zwierząt (International Society for Animal Genetics – ISAG) u konika polskiego będącego rodzimą rasą koni wywodzącą się od tarpana. Celem przeprowadzonych badań była analiza polimorfizmu 17 loci mikrosatelitarnych DNA u konika polskiego oraz ocena przydatności zestawu markerów do kontroli pochodzenia w tej rasie. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły próbki krwi od 118 koników polskich (kn) pochodzących po 20 ogierach, zgromadzone w ramach kontroli pochodzenia koni w IZ PIB. Krew do analiz przechowywano w probówkach z dodatkiem EDTA w temperaturze -20oC. DNA izolowano przy użyciu zestawu Wizard DNA purification kit (Promega) wg procedur podanych przez producenta. Reakcję PCR przeprowadzono za pomocą komercyjnego zestawu do jednoczesnej amplifikacji 17 sekwencji mikrosatelitarnych specyficznych dla koni produkcji Finnzymes Diagnostics. Zestaw ten zawiera mieszaninę 17 par sekwencji starterowych, jeden z każdej pary starterów znakowany jest na końcu 5’ fluorescencyjnym barwnikiem - 6-FAM, JOE i NED. Umożliwia on oznaczenie 12 loci: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, VHL20, ASB17, ASB23 podstawowy i 5 dodatkowych loci: HTG6, HTG7, CA425, HMS1, LEX3 stanowiących panel STR rekomendo288 Ocena polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych DNA... wanych przez ISAG do weryfikacji rodowodów koni. Do amplifikacji zastosowano warunki zgodne z protokołem producenta zestawu. Produkty reakcji PCR poddano elektroforezie kapilarnej w 4% żelu poliakryloamidowym w sekwenatorze ABI 3130xl (Applied Biosystems), z użyciem standardu wielkości LIZ500. Analizę uzyskanych fragmentów DNA i weryfikacji profili w 17 mikrosatelitarnych loci wykonano w programie GeneMapper 4.0. Na podstawie częstości występowania zidentyfikowanych alleli wyliczono heterozygotyczność obserwowaną (Ho) i oczekiwaną (He) [Nei 1978], indeks stopnia polimorfizmu (PIC) [Botstein i in. 1987] oraz siłę dyskryminacji (PD). Oszacowano także prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia na podstawie pojedynczego locus w przypadku, gdy znany jest genotyp jednego z rodziców (PE1) i obojga rodziców (PE2) oraz prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa - PEC na podstawie wszystkich 17 analizowanych loci [Jamieson i Taylor 1997, Kimberly 1998]. Obliczenia wykonano z wykorzystaniem własnego programu statystycznego Imgbov-Stat, obsługującego bazę danych IZ PIB. WYNIKI I DYSKUSJA Sekwencje mikrosatelitarne DNA są grupą markerów genetycznych, która zgodnie z zaleceniem Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierząt z 1996 r. powinna być stosowana równolegle z grupami krwi do kontroli pochodzenia koni. Dotychczas wyniki różnych badań wskazują, że do kontroli pochodzenia powinny być wybrane sekwencje mikrosatelitarne DNA charakteryzujące się wysokim polimorfizmem, dobrze zrównoważoną częstością występowania alleli w poszczególnych loci, dla których wartości wskaźników PIC, Ho oraz PE2 dla pojedynczych loci osiągają wartość powyżej 0,5. Ponadto, powinny charakteryzować się dobrą rozdzielczością elektroforetyczną produktów amplifikacji w żelu poliakrylamidowym i powtarzalnością wyników przy określaniu wielkości poszczególnych alleli [Botstein i in. 1980]. W badanej rasie koni, w trakcie elektroforezy, poszczególne produkty PCR wyraźnie się rozdzielały, słabszy sygnał wynikający ze słabszej amplifikacji zaobserwowano jedynie w locus AHT5 u 15 osobników oraz w HMS3 u 12 osobników. Łącznie w 17 analizowanych mikrosatelitarnych loci zidentyfikowano ogółem 114 alleli, których liczba w zależności od locus wynosiła od 3 (locus HTG6) do 10 (locus HTG10), średnia liczba alleli wynosiła 6,71. W większości przypadków allele zidentyfikowane w poszczególnych loci występowały ze zróżnicowaną częstością. Na podstawie częstości alleli oszacowano wskaźniki polimorfizmu badanych markerów. W tabeli 1. zostały zestawione parametry dla każdego polimorficznego locus badanej populacji. Większość 289 Agnieszka Fornal, Anna Radko analizowanych STR charakteryzowała się wysokimi wartościami wskaźników Ho, He, PIC i PD wynoszącymi wartość ponad 0,5. Wyjątek stanowiły markery HTG4 z podstawowego panelu STR wymaganego do weryfikacji pochodzenia koni oraz HTG6 z panelu dodatkowego. Wartości Ho i PIC dla HTG4 wyniosły odpowiednio 0,466 i 0,382 oraz dla HTG6 - 0,076 i 0,073. Wyliczona siła dyskryminacji dla tych markerów również przyjęła najniższe, spośród badanych loci, wartości 0,646 dla HTG4 i jedynie 0,144 dla HTG6. Natomiast najwyższym polimorfizmem odznaczał się marker HMS6, dla którego wartości Ho, PIC i PD osiągnęły odpowiednio 0,822, 0,728 i 0,903. Wysokim polimorfizmem (Ho, PIC i PD wyższym od 0,7) charakteryzowało się aż 8 badanych loci (Tab. 1). Locus Liczba alleli Ho He PIC PD PE1 PE2 AHT4 6 0,7542 0,7379 0,6962 0,8808 0,3349 0,5111 AHT5 7 0,7627 0,7743 0,7407 0,9140 0,3878 0,5666 ASB2 8 0,7797 0,7218 0,6945 0,8947 0,3375 0,5236 HMS2 7 0,6441 0,6837 0,6360 0,8505 0,2730 0,4443 HMS3 6 0,7542 0,7731 0,7419 0,9115 0,3892 0,5700 HMS6 6 0,8220 0,7640 0,7277 0,9028 0,3671 0,5469 HMS7 7 0,5763 0,6965 0,6416 0,8607 0,2762 0,4423 HTG10 10 0,6780 0,7798 0,7468 0,9138 0,3957 0,5741 HTG4 4 0,4661 0,4048 0,3816 0,6462 0,0865 0,2303 HTG6* 3 0,0763 0,0741 0,0727 0,1438 0,0027 0,0374 HTG7* 4 0,5593 0,5973 0,5402 0,7703 0,1880 0,3428 VHL20 9 0,7966 0,7665 0,7320 0,8901 0,3806 0,5585 ASB17 9 0,7542 0,7415 0,7068 0,8778 0,3515 0,5311 ASB23 8 0,7119 0,7346 0,6878 0,8723 0,3222 0,4950 CA425* 6 0,6780 0,6849 0,6514 0,8687 0,2865 0,4699 HMS1* 7 0,7288 0,7448 0,7054 0,8986 0,3452 0,5228 LEX3* 7 0,4661 0,7732 0,7408 0,8992 0,3887 0,5683 Średnia 6,71 0,6476 0,6737 0,6379 1-0,3x10 0,998092 0,999986 -14 Tab. 1. Wskaźniki polimorfizmu dla każdego locus zestawu 17 mikrosatelitarnych loci. * dodatkowe markery mikrosatelitarne 290 Ocena polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych DNA... W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano wyraźną różnicę w wartościach Ho i He dla LEX3 (Ho = 0,466, He = 0,773) może to być spowodowane faktem, że marker ten zlokalizowany jest na chromosomie X. Kumulatywna wartość siły dyskryminacji (PDC) jest ważnym parametrem określającym przydatność zestawu STR do identyfikacji osobniczej. W badaniach własnych, na podstawie 17 loci mikrosatelitarnych parametr ten osiągnął wartość bliską jedności (PDC = 1-0,3x10-14). W celu określenia przydatności ocenianych markerów do kontroli pochodzenia wyliczono prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia dla każdego locus i dla wszystkich 17 loci łącznie, gdy znany jest genotyp jednego rodzica (PE1) i obojga rodziców (PE2). Wartość PE1 w badanej rasie koni obliczone na podstawie pojedynczych loci mieściło się w przedziale od 0,003 w locus HTG6 do 0,396 w HTG10, natomiast PE2 od 0,0374 do 0,5741 odpowiednio dla tych samych markerów (Tab. 1). Łączne prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PEC) na podstawie 17 analizowanych STR dla PE1 wyniosło 99,809%, a dla PE2 powyżej 99,998%. WNIOSKI Wysokie wartości omawianych wskaźników Ho, PIC i PD oraz wyliczone wysokie łączne prawdopodobieństwo wykluczenia pochodzenia wskazują na znaczny stopień zmienności genetycznej analizowanej populacji koni oraz świadczą o przydatności analizowanego zestawu 17 markerów mikrosatelitarnych DNA do badań weryfikacji rodowodów konika polskiego. LITERATURA Botstein D. White R.L. Skolnick M. Davis R.W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Am. J. Human Genet., 32: 182 – 190. Curik I. Zechner P. Sölkner J. Achmann R. Bodo I. Dovc P. Kavar T. Marti E. Brem G. 2003. Inbreeding, Microsatellite Heterozygosity, and Morphological Traits in Lipizzan Horses, Journal of Heredity 94 (2): 125-132. DAD-IS (Domestic Animal Diversity Information System hosted by FAO) 2012.02.12 http://dad.fao.org Diesterbeck U.S., Hertsch B. & Distl O. 2007. Genome-wide searchfor microsatellite markers associated with radiologic alterations in the navicular bone of Hanoverian warmblood horses. Mamm. Gen. 18: 373–81. 291 Agnieszka Fornal, Anna Radko Gralak B., Kuryl J. and Niemczewski C. 1998. Usefulness of a set of seven microsatellites for parentage control in Arabian Horse and Thoroughbreds in Poland. Anim. Genet. 29 (Suppl. 1):16. Groeneveld L.F. Lenstra J.A. Eding H. Toro M.A. Scherf B. Pilling D. Negrini R. Finlay E.K. Jianlin H. Groeneveld E. Weigend S. 2010. Genetic diversity in farm animals - a review. Animal Genetics 41: 6-31. Jamieson A., Taylor S.C.S. 1997. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion. Anim. Genet., 28: 397 – 400. Kimberly A.H. 1998. Statistical Analysis of STR Data. Profiles in DNA 3: 14-15. Lee S, i Cho G. 2006. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. J. Vet. Sci. 7: 63-67. Luís C., Cothran E Gus and Oom M.M. 2002. Microsatellites in Portuguese autochthonous horse breeds: usefulness for parentage testing. Genet. Mol. Biol., 25: 131-134. Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: 583–590. Sávio P.R. Evonnildo C.G. Artur S. Maria P.C.S. 2008. Genetic variability and efficiency of DNA microsatellite markers for paternity testing in horse breeds from the Brazilian Marajó archipelago. Genetics and Molecular Biology, 31 (1): 68-72. Tautz D. 1989. Hypervariability of simple sequences as general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res 17 (16): 6463-6471. Ząbek T., Żyga A., Radko A., Słota E. 2006. Analysis of genetic variation in Małopolski horses using molecular and pedigree data. Ann. Anim. Sci. 6: 13-27. Adres do korespondencji: dr hab. Anna Radko, mgr Agnieszka Fornal Instytut Zootechniki – Państwowy Instytut Badawczy e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Słota 292 Marta Głogowska, Grzegorz Formicki Bogdan Kosowski, Robert Stawarz EPISTEME 14/2012 s.293-299 ISSN 1895-4421 KUMULACJA RTĘCI W LUDZKICH TKANKACH NOWOTWOROWYCH ŻOŁĄDKA I JELITA GRUBEGO W ZALEŻNOŚCI OD WIEKU I PŁCI ACCUMULATION OF MERCURY IN HUMAN NEOPLASTIC TISSUES OF STOMACH AND LARGE INTESTINE IN RELATION AGE AND THE SEX Abstrakt. Badania przeprowadzono na fragmentach tkanek ludzkich pochodzących z guzów nowotworowych żołądka i jelita grubego. Materiał do badań pobierano w trakcie zabiegów operacyjnych przeprowadzanych w Niepublicznym Zakładzie Opieki Zdrowotnej PROSMED w Krakowie. W dalszej kolejności wycinki kierowane były do badania histopatologicznego, przeprowadzanego w Zakładzie Patomorfologii wyżej wymienionej jednostki i stamtąd ostatecznie odbierane. Na badania uzyskano zgodę lokalnej komisji bioetycznej (opinia nr KBET/95/B/2009). W badaniach wykorzystano także grupę kontrolną, którą stanowiły tkanki zdrowe, niezmienione histopatologicznie, pochodzące z żołądka, jelita grubego, a także z przełyku i jelita cienkiego. Tkanki zdrowe były pobierane w trakcie biopsji lub autopsji. Zawartość rtęci w próbkach zmierzono metodą spektrofotometryczną zimnych par (CVAAS). Metoda ta nie wymaga mineralizacji wstępnej i umożliwia precyzyjny pomiar bezpośrednio w tkance. Niewielkie fragmenty tkanek, umieszczano w specjalnym tyglu bezpośrednio po rozmrożeniu i uprzednim precyzyjnym zważeniu ich. Wyniki ważenia wpisywane były do programu obsługującego analizator MA2, dzięki czemu, po zakończeniu cyklu pomiarowego uzyskiwano automatycznie wyliczony wynik w ppm. Pomiar dla każdej próbki powtarzano trzy razy. Grupę kobiet i mężczyzn podzielono odpowiednio na 2 klasy wiekowe: 20-60 lat oraz 61-90 lat. Średnia zawartość rtęci w tkankach przewodu pokarmowego jest prawie identyczna u kobiet chorych zarówno z przedziału wiekowego 20-60 lat, jak i 61-90 lat, w porównaniu z zawartością tego pierwiastka u kobiet zdrowych. W przypadku mężczyzn, średnia zawartość rtęci jest zdecydowanie wyższa u pacjentów chorych z grupy wiekowej 61-90 lat. Słowa kluczowe: rtęć, żołądek, jelito grube, nowotwór, metale ciężkie Summary. The studies were carried out on samples of human neoplastic tissues coming from stomach and large intestine. Material was taken during surgeries carried out in the Non-public Health Care Facility PROSMED in Cracow. First the samples were directed to histopathologic studies which were carried out in Pathomorphology Department PROSMED, Cracow. Metal content analysis was performed in Institute of Biology, Cracow Pedagogical University. The investigations were supported by permission of the local bioethical committee (KBET/95/B/2009). Healthy, unchanged histopathologically, tissues coming from the stomach and large intestine served as control. Healthy tissues were taken during the biopsy or the autopsy. The samples coming from women and men were divided suitably into 2 age classes: 20-60 years and 61-90 years. Small fragments of tissues were weight before the analysis. The content of mercury was measured using the cold vapor atomic absorption spectrometry (CVAAS). Each sample was analyzed three times for mercury content. The average content of mercury was almost identical comparing neoplastic and health tissues of women from both age classes. In 61-90 years old men the average content of mercury was significantly higher in neoplastic tissues comparing to healthy tissues. Key words: mercury, stomach, large intestine, neoplasm, heavy metals 293 Marta Głogowska, Grzegorz Formicki, Bogdan Kosowski, Robert Stawarz WSTĘP Rocznie około 12 000 mężczyzn i 11 000 kobiet umiera w Polsce z powodu raka przewodu pokarmowego [Wronkowski 2001]. Nawet niewielkie zmiany w stylu życia wyrażone w nawykach żywieniowych, takie jak ograniczenie spożycia soli kuchennej, żywności marynowanej, tłuszczów, a wzrost konsumpcji świeżych warzyw, owoców i bogatej w błonnik żywności, sprawia, że ryzyko rozwoju chorób nowotworowych jest znacznie mniejsze [Tanaka 1997] . Palenie i picie alkoholu aktywuje rozwój raka przełyku i jamy ustnej [Van Halteren i in. 1995, Warnakulasuriya 2009]. Rak żołądka zajmuje ważne miejsce wśród nowotworów złośliwych. Znajomość czynników genetycznych i żywieniowych jest niezbędna jeśli chodzi o powstawanie raka żołądka [Kotynia 2006]. Głównymi czynnikami ryzyka są: dieta bogata w sól, mięso i marynaty. Rak jelita cienkiego występuje głównie w krajach wysoko zurbanizowanych, z podobną częstością u kobiet i mężczyzn. Ryzyko tego nowotworu jest związane z dietą pełnomięsną [Key i in. 2002]. Metale biorą udział w różnych procesach fizycznych i chemicznych, które są powszechne w procesach związanych z rozwojem raka. Różne są ścieżki kancerogenności metali: • Indukcja zniszczenia DNA • Tworzenie cross-linków DNA • Interferencja metali z enzymami naprawczymi DNA Niektóre metale wpływają na sygnał transdukcyjny przez promowanie zaburzeń w ekspresji genów i komunikacji wewnątrzkomórkowej, a także mogą powodować efekt w postaci odpowiedzi immunologicznej i zaburzeń homeostazy komórkowej. Wpływ metali na drogi kancerogenezy jest określony przez liczne czynniki tj.: typ metalu, specjacja, rozpuszczalność, interakcje metal-metal i inne [Hayes 1996]. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na wycinkach ludzkiego żołądka i jelita grubego. Materiał do badań był pobierany w trakcie operacji oraz sekcji zwłok, przeprowadzanych w 5 Wojskowym Szpitalu Klinicznym z Polikliniką w Krakowie oraz w Niepublicznym Zakładzie Opieki Zdrowotnej PROSMED w Krakowie. W dalszej kolejności wycinki kierowane były do badania histopatologicznego, przeprowadzanego w Zakładach Patomorfologii wyżej wymienionych jednostek i stamtąd ostatecznie odbierane. Na badania uzyskano zgodę komisji bioetycznej UJ (opinia nr KBET/95/B/2009). 294 Kumulacja rtęci w ludzkich tkankach nowotworowych... Tkanki ważące 0,5 – 1 g bezpośrednio po pobraniu były umieszczane w pojemnikach wykonanych z polietylenu, szczelnie zamykane, opisywane oraz zamrażane. Pobrany materiał był świeży. Zebrane probówki z zawartością (fragmenty tkanek zdrowych, jak i zmienionych nowotworowo) przewożono do laboratorium Instytutu Biologii UP w specjalnym termosie wyposażonym we wkłady mrożące, w celu utrzymania niskiej temperatury - następnie przenoszono je do zamrażarki. Po zebraniu odpowiedniej ilości materiału każdą próbkę poddano procedurom umożliwiającym oznaczanie w tkankach zawartości rtęci. Zawartość rtęci w próbkach zmierzono metodą spektrofotometryczną zimnych par (CVAAS). Metoda ta nie wymaga mineralizacji wstępnej i umożliwia precyzyjny pomiar bezpośrednio w tkance. Niewielkie fragmenty tkanek, umieszczano w specjalnym tyglu bezpośrednio po rozmrożeniu i uprzednim precyzyjnym zważeniu ich. Wyniki ważenia wpisywane były do programu obsługującego spektrofotometr MA2, dzięki czemu, po zakończeniu cyklu pomiarowego uzyskiwano automatycznie wyliczony wynik w ppm. Pomiar dla każdej próbki powtarzano trzy razy. WYNIKI Wyniki pomiarów opracowano statystycznie za pomocą pakietu Statistica wersja 7.1. W opisie statystycznym badanych cech wykorzystano następujące statystyki: średnią arytmetyczną, odchylenie standardowe, błąd standardowy średniej. Za pomocą testu W Shapiro-Wilka określono normalność rozkładu w poszczególnych grupach badawczych. Ponieważ stwierdzono występowanie licznych rozkładów nienormalnych w celu zbadania, które z porównywanych średnich różnią się istotnie, a które nie, stosowano test Kruskala - Wallisa dla prób niezależnych. Ten test jest nieparametryczną alternatywą ANOVA (w klasyfikacji pojedynczej). Po odrzuceniu hipotezy zerowej stosowano właściwy dla tego testu test wielokrotnych porównań. Dla sprawdzenia hipotezy o braku istotnej różnicy między dwoma próbami stosowano test U Manna Whitney’a. W obliczeniach statystycznych posłużono się testem U Manna Whitney’a, w celu sprawdzenia różnic między dwoma próbami. Różnice pomiędzy średnią zawartością Hg u kobiet zdrowych i chorych, oraz u mężczyzn zdrowych i chorych, przedstawiono na wykresie nr 1. Średnia zawartość rtęci w tkankach przewodu pokarmowego jest prawie identyczna u kobiet chorych zarówno z przedziału wiekowego 20-60 lat, jak i 61-90 lat, w porównaniu z zawartością tego pierwiastka u kobiet zdrowych. W przypadku mężczyzn, średnia zawartość rtęci jest zdecydowanie wyższa u pacjentów chorych z grupy wiekowej 61-90 lat (wykres 2). 295 Marta Głogowska, Grzegorz Formicki, Bogdan Kosowski, Robert Stawarz Rys. 1. Średnia zawartość rtęci w przewodzie pokarmowym kobiet i mężczyzn zdrowych i chorych (µg•g-1 s.m.) Średnia zawartość rtęci jest wyższa w tkankach nowotworowych przewodu pokarmowego zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn, w porównaniu do tkanek zdrowych przewodu pokarmowego kobiet i mężczyzn (wykres 1). W celu sprawdzenia różnic w średniej zawartości badanych pierwiastków pomiędzy dwoma grupami wiekowymi, osobno dla kobiet zdrowych i chorych i dla mężczyzn zdrowych i chorych, zastosowano test U Manna – Whitney’a. Otrzymane wyniki ilustruje wykres nr 2. Rys. 2. Średnia zawartość rtęci w tkankach zdrowych i nowotworowych przewodu pokarmowego kobiet i mężczyzn w wieku 20-60 i 61-90 lat (µg•g-1 s.m.) 296 Kumulacja rtęci w ludzkich tkankach nowotworowych... DYSKUSJA I WNIOSKI Toksyczne metale są często transportowane do wnętrza komórki w postaci rozpuszczalnych kompleksów organicznych. Metionina jest aminokwasem, który może być transportowany do wnętrza komórki za pośrednictwem przenośnika aminokwasów obojętnych typu L, obecnych w błonie komórki [Ballatori 2002]. Jak na złość toksyczny metal w postaci metylortęci może wiązać się do aminokwasu biogennego - cysteiny, formując w ten sposób kompleks, który przypomina budową strukturalną metioninę, będącą aminokwasem endogennym, dzięki czemu może być transportowana do wnętrza komórki przy pomocy przenośnika aminokwasów typu L [Aschner i Clarkson 1988; Kerper i in. 1992]. Rtęć nie jest składnikiem potrzebnym do prawidłowego funkcjonowania organizmów zwierzęcych. Niektóre badania wykazują, że rtęć w związkach metylowych jest znacznie szybciej wchłaniana przez organizmy zwierzęce, a więc i bardziej toksyczna od rtęci metalicznej, podobnie jak metylortęć pochodzenia organicznego wykazuje aktywniejsze działanie w blokowaniu procesów metabolicznych od chemicznej soli metylortęci [Kabata-Pendias i Pendias 1979]. Związki metylowe rtęci wchłaniane są w ponad 90% przez człowieka drogą pokarmową [Kowalak 1991]. Kumulacja rtęci w tkankach zdrowych jelita grubego wynosi 0.012 µg•g-1 s.m., z kolei nieco mniejszą średnią zawartość ma śluzówka żołądka (0.008 µg•g-1 s.m). Należy podkreślić, że wyniki te są znacznie niższe od wyników uzyskanych w tkankach nowotworowych, co wskazuje na możliwy udział rtęci w transformacji nowotworowej - nie jest jasne jednak, czy podwyższona jej zawartość jest przyczyną czy skutkiem zaburzenia homeostazy. W przypadku żołądka stwierdzono negatywny wpływ metylortęci na ryzyko rozwoju raka żołądka, co jest związane z dostawaniem się do organizmu jej soli [Yorifuji i in. 2007]. Kumulacja rtęci jest wyższa w tkance guza żołądka (0.015 µg•g-1 s.m.), w porównaniu do zdrowej śluzówki (0.008 µg•g-1 s.m.). W przypadku jelita grubego sytuacja jest odwrotna - większą zawartością odznacza się śluzówka zdrowa (0.032 µg•g-1 s.m.), niż tkanka guza (0.017 µg•g-1 s.m.). Zróżnicowane miejsce koncentracji Hg w żołądku i jelicie grubym osób chorych, jest ważną informacją dla etiologii tych nowotworów. Wykazano, że różnice w zawartości poszczególnych pierwiastków w przewodzie pokarmowym zależą od: płci, stanu zdrowia, wieku, badanego odcinka przewodu pokarmowego oraz stanu patologicznego tkanki. Średnia zawartość rtęci jest wyższa w tkankach kobiet i mężczyzn chorych, w porównaniu do tkanek osób zdrowych obu płci. Spośród osób chorych, największą zawartość rtęci wykazano u mężczyzn z przedziału wiekowego 61-90 lat. Wykazano istotne różnice w zawartości rtęci w zależności od płci (najwięcej Hg skumulowane jest u chorych mężczyzn), co może być konsekwencją różnic w ilości spożywanych pokarmów, różnic w metabolizmie oraz narażeniem poprzez miejsce pracy (górnictwo, przemysł) [Ashe 2012]. 297 Marta Głogowska, Grzegorz Formicki, Bogdan Kosowski, Robert Stawarz LITERATURA Aschner M. Clarkson T.W. 1988. Uptake of methylmercury in the rat brain: effects of amino acid. W: Brain Research, 462: 31-39. Ashe K. 2012. Elevated mercury concentrations in humans of madre de dios, peru. W: PLoS One, 7, 3. Ballatori N. 2002. Transport of toxic metals by molecular mimicry. W: Environmental Health Perspectives, 110: 689-694. Hayes R.B. 1997. The carcinogenicity of metals in humans. W: Cancer Causes and Control 8, 371-385. Kabata - Pendias A., Pendias H. 1979. Pierwiastki śladowe w środowisku biologicznym. Wydawnictwo Geologiczne. Warszawa. 78-100, 100-145, 240-257. Key T.J., Allen N.E., Spencer E.A., Travis R.C. 2002. The effect of diet on risk of cancer. W: Lancet. 360: 861-868. Kotynia J. 2006. Rak żołądka. 49-55. W: Małecka – Panas E. Zarys gastroenterologii. Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego. Łódź. Kowalak A. 1991. Metale śmierci. CEEW. Krosno. 18-27. Tanaka T. 1997. Effect of diet on human carcinogenesis. W: Critical Reviews in Oncology/ Hematology. 25: 73-95. Van Halteren H.K., Taal B.G., Van Tinteren, H., Van Leeuwen F.E. 1995. Risk Factors for the Development of Oesophageal Cancer as a Second Primary Tumor. W: European Journal of Cancer. 11: 1836-1839. Warnakulasuriya S. 2009. Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer. W: Oral Oncology. 45: 309-316. Wronkowski Z. 2001. Epidemiologia nowotworów złośliwych przewodu pokarmowego. 15-77. W: Krawczyk M. Nowotwory przewodu pokarmowego. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa. Yorifuji T., Tsuda T., Kawakami N. 2007. Age standardized cancer mortality ratios in areas heavily exposed to methyl mercury. W: International Archives Occupational Environmental Health. 80: 679-688. 298 Kumulacja rtęci w ludzkich tkankach nowotworowych... Adres do korespondencji: mgr Marta Głogowska Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie e-mail: [email protected]; [email protected] dr hab. prof. UP Grzegorz Formicki Zakład Fizjologii Zwierząt i Toksykologii Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie lek. med. Bogdan Kosowski Niepubliczny Zakład Opieki Zdrowotnej PROSMED w Krakowie dr hab. prof. UP Robert Stawarz Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie Opiekun naukowy: dr hab. Robert Stawarz prof. UP 299 Beata Horecka EPISTEME 14/2012 s.301-307 ISSN 1895-4421 STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI DZIKO ŻYJĄCEJ LISA POSPOLITEGO (VULPES VULPES) GENETIC STRUCTURE OF WILD RED FOX (VULPES VULPES) POPULATION Abstrakt. Celem pracy była charakterystyka struktury genetycznej lisów pospolitych z różnych regionów Polski, w oparciu o analizę sekwencji mikrosatelitarnych. Materiał stanowiły próbki skór pozyskane od 27 lisów pospolitych z dwóch obszarów: woj. podkarpackie (n=20) i woj. lubelskie (n=7). Identyfikację alleli w obrębie 10 loci (Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019, Ren44K10, Ren13J22, Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20) przeprowadzono w oparciu o produkty PCR rozdzielone na drodze elektroforezy kapilarnej. Najbardziej polimorficzne okazało się locus INU014, w którym odnotowano dla populacji podkarpackiej największą liczbę alleli (12) oraz najwyższą wartość PIC (0,8553). Dla obu populacji indeks stopnia polimorfizmu we wszystkich loci przekroczył 0,5. W 5 loci zaobserwowano znaczne różnice pomiędzy heterozygotycznością obserwowaną a oczekiwaną. Dystans genetyczny (Nei, 1978) dzielący badane populacje wyniósł 0,1835. Słowa kluczowe: lis pospolity dziki, sekwencje mikrosatelitarne Summary. The aim of the study was to characterise the genetic structure of red foxes from different regions in Poland, based on microsatellite sequence analysis. Material were skin samples collected from 27 red foxes in two areas: Podkarpackie voivodeship (n=20) and Lubelskie voivoideship (n=7). Allele identification in 10 loci (Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019, Ren44K10, Ren13J22, Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20) was conducted on the basis of PCR products length separated by capillary electrophoresis. The most polymorphic was INU014 locus, at which the highest total number of alleles (12) and the highest PIC value (0,8553) were found in population from Podkarpackie voivoideship. For both populations polymorphic information content in all loci was higher than 0,5. In 5 loci considerable differences between observed and expected heterozygosity were noted. Genetic distance (Nei, 1978) among studied populations was 0,1835. Key words: wild red fox, microsatellite sequences 301 Beata Horecka WSTĘP Lis pospolity (Vulpes vulpes) jest gatunkiem o najszerszym zasięgu geograficznym spośród wszystkich dzikich ssaków drapieżnych, który obejmuje Eurazję, Amerykę Północną, północną Afrykę oraz Australię, gdzie został introdukowany przez człowieka w XIX wieku. W Polsce lisa pospolitego spotyka się na terenie całego kraju a drapieżnik ten stale zwiększa swoją liczebność. Wiąże się to w głównej mierze z wprowadzeniem szczepionek przeciw wściekliźnie, które zapobiegając rozprzestrzenianiu choroby przez lisy, jednocześnie ograniczyły naturalną selekcję osobników tego gatunku. Lisy pospolite zamieszkujące zarówno Polskę, jak i inne kraje czy kontynenty, charakteryzuje duża zmienność umaszczenia. Ma to związek z modyfikującym działaniem środowiska, głównie zaś z zamieszkiwanym obszarem geograficznym. Plastyczność fenotypu może powodować problemy z określeniem różnorodności genetycznej, w przypadku dokonywania oceny jedynie na podstawie zewnętrznych cech morfologicznych. Coraz większą popularnością cieszy się więc obecnie ekologia molekularna, obejmująca badania genetyczne zwierząt dziko żyjących., w tym genetykę populacji oraz identyfikację i ocenę różnorodności biologicznej gatunków. Skomplikowane zależności pomiędzy genotypem, fenotypem i środowiskiem utrudniają ocenę zmienności populacji na podstawie samych obserwacji. Wiarygodną metodą badawczą stają się w takim przypadku markery molekularne. Jednymi z często wykorzystywanych narzędzi służących analizie zmienności gatunków wolno żyjących są sekwencje mikrosatelitarne. Markery te mają kodominujący charakter, ponadto cechuje je wysoki polimorfizm oraz powszechność występowania w genomie i mendlowski model dziedziczenia. Sekwencje mikrosatelitarne znalazły również zastosowanie w badaniach obejmujących dzikie populacje należące do rodziny Canidae. Dotyczyły one między innymi lisów pospolitych [Oishi i in. 2011; Sacks i in. 2011; Swanson i in. 2005], lisów polarnych [Norén i in. 2011; Dalén i in. 2006; Nyström i in. 2006], czy wilków [Verardi i in. 2006; Vilà i in. 2002]. Celem pracy była zbadanie struktury genetycznej polskiej populacji dziko żyjącej lisa pospolitego oraz ocena zróżnicowania genetycznego w obrębie grup osobników pochodzących z dwóch regionów kraju, w oparciu o analizę polimorfizmu dziesięciu sekwencji mikrosatelitarnych. MATERIAŁ I METODY Analizie poddano 27 osobników lisa pospolitego (Vulpes vulpes) z dwóch rejonów Polski: województwo lubelskie (n=7) i województwo podkarpackie (n=20). Materiał do badań zwierząt dzikich stanowiły próbki tkanek – fragmenty skór. Izolację DNA wykonano przy pomocy zestawu QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN. Czystość i koncentrację wyizolowanego DNA 302 Struktura genetyczna poplacji dziko żyjącej lisa pospolitego... oceniano spektrofotometrycznie w aparacie BioPhotometer, firmy Eppendorf. Ocenę jakościową przeprowadzono poprzez rozdział elektroforetyczny w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny, w buforze 1xTBE, pod napięciem 70V w czasie 40 minut. Próby wizualizowano w świetle UV i archiwizowano przy pomocy programu ScionImage. Na podstawie piśmiennictwa do analizy wybrano 10 markerów mikrosatelitarnych pochodzących z genomu psa domowego: Ren02K21, Ren01E05, INU013, INU014, INU019, Ren44K10, Ren13J22, Ren39L15, Ren04M22, Ren02C20 [Jouquand i in. 2000; Ichikawa i in. 2002]. Reakcję PCR wykonano z zastosowaniem zestawu AmpliTag Gold 360 DNA Polymerase w termocyklerze MJ Research PTC 225 Tetrad. Charakterystykę starterów przedstawiono w tabeli 1. Locus INU013 INU014 INU19 Ren01E05 Ren02C20 Ren04M22 Ren02K21 Ren39L15 Ren13J22 Ren44K10 Sekwencja startera. F – Forward; R – Rewerse F:5’AGAGAAAAGCATCCAGTAAG3’ R:5’AAATGGTCTTCCTGTATCCT3’ F:5’ACATTTATCATAGTAAGTACCGAG3’ R:5’AAAACCACAAAACCTAACCT3’ F:5’TGACAAATAGGGTGGATGAT3’ R:5’GGTCTTTAGCAGGGACGAAT33 F:5’TCATCACTTCCTGCTCCATT3’ R:5’TCTCATGCCACACGGAACCT3’ F:5’AGAAATTGCATCACTCACAT3’ R:5’GCTGCTCCGAAAACTAACTT3’ F:5’AGAGAAAAGCATCCAGTAAG3’ R:5’AAATGGTCTTCCTGTATCCT3’ F:5’CTTAGTTTTCAGGCTTTCAG3’ R:5’TGATAGGAAGTAAAGATGTT3’ F:5’CTTGTTTTCTTTTGGATAGC3’ R:5’CTGCCTTGAAGAATGATAAA3’ F:5’TATTGCAACTGTCTTATGTA3’ R:5’TGTCTTAGTGATGGCTCCTG3’ F:5’CATATTGGACCTTCACAT3’ R:5’TTAACGCACAACTTCATC3’ Temperatura przyłączania starterów (°C) Barwnik 6-FAM 60 NED 6-FAM 6-FAM 52 VIC NED NED 6-FAM 50 VIC NED Tab. 1. Charakterystyka starterów dla analizowanych sekwencji mikrosatelitarnych Objętość jednej próby wynosiła 10 µl (9 µl mieszaniny reakcyjnej i 1 µl wyizolowanego DNA). Mieszanina reakcyjna dla loci INU013, INU014, INU019, Ren01E05, Ren02C20, Ren04M22 zawierała 1X bufor PCR, MgCl2 (2,7 mM), dNTP mix (0,2 mM), startery (0,3 pmol/µl - każdy) oraz 0,2 U polimerazy. Dla loci Ren02K21, Ren39L15 skład mieszaniny był następujący: 1X bufor PCR, MgCl2 (2,2 mM), dNTP mix (0,2 mM), startery (0,32 pmol/ 303 Beata Horecka µl - każdy) oraz 0,12 U polimerazy. W przypadku loci Ren13J22 i Ren44K10 mieszanina reakcyjna zawierała 1X bufor PCR, MgCl2 (2,2 mM), dNTP mix (0,2 mM), startery (0,31 pmol/µl - każdy) oraz 0,15 U polimerazy. Produkty PCR oceniono spektrofotometrycznie oraz w żelu agarozowym. Po reakcji PCR przeprowadzono elektroforezę fragmentów DNA w analizatorze kapilarnym 3100 Avant Genetic Analyzer firmy Applied Biosystems. Wyniki analizowano przy wykorzystaniu programu komputerowego: Gene Mapper v 3.5. Długości otrzymanych alleli ustalono z zastosowaniem GeneScan – 500 Rox Size Standard. Analizę statystyczną wyników przeprowadzono z wykorzystaniem programu komputerowego Popgene v 1.31 oraz Cervus v 3.0.3. Zmienność wewnątrz- i międzypopulacyjną oszacowano na podstawie następujących parametrów: indeks stopnia polimorfizmu (PIC), heterozygotyczność oczekiwana (He) i obserwowana (Ho), podobieństwo i dystans genetyczny według Nei’a (1978), a także współczynnik Wright’a (FST) i liczba migrantów na pokolenie (Nm). WYNIKI I DYSKUSJA Analizowano 10 sekwencji mikrosatelitarnych, w dwóch populacjach lisów pospolitych. We wszystkich loci większą liczbę alleli odnotowano dla lisów z województwa podkarpackiego (Tab. 2). Najwięcej alleli (12) stwierdzono dla tej grupy osobników w locus INU014. W trzech loci wystąpiło po 8 alleli. Były to loci Ren02K21, INU013 i Ren02K21. W przypadku lisów z województwa lubelskiego najwięcej alleli – po 7, odnotowano w loci INU014 oraz INU019. W obu analizowanych populacjach wartość indeksu stopnia polimorfizmu (PIC) dla wszystkich loci wynosiła >0,5, co świadczy o ich wysokiej informatywności. Najwyższy PIC w populacji lubelskiej stwierdzono w locus INU019 i wynosiła ona 0,8119. Dla populacji podkarpackiej najwyższą wartości PIC odnotowano w locus INU014 (0,8553). Kolejnym parametrem opisującym zróżnicowanie genetyczne jest heterozygotyczność. Najwyższa heterozygotyczność obserwowana wystąpiła u lisów z województwa podkarpackiego w locus Ren02K21 i wynosiła 1,0000. Wysoką wartość heterozygotyczności odnotowano także w loci INU014 (0,9000) oraz Ren01E05 i INU013 (0,8000). Najmniejszą heterozygotyczność obserwowaną (0,2000) stwierdzono w tej grupie w locus Ren13J22. W populacji lisów z terenu województwa lubelskiego najwyższa heterozygotyczność o wartości 0,8571 została odnotowana w locus Ren39L15. Wysoką heterozygotycznością charakteryzowały się także loci INU013 i INU019 (0,8333). Dla trzech loci: Ren01E05, Ren13J22, Ren04M22, heterozygotyczność obserwowana wynosiła 0,4286 i była to najniższa wartość odnotowana w tej grupie osobników. W obu analizowanych populacjach heterozygotyczność 304 Struktura genetyczna poplacji dziko żyjącej lisa pospolitego... obserwowana odbiegała od oczekiwanej. Największe różnice zaobserwowano dla obu populacji w loci Ren13J22 i Ren04M22, jak również w loci Ren01E05 dla populacji lubelskiej oraz Ren44K10 i Ren02C20 dla osobników z województwa podkarpackiego. W przypadku sześciu populacji lisa na wyspie Hokkaido (Japonia) wartości heterozygotyczności obserwowanej obliczone dla poszczególnych grup, łącznie dla 12 loci mikrosatelitarnych, zawierały się w przedziale 0,59 – 0,67 i jedynie dla populacji centralnej odbiegały istotnie od heterozygotyczności oczekiwanej [Oishi i in. 2011]. Z kolei Sacks i in. (2011) analizując polimorfizm 33 sekwencji mikrosatelitarnych w rodzimej i introdukowanej populacji lisa, nie zaobserwowali odchylenia od równowagi Hardy’ego-Weinberga w żadnym z loci. Odnotowane przez tych autorów średnie wartości heterozygotyczności dla wspomnianych populacji wynosiły 0,65 i 0,69. Lis dziki - lubelskie Locus La Zd (pz) Ren02K21 6 Ren01E05 PIC Lis dziki - podkarpackie Ho He La Zd (pz) PIC Ho He 288-302 0,6049 0,7143 0,6813 8 280-302 0,8117 1,0000 0,8538 5 402-410 0,6707 0,4286 0,7692 6 402-412 0,6892 0,8000 0,7462 INU013 6 169-185 0,7193 0,8333 0,8182 8 163-183 0,7930 0,8000 0,8372 INU014 7 158-184 0,7795 0,7143 0,8681 12 158-186 0,8553 0,9000 0,8910 INU019 7 266-278 0,8119 0,8333 0,9091 7 266-280 0,7705 0,7000 0,8192 Ren44K10 3 202-206 0,5674 0,7143 0,6923 7 198-210 0,7064 0,5500 0,7641 Ren13J22 4 408-418 0,6348 0,4286 0,7473 4 408-418 0,5293 0,2000 0,6244 Ren39L15 5 230-240 0,6707 0,8571 0,7692 6 220-236 0,6424 0,7000 0,7090 Ren04M22 6 179-191 0,7444 0,4286 0,8352 7 179-191 0,6933 0,6500 0,7385 Ren02C20 4 292-302 0,6499 0,7143 0,7582 8 292-308 0,7894 0,5000 0,8346 Tab. 2. Liczba (La) i zakres długości (Zd) alleli oraz indeks stopnia polimorfizmu (PIC), heterozygotyczność obserwowana (Ho) i oczekiwana (He) dla badanych populacji w poszczególnych loci Dla analizowanych populacji lisa pospolitego z terenu Polski obliczono także współczynnik Wright’a (FST). Jego wartość wyniosła 0,038, co świadczy o małym zróżnicowaniu genetycznym pomiędzy analizowanymi populacjami. Oishi i in. (2011) podali wartości współczynnika FST pomiędzy poszcze305 Beata Horecka gólnymi populacjami lisów z Japonii zawierające się w zakresie od 0,02 do 0,17, co wskazuje na zróżnicowany stopień odrębności pomiędzy osobnikami z różnych obszarów. Wartość współczynnika FST 0,08 oszacowana w badaniach Sacks’a i in. (2011) świadczy o umiarkowanym zróżnicowaniu genetycznym pomiędzy rodzimą i wprowadzoną populacją lisów kalifornijskich. Na podstawie współczynnika FST ustalono także w badaniach własnych liczbę migrantów na pokolenie (Nm), która kształtowała się na poziomie 6,34. Dodatkowo, na podstawie frekwencji alleli w badanych loci, obliczono podobieństwo oraz dystans genetyczny dzielący lisy pospolite z terenu województwa lubelskiego i podkarpackiego. Podobieństwo genetyczne pomiędzy wspomnianymi populacjami wynosiło 0,8323, zaś dzielący je dystans przyjął wartość 0,1835. WNIOSKI Wszystkie analizowane loci okazały się dla obu populacji wysoce polimorficzne, co świadczy o ich przydatności w analizach zmienności genetycznej. Zarówno niska wartość współczynnika Wright’a, jak również wynikająca z tego znaczna liczba migrantów na pokolenie, mogą być spowodowane małym dystansem geograficznym dzielącym badane populacje, gdyż województwo lubelskie i podkarpackie położone są w bezpośrednim sąsiedztwie. Potwierdza to również wysoka wartość podobieństwa genetycznego pomiędzy analizowanymi grupami, a co za tym idzie – niewielki dystans genetyczny. Taka sytuacja może mieć także wpływ na zaburzenie równowagi genetycznej, związane z efektem Wahlunda, gdyż próby gromadzone na granicy występowania dwóch populacji mogą być mylnie klasyfikowane i może to w efekcie prowadzić do pozornego niedoboru heterozygot. LITERATURA Dalén L., Kvaløy K., Linnell J. D. C., Elmhagen B., Strand O., Tannerfeldt M., Henttonen H., Fuglei E., Landa A., Angerbjörn A. 2006. Population structure in a critically endangered arctic fox population: does genetics matter? Molecular Ecology, 15 (10): 2809-2819. Ichikawa Y., Takahashi Y., Tsumagari S., Takeishi M., Ishihama K., Morita M., Kanemaki M., Minezawa M., Takahashi H. 2002. Identification and characterization of 40 dinucleotide microsatellites in the dog genome. Animal Genetics, 33: 377-405. Jouquand S., Priat C., Hitte C., Lachaume P., André C., Galibert F. 2000. Identification and characterization of a set of 100 tri- and dinucleotide microsatellites in the canine genome. Animal Genetics, 31: 266-272. 306 Struktura genetyczna poplacji dziko żyjącej lisa pospolitego... Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small numbers of individuals. Genetics, 89: 583-590. Norén K., Carmichael L., Dalén L., Hersteinsson P., Samelius G., Fuglei E., Kapel C. M. O., Menyushina I., Strobeck C., Angerbjörn A. 2011. Arctic fox Vulpes lagopus population structure: circumpolar patterns and processes. Oikos, 120 (6): 873–885. Nyström V., Angerbjörn A., Dalén L. 2006. Genetic consequences of a demographic bottleneck in the Scandinavian arctic fox. Oikos, 114 (1): 84-94. Oishi T., Uraguchi K., Takahashi K., Masuda R. 2011. Population Structures of the Red Fox (Vulpes vulpes) on the Hokkaido Island, Japan, Revealed by Microsatellite Analysis. Journal of Heredity, 102 (1):38–46. Sacks B. N., Moore M., Statham M. J., Wittmer H. U. 2011. A restricted hybrid zone between native and introduced red fox (Vulpes vulpes) populations suggests reproductive barriers and competitive exclusion. Molecular Ecology, 20: 326–341. Swanson B. J., Fuhrmann R. T., Crabtree R. L. 2005. Elevational isolation of red fox populations in the Greater Yellowstone Ecosystem. Conservation Genetics, 6: 123-131. Verardi A., Lucchini V. Randi E. 2006. Detecting introgressive hybridization between freeranging domestic dogs and wild wolves (Canis lupus) by admixture linkage disequilibrium analysis. Molecular Ecology, 15 (10): 2845-2855. Vilà C., Sundqvist A. K., Flagstad Ø., Seddon J., Björnerfeldt S., Kojola I., Casulli A., Sand H., Wabakken P., Ellegren H. 2003. Rescue of a severely bottlenecked wolf (Canis lupus) population by a single immigrant. Proceedings of the Royal Society B (Biological Sciences), 270: 91-97. Adres do korespondencji: mgr inż. Beata Horecka Katedra Biologicznych Podstaw Produkcji Zwierzęcej Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie ul. Akademicka 13, 20-950 Lublin e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Grażyna Jeżewska-Witkowska Praca naukowa finansowana ze środków NCBiR, projekt rozwojowy NR 12-0140-10 307 Andrzej Jurkowski Andrzej Latusek EPISTEME 14/2012 s.309-315 ISSN 1895-4421 ANALIZA OBECNOŚCI MARKERA XCFD81-5D U ŻYTA OZIMEGO ANALYSIS OF A MARKER XCFD81-5D PRESENCE IN WINTER RYE Abstrakt. Żyto ozime (Secale cereale L.) jest jednym z najważniejszych zbóż uprawianych w Polsce. Mączniak prawdziwy (Blumeria graminis) może powodować w sprzyjających warunkach dla jego rozwoju straty w plonie żyta w wysokości nawet do 20%. Regulacja odporności żyta na mączniaka nie jest tak dokładnie poznana jak u pszenicy. Dotychczas nie wykonywano żadnych badań molekularnych w tym zakresie. Natomiast u pszenicy zidentyfikowano łącznie 53 różnych alleli odporności na mączniaka prawdziwego (Pm) i dla większości z nich wykazano markery molekularne ściśle sprzężone z tymi genami. W pracy podjęto próbę identyfikacji genu odporności na mączniaka prawdziwego u żyta ozimego za pomocą analizy stopnia podatności na porażenie przez mączniaka prawdziwego oraz analizy występowania markera Xcfd81-5D, sprzężonego z genem odporności na mączniaka prawdziwego Pm2 u pszenicy. Analizom poddano łącznie 397 linii wsobnych żyta ozimego. Słowa kluczowe: pszenica, żyto ozime, mączniak prawdziwy, geny odporności Summary. Winter rye (Secale cereale L.) is one of the most important cereals in Poland. Powdery mildew (Blumeria graminis) may causes losses of the rye yield up to 20%. Adjusting the resistance of wheat to powdery mildew is not as well understood as in wheat. Not yet performed any molecular studies in this field. In contrast, a total of 53 different alleles for resistance to powdery mildew (Pm) was identified in wheat, and for most of them are molecular markers tightly linked to those genes. This paper attempts to identify a gene for resistance to powdery mildew in winter rye by analyzing the degree of susceptibility to infection by powdery mildew and analysis of a marker Xcfd81-5D presence, linked with a Pm2, gene for resistance to powdery mildew in wheat. Analyzes were a total of 397 inbred lines of winter rye. Key words: wheat, winter rye, powdery mildew, resistance genes 309 Andrzej Jurkowski, Andrzej Latusek WSTĘP Żyto ozime (Secale cereale L.) jest jednym z najważniejszych zbóż uprawianych w Polsce. Pod względem powierzchni upraw zajmuje drugie miejsce. Do najważniejszych chorób grzybowych liści należy mączniak prawdziwy (Blumeria graminis f. sp. secalis), który może powodować w sprzyjających warunkach dla jego rozwoju straty w plonie żyta w wysokości nawet do 20%. Regulacja odporności żyta na mączniaka prawdziwego nie jest tak dokładnie poznana jak u pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.). Jak dotąd u żyta rozpoznano 9 genów warunkujących odporność na porażenie przez mączniaka prawdziwego. Są to geny Pm1a, Pm1b, Pm7 (1RS), Pm2 i Pm8 (2RL), Pm3 (3RS), Pm6 (4R), Pm4 (5RL), Pm5 i Pm(?) (6RL) [Schlegel i in. 1998]. Natomiast u pszenicy zidentyfikowano łącznie 53 różne allele odporności na mączniaka prawdziwego (Pm), i dla większości z nich wykazano markery molekularne ściśle sprzężone z tymi genami [Ma i in. 2011; Huang i Röder 2004; Miranda i in. 2006; 2007; Blanco i in. 2008; Perugini i in. 2008; Luo i in. 2009; Li i in. 2009; Hua i in. 2009; He i in. 2009]. Uprawa odmian odpornych oferuje skuteczne, ekonomiczne i ekologicznie bezpieczne podejście do wyeliminowania użycia fungicydów i do zmniejszenia strat plonów spowodowanych przez mączniaka prawdziwego. Natomiast zidentyfikowanie markerów molekularnych ściśle sprzężonych z genami odporności na mączniaka prawdziwego u żyta znajdzie praktyczne zastosowanie w procesie hodowli nowych odmian. Identyfikacja genów odporności na tego patogena umożliwi hodowcom szybsze wytwarzanie odmian odpornych na mączniaka stosując selekcję przy użyciu markerów molekularnych (MAS- marker assisted selection). Selekcja przy użyciu markerów molekularnych posiada wiele zalet: jest niezależna od stadium rozwojowego rośliny i warunków środowiskowych (można ją stosować już w bardzo wczesnym stadium rozwojowym), przy czym nie niszczy badanego materiału. Wyprowadzenie odmian tego zboża odpornych na mączniaka przyczyni się z kolei do zmniejszenia strat w plonie. W zależności od stopnia odporności danej odmiany, możliwe będzie ograniczenie, lub całkowite zaniechanie oprysków fungicydami. Zwiększy to opłacalność produkcji żyta. Przyczyni się ponadto do zmniejszenia zanieczyszczania środowiska. Celem pracy była analiza obecności markera Xcfd81-5D wśród badanych genotypów żyta. Marker Xcfd81-5D jest sprzężony z genem Pm2 u pszenicy [Qiu i in. 2006]. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiło 397 linii wsobnych żyta przekazanych przez firmy hodowlane oraz wchodzących w skład kolekcji własnej Katedry Genetyki Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. 310 Analiza obecności markera XCFD81-5D... Pierwszą fazą badań była ocena podatności genotypów żyta na porażenie mączniakiem prawdziwym. Drugą fazę badań stanowiła analiza obecności markera Xcfd81-5D wśród wybranych genotypów żyta. Analiza ta była przeprowadzona metodą PCR, z wykorzystaniem starterów właściwych dla markera Xcfd81-5D. Ocenę podatności genotypów żyta na porażenie przez Blumeria graminis przeprowadzono w doświadczeniu szklarniowym. Wykorzystano pięciostopniową skalę porażenia (0–4), gdzie 0 – oznacza brak widocznych objawów infekcji; 1 - wysoka odporność - słabo rozwinięta grzybnia bez zarodnikowania - silne nekrozy i chlorozy; 2 - średnia odporność - widoczne słabe zarodnikowanie - słabe nekrozy i chlorozy; 3 – średnia podatność - średnio rozwinięta grzybnia i zarodnikowanie; 4 - dobrze rozwinięta grzybnia i obfite zarodnikowanie. Szklarniowe doświadczenie infekcyjne przeprowadzano z wykorzystaniem własnej polowej populacji patogena utrzymywaną na siewkach wrażliwej odmiany żyta oraz inokulum otrzymanym z Hodowli Roślin Smolice Sp. z o. o. Grupa IHAR. Inokulację przeprowadzano w fazie trzech liści metodą „miotełkową”. Następnie rośliny umieszczono w kamerze o wysokiej wilgotności. Stopień porażenia roślin oceniany był po siedmiu dniach od inokulacji, posługując się wspomnianą skalą. Genomowy DNA z roślin wyizolowano metodą ekstrakcji fenolowej opracowaną przez Junghansa i Metzlaffa (1990). Materiał do izolacji stanowiły liście 22 siewek genotypów żyta: 11 o największym i 11 najmniejszym stopniu porażenia przez Blumeria graminis. Ilość oraz czystość wyizolowanego DNA oznaczano spektrofotometrycznie. Źródłem matrycowego DNA do reakcji PCR były izolaty genomowego DNA badanych genotypów żyta. Amplifikację przeprowadzono przy użyciu polimerazy DreamTaq Polymerase firmy Fermentas. Warunki termiczne reakcji PCR, sekwencje starterów, jak również skład mieszaniny reakcyjnej był zgodny z danymi umieszczonymi w bazie danych na stronie internetowej http://wheat.pw.usda.gov. Analizom poddano genotypy żyta najmniej podatne na porażenie mączniakiem, następnie wykonano amplifikację dla genotypów wrażliwych w celu analizy różnic uzyskiwanych produktów amplifikacji. Produkty amplifikacji analizowano elektroforetycznie. W każdym rozdziale stosowano marker wielkości fragmentów DNA (MassRuler DNA Ladder #SM0403, Fermentas) jako standard zewnętrzny i linię referencyjną pszenicy Ulka/8*CC jako próbę kontrolną swoistości reakcji PCR. Żele barwiono wodnym roztworem bromku etydyny (5 μg/ml) przez 20 minut. Wybarwione żele analizowano w świetle UV i archiwizowano w formie plików TIFF. 311 Andrzej Jurkowski, Andrzej Latusek WYNIKI W przeprowadzonym teście szklarniowym oceną podatności na porażenie przez Blumeria graminis f. sp. secalis objęto ogółem 379 genotypów. Średni stopień porażenia badanych materiałów żyta był istotnie różny i wynosił od 1 do 4 (dane nie pokazane). Spośród badanych genotypów żyta wybrano 11 linii wsobnych żyta o najniższym stopniu porażenia i 11 linii wsobnych o najwyższym stopniu porażenia mączniakiem prawdziwym. Analiza produktów amplifikacji wśród genotypów odpornych (o najmniejszym stopniu porażenia) wykazała obecność markera Xcfd81-5D (produkt wielkości 283 pz), wśród 10 genotypów (Rys. 1.). Natomiast wśród produktów amplifikacji dla linii nieodpornych na porażenie mączniakiem marker Xcfd81-5D występuje u dziewięciu genotypów (Rys. 2). Rys. 1. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji dla linii wsobnych żyta ozimego o najmniejszej podatności na porażenie mączniakiem prawdziwym. M – marker, K – kontrola- Ulka/8*CC, 1 – UP77, 2 – UP78, 3 – UP259, 4 – UP269, 5 – UP366, 6 – UP382, 7 – UP2, 8 – UP76, 9 – UP90, 10 – UP260, 11 – UP287 Rys. 2. Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji dla linii wsobnych żyta ozimego o największej podatności na porażenie mączniakiem prawdziwym. M – marker, K – kontrola - Ulka/8*CC, 1 – UP397, 2 – UP390, 3 – UP389, 4 – UP388, 5 – UP386, 6 – UP385, 7 – UP384, 8 – UP379, 9 – UP378, 10 – UP377, 11 – UP374 312 Analiza obecności markera XCFD81-5D... DYSKUSJA I WNIOSKI Markery molekularne są obecnie szeroko wykorzystywane do mapowania genów i innych badań genetycznych, ponieważ nie są zmienne pod wpływem warunków środowiskowych i fazy wzrostu badanego organizmu. Wykorzystanie markerów molekularnych w technice PCR, do oznaczania regionów genomowych są bardziej wydajne w selekcji przy użyciu markerów (MAS), ze względu na małą ilość wymaganej matrycy DNA i łatwe w badaniu dużych populacji. Zidentyfikowanie markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności na choroby, umożliwia uproszczenie działań hodowlanych takich jak: wyprowadzanie nowych odmian [Bonnett i in. 2005], wyprowadzanie linii ‘near isogenic line’ [Zhou i in. 2005], a także piramidyzacja genów oporności w pojedynczych genotypach. Ułatwienie działań hodowlanych możliwe jest dzięki użyciu selekcji przy użyciu markerów (MAS). MAS zwiększa efektywność konwencjonalnej hodowli roślin, poprzez selekcję roślin posiadających markery molekularne powiązane z korzystnymi cechami [Gupta i in. 1999]. Wśród 397 linii wsobnych żyta ozimego nie stwierdzono występowania genotypów całkowicie odpornych na porażenie mączniakiem prawdziwym. Dla wszystkich badanych linii wsobnych średnia ocena stopnia porażenia z trzech powtórzeń wynosiła od 1 do 4. Analiza molekularna linii wsobnych żyta ozimego wybranych do dalszych badań stwierdziła występowanie markera Xcfd81-5D zarówno wśród linii odporniejszych na porażenie mączniakiem prawdziwym jak również wśród linii podatnych na porażenie tym patogenem. Z otrzymanych wyników można wnioskować, że marker Xcfd81-5D nie jest markerem selekcyjnym odporności na mączniaka prawdziwego u żyta ozimego. Możliwość skutecznej selekcji i hodowli odpornościowej żyta ozimego będzie możliwa dopiero w momencie zidentyfikowania u żyta ozimego markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności na mączniaka prawdziwego. Dlatego konieczne jest nadal poszukiwanie markerów molekularnych sprzężonych z tą cechą u żyta ozimego. 313 Andrzej Jurkowski, Andrzej Latusek LITERATURA Blanco A., Gadaleta A., Cenci A., Carluccio A., Abdelbacki A., Simeone R. 2008. Molecular mapping of the novel powdery mildew resistance gene Pm36 introgressed from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat. Theor. Appl. Genet., 117: 135-142. Bonnett D. G., Rebetzke G. J., Spielmeyer W. 2005. Strategies for efficient implantation of molecular markers in wheat breeding. Mol. Breed., 15: 75-85. Gupta P. K., Varshney R. K., Sharma P. C., Ramesh B. 1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. Plant Breeding, 118: 369-390 He R., Chang Z., Yang Z., Yuan Z., Zhan H., Zhan X., Liu J. 2009. Inheritance and mapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgressed from Thinopyrum intermedium into wheat. Theor. Appl. Genet., 118: 1173-1180 Hua W., Liu Z., Zhu J., Xie Ch., Yang T., Zhou Y., Duan X., Sun Q., Liu Z. 2009. Identification and genetic mapping of pm42, a new recessive wheat powdery mildew resistance gene derived from wild emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides). Theor. Appl. Genet., 119: 223–230 Huang X.Q., Röder M.S. 2004. Molecular mapping of powdery mildew resistance genes in wheat: A review. Euphytica, 137: 203-223 Junghans H., Metzlaff M. 1990. A simple and rapid method for the preparation of total DNA. Biotechniques, 8:176. Li G., Fang T., Zhang H., Xie C., Li H., Yang T., Nevo E., Fahima T., Sun Q., Liu Z. 2009. Molecular identification of a new powdery mildew resistance gene Pm41 on chromosome 3BL derived from wild emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides). Theor Appl Genet 119: 531-539 Luo P. G., Luo H. Y., Chang Z. J., Zhang H. Y., Zhang M., Ren Z. L. 2009. Characterization and chromosomal location of Pm40 in common wheat: a new gene for resistance to powdery mildew derived from Elytrigia intermedium. Theor Appl Genet, 118: 1059-1064 Ma H., Kong Z., Fu B., Li N., Zhang L., Jia H., Ma Z. 2011. Identification and mapping of a new powdery mildew resistance gene on chromosome 6D of common wheat. Theor. Appl. Genet., 123: 1099-106 Miranda, L. M., Murphy J. P., Marshall D., Leath S., 2006. Pm34: a new powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops tauschii Coss. to common wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 113: 1497—1504. 314 Analiza obecności markera XCFD81-5D... Miranda, L. M., Murphy J. P., Marshall D., Cowger C., Leath S., 2007. Chromosomal location of Pm35, a novel Aegilops tauschii derived powdery mildew resistance gene introgressed into common wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 114: 1451-1456 Perugini, L., J. Murphy, D. Marshall, Brown-Guedira G., 2008. Pm37, a new broadly effective powdery mildew resistance gene from Triticum timopheevii. Theor. Appl. Genet., 116: 417-425. Qiu Y. C., Sun X. L., Zhou R. H., Kong X. Y., Zhang S. S., Jia J. Z. 2006. Identification of microsatellite markers linked to powdery mildew resistance gene Pm2 in wheat. Cereal Research Communications, 34: 1267-1273 Schlegel R., Melz G., Korzun V. 1998. Genes, marker and linkage data of rye (Secale cereale L.): 5th updated inventory. Euphytica, 101: 23-67 Zhou R., Zhu Z., Kong X., Huo N. Tian Q., Li P., Jin C., Dong Y., Jia J. 2005. Development of wheat near-isogenic lines for powdery mildew resistance. Theor. Apel. Genet., 110: 640-648 Adres do korespondencji: mgr Andrzej Jurkowski, mgr Andrzej Latusek Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Henryk Bujak, prof. nadzw. Linię pszenicy posiadającą gen Pm2, Ulka/8*CC, pozyskano dzięki uprzejmości Dr. Susanne Brunner, Institute of Plant Biology, University of Zürich, Szwajcaria. Projekt został sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki, numer grantu 7773/B/P01/2011/40. 315 Agata Kapturowska Wanda Zamojska Izabela Stolarzewicz Ewa Białecka-Florjańczyk EPISTEME 14/2012 s.317-323 ISSN 1895-4421 SUBSTRATY HYDROFOBOWE W PODŁOŻACH STYMULUJĄCYCH AKTYWNOŚĆ LIPOLITYCZNĄ DROŻDŻY YARROWIA LIPOLYTICA HYDROPHOBIC SUBSTRATES IN MEDIA STIMULATING LIPOLYTIC ACTIVITY OF YARROWIA LIPOLYTICA YEAST Abstrakt. Oliwa z oliwek oraz kwasy tłuszczowe takie jak kwas oleinowy czy palmitynowy są powszechnie stosowanymi w badaniach induktorami produkcji lipaz – ważnej grupy enzymów hydrolitycznych o szerokim zastosowaniu w przemyśle spożywczym, paliwowym, chemicznym oraz farmaceutycznym. Źródła literaturowe wskazują na istotny wpływ obecności i zawartości kwasu oleinowego w olejach stosowanych w podłożach na mikrobiologiczną produkcję lipaz. Celem pracy było zbadanie związku pomiędzy rodzajem zastosowanego oleju a aktywnością enzymów zewnątrzkomórkowych produkowanych przez komórki drożdży Yarrowia lipolytica KKP 379. Wyniki badań potwierdzają, iż najwyższą aktywnością lipolityczną charakteryzowały się komórki drożdży hodowane na podłożu z oliwą z oliwek oraz olejem słonecznikowym. Ponadto zauważono, że nie zawsze wysoka aktywność lipaz była związana z wysoką zawartością kwasu oleinowego w olejach stosowanych jako jedyne źródło węgla w pożywkach. Słowa kluczowe: Yarrowia lipolytica, podłoże stymulujące, olej, lipaza Summary. Olive oil and free fatty acids such as oleic acid and palmitic acid are inducers of lipase production commonly used in laboratories. Lipases are very important hydrolytic enzymes widely applicable in food, chemical, pharmaceutical and fuel industry. There is pointed out an important impact of the oleic acid presence and its content in oils for microbiological lipase production. The aim of this study was to evaluate the connection between the oil used in culture medium and the extracellular activity of lipases synthesized by Yarrowia lipolytica KKP 379 cells. The results confirmed that the highest lipolytic activity was measured for yeast cells cultured in medium with olive oil and sunflower oil. There can be also concluded that the high activity of lipases is not always correlated with the high content of oleic acids in oils used as a sole carbon source in medium. Key words: Yarrowia lipolytica, stimulating medium, oil, lipase 317 Agata Kapturowska, Wanda Zamojska, Izabela Stolarzewicz, Ewa Białecka-Florjańczyk WSTĘP Lipazy to jedna z najważniejszych grup enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym, chemicznym, w tym w produkcji detergentów czy paliwa typu biodiesel. Enzymy te cechuje ogromna różnorodność, a syntezują je zarówno komórki roślinne, zwierzęce jak i mikroorganizmy. Na ryku dostępnych jest kilkadziesiąt oczyszczonych preparatów enzymów lipolitycznych pochodzenia mikrobiologicznego oferowanych przede wszystkim przez koncerny Novo Nordisk, Amano, Bicatalysts, a głównymi producentami komercyjnie dostępnych lipaz są bakterie: Burkholderia cepacia, Pseudomonas fluorescens, Penicillium spp., Bacillus lentus, Chromobacterium viscosum, Alcaligenes sp., drożdże: Candida spp. i Yarrowia lipolytica oraz pleśnie: Mucor miehei, Thermomyces lanuginosis i Th. lanuginous (Humicola), Rhizopus oryzae, Aspergillus sp. [Dominguez i in. 2003, Pancreac’h, Baratti, 2001]. W celu uzyskania pożądanych enzymów lipolitycznych należy brać pod uwagę odpowiedni rodzaj, gatunek, a nawet szczep drobnoustroju, który posiada zdolność do syntezy tych białek, jak również optymalne warunki jego hodowli. Na wydajność biosyntezy lipaz oraz ich właściwości wpływa wiele czynników. Za podstawowe kryterium uznaje się skład pożywki hodowlanej, w tym źródło azotu, węgla oraz obecność substancji indukujących i stężenie soli nieorganicznych. Istotną rolę odgrywają również warunki hodowli drobnoustrojów, w tym takie parametry jak: temperatura, pH podłoża oraz stężenie rozpuszczonego tlenu [Corzo i Revah 1999; Sharma i in. 2001, Dominguez i in. 2003]. Stosując różne modyfikacje warunków hodowli mikroorganizmów, można wpływać na osiągnięcie maksymalnej wydajności otrzymywania lipaz o wysokiej aktywności, czego rezultatem jest niższa cena uzyskanego preparatu enzymatycznego. Większość doniesień literaturowych sugeruje, że wolne kwasy tłuszczowe, a w szczególności kwas oleinowy obecny w oliwie z oliwek, są dobrymi induktorami produkcji lipaz [Papanikolau i Aggelis 2003, Barth i Gaillardin 1997, Darvishi i in. 2009]. Tymczasem wyniki badań własnych wskazują na inne czynniki decydujące o pozytywnym wpływie oleju jakim jest oliwa z oliwek na aktywność lipolityczną drożdży Y. lipolytica. Celem pracy było zbadanie związku pomiędzy rodzajem zastosowanego oleju, a aktywnością lipaz zewnątrzkomórkowych produkowanych przez komórki drożdży Yarrowia lipolytica KKP 379. 318 Substraty hydrofobowe w podłożach stymulujących aktywność lipolityczną... MATERIAŁY I METODY Badania prowadzono z użyciem szczepu drożdży Yarrowia lipolytica KKP 379, należącego do Kolekcji Kultur Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie. Podłoża stymulujące aktywność lipolityczą zawierały w 1000 cm3: 20g peptonu, 10g ekstraktu drożdżowego oraz 25 cm3 odpowiedniego oleju roślinnego (oliwę z oliwek, olej rzepakowy, olej słonecznikowy, olej ryżowy lub olej z owoców czerwonej palmy i canoli). pH podłoża wynosiło 5,0 ± 0,1. 100 cm3 podłoża zaszczepiano 0,1 cm3 18-godzinnej hodowli inokulacyjnej prowadzonej w podłożu YPG. Hodowlę prowadzono na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej w temperaturze 28oC przez 67 godzin. Plon biomasy oznaczono po odwirowaniu płynu pohodowlanego. Aktywność lipolityczną płynu pohodowlanego zbadano metodą spektrofotometryczną wg Kapturowskiej i in. [2012], opartą na reakcji hydrolizy laurynianu p-nitrofenylu. WYNIKI I DYSKUSJA Poziom aktywności enzymów lipolitycznych pochodzenia mikrobiologicznego jest uzależniony w znacznym stopniu od hydrofobowych źródeł węgla w pożywce. W badaniach w skali laboratoryjnej najczęściej stosowanym substratem o charakterze hydrofobowym jest oliwa z oliwek [Gulati i in. 1999]. Z uwagi na wysoki koszt hodowli drożdży w podłożu z oliwą z oliwek w skali przemysłowej podjęto próbę oceny wpływu innych lipidowych źródeł węgla na aktywację produkcji lipaz przez drożdże Yarrowia lipolytica KKP 379. Przeprowadzone doświadczenia wskazują, iż rodzaj oleju stosowanego w podłożu jako jedyne źródło węgla nie wpływa na plon biomasy drożdży, ale w znaczący sposób może zmienić jej zewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną. Wyniki naszych badań potwierdzają, że najlepszymi stymulatorami aktywności lipolitycznej są oliwa z oliwek (0,206 U/cm3) oraz olej słonecznikowy (0,201 U/cm3), natomiast istotnie niższą aktywność zaobserwowano w przypadku hodowli drożdży w pożywkach z olejem rzepakowym, olejem ryżowym oraz olejem z owoców czerwonej palmy i canoli (odpowiednio 0,133; 0,104; 0,120 U/cm3 , rys. 1). Za zewnątrzkomórkową aktywność lipolityczną wykazywaną przez komórki drożdży z rodzaju Yarrowia odpowiada w większości gen LIP2 kodujący zewnątrzkomórkową lipazę Lip2p [Turki i in. 2010]. Induktorem promotora POX2, pod którego kontrolą znajduje się wspomniany gen, jest kwas oleinowy [Barth i Gaillardin 1997, Darvishi i in. 2009], którego zawartość w oliwie z oliwek waha się od 55 do 85%. Dzięki temu, jak wynika z doniesień literaturowych, olej ten jest najlepszym aktywatorem syntezy lipaz. 319 Agata Kapturowska, Wanda Zamojska, Izabela Stolarzewicz, Ewa Białecka-Florjańczyk Rys. 1. Aktywność płynu pohodowlanego oraz plon biomasy w hodowli drożdży Yarrowia lipolityca KKP 379 po hodowli w podłożach zawierających źródła węgla o charakterze hydrofobowym W celu oceny faktycznego wpływu kwasu oleinowego na aktywność lipolityczną drożdży Y. lipolytica, zastosowano w pożywkach oleje o różnej jego zawartości. Porównując skład użytych olejów (Tab. 1), stwierdzono, iż wprawdzie największą ilość kwasu oleinowego zawiera oliwa z oliwek, to jednak olej palmowy i ryżowy cechuje 10-cio krotnie wyższa jego zawartość w porównaniu z olejem słonecznikowym. Natomiast w oleju rzepakowym procentowy udział kwasu oleinowego jest najmniejszy. Przyjmując za przyczynę wysokiej aktywności lipolitycznej zawartość kwasu oleinowego w pożywce, powinniśmy zaobserwować najniższą aktywność w przypadku oleju rzepakowego i słonecznikowego. Tymczasem wyniki uzyskane dla podłoży zawierających olej palmowy i ryżowy były porównywalne z wynikami z podłoża z olejem rzepakowym, a ich wartość o połowę niższa niż w przypadku zastosowania oleju słonecznikowego, który pozwolił na uzyskanie aktywności porównywalnej z rezultatami z hodowli z oliwą z oliwek. Zatem można przypuszczać, iż sumaryczna zawartość kwasu oleinowego w oleju stosowanym jako lipidowe źródło węgla nie jest jedynym czynnikiem determinującym poziom aktywności lipolitycznej. Z doniesień literaturowych wynika, że komórki drożdży są w stanie wybiórczo przyswajać z pożywki określone kwasy tłuszczowe - Papanikolau i Aggelis zaobserwowali preferencyjne wykorzystanie kwasów C12:0, C14:0, C18:1, C18:2 i C18:3 z mieszaniny różnych kwasów tłuszczowych w wyjściowej pożywce [Papanikolau i Aggelis 2003]. 320 Substraty hydrofobowe w podłożach stymulujących aktywność lipolityczną... Rodzaj oleju Profil kwasów tłuszczowych [%] Kwas oleinowy Kwas linolowy Kwas palmitynowy oliwa z oliwek 71 10 13 olej słonecznikowy 19 68 7 olej rzepakowy 4 56 26 olej palmowy 44 40 10 olej ryżowy 42 37 16 Tab. 1. Profil kwasów tłuszczowych wybranych olejów roślinnych [Gunstone i in. 1994, Wang i in. 2008] Zatem należałoby wziąć pod uwagę nie tylko zawartość kwasu oleinowego lecz także linolowego, a ich sumaryczna ilość dla wszystkich badanych przez nas olejów z wyjątkiem rzepakowego była zbliżona lub przekraczała 80 %. Jednak to spostrzeżenie wyjaśnia w sposób bezpośredni korzystny wpływ jedynie oleju słonecznikowego, natomiast różnice w stosunku do olejów palmowego i ryżowego mogą wynikać z budowy cząsteczek występujących w nich triacylogliceroli. W szczególności dotyczy to pozycji zajmowanej przez poszczególne kwasy tłuszczowe w cząsteczce, ponieważ jak wiadomo determinuje ona szybkość hydrolizy wiązania estrowego. W związku z tym efektywna zawartość wolnych kwasów tłuszczowych w pożywce może nie być zgodna z sumarycznym profilem kwasów tłuszczowych w oleju. Lipazy produkowane przez drożdże Yarrowia lipolytica hydrolizują preferencyjnie wiązania estrowe w pozycjach 1,3 [Fickers i in. 2005], a zatem cząsteczki kwasów, które znajdują się w tych pozycjach są najłatwiej uwalniane do podłoża, a następnie selektywnie wykorzystywane przez komórki drożdży z rodzaju Yarrowia. Zasadne jest więc kontynuowanie badań nad wpływem położenia kwasów tłuszczowych w cząsteczkach triacylogliceroli różnych olejów na aktywność lipaz w celu zweryfikowania tej hipotezy. WNIOSKI • Najwyższą aktywnością lipolityczną charakteryzowały się komórki drożdży hodowane na podłożu z oliwą z oliwek oraz olejem słonecznikowym. • Wysoka zawartość kwasu oleinowego w olejach stosowanych jako jedyne źródło węgla w pożywkach nie jest jedynym czynnikiem wpływającym na wysoką aktywność lipaz produkowanych przez drożdże Yarrowia lipolytica. 321 Agata Kapturowska, Wanda Zamojska, Izabela Stolarzewicz, Ewa Białecka-Florjańczyk LITERATURA Barth G., Gaillardin C. 1997. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol., 19 (4): 219-237. Corzo G. i Revah S. 1999. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681. Bioresour. Technol., 70: 173–180. Darvishi F., Nahvi I., Zarkesh-Esfahani H., Momenbeik F. 2009. Effect of plant oils upon lipase and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast. J. Biomed. Biotechnol., 1-7. Dominguez A., Deive F.J., Sanroman A., Longo M.A. 2003. Effect of lipids and surfactants on extracellular lipase production by Yarrowia lipolytica. J. Chem. Technol. Biotechnol., 78: 1166-1170. Fickers P., Nicaud J.-M., Destain J., Thonart P. 2005. Involvement of Hexokinase Hxk1 in glucose catabolite repression of LIP2 encoding extracellular lipase in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr. Microbiol., 50: 133-137. Gulati R., Saxena R.K., Gupta R., Yadav R.P., Sheba Davidson W. 1999. Parametric optimization of Aspergillus terreus lipase production and its potential in ester synthesis. Process Biochem., 35: 459-464. Gunstone F.D., Harwood J.L., Padley F.B. 1994. The Lipid Handbook. Second edition. Chapman & Hall, London. Kapturowska A., Stolarzewicz I., Krzyczkowska J., Białecka-Florjańczyk E. 2012. Studies on lipolytic activity of sonicated enzymes from Yarrowia lipolytica. Ultrason. Sonochem., 19: 186-191. Pancreac’h G., Baratti J.C. 2001. Comparison of hydrolytic activity in water and heptane for Thiry-two commercial lipase preparations. Enz. Microb. Technol., 28: 473-479. Papanikolaou S., Aggelis G. 2003. Selective uptake of fatty acids by the yeast Yarrowia lipolytica. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 105: 651-655. Sharma R., Chisti Y., Banerjee U. Ch. 2001. Production, purification, characterization and application of lipases. Biotechnol. Adv., 19: 627-666. Turki S., Ayed A., Chalghoumi N., Weekers F., Thonart P., Kallel H. 2010. An enhanced process for the production of a highly purified extracellular lipase in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Biochem. Biotechnol., 160: 1371-1385. Wang D., Xu Y., Shan T. 2008. Effects of oil and oil-related substrates on the synthetic activity of membrane- bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of the lipase fermentation media. Biochem. Eng. J., 41: 30-37. 322 Substraty hydrofobowe w podłożach stymulujących aktywność lipolityczną... Adres do korespondencji: mgr inż. Agata Kapturowska, mgr inż. Wanda Zamojska*, dr inż. Izabela Stolarzewicz, dr hab. Ewa Białecka-Florjańczyk, prof. SGGW Katedra Chemii, Wydział Nauk o Żywności *Międzywydziałowe Studium Biotechnologii Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Ewa Białecka-Florjańczyk, prof. SGGW Praca naukowo-badawcza wykonana w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr N N209 107639. 323 Bartosz Kozak EPISTEME 14/2012 s.325-332 ISSN 1895-4421 WYBÓR STARTERÓW Z NUKLEOTYDAMI SELEKCYJNYMI DO ANALIZ AFLP U ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) PRIMERS SELECTION FOR AFLP ANALYSIS OF NARROW-LEAFED LUPINE (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) Abstrakt. W przeprowadzonych badaniach analizowano polimorfizm uzyskiwane przy zastosowaniu 64 par starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi: EcoRI-ANN oraz MseI-CNN (gdzie N oznacza dowolny nukleotyd). Startery EcoRI-ANN wybarwione zostały fluorescencyjnie. Badania przeprowadzono na dwóch genotypach łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.), odmiana ‘Emir’ oraz ród hodowlany LAE-1, które są formami rodzicielskimi populacji mapującej na której tworzona będzie mapa genetyczna przy użyciu różnych markerów między innymi AFLP. Trawienie restrykcyjne, preselektywny i selektywny PCR przeprowadzono według Vos i in. 1995 (zmodyfikowany). Analizy AFLP prowadzono z wykorzystaniem urządzenia ABI 310 przeprowadzając elektroforezę kapilarną. Z przetestowanych 64 par starterów wybrano 9 które zostaną wykorzystane do poszukiwania markerów AFLP w posiadanej populacji mapującej. Słowa kluczowe: Łubin wąskolistny, AFLP, DNA fingerprinting, selektywny AFLP - PCR Summary. The present study analyzed the number of polymorphisms obtained by using 64 combinations of primers pars with three selected nucleotides: EcoRIANN and MseI-CNN (where N is any nucleotides). EcoRI-ANN primers were labelled with fluorescent dyes. The study was conducted on two genotypes of narrow-leafed lupine (Lupinus angustifolius L.), cultivar “Emir” and breeding line LAE-1, which are the parental forms of the mapping population on which will be created the genetic map using several types of markers including AFLP markers. Restriction digestion, preselective and selective PCR was performed according to Vos et al. 1995 (modified). AFLP analysis was performed using an ABI 310 Genetic Analyzer. Of those 64 tested combinations 9 pairs of primers were selected to be used to search for further analysis on the mapping population. Key words: Narrow-leafed lupine, AFLP, DNA fingerprinting, selective AFLP - PCR 325 Bartosz Kozak WSTĘP Z roślin motylkowatych łubin wąskolistny (Lupinus angustifolius L.) wzbudza coraz większe zainteresowanie hodowców i rolników ze względu na jego wysoką zawartość białka w nasionach (31 – 34%) oraz zdolność adaptacji na glebach lekkich i zakwaszonych [Galek i Sawicka-Sienkiewicz 2001; Sujak i in. 2006]. W porównaniu do dwóch pozostałych gatunków łubinu uprawianych w Polsce (łubinu żółtego i białego) łubin wąskolistny odznacza się podwyższoną odpornością na antraknozę, groźną chorobę grzybową powodowaną przez Colletotrichum lupini [Nirenberg 2003; Thomas i Sweetingham 2004.]. Dzięki wyhodowaniu odmian o zdeterminowanym typie wzrostu (tzw. samokończące) oraz tolerancji na opóźnienie siewu (odmiany termoneutralne) łubin wąskolistny charakteryzuje się najkrótszym okresem wegetacji. [Boersma 2005]. Dzięki tym właściwościom łubin wąskolistny ma szansę stać się rośliną strączkową szerzej uprawianą w naszym kraju i alternatywą w produkcji paszy treściwej dla importowanej z zagranicy soi. Areał zasiewu łubinu wąskolistnego nadal jednak pozostaje nieduży (według danych GUS ok. 36 tys. ha), a to ze względu na kilka niekorzystnych cech, których jak dotąd nie wyeliminowano w procesie hodowlanym. Należy tu wymienić: nierównomierne dojrzewanie strąków i nasion u form o niezdeterminowanym typie wzrostu, pękające strąki oraz osypywanie się nasion. Odporność na choroby jest także cechą, na którą należy zwrócić uwagę w dalszych pracach hodowlanych [Sawicka–Sienkiewicz i in. 2007]. Dla łubinu wąskolistnego opracowane zostały już mapy genetyczne [Boersma i in. 2005, Nelson i in. 2006, Nelson i in. 2010], jednak przy wykorzystaniu jako rodziców dzikiej formy z terenów Maroka i australijskiej linii hodowlanej. Dla polskich materiałów dotychczas nie została opracowana mapa genetyczna tego gatunku. Ponadto na opracowanych do tej pory mapach z ważnych dla hodowców cech zmapowano niemal wyłącznie cechy dziedziczone jednogenowo. Brak natomiast cech poligenicznych takich jak: plon (wierność plonowania), wczesność, wysokość roślin, zawartość białka, tłuszczu oraz alkaloidów [Nelson i in. 2010]. Do tworzenia map genetycznych wykorzystuje się wiele systemów markerów, ale jednym z najczęściej stosowanych jest AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism). Wykorzystując technikę AFLP można otrzymać bardzo dużą liczbę polimorficznych markerów DNA, przy stosunkowo niskim nakładzie pracy i środków finansowych. AFLP łączy w sobie zalety RFLP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) oraz technik wykorzystujących PCR [Vos i in 1995]. Technika AFLP wielokrotnie była już wykorzystywana do tworzenia map genetycznych u roślin [Marques i in. 1998, Lu i in. 1998, Vuylsteke i in. 1999, Nelson i in. 2006, Yamamoto i in. 2007]. 326 Wybór starterów z nukleotydami selekcyjnymi... Celem niniejszej pracy było przetestowanie 64 par starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi, dla wyboru tych które generują największy polimorfizm w badanym materiale. Badania prowadzono na dwóch genotypach łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.): odmianie ‘Emir’ i rodzie LAE-1. Genotypy te zostały użyte jako formy rodzicielskie 148 linii typu RIL’s (ang. Recombinant Inbred Lines), stanowiących populację mapującą do opracowania mapy genetycznej z wykorzystaniem między innymi markerów AFLP. MATERIAŁY I METODY DNA wyizolowano według Doyl i Doyl 1987 (zmodyfikowany) z użyciem CTAB. Liście ok. 100 mg św. m. rozcierano w ciekłym azocie, po czym inkubowano w buforze ekstrakcyjnym przez godzinę. Następnie dodawano mieszaninę chloroform izoamyl (24:1), mieszano 10 min i wirowano 10 min. Fazę wodną (górną) po wirowaniu przenoszono do nowej próbówki i dodawano równą objętość izopropanolu. DNA wytrącano w - 20°C przez 30 min. Próbki wirowano w 4°C przez 30 min, płukano etanolem i ponownie wirowano przez 5 min. Po zlaniu etanolu próbki suszono próżniowo przez 10 min i zalewano buforem TE x 0,1. Po izolacji ilość i jakość DNA sprawdzano elektroforetycznie i spektrofotometrycznie. Do dalszych analiz przygotowano roztwory DNA o stężeniu 100 ng *ml-1. Trawienie restrykcyjne wykonywano przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i MseI (NewEngland BioLabs). Mieszanina reakcyjna składała się z 5 ml roztworu DNA oraz 5 ml miksu o następującym składzie: H2O 3,7625 ml, bufor NE x 10 (NewEngland BioLabs) 1 ml, BSA x 100 (NewEngland BioLabs) 0,1 ml, EcoRI (20 u * ml-1) 0,0625 ml, MseI (10 u *ml-1) 0,125 ml. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano w 37°C przez 3h. Następnie dezaktywowano enzymy inkubując mieszaninę przez 1 min w 75°C. W celu ligacji adaptorów do tej mieszaniny dodawano 6 ml miksu o składzie: H2O 3,6 ml, Ligase Buffer x 10 (Fermentas) 0,6 ml, MseI adaptor (50 pmol * ml-1) 0,6 ml, EcoRI adaptor (5 pmol * ml-1) 0,6 ml, T4 DNA ligase (1 u * ml-1, Fermentas) 0,6 ml. Tak przygotowaną mieszaninę inkubowano w 37°C przez 16 h. Preselektywny i Selektywny PCR wykonywano na termocyklerze Biometria. Preselektywny PCR wykonano przy użyciu mieszaniny reakcyjnej o następującym składzie: H2O 2,7 ml, Taq buffer x 10 (Fermentas) 2 ml, MgCl2 (25mM) 2 ml, dNTP mix (10 mM, Fermentas) 1ml 2,5 ml startera EcoRI-A (1 pmol/ml), 2,5 ml startera MseI-C (5 pmol/ml), BSA (Fermentas) 0,2 ml, polimeraza DNA (5u * ml-1 Fermentas) 0,1 ml oraz 4 ml mieszaniny po ligacji. Profil termiczny: wstępna denaturacja 94°C przez 2 min, 20 cykli denaturacja 94°C 20 sek, przyłączanie starterów 56°C 30 sek, amplifikacja 72°C 327 Bartosz Kozak 2 min, końcowa amplifikacja 72°C przez 15 min. Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodano 25 ml H2O. Selektywny PCR prowadzono z wykorzystaniem kombinacji 64 par starterów (Tab. 1, Applied Biosystems), mieszanina reakcyjna miała skład: H2O 3,55 ml, Taq buffer x 10 (Fermentas) 1 ml, MgCl2 (25mM) 1 ml, dNTP mix (10 mM, Fermentas) 0,25 ml 1 ml startera EcoRI-ANN (1 pmol/ml), 0,5 ml startera MseI-CNN (3 pmol/ml), BSA (Fermentas) 0,8 ml, polimeraza DNA (5u * ml-1 Fermentas) 0,4 ml oraz 1,5 ml mieszaniny po preselektywnym PCR. Profil termiczny selektywnego PCR był następujący: wstępna denaturacja 94°C przez 2 min, 5 cykli denaturacja 94°C 20 sek, przyłączanie startera od 66°C do 58°C temperatura obniżana co 2 stopnie w każdym cyklu 30 sek, amplifikacja 72°C 2 min, 20 cykli denaturacja 94°C przez 20 sek, przyłączanie startera 56°C 30 sek, amplifikacja 72°C 2 min, końcowa amplifikacja 72°C przez 15 min. Po selektywnym PCR 2 ml produktu dodawano do 25 ml mieszaniny składającej się z 24,5 ml formamidu oraz 0,5 ml ROX500 (Applied Biosystems). Rozdział tak przygotowanych produktów po selektywnym PCR prowadzono na urządzeniu ABI 310 w następujących warunkach: moduł GS POP4 (1 ml), filtr F, czas iniekcji 12 sek, rozdział 30 min, temp. 60°C. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW Elektroforogramy uzyskane po rozdziale produktów selektywnego PCR na urządzeniu ABI 310 analizowano według metody opisanej przez Rineharta 2004 (zmodyfikowany). Dla każdego genotypu całą analizę (trawienie restrykcyjne, ligację adaptorów, preselektywny i selektywny PCR) przeprowadzano w dwóch powtórzeniach dla obydwu genotypów. Do analiz brano wyłącznie piki, które były obecne w obu powtórzeniach. Dla każdej z analizowanych par starterów policzono ogólną liczbę pików oraz pików polimorficznych. Obliczono procent pików polimorficznych dla każdej pary starterów. Wyniki zamieszczono w tabeli 1. Badane startery wygenerowały łączną liczbę 3610 pików w tym 1004 polimorficzne (28%). Jedna kombinacja tworzyła średnio 56 pików w tym 16 polimorficznych. Uzyskane wyniki znajdują potwierdzenie w pracach innych autorów [Marques i in. 1998, Lu i in. 1998, Vuylsteke i in. 1999, Nelson i in. 2006, Yamamoto i in. 2007]. Startery, które wygenerowały najwyższy polimorfizm w prezentowanych badaniach zestawiono w tabeli 2. 328 [FAM] EcoRI_ACA [JOY] EcoRI_ACG [JOY] EcoRI_AGG [JOY] EcoRI_AAG [NED] EcoRI_AGC [NED] EcoRI_ACC [NED] EcoRI_AAC M P % M P % M P % 15 43 56 10 18 57 4 7 48 14 29 28 28 100 38 8 21 35 16 46 43 9 21 8 20 50 15 30 45 8 18 41 9 22 63 14 22 54 20 37 44 15 34 69 29 42 14 26 70 12 17 40 10 25 69 13 19 83 24 29 16 11 69 38 11 29 58 8 14 15 27 79 19 24 65 4 6 76 17 22 83 24 29 42 12 29 66 22 33 52 9 17 9 18 30 30 100 75 4 5 75 27 36 83 28 34 39 7 18 42 13 31 66 20 30 13 26 58 12 21 70 1 1 89 46 52 79 28 35 78 37 47 53 24 45 65 24 37 22 34 44 7 16 52 4 8 76 16 21 43 12 28 62 23 37 62 21 34 66 11 17 16 28 49 11 22 68 2 3 79 31 39 44 15 34 35 7 20 58 21 36 56 15 27 CAG % MesI_ P 35 CAC M MesI_ % 41 CAA P MesI_ M 54 CAT % MesI_ P 55 CTA M MesI_ % 50 CTC P MesI_ M 49 CTG % MesI_ P 64 CTT M MesI_ [FAM] EcoRI_ACT Wybór starterów z nukleotydami selekcyjnymi... 58 Tab. 1. Zestawienie liczby otrzymanych pików przy zastosowaniu 64 par starterów. Liczba otrzymanych pików (M), liczba pików polimorficznych (P), procent pików polimorficznych (%). Startery EcoRI-ANN – wybarwione fluorescencyjnie na końcu 5’) Przy opracowywaniu istniejącej już mapy genetycznej łubinu wąskolistnego [Nelson i in. 2006], badacze australijscy wykorzystali kombinacje starterów zamieszczone w tabeli 2. Testując formy rodzicielskie (odmiana australijska oraz dzika forma z terenów Maroka) swojej populacji mapującej przy użyciu tych starterów uzyskali 276 polimorficznych produktów. Formy te są jednak bardzo odległe genetycznie od genotypów użytych w prezentowanej pracy. Dlatego przy zastosowaniu tych kombinacji starterów w prezentowanych badaniach form rodzicielskich (Emir oraz LAE1) uzyskano znacznie niższą ogólną liczbę polimorficznych produktów wynoszącą 143 (Tab. 2). Łączna liczba polimorficznych pików wygenerowana przez 9 najlepszych kombinacji starterów wynosi 284. Z doniesień innych autorów wynika, że liczba uzyskanych w ten sposób polimorficznych markerów powinna być wystarczająca do utworzenia szkieletu przygotowywanej mapy [Nelson i in. 2006]. Ostatecznym potwierdzeniem będzie jednak zmapowanie tych markerów. 329 Wytypowane w prezentowanej pracy Bartosz Kozak Kombinacja Liczba polimorficznych pików uzyskana na genotypach: Emir oraz LAE 1 EcoRI-ACC/MesI-CTA 30 EcoRI-AGC/MesI-CTA 27 EcoRI-AGC/MesI-CTC 46 EcoRI-AGC/MesI-CTT 31 EcoRI-AAG/MesI-CAG 28 EcoRI-AAG/MesI-CTA 28 EcoRI-AAG/MesI-CTC 28 EcoRI-AGG/MesI_CTC EcoRI_ACA/ MesI_CAC 37 Suma 284 EcoRI-AAC/MseI-CAA Użyte przez Nelsona i in. 2006 EcoRI-ACA/MseI-CAA EcoRI-ACG/MseI-CAA EcoRI-ACT/ MseI-CAA EcoRIAGG/ MseI-CAA 29 12 8 11 14 11 EcoRI-AAC/MseI-CAC 15 EcoRI-ACA/MseI-CAC 29 EcoRI-ACG/MseI-CAC 15 EcoRI-ACT/MseI-CAC, EcoRIAGG/ MseI-CAC 8 Suma 20 143 Tab. 2. Zestawienie kombinacji wytypowanych starterów i użytych do opracowania istniejącej mapy genetycznej łubinu wąskolistnego (Nelson i in. 2006) WNIOSKI Po przetestowaniu 64 kombinacji starterów z trzema nukleotydami selekcyjnymi EcoRI-ANN/MseI-CNN (N – dowolny nukleotyd) stwierdzono że: • Analizowane kombinacje starterów generowały zróżnicowany polimorfizm u badanych form rodzicielskich (Emir oraz LAE1) 330 Wybór starterów z nukleotydami selekcyjnymi... • Dziewięć kombinacji starterów dających najwyższy polimorfizm to: EcoRI-ACC/MesI-CTA (30), EcoRI-AGC/MesI-CTA (27), EcoRI-AGC/ MesI-CTC (46), EcoRI-AGC/MesI-CTT (31), EcoRI-AAG/MesI-CAG (28), EcoRI-AAG/MesI-CTA (28), EcoRI-AAG/MesI-CTC (28), EcoRI-AGG/MesI_CTC (37), EcoRI_ACA/MesI_CAC (29), łącznie 284 polimorficzne produkty. • Kombinacje tych starterów wykorzystane zostaną przy opracowywaniu mapy genetycznej łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.) - z wykorzystaniem 148 linii typu RIL’S pochodzących ze skrzyżowania odmiany Emir z rodem LAE1 LITERATURA Boersma J. G., Pallotta M., Li C., Buirchell B. J., Sivasithamparam K. i Yang H. 2005. Construction of a genetic linkage map using MFLP and identification of molecular markers linked to domestication genes in narrow-leafed lupin (Lupinus angustifolius L.). Cellular and Molecular Biology Letters 10: 331 – 344 Doyle J. J., Doyle J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19(1): 11 – 15 Galek R., Sawicka-Sienkiewicz E. 2001. Ocena form kolekcyjnych łubinów pochodzących z rożnych warunków geograficzno-klimatycznych, pod względem wybranych cech morfologicznych. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu 427: 31-49 Lu Z., Sosinski B., Reighard G. L., Baird W. V., Abbott A. G. 1998. Construction of a genetic linkage map and identification of AFLP markers for resistance to rootknot nematodes in peach rootstocks. Genome 41: 199-207 Marques C. M., Araujo J. A., Ferreira J. G., Whetten R., D. O`Malley D. M.,. Liu B.-H., Sedero R. 1998. AFLP genetic maps of Eucalyptus globulus and E. tereticornis. Theoretical and Applied Genetics 96: 727 – 737 Nelson M. N., Phan H. T. T., Ellwood S. R., Moolhuijzen P. M., Hane J., Williams A., O‘Lone C. E., Fosu-Nyarko J., Scobie M., Cakir M., Jones M. G. H., Bellgard M., Ksiarkiewicz M., Wolko B., Barker S. J., Oliver R. P., Cowling W. A. 2006. The first gene-based map of Lupinus angustifolius L. - location of domestication genes and conserved synteny with Medicago truncatula. Theoretical and Applied Genetics 113: 225 – 238 Nelson M., Moolhuijzen P. M., Boersma J. G., Chudy M., Lesniewska K., Bellgard M., Oliver R. P., Święcicki W., Wolko B., Cowling W. A. i Ellwood S. R. 2010. Aligning a new reference genetic map of Lupinus angustifolius with the genome sequence of the model legume, Lotus japonicus. DNA Research 17: 73-83 331 Bartosz Kozak Nirenberg H. I, Feiler U., Hagedorn G. 2002. Description of Colletotrichum lupine comb. nov. in modern terms. Mycologia 94: 307–320 Rinehart T. 2004. AFLP analysis using GeneMapper software and an Excel macro that aligns and converts output to binary. Biotechniques 37:186–188 Sawicka-Sienkiewicz E., Galek R., Zalewski D. 2007. Zmienność wybranych cech u mutantów odmiany Emir łubinu wąskolistnego (Lupinus angustifolius L.). Zeszyty Problemowe Postępu Nauk Rolniczych 522: 39–54 Sujak A., Kotlarz A., Strobel W. 2006. Compositional and nutritional evaluation of several lupin seeds. Food Chemistry 98: 711–719 Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. and Zabeau M. 1995 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23(21): 4407-4414 Vuylsteke M., Mank R., Antonise R., Bastiaans E., Senior M. L., Stuber C. W., Melchinger A. E., Lübberstedt T., Xia X. C., Stam P., Zabeau M., M. Kuiper 1999. Two high-density AFLP® linkage maps of Zea mays L.: analysis of distribution of AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 99: 921 – 935 Yamamoto T., Kimura T., Terakami S., Nishitani C., Sawamura Y., Saito T., Kotobuki K., Hayashi T. 2007. Integrated Reference Genetic Linkage Maps of Pear Based on SSR and AFLP Markers. Breeding Science 57: 321 – 329 Adres do korespondencji: mgr inż. Bartosz Kozak Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: Prof. dr hab. Ewa Sawicka – Sienkiewicz Zadanie współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 332 Iwona Kozikowska Magdalena Chrobaczyńska – Dyląg Katarzyna Suprewicz Magdalena Czajkowska EPISTEME 14/2012 s.333-340 ISSN 1895-4421 WPŁYW ILOŚCI PORODÓW NA KUMULACJĘ KADMU, MIEDZI I CYNKU W ŁOŻYSKACH KOBIET ORAZ KRWI PĘPOWINOWEJ NOWORODKÓW IMPACT OF BIRTH NUMBER ON ACCUMULATION OF CADMIUM, COPPER AND ZINC IN HUMAN PLACENTA AND UMBILICAL CORD BLOOD Abstrakt. Celem badań było określenie średniej zawartość kadmu, miedzi i cynku we krwi pępowinowej noworodków oraz łożyskach kobiet w zależności od liczby przebytych ciąż. Materiał do badań pobrano od 100 kobiet, zamieszkujących obszar Górnego Śląska. Zawartość metali w tkankach została oznaczona metodą płomieniowej absorpcyjnej spektrometrii atomowej (FAAS). Koncentrację Cd, Zn i Cu wyrażono w miligramach na kilogram suchej masy. W wyniku przeprowadzonych pomiarów wykryto obecność kadmu, cynku i miedzi we wszystkich badanych tkankach, zarówno u pierworódek jak i wieloródek. Spośród badanych metali, największą zawartość kadmu odnotowano we krwi pępowinowej w grupie wieloródek (2,229 mg×kg-1 s.m.). Największe zawartości Cu występowały w tkankach łożyska pierworódek. Analiza statystyczna wykazała, iż kumulacja cynku w łożysku znacznie przewyższa średnią zawartość Zn we krwi pępowinowej. Słowa kluczowe: łożysko, krew pępowinowa, metale ciężkie, ciąża Summary. The aim of this study was to determine the average content of cadmium, copper and zinc in umbilical cord blood of newborns and women placenta depending on the number of pregnancies. Biological material used in the research came from 100 women living in the Upper Silesian Region. Concentration of metals in each sample was measured using flame atomic absorption spectrometry (FAAS). The concentration of Cd, Zn and Cu was shown in milligrams per kilogram of dry matter. The conducted study demonstrates that cadmium, zinc and copper were noted in all tissues, both nulliparous women and multiparous mothers. The maximum concentration of cadmium was observed in umbilical cord blood among multiparous mothers (2,229 mg×kg-1 d.m.). The maximum concentration of Cu was observed in the placenta of nulliparous women. Statistical analysis showed that concentration of zinc in the placenta is much higher than in cord blood. Key words: placenta, umbilical cord blood, heavy metals, pregnancy 333 Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska WSTĘP Łożysko to narząd, pośredniczący pomiędzy organizmem matki a organizmem płodu. Pełni funkcje analogiczne do płuc oraz układu żołądkowo-jelitowego i wydalniczego. Stanowi barierę dla niektórych substancji, innym z kolei pozwala na swobodny przepływ. Oddziela krew matki od krwi dziecka cienką warstwą tkanek, zwaną barierą łożyskową. Pod względem czynnościowym stanowi skomplikowany narząd wzajemnej wymiany [Fernandez i Kuczkowski 2009]. Przez barierę łożyskową przenikają tlen i substancje pokarmowe oraz usuwane są szkodliwe produkty przemiany materii. Narząd ten pełni także funkcję ochronną i wewnątrzwydzielniczą. Łożysko nie zapewnia jednak płodowi całkowitej ochrony przed różnymi szkodliwymi substancjami takimi jak: składniki dymu tytoniowego, leki, używki czy zawarte w pożywieniu mutageny. Głównie od środowiska oraz trybu życia matki zależy zdrowie jej nienarodzonego dziecka [Falcon i in. 2002; Kantola i in. 2000; Piestrzyńska-Kajtoch 2005]. Celem badań było określenie średniej zawartości kadmu, cynku i miedzi w tkankach łożyska ludzkiego oraz we krwi pępowinowej noworodków wśród pierworódek oraz wieloródek. Istotne było także określenie wzajemnych korelacji pomiędzy zawartością badanych pierwiastków w tkankach łożyska i ich zawartością we krwią pępowinowej. MATERIAŁ I METODY Materiał badawczy stanowiły tkanki łożyska ludzkiego oraz krew pępowinowa noworodków. Materiał został pozyskany z Kliniki Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu, bezpośrednio po porodzie. W badaniu wzięło udział 100 kobiet, które wyraziły chęć uczestnictwa w badaniu, podpisując pisemną zgodę. Ponadto została przeprowadzona ankieta wśród pacjentek dotycząca ich wieku, ilości porodów, stanu zdrowia oraz wagi noworodka. Na badania uzyskano pisemną zgodę komisji bioetycznej (Nr 75/KBL/OIL/2010). W celu dokonania analizy statystycznej, grupa kobiet została podzielona ze względu na ilość przebytych ciąż na: pierworódki (1 dziecko) oraz wieloródki (≥2 dzieci). Kobiety z grupy pierworódek były w przedziale wiekowym między 18 a 36 rokiem życia, natomiast wieloródki między 29 a 40 rokiem życia. W celu oznaczenia zawartość kadmu, miedzi i cynku w łożyskach oraz krwi pępowinowej przeprowadzono mineralizację tkanek. W tym celu wysuszony uprzednio materiał (suchą masę) umieszczono w piecu muflowym i poddano procesowi spalania w temperaturze 450°C. Spopielony materiał zalano 65% kwasem azotowym HNO3 w ilości 2 cm3. Roztwory mineralizatów przeniesiono do kolbek miarowych o pojemności 10 cm3 i dopełniono wodą redestylowaną. Zawartość badanych pierwiastków oznaczono metodą płomieniowej spektrometrii absorpcji atomowej (FAAS) przy użyciu spektrometru Cole-Palmer model BUCK 200A. 334 Wpływ ilości porodów na kumulację kadmiu, miedzi i cynku... Hipotezy weryfikowano za pomocą pakietu Statistica 9.0. Typ rozkładu w próbie badawczej badano przy pomocy testu Shapiro–Wilka. Dalsze statystyki oparte były na testach U Manna-Whitneya oraz analizie korelacji Pearson’a. Wyniki wyrażono w miligramach na kilogram suchej masy (mg×kg-1 s.m) i zobrazowano na wykresach. WYNIKI Zarówno we krwi pępowinowej noworodków jak i w łożyskach kobiet odnotowano obecność kadmu, cynku i miedzi. Wyniki analizy statystycznej kumulacji Cd, Zn, Cu we krwi pępowinowej noworodków zilustrowano na Rys. 1. Cynk jest metalem, który spośród badanych pierwiastków występuje w największych ilościach. Jego zawartość we krwi pępowinowej pobranej od płodów pierworódek oraz wieloródek była na zbliżonym poziomie (17,737±2,266 mg×kg-1 s.m., 18,720±2,863 mg×kg-1 s.m.). We krwi pępowinowej płodów kobiet rodzących po raz pierwszy odnotowano wyższy poziom miedzi (3,440±0,369 mg×kg-1 s.m.) niż u kobiet rodzących dwa lub więcej razy (3,165±0,269 mg×kg-1 s.m.). Rys. 1. Średnia zawartość kadmu, cynku i miedzi we krwi pępowinowej noworodków pobranej od płodów pierworódek i wieloródek (mg×kg-1 s.m.±błąd standardowy – skala logarytmiczna) Analiza wykazała występowanie statystycznie istotnych różnic pomiędzy średnią zawartością kadmu we krwi pępowinowej w grupie pierworódek a średnią zawartością kadmu w grupie wieloródek (p=0,000). W grupie pierworódek średnia zawartość Cd osiągnęła wartość 0,666±0,148 mg×kg-1 s.m podczas gdy u wieloródek była to wartość znacznie wyższa (2,229±0,176 mg×kg-1 s.m.). Średnią zawartość Cd, Zn oraz Cu w łożyskach kobiet z różną ilością przebytych porodów ilustruje Rys. 2. W przypadku zawartości cynku w łożysku, 335 Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska odnotowano nieznacznie wyższy poziom tego metalu w grupie kobiet rodzących po raz pierwszy (48,412±2,944 mg×kg-1 s.m.) w stosunku do grupy wieloródek (45,448±2,388 mg×kg-1 s.m.). Średnie zawartości miedzi w łożysku zarówno u pierworódek jak i wieloródek były zbliżone. Analiza statystyczna wykazała brak istotnych statystycznie różnic pomiędzy średnią zawartością miedzi w łożysku pierworódek a średnią zawartością tego pierwiastka w łożysku wieloródek. Również nie zanotowano statystycznie istotnych różnic pomiędzy zawartościami cynku w łożysku pierworódek a zawartościami cynku w łożysku wieloródek. Porównując średnią zawartość kadmu w badanych tkankach można zaobserwować, iż w grupie wieloródek jego zawartość w łożysku (0,647±0,061 mg×kg-1 s.m.) jest ponad trzykrotnie mniejsza od średniej zawartości tego metalu we krwi pępowinowej. Rys. 2. Średnia zawartość kadmu, cynku i miedzi w łożyskach pierworódek oraz wieloródek (mg×kg-1 s.m.±błąd standardowy – skala logarytmiczna) Wykonując analizę Pearson’a zbadano korelacje jakie występują pomiędzy zawartościami badanych pierwiastków (cynkiem, miedzią oraz kadmem) we krwi pępowinowej a zawartościami tych pierwiastków w łożyskach kobiet zarówno w grupie pierworódek jak i wieloródek. Wyniki testu opracowano i zestawiono w tabeli (Tab. 1). Przeprowadzone analizy wykazały występowanie statystycznie istotnych zarówno dodatnich jak i ujemnych korelacji pomiędzy badanymi pierwiastkami. W grupie pierworódek ujawniono występowanie dodatniej umiarkowanej korelacji pomiędzy zawartością cynku i miedzi w łożysku (Zn/Cu: r2=0,490; p=0,000) oraz silnej korelacji we krwi pępowinowej noworodków pomiędzy zawartością cynku i miedzi (Zn/Cu: r2=0,763; p=0,000). Ponadto w grupie kobiet rodzących pierwszy raz dziecko stwierdzono występowanie umiarkowanej korelacji pomiędzy średnią zawartością Cu w łożysku a zawartością Cu we krwi pępowinowej (r2=0,604; p=0,000) oraz pomiędzy zawartością kadmu w łożysku a zawartością Cd we krwi pępowinowej (r2=0,548; p=0,000). 336 Wpływ ilości porodów na kumulację kadmiu, miedzi i cynku... Wieloródki Pierworódki Rodność Porównywane tkanki Metal Współczynnik Perasona (r2) Wartość p Łożysko i krew pępowinowa Cd 0,548 p=0,000 Cu 0,604 p=0,000 Łożysko Zn i Cu 0,490 p=0,000 Krew pępowinowa Zn i Cu 0,763 p=0,000 Łożysko Cd i Cu 0,772 p=0,000 Cd i Zn -0,461 p=0,001 Cd i Cu 0,371 p=0,011 Zn i Cu 0,453 p=0,002 Krew pępowinowa Tab. 1. Analiza korelacji pomiędzy kadmem, cynkiem i miedzią we krwi pępowinowej i łożyskach pochodzących od pierworódek oraz wieloródek (wartości statystycznie istotne) We krwi pępowinowej w grupie wieloródek wystąpiły umiarkowane dodatnie korelacje pomiędzy zawartością kadmu a zawartością miedzi (Cd/Cu: r2=0,371; p=0,011 ), pomiędzy zawartością cynku a zawartością miedzi (Zn/ Cu: r2=0,453; p=0,002) oraz ujemna umiarkowana korelacja pomiędzy zawartością kadmu a zawartością cynku (Cd/Zn: r2=-0,461; p=0,001). W łożysku odnotowano silną dodatnią korelację pomiędzy zawartościami kadmu i miedzi w grupie wieloródek (Cd/Cu: r2=0,772; p=0,000). Wieloródki Pierworódki Rodność Porównywane tkanki Cd Zn Łożysko r2 = -0,0669 p = 0,631 r2 = 0,1355 p = 0,329 r2 = 0,0747 p = 0,591 Krew pępowinowa r2 = -0,1802 p = 0,192 r2 = 0,2035 p = 0,140 r2 = 0,3370 p = 0,013* Łożysko r2 = -0,2070 p = 0,167 r2 = 0,1007 p = 0,505 r2 = -0,1100 p = 0,467 Krew pępowinowa r2 = -0,0172 p = 0,909 r2 = -0,1631 p = 0,279 r2 = -0,2688 p = 0,071 Cu Tab. 2. Analiza korelacji Pearsona pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością kadmu, cynku oraz miedzi we krwi pępowinowej i łożyskach pochodzących od pierworódek oraz wieloródek. * - Różnice istotne statystycznie Zbadano również zależności pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością Zn, Cu oraz Cd w badanych tkankach w grupie pierworódek oraz wieloródek (Tab. 2). W grupie kobiet rodzących pierwszy raz dziecko stwierdzono występowanie słabej korelacji pomiędzy wiekiem kobiet a średnią zawartością miedzi we krwi pępowinowej (r2=0,3370; p=0,013). 337 Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska DYSKUSJA I WNIOSKI Pewne substancje a także metale toksyczne mogą wpływać na funkcję łożyska na wielu poziomach takich jak: sygnalizacja, produkcja i uwalnianie hormonów i enzymów, transport substancji odżywczych i produktów zbędnych, implantacja, wzrost komórek i dojrzewanie. Może to stanowić potencjalne zagrożenie dla funkcjonowania łożyska, co może skutkować poronieniem, przedwczesnym porodem czy deformacjami płodu [Singh 2010]. Liczne badania wskazują jednak, że łożysko skutecznie chroni płód przed pewnymi substancjami np. związkami kadmu. Wykazano, że w organizmach noworodków zawartość kadmu jest niewielka i wynosi około 0,1 μg [Czeczot i Skrzycki 2010]. Badania przeprowadzone w Szwecji wykazały, że we krwi pępowinowej poziom kadmu był niższy w porównaniu z krwią matki, co potwierdza tezę, że łożysko jest skuteczną barierą dla tego pierwiastka [Osman i in. 2000]. Podobne wnioski w swoich badaniach wysunęli Sakamoto i in. [2010] oraz Baranowska [1995]. Jednak część badaczy donosi, że większość metali ksenobiotycznych (m.in. Cd) oraz pierwiastków biogennych (np. Cu, Zn) ma zdolność przenikania przez barierę łożyskową [Rudge i in. 2009]. W badaniach przeprowadzonych w Bytomiu można zaobserwować, iż w grupie wieloródek średnia zawartość kadmu w łożysku (0,647±0,061 mg×kg-1 s.m.) jest ponad trzykrotnie mniejsza od średniej zawartości tego metalu we krwi pępowinowej. Badania wykazały, że ilość porodów istotnie wpływa na zawartość kadmu we krwi pępowinowej noworodków. Może to być prawdopodobnie wynikiem zmniejszania się zdolności łożyska do ochrony płodu lub spowodowane działaniem innych czynników, które nie zostały zbadane. (Świadczy to prawdopodobnie o tym, iż łożysko traci swoje właściwości ochronne przed kadmem wraz ze wzrostem ilości przebytych ciąż). Ponadto nie zaobserwowano korelacji pomiędzy wiekiem kobiet a zawartością Cd, Zn oraz Cu w grupie wieloródek. Łożysko jako narząd przejściowy, powstaje de novo w przypadku kolejnych ciąż, co czyni go doskonałym bioindykatorem dla metali ciężkich. Cynk i miedź łatwo przenikają przez barierę łożyskową i mogą odgrywać znaczącą rolę w funkcjonowaniu łożyska, a nawet mieć wpływ na poprawę jego kondycji [Singh 2010]. Warto zwrócić uwagę, że poziom niektórych pierwiastków takich jak Cu i Zn w łożysku może być skorelowany z wiekiem matki, wagą noworodka, obwodem głowy noworodka czy wagą łożyska [Ozdemir i in. 2009; Osman i in. 2000]. Badania przeprowadzone w Bytomiu wykazały, że zarówno w przypadku cynku jak i miedzi, liczba urodzonych dzieci nie wpływa na zawartość tych pierwiastków we krwi pępowinowej oraz w łożyskach kobiet (Rys. 1, Rys. 2). Świadczy to o stabilnej funkcji jaką pełni łożysko dla przenikania metali biogennych do organizmu płodu. We krwi pępowinowej noworodków średnia zawartość tak cynku jak i miedzi w grupie pierworódek była zbliżona do średniej 338 Wpływ ilości porodów na kumulację kadmiu, miedzi i cynku... zawartości Zn i Cu u wieloródek, co wskazuje, że łożysko jako sprawny narząd płodowy, przepuszcza metale biogenne potrzebne do prawidłowego rozwoju płodu, niezależnie od ilości przebytych ciąż. Osman i in. [2000] wykazali jednak, że łożysko wieloródek posiada niższy poziom Zn w porównaniu do łożyska pierworódek, co również zostało zaobserwowane w badaniach z Bytomia. Pomiędzy poszczególnymi pierwiastkami mogą występować interakcje [Ozdemir i in. 2009]. Wykazano istotną korelację pomiędzy poziomem kadmu a poziomem cynku i miedzi w łożysku kobiet [Kuhnert i in. 1993]. Przeprowadzone przez nas badania dowodzą, że zarówno w łożysku jak i we krwi pępowinowej występują korelacje pomiędzy metalami, zwłaszcza pomiędzy Zn/Cu u pierworódek oraz Cd/Cu w grupie wieloródek. Obecność ksenobiotyków we krwi pępowinowej oraz w łożysku może wpłynąć na zawartość metali biogennych w organizmie człowieka. Ludzkie łożysko jest narażone na różne szkodliwe substancje, pochodzące z otaczającego środowiska. W przypadku metali toksycznych łożysko może stanowić biomarker zarówno do oceny stanu zdrowia matki jak i płodu [Singh, 2010; Iyengar i Rapp 2001]. Może to odgrywać szczególnie ważną rolę w przypadku kobiet oraz ich dzieci pochodzących z terenów przemysłowych (Górny Śląsk), silnie zanieczyszczonych metalami ciężkimi. Iyengar i Rapp [2001] zasugerowali, że jeśli toksyczne stężenia metali w tkankach łożyska są wysokie, informacje te mogą zostać wykorzystane do zmniejszenia narażenia matki podczas kolejnych ciąż. LITERATURA Baranowska I. 1995. Lead and cadmium in human placentas and maternal and neonatal blood (in a heavily polluted area) measured by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Occup Environ Med (52) 229–232. Czeczot H. Skrzycki M. 2010. Kadm – pierwiastek całkowicie zbędny dla organizmu. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 64: 38-49. Falcon M. Vinas P. Osuna E. Luna A. 2002. Environmental exposures to lead and cadmium measured in human placenta. Arch Environ Health; (57) 598–602. Fernandez CL. Kuczkowski KM. 2009. Przepływ leków przez łożysko. Anestezjologia i Ratownictwo, 3: 416-439. Iyengar GV. Rapp A. 2001. Human placenta as a ‘dual’ biomarker for monitoring fetal and maternal environment with special reference to potentially toxic trace elements. Part 3: Toxic trace elements in placenta and placenta as a biomarker for these elements. The Science of the Total Environment, 280 :221-238 339 Iwona Kozikowska, M. Chrobaczyńska-Dyląg, K. Suprewicz, M.Czajkowska Kantola M. Purkunen R. Kroger P. Tooming A. Juravskaja J. Pasanen M. Saarikoski S. Vartiainen T. 2000. Accumulation of cadmium, zinc, and copper in maternal blood and developmental placental tissue: differences between Finland, Estonia, and St. Petersburg. Environ Res; 83 (1) 54–66. Kuhnert BR. Kuhnert PM. Lazebnik N. Erhard P. 1993. The relationship between placental cadmium, zind, and copper. Journal of the American College of Nutrition, 12: 31-35. Osman K. Åkesson A. Berglund M. Bremme K. Schütz A. Ask K. Vahter M. 2000. Toxic and essential elements in placentas of Swedish women. Clinical Biochemistry, 33: 131-138. Ozdemir Y. Börekci B. Levet A. Kurudirek M. 2009. Assessment of trace element concentration distribution in human placenta by wavelength dispersive X-ray fluorescence: effect of neonate weight and maternal age. Applied Radiation and Isotopes, 67: 1790-1795. Piestrzyńska-Kajtoch A. 2005. Łożysko - bariera chroniąca płód? Kosmos - Problemy Nauk Biologicznych, 54: 357-365. Rudge CV. Röllin HB. Nogueira CM. Thomassen Y. Rudge MC. Odland JØ. 2009. The placenta as a barrier for toxic and essential elements in paired maternal and cord blood samples of South African delivering women. Journal of Environmental Monitoring, 11: 1322-1330. Singh J. Singh VK. Anand M. Kumar P. Siddiqui MKJ. 2010. Placental lead and its interaction with some essential metals among women from Lucknow, India. Asian Journal of Medical Sciences, 1: 32-36. Sakamoto M. Murata K. Kubota M. Nakai K. Satoh H. 2010. Mercury and heavy metal profiles of maternal and umbilical cord RBCs in Japanese population. Ecotoxicology and Environmental Safety 73; 1–6 Adres do korespondencji: mgr Iwona Kozikowska, mgr Magdalena Chrobaczyńska-Dyląg mgr Katarzyna Suprewicz, mgr Magdalena Czajkowska Instytut Biologii, Zakład Zoologii Kręgowców i Biologii Człowieka Uniwersytet Pedagogiczny w Krakowie ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków email: [email protected] Opiekun naukowy: prof. nadzw. dr hab. Robert Stawarz 340 Anna Latacz, Paulina Szczurek Marta Strzetelska Krystyna Pierzchała-Koziec EPISTEME 14/2012 s.341-348 ISSN 1895-4421 UDZIAŁ OPIOIDÓW W MODULOWANIU WPŁYWU RAPAMYCYNY NA STĘŻENIE BIAŁKA S6K1 SZLAKU MTORC1 W PODWZGÓRZU OPIOIDS PARTICIPATION IN MODULATING RAPAMYCIN IMPACT IN THE S6K1 PROTEIN CONCENTRATION IN THE HYPOTHALAMUS MTORC1 TRACT Abstrakt. Białko S6K1 jest jednym z substratów kompleksu mTORC1, odpowiedzialnego za regulowanie syntezy białek. Celem badań było określenie wpływu rapamycyny, inhibitora aktywności kompleksu mTORC1, na stężenie i stopień in vitro wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Eksperyment przeprowadzono na myszach kontrolnych lub poddanych iniekcji naltreksonu, będącego antagonistą receptorów opioidowych. Stężenie białka S6K1 zmierzono przy pomocy testu ELISA (test immunoenzymatyczny), stężenie białka w tkance określono metodą BCA (metoda kolorymetryczna z użyciem kwasu bis-cynchoninowego). Naltrekson obniżył stopień spontanicznego wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Rapamycyna znacząco zahamowała wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych, ale wywołała wzrost sekrecji tego białka z tkanki zwierząt traktowanych naltreksonem. Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na zaangażowanie układu opioidowego m.in. w regulację wewnątrzkomórkowego mechanizmu syntezy białek i rzucają nowe światło na zagadnienia związane z rolą rapamycyny w modulowaniu szlaku kinazy mTORC1. Słowa kluczowe: białko S6K1, rapamycyna, naltrekson, kinaza mTORC1 Summary. S6K1 protein is one of the mTORC1 complex substrate, responsible for the regulation of protein synthesis. The aim of this study was to determine the effect of rapamycin, an inhibitor of complex mTORC1 activity, concentration and degree of in vitro secretion of hypothalamic S6K1 protein. The experiment was conducted in control mice or in mice after injection of naltrexone, an opioid receptor antagonist. S6K1 protein concentration was measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), protein concentration in tissue was determined by BCA (colorimetric method with the use of bicinchoninic acid). Naltrexone reduced the level of spontaneous secretion of hypothalamic S6K1 protein. Rapamycin significantly inhibited the S6K1 protein secretion from the control mice hypothalamus, but caused increased secretion of the protein from the tissue of animals treated with naltrexone. The results clearly indicate the involvement of the opioid system e.g. in the regulation of intracellular mechanisms of protein synthesis and shed new light on issues related to the role of rapamycin in modulating mTORC1 kinase pathway. Key words: S6K1 protein, rapamycin, naltrexone, mTORC1 kinase 341 Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec WSTĘP Kinaza mTOR, tzw. ssaczy cel rapamycyny (ang. mammalian target of rapamycin kinase) należy do dużej rodziny kinaz serynowo-treoninowych. Bierze ona udział w utrzymaniu homeostazy komórki poprzez koordynowanie procesów katabolicznych, anabolicznych, a także poprzez informowanie o poziomie substancji odżywczych, związków energetycznych oraz czynników wzrostowych [Sengupta i in. 2010]. Kinaza funkcjonuje jako katalityczna podjednostka w dwóch różnych kompleksach białkowych o odmiennych funkcjach: mTORC1 i mTORC2 [Martin i Hall 2005; Kapahi i in. 2010]. Kompleks TORC1 stanowi kluczowy element szlaku sygnalizacyjnego TOR, monitorując i integrując sygnały dotyczące czynników wzrostu, substancji odżywczych, czynników energetycznych i stresowych [Shaw i Cantley 2006; Kapahi i in. 2010]. Aktywność tego kompleksu wpływa na wiele procesów komórkowych takich jak: translacja mRNA, transkrypcja, autofagia, metabolizm, proliferacja oraz wzrost [Kapahi i in. 2010]. Mało jednak wiadomo o roli szlaku mTOR w centralnym układzie nerwowym (CNS). Jak do tej pory wykazano, mTOR pełni funkcje w różnicowaniu neuronalnym, wzroście aksonalnym czy synaptogenzie. W dojrzałym CNS mTOR wpływa na regenerację aksonów oraz na proces plastyczności synaptycznej w hipokampie [Costa-Mattioli i in. 2009; Cao i Obrietan 2010]. Coraz częściej postuluje się udział ścieżki mTOR w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Huntingtona, Parkinsona czy Alzheimera [Webb i in. 2003; Bandhyopadhyay i in. 2007; Perycz i in. 2007]. Spośród kompleksów kinazy mTOR tylko mTORC1 reaguje w krótkim czasie na rapamycynę, która hamuje część jego funkcji [Hands i in. 2009]. Rapamycyna należy do grupy leków makrolidowych m.in. o działaniu antynowotworowym i immunosupresyjnym [Minor i in. 2010]. Mechanizm jej działania opiera się na osłabieniu interakcji pomiędzy mTOR, a białkiem raptor (ang. regulatory associated protein of mTOR), stanowiącym kluczowy element kompleksu mTORC1, co skutkuje zmniejszeniem jego aktywności. Innym czynnikiem wpływającym hamująco na aktywność mTORC1 może być np. niski poziom związków energetycznych i czynników wzrostu w komórce czy niski potencjał redoks [Cota i in. 2006]. Dwoma najlepiej scharakteryzowanymi substratami kompleksu mTORC1 są kinaza S6K1 (ang. ribosomal S6 protein kinase 1) i białko wiążące eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4E-BP1 (ang. eukariotyc initiation factor 4E-binding protein 1) [Foster i Fingar 2010]. Aktywne formy zarówno kinazy mTOR jak i białka S6K1 występują w wysokich stężeniach w komórkach dwóch obszarów podwzgórza: jądrze przykomorowym (ang. paraventricular nucleus - PVN) oraz jądrze łukowatym 342 Udział opioidów w modulowaniu wpływu rapamycyny... (ang. arcute nucleus - ARC) [Cota i in. 2006]. mTORC1 fosforyluje kinazę S6K1, a reakcja ta stymuluje następnie fosforylację rybosomalnego białka p70S6 (S6K1). Aktywowane białko S6K1 może stymulować syntezę innych białek biorących udział w translacji mRNA [Kapahi i in. 2010]. Mimo to, że kinaza S6K1 nie jest niezbędnym czynnikiem do rozwoju organizmu, to jednak jej brak powoduje spowolnienie procesu wzrostu komórkowego oraz zmniejszenie rozmiarów ciała u wielu gatunków zwierząt [Kapahi i in. 2010]. Szlak mTOR, jest jednym ze szlaków związanych z kinazą PI3K [Sengupta i in. 2010]. Dowiedziono, że jednym z czynników prowadzących do aktywacji ścieżki sygnałowej PI3K/Akt-mTOR w polu CA3 hipokampa u szczura jest morfina. Zaobserwowano także, że rapamycyna hamuje fosforylację kinazy S6K1 w komórkach hipokampalnych zarówno w warunkach in vivo [Cui i in. 2010] jak i in vitro [Sato i in. 2008]. Można sugerować, że działanie rapamycyny w mózgowiu uzależnione jest od aktywności układu opioidowego. Dlatego też, celem podjętych badań było określenie wpływu endogennych opioidów na stężenie białka S6K1 w podwzgórzu, w zależności od obecności inhibitora kompleksu mTORC1 – rapamycyny. MATERIAŁ I METODY Eksperyment przeprowadzono na 12 myszach szczepu Swiss o średniej masie ciała 26g, trzymanych w standardowych warunkach, z wolnym dostępem do wody i paszy. Zwierzęta podzielono na dwie grupy: kontrolną (n=6) i doświadczalną (n=6). Myszy z grupy kontrolnej otrzymały iniekcję z soli fizjologicznej (100µl), natomiast grupie doświadczalnej podano dootrzewnowo naltrekson (3mg/kg m.c., Sigma – Aldrich, USA) 60 minut przed dekapitacją i pobraniem podwzgórza. Fragmenty podwzgórza umieszczono w dołkach, zawierających 1,5ml buforu Krebsa z dodatkiem BSA (0,3g glukozy/ 100ml, 0,1g BSA/ 100ml), w temperaturze 37°C na okres 10 minut, pozwalając na stabilizację spontanicznego wydzielania (A). Po tym czasie przełożono tkanki do kolejnych dołków z buforem na 60 minut (B), następnie na kolejne 60 minut (C) i końcowe 10 minut inkubacji (D). W celu określenia wpływu endogennych opioidów na stężenie białka S6K1 w zależności od obecności inhibitora kompleksu mTORC1, do dołków na etapie B i C dodano roztwór rapamycyny (50nM, Sigma – Aldrich, USA). Po każdym z etapów pobrano 0,5 ml medium hodowlanego i oznaczano w nim stężenie białka S6K1 za pomocą testu ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit for Ribosomal Protein S6 Kinase Beta1, USCN Life Science Inc.). Tkanki po hodowli zhomogenizowano w buforze fosforanowym o pH=6,5, odwirowano 10minut/12000xg 343 Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec i w nadsączach oznaczono stężenie białka całkowitego metodą BCA (QuantiPro BCA Assay Kit, Sigma – Aldrich, USA), a następnie testem ELISA stężenie białka S6K1. Wyniki zaprezentowano jako wartości średnie ±SEM (pg/mg białka). Analizę statystyczną wykonano stosując program Statistica (StatSoft Inc.,Tulsa, OK, USA). Jednoczynnikowa analiza wariancji umożliwiła określenie różnic statystycznych między grupami (p<0,01). W celu dokładniejszej ilustracji wartości wyników poddano transformacji (pierwiastkowano). WYNIKI Wydzielanie spontaniczne białka S6K1 (Rys. 1A). Stopień wydzielania białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych wzrósł z wartości 0,76±0,2 (Rys. 1A 0,87±0,44) obserwowanej w pierwszych 10 minutach inkubacji do 15,58±1,03 (Rys. 1A 3,95±1,01) po kolejnych 60 minutach (p<0,01). W kolejnych etapach inkubacji (C i D) wydzielanie spontaniczne wyniosło 0,25±0,01 (Rys. 1A 0,5±0,1) i 0,12±0,01 (Rys. 1A 0,35±0,1), odpowiednio (p<0,01). Iniekcja naltreksonu wywołała istotne obniżenie wydzielania białka w każdym z badanych etapów w porównaniu do wydzielania z podwzgórza myszy kontrolnych. Wpływ rapamycyny na wydzielanie białka S6K1 (Rys. 1B). Rapamycyna zahamowała wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych zarówno w etapie B jak i D. Natomiast u myszy traktowanych naltreksonem zaobserwowano stymulujący wpływ rapamycyny na wydzielanie białka S6K1 – wzrost o 560 % po 60 minutach i o 117% po kolejnych 60 minutach inkubacji (p<0,01). 5 kontrola 5 4 naltrekson 4 3 S6K1 [pg/mg] S6K1 [pg/mg] Stężenie białka S6K1 w tkankach przed i po wydzielaniu. W tkankach z grupy doświadczalnej, na które działała rapamycyna zauważono spadek stężenia białka S6K1 w porównaniu z kontrolą. Nie zauważono istotnych statystycznie różnic w stężeniu białka S6K1 po wydzielaniu spontanicznym pomiędzy grupą kontrolna i doświadczalną (Rys. 2). # * 2 * 1 # # # * # 3 2 # 1 * # # # * 0 0 A 344 # B C D A B C D Udział opioidów w modulowaniu wpływu rapamycyny... Naltrekson obniżył stopień spontanicznego wydzielania białka S6K1 w porównaniu z grupą kontrolną (Rys. 3A). W przypadku wydzielania stymulowanego naltrekson obniżył stężenie białka w tkankach oraz zastymulował jego wydzielanie w stosunku do grupy kontrolnej (Rys. 3B). Rys. 1. Stężenie białka S6K1 wydzielonego z podwzgórza: 8 A – bez rapamycyny, naltreks on B – po dodaniu rapamycyny; 6 A – pierwsze 10 minut inkuba4 cji (stabilizacja), B – kolejne 2 60 minut inkubacji, C – kolejne 0 60 minut inkubacji, D – końcobez RA PA z RA PA we 10 minut inkubacji. Różnice statystycznie istotne: # – pomiędzy grupą kontrolną, a doświadczalną ( z naltreksonem); * – w stosunku do pierwszych 10 minut inkubacji. Wyniki zostały zaprezentowane jako wartości średnie ±SEM (n=6/ grupa). p<0,01 10 S6K1 [pg/mg] S 6K 1 [pg/mg] kontrola w tkance 8 7 6 5 4 3 2 1 0 w ydzielone kontrola naltrekson z RAPA S6K1 [pg/mg] Rys. 2. Stężenie białka S6K1 w tkankach po wydzielaniu spontanicznym (bez rapamycyny) i po dodaniu rapamycyny. Wyniki zostały zaprezentowane jako wartości średnie ±SEM (n=6/grupa) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 kontrola naltrekson bez RAPA Rys. 3. Stężenie białka S6K1 w tkankach przed wydzielaniem : A – spontanicznym (bez rapamycyny), B – po dodaniu rapamycyny oraz stężenie białka wydzielone z tkanki. Wyniki zostały zaprezentowane jako wartości średnie ±SEM (n=6/grupa) 345 Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec DYSKUSJA Układ opioidowy jest jednym z głównych układów zaangażowanych w silnie konserwatywne ewolucyjnie mechanizmy, dotyczące percepcji bólowej, nagrody, uzależnienia i zachowań lękowych [Lesniak i Lipowski 2011]. Znane są trzy typy receptorów opioidowych – mu, delta i kappa [Chang i Porecca 2003], rozpowszechnione w centralnym i obwodowym układzie nerwowym, a także w tkankach pochodzenie nieneuronalnego [Sehgal i in. 2011]. Obszar podwzgórza, w którym znajdują się komórki wykazujące ekspresję aktywnych form mTOR i S6K1 [Cota i in. 2006], charakteryzuje się również występowaniem dużej liczby receptorów mu opioidowych [Lesniak i Lipowski 2011]. Potwierdzono, że zastosowanie antagonistów receptorów mu opioidowych stymuluje ścieżkę sygnałową kinazy PI3K. Użycie DAMGO (selektywny agonista receptorów opioidowych typu mu) w hodowli komórkowej zadziałało stymulująco na kinazę Akt, S6K1 oraz 4E-BP1. Przeciwstawne działanie wywołało podanie selektywnych inhibitorów kinazy PI3K [Polakiewicz i in. 1998]. Uzyskane wyniki doświadczenia wykazały, że zastosowanie inhibitora receptorów opioidowych (naltreksonu) spowodowało znaczny spadek spontanicznego wydzielanie białka S6K1 z podwzgórza w porównaniu do grupy kontrolnej. Świadczy to o niewątpliwym udziale endogennych opioidów w modulacji szlaku kinazy mTORC1, której jednym z substratów jest białko S6K1. Wcześniejsze doniesienia podkreślają hamujący wpływ rapamycyny na fosforylację kinazy S6K1 [Sato i in. 2008]. Przeprowadzone badania wykazały, że dodanie rapamycyny do hodowli spowodowało spadek wydzielania białka S6K1 z podwzgórza myszy kontrolnych. Niespodziewanie, rapamycyna spowodowała wzrost wydzielania białka S6K1 z podwzgórza zwierząt traktowanych naltreksonem w stosunku do grupy kontrolnej (Rys. 3B) oraz grupy doświadczalnej nie poddanej działaniu rapamycyny (Rys. 3A). Wyniki te sugerują, iż niskie stężenie endogennych opioidów wywołane działaniem naltreksonu znosi inhibicyjny efekt rapamycyny, objawiający się spadkiem wydzielania białka S6K1 z podwzgórza. Otrzymane wyniki rzucają nowe światło na zagadnienia związane z rolą rapamycyny oraz układu opioidowego w modulowaniu aktywności szlaku kinazy mTORC1. WNIOSKI • Rapamycyna powoduje spadek stopnia wydzielania białka S6K1 z podwzgórza, co świadczy o jej hamujący wpływie na aktywność kinazy mTORC1. 346 Udział opioidów w modulowaniu wpływu rapamycyny... • Zmiany stężenia białka S6K1 w komórkach podwzgórza wywołane podaniem naltreksonu, wskazują na udział opioidów w regulacji aktywności szlaku kinazy mTORC1. • Przy jednoczesnej stymulacji komórek podwzgórza naltreksonem i rapamycyną, niskie stężenie endogennych opioidów znosi inhibicyjny efekt działania rapamycyny. LITERATURA Bandhyopadhyay U. Cuervo AM. 2007. Chaperone-mediated autophagy in aging and neurodegeneration: lessons from alpha-synuclein. Experimental Gerontology, 42: 120-128. Cao R. Obrietan K. 2010. mTOR Signaling and entrainment of the mammalian circadian clock. Molecular and Cellular Pharmacology, 2(4):125-130. Chang KJ. Porecca F. 2003. The delta receptor. CRC press. Cota D. Proulx K. Blade Smith KA. Kozma SC. Thomas G. Woods SC. Seeley RJ. 2006. Hypothalamic mTOR signaling regulates food intake. Science, 312, 927. Costa-Mattioli M. Sossin WS. Klann E. Sonenberg N. 2009. Translational control of longlasting synaptic plasticity and memory. Neuron, 61: 10-26. Cui Y. Zhang XQ. Cui Y. Xin WJ. Jing J. Liu G. 2010. Activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-mammalian target of rapamycin signaling pathway in the hippocampus is essential for the acquisition of morphine-induced place preference in rats. Neuroscience, 171: 134-143. Foster KG. Fingar D. 2010. Mammalian target of rapamycin (mTOR): conducting the cellular signaling symphony. The Journal of Biological Chemistry, 285(19): 14071-14077. Hands SL. Proud ChG. Wyttenbach A. 2009. mTOR’s role in ageing; protein synthesis or autophagy? Aging, 1(7). Kapahi P. Chen Di. Rogers AN. Katewa SD. Wai-Lun Li P. Thomas EL. Kockel L. 2010. With TOR less is more: a key role for the conserved nutrient sensing TOR pathway in aging. Cell Metabolism, 11(6): 453-465. Lesniak A. Lipkowski W. 2011. Opioid peptides in peripheral pain control. Acta Neurobiologiae Experimentalis, 71: 129-138. Martin DE. Hall MN. 2005. The expanding TOR signaling network. Current Opinion in Cell Biology, 17: 158-166. 347 Anna Latacz, Paulina Szczurek, Marta Strzetelska, Krystyna Pierzchała-Koziec Minor RK. Allard JS. Younts CM. Ward TM. de Cabo R. 2010. Dietary interventions to extend life span and health span based on calorie restriction. Journal of Gerontology, 65(7): 695-793. Perycz M. Wiech Ł. Malik A. Jaworski J. 2007. mTor physiology and pathology of the nervous system. Postępy Biologii Komórki, 34(3): 511-525. Polakiewicz RD. Schieferl SM. Gingras AC. Sonenberg N. Comb MJ. 1998. Mu-opioid receptor activates signaling pathways implicated in cell survival and translational control. The Journal of Biological Chemistry, 36: 23534-23541. Sato T. Umetsu A. Tamanoi F. 2008. Characterization of the Rheb-mTOR signaling pathway in mammalian cell: constitutive active mutant of Rheb and mTOR. Methods in Enzymology, 438: 307-320. Sehgal N. Smith H. Manchikanti L. 2011. Peripherally acting opioids and clinical implications for pain control. Pain Physician, 14: 249-258. Shaw RJ. Cantley LC. 2006. Ras, PI(3)K and mTOR signaling controls tumor cell growth. Nature, 441: 424-430. Sengupta S. Peterson TR. Sabatini DM. 2010. Regulation of the mTOR complex 1 pathway by nutrients, growth factors, and stress. Molecular Cell, 40(2): 310322. Webb JL. Ravikumar B. Atkins J. Skepper JN. Rubinsztein DC. 2003. Alpha-synuclein is degraded by both autophagy and the proteasome. Journal of Biological Chemistry, 278: 25009-25013. Adres do korespondencji: mgr Anna Latacz, Paulina Szczurek, mgr inż. Marta Strzetelska Katedra Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt Wydział hodowli i biologii zwierząt Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krystyna Pierzchała-Koziec Praca finansowana z DS.3243/KFEZ/2011 348 Małgorzata Łukasz Aleksandra Cetera Barbara Rusztowicz Jerzy Świtalski EPISTEME 14/2012 s.349-355 ISSN 1895-4421 ODDZIAŁYWANIE WODY ANIONOWEJ NA TEMPO WZROSTU DROBNOUSTROJÓW INFLUENCE OF ANIONIC WATER ON THE GROWTH RATE OF MICROBES Abstrakt. W doświadczeniu zbadano wpływ wody anionowej na wzrost wybranych drobnoustrojów. Woda alkaliczna wzbogacona jest w aktywny wodór (OH-) oraz elektrolity o ładunku ujemnym. Efekt oddziaływania czynnika doświadczalnego na tempo namnażania mikroorganizmów oceniono sporządzając krzywe kinetyki wzrostu wybranych drobnoustrojówów. Analiza wyników doprowadziła do wniosku, że woda anionowa może stymulować niektóre bakterie w logarytmicznej fazie wzrostu. Nie wykazano natomiast wpływu alkalizowanej wody na tempo przyrostu drożdży. Słowa kluczowe: woda anionowa, kinetyka wzrostu drobnoustrojów, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae Summary. Influence of alcaline water on the growth of selected microbes was the object of this experiment. Anionic water contains active hydrogen (OH-) and negative electrolites. Effect of the tested factor on the growth rate of microbes was estimated by compiling growth curves for chosen microorganisms. Results of this study suggest that alkaline water may stimulate some bacteria in their exponential growth phase. Yet no influence of anionic water on the growth rate of yeast occurred. Key words: anionic water, growth kinetics of microbes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae 349 Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski WSTĘP Japońscy naukowy uważają spożywanie wody anionowej (zwanej też wodą alkaliczną lub „wodą żywą”) za bezcenne dla zdrowia. Woda ta o alkalicznym pH i ujemnym potencjale redoks powstaje wskutek elektrolizy wody wodociągowej. Pod wpływem przyłożonego napięcia elektrycznego na katodzie wydzielany jest wodór (H2) oraz powstają aniony wodorotlenkowe (OH), co skutkuje alkalizacją środowiska głównie z powodu tworzenia wodorotlenku sodu (NaOH). Korzyści zdrowotne wynikające ze spożywania wody alkalicznej przypisuje się głównie neutralizacji nierównowagi kwasowej w organizmie. Badania kliniczne w japońskich szpitalach dowodzą znamienitego wpływu spożywania wody anionowej na poprawę ogólnego stanu zdrowia w tym: stymulację fizjologicznej mikroflory jelitowej oraz przeciwdziałanie fermentacji kątniczej [Hayakawa i Tsuge a) b) 1999], przeciwdziałanie osteoporozie, obniżenie poziomu cholesterolu, regulację wydzielania soku żołądkowego, przeciwdziałanie alergiom, wspomaganie rekonwalescencji, neutralizację toksyn, regulację poziomu cukru we krwi, wspomaganie funkcji wątroby, pomoc w leczeniu chronicznych biegunek [Hayashi i Kawamura 1990; Hayakawa i Tsuge b) 1999]. W testach in vitro wykazano, że poprzez zmiatanie rodników tlenowych aktywnym wodorem (OH-) woda anionowa chroni DNA przed uszkodzeniami [Shirahata i in. 1997] jak również wzmacnia działanie innych przeciwutleniaczy takich jak kwas askorbinowy [Hanaoka i in. 2004]. Południowokoreańscy badacze dowiedli działania przeciwnowotworowego u myszy pojonych woda anionową – opóźnienie wzrostu guzów oraz wydłużenie czasu przeżycia zwierząt [Lee i in. 2004]. Dla wielu wyniki te pozostają jednak wątpliwe. Powyższe doniesienia zainspirowały autorów niniejszej pracy do zbadania oddziaływania wody alkalicznej na tempo wzrostu drobnoustrojów: Escherichia coli, Bacillus subtilis oraz Saccharomyces cerevisiae. Korzystne efekty działania wody anionowej na tak nieskomplikowane organizmy, w porównaniu do organizmu człowieka, przemawiałyby za dodatnimi efektami spożywania tej wody również przez ludzi. Korzyści ze stymulacji tempa namnażania, a pośrednio metabolizmu mikroorganizmów mogłyby zostać wykorzystane w biotechnologii i mikrobiologii przemysłowej w celu eskalacji produkcji biomasy, zwiększenia efektywności syntezy metabolitów przez drobnoustroje czy wreszcie przyspieszenia procesów biochemicznych z ich udziałem. MATERIAŁ I METODY Materiał biologiczny. Materiałem biologicznym były trzy gatunki drobnoustrojów: Escherichia coli ATCC 25922, dziki szczep Bacillus subtilis oraz szczep przemysłowy Saccharomyces cerevisiae - pozyskany z kostki “Drożdże domowe” wyprodukowanej przez firmę “Lallemad” S.p. z o. o. Wybrane 350 Oddziaływanie wody anionowej na tempo wzrostu drobnoustrojów... bakterie stanowiły przykład modelowych organizmów gramoujemnych i gramododatnich, natomiast wykorzystane drożdże organizmu eukariotycznego. Podłoża mikrobiologiczne. Wodę anionową pozyskano z wody wodociągowej z wykorzystaniem urządzenia „Jonizator wody PTV-KL, PTV-AL.” firmy „BURBULIKAS”. Wodę wodociągową poddawano 30-minutowemu procesowi jonizacji. W wyniku powyższej procedury otrzymano wodę anionową o wartości pH ok. 11 i potencjale utleniania-redukcji równym -949 mV. W celu oszacowania oddziaływania badanego czynnika w doświadczeniu używano podłoży o optymalnie dobranych komponentach dla danego mikroorganizmu. Kontrolę stanowiła pożywka wykonana na bazie wody wodociągowej, natomiast podłoże właściwe zawierało wodę anionową. Wartości pH medium z „wodą żywą” minimalnie skorygowano dodatkiem 0,1M roztworu HCl do wartości pH charakteryzujących próby kontrolne tj. 6,50 - 7,00. Skład pożywki dla E. coli w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: bulion odżywczy 8g, ekstrakt drożdżowy 2g, NaCl 5g, laktoza 5g, K2HPO4 5g, KH2PO4 1,5g. Skład pożywki dla B. subtilis w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: pepton 5g, ekstrakt drożdżowy 5g, glukoza 5g, NaCl 1g, K2HPO4 0,5g, MgSO4 0,5g, NaHCO3 1g. Skład pożywki dla S. cerevisiae w przeliczeniu na 1000 cm3 wody: pepton 2g, ekstrakt drożdżowy 2g, glukoza 20g, (NH4)2SO4 3g, MgSO4 x 7H2O 0,3g, KH2PO4 1g, CaCl2 x 5 H2O 0,2g. Metody. W celu zbadania wpływu wody anionowej na wzrost mikroorganizmów mierzono gęstość optyczną płynnej hodowli co godzinę od momentu inokulacji. Pomiar gęstości optycznej (OD - Optical Dentisity) przeprowadzono w spektrofotometrze Shimadzu UV-1201V przy długości fali λ=550 nm w kuwecie szklanej zawierającej 2 cm3 wody dejonizowanej i 0,2 cm3 płynnej hodowli drobnoustrojów. Dla każdego pomiaru wykonano trzy powtórzenia, których uśrednione wartości poddano analizie statystycznej. Badane mikroorganizmy, w celu otrzymania czystej kultury, hodowano na pożywkach stałych: bakterie na bulionie z glukozą, S. cerevisiae na pożywce Sabouruaud (Biomerieux) z chloramfenikolem. W celu otrzymania inokulum, podłoże płynne szczepiono ezą z pojedynczej koloni. Po 24 godzinach hodowli przygotowanym inokulum zaszczepiano 20 cm3 płynnej pożywki tak, by mierzona gęstość optyczna w czasie inokulacji wynosiła od 0,015 do 0,025. Hodowle prowadzono na wytrząsarce Heidolph Unimax 1010 z inkubatorem Heidolph Inkubator 1000 w temperaturze 37ºC dla bakterii oraz 28ºC dla drożdży. Kontrolę oraz próbę właściwą wykonano w trzech replikach. Eksperyment powtórzono dla B. subtilis i E. coli trzykrotnie, natomiast dla S. cerevisiae - pięciokrotnie. Do oszacowania istotności statystycznej posłużono się testem t dla par skorelowanych. 351 Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski WYNIKI Bacillus subtilis. Zaobserwowano zwiększoną gęstość optyczną podczas fazy wzrostu wykładniczego w hodowlach prowadzonych na wodzie alkalicznej w stosunku do kontroli. Największe różnice w OD wynosiły dla kolejnych powtórzeń: 1,93 w 5 i 6 godzinie hodowli; 2,56 w 6 i 7 godzinie oraz 2,61 w 8 godzinie hodowli;1,47 w 5 godzinie hodowli. Rozbieżności te stanowiły dla kolejnych powtórzeń odpowiednio 71%, 175% i 64 % przyrostu gęstości optycznej w odniesieniu do kontroli. Nie zaobserwowano skrócenia fazy lag ani wydłużenia fazy logarytmicznego wzrostu podczas hodowli B. subtilis w pożywce na bazie wody anionowej. Uzyskane wyniki są wysoce istotne statystycznie (p < 0,01). Escherichia coli. W pierwszym eksperymencie zanotowano wyraźnie zwiększony przyrost gęstości optycznej w czasie logarytmicznej fazy wzrostu bakterii E. coli hodowanych na wodzie alkalicznej w odniesieniu do hodowli kontrolnej. Różnica w OD wyniosła 1,91, 1,90, 1,62 oraz 1,84 w kolejno 5, 6, 7, i 8 godzinie hodowli, co stanowiło maksymalnie 67% przyrostu gęstości optycznej w porównaniu do kontroli. Otrzymane wyniki są wysoce istotne statystycznie (p < 0,01). Analogicznych rezultatów nie odnotowano w kolejnych powtórzeniach doświadczenia, w których największe różnice gęstości optycznej pomiędzy próbą właściwą a kontrolą wynosiły od 0,32 do 0,38 będąc na granicy błędu statystycznego. Saccharomyces cerevisiae. Nie zaobserwowano istotnych różnic w gęstości optycznej prób właściwych S. cerevisiae w stosunku do kontroli w żadnej fazie wzrostu podczas 10-godzinnych eksperymentów. Odnotowane rozbieżności w wartościach OD mieszczą się w zakresie wyliczonych odchyleń standardowych lub są na ich granicy. Na Rycinie 1 przedstawiono wykresy obrazujące wzrost B. subtilis, E. coli oraz S. cereviasiae w dwóch powtórzeniach doświadczenia dla każdego z badanych mikroorganizmów. WYNIKI I DYSKUSJA Celem doświadczenia było zbadanie oddziaływania wody anionowej na tempo przyrostu wybranych drobnoustrojów. Wyniki przeprowadzonych eksperymentów wskazują na stymulację bakterii z gatunku Bacillus subtilis w logarytmicznej fazie wzrostu pod wpływem wody alkalicznej w medium, o czym świadczy przyrost OD w zakresie 64 - 175% w porównaniu do kontroli. Dla modelowego gatunku gramoujemnych bakterii Escherichia coli jedynie w pierwszym z trzech przeprowadzonych eksperymentów odnotowano przyrost gęstości optycznej rzędu 67% pod wpływem czynnika doświadczalnego w fazie wzrostu wykładniczego. Z kolei dla drożdży Saccharomyces cerevisiae woda alkaliczna w podłożu w żaden sposób nie ingeruje w tempo 352 Oddziaływanie wody anionowej na tempo wzrostu drobnoustrojów... wzrostu. W żadnym z badanych przypadków nie zaobserwowano negatywnego odziaływania „wody żywej” na przyrost drobnoustrojów. Woda anionowa w medium mikrobiologicznym nie wpłynęła również na długość fazy lag ani przebieg fazy akcelerecji. Rys. 1. Obserwacje wzrostu B. subtilis, E. coli oraz S. cerevisiae w podłożach na bazie wody anionowej (linie przerywane) oraz podłożach kontrolnych (linie ciągłe) 353 Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski Uzyskane wyniki w przypadku B. subtilis mogą być spowodowane zawartością soli mineralnych jako czynnika limitującego wzrost w tradycyjnych podłożach mikrobiologicznych. Uzupełnienie poziomu składników mineralnych przez wodę alkaliczną w medium mogło przyczynić się do stymulacji wzrostu B. subtilis. Spotęgowanie proliferacji bakterii B. subtilis oraz E. coli mogło być ponadto następstwem doznanego przez bakterie szoku osmotycznego po zainokulowaniu podłoża na bazie wody alkalicznej. Warunki stresu mogły spowodować obumarcie lub sprzetrwalnikowanie części komórek, po czym pozostałe zdołały zaadoptować się do napotkanych warunków i w szybkim tempie zająć dostępną niszę [Ding i in. 2009]. Ponadto aniony zawarte w „wodzie żywej” mogą neutralizować kwaśne produkty metabolizmu bakterii, przez co nie dochodziło do silnego zakwaszenia środowiska, które ostatecznie hamuje proliferację komórek [Salmond i in. 1984; Shelef 1994]. Możliwe, że ze względu na złożony metabolizm S. cerevisiae nieistotne okazało się zwiększenie ilości dostępnych związków mineralnych jak to mogło mieć miejsce w przypadku bakterii. Warunki przeprowadzanych eksperymentów oraz podłoża mikrobiologiczne były odpowiednio dobrane o czym świadczy szybkie wejście drobnoustrojów w fazę wzrostu wykładniczego. Gęstość optyczna inokulum była wystandaryzowana, a warunki pH, temperatury i wytrząsania ustabilizowane. Nie można zlekceważyć faktu odmiennego przebiegu krzywych wzrostu dla prób B. subtilis, który może wskazywać na pominięcie dodatkowego czynnika wpływającego na wzrost drobnoustrojów. Z uwagi na rozbieżne wyniki w przypadku E. coli oraz niespójności w obrazie krzywych wzrostu B. subtilis należy przeprowadzić powtórzenie doświadczenia przy odmiennych wartościach temperatury oraz z wykorzystaniem różnych szczepów tych gatunków bakterii. Nie można wykluczyć interakcji składników medium z jonami zawartymi w „wodzie żywej”, dlatego wyniki eksperymentu należy zweryfikować przeprowadzając doświadczenia z użyciem maksymalnie zubożonych podłóż. Reasumując powyższe, należy być ostrożnym w jednoznacznym stwierdzeniu korzystnego efektu oddziaływania wody alkalicznej na wzrost bakterii. Możliwe pozytywne rezultaty oddziaływania wody anionowej w medium na wzrost B. subtilis mogą znaleźć zastosowanie w mikrobiologicznej syntezie α-amylaz (również α-amylazy), proteaz, ksylanazy, amidazy penicylanowej [Libudzisz i in. 2008], kwasu hialuronowego, polihydroksyalkalonów (PHA) [Chen i in. 2000] oraz antybakteryjnej subtyliny [Błaszczyk 2008]. 354 Oddziaływanie wody anionowej na tempo wzrostu drobnoustrojów... LITERATURA Błaszczyk U. 2008. Bakteriocyny – właściwości i zastosowanie. Laboratorium Przemysłowe, 10:28-32. Chen GQ. Wu Q. Xi JZ. Yu HP. Chan A. 2000. Microbial production of biopolyesters polyhydroxyalkanoates. Prog Nat Sci, 10:843–50. Ding T. Jin YG. Rahman, SME. Kim JM. Choi KH. Choi GS. Oh DH. 2009. Prediction of Growth of Escherichia coli O157 : H7 in Lettuce Treated with Alkaline Electrolyzed Water at Different Temperatures. J. Fd Hyg. Safety, 24(3):232-237. Hanaoka K. Sun D. Lawrence R. Kamitani Y. Fernandes G. 2004. The mechanism of the enhanced antioxidant effects against superoxide anion radicals of reduced water produced by electrolysis. Biophys Chem, 107(1):71-82. Hayakawa T. Tsuge H. 1999: Science and Technology of Functional Water. Water Scienll cc Institute, 109-116. Hayakawa T. Tsuge H. 1999: Basics and Effective Use of Alkaline Ionized Water. 25th General Assembly of Japan Medical Congress Functional Water in Medical Treatment, Administration Offices, 10-11. Hayashi H. Kawamura M. 1990. The concept of prehepatic medicines. Presentation At The Eight Annual International Symposium On man And His Environment in Health And Disease at The Grand Kempinski Hotel, Dalls, USA. Lee KJ. Park SK. Kim JW. Kim GY. Ryang YS. Kim GH. Cho HC. Kim SK. Kim HW. 2004. Anticancer Effect of Alkaline Reduced Water. Journal of International Society of Life Information Science. 22(2):302-305. Libudzisz Z. Kowal K. Żakowska Z.2008. Mikrobiologia techniczna. Tom 2. PWN Warszawa, 128-143 Salmond CV. Kroll RG. Booth IR. 1984. The effect of food preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol,130:2845–2850. Shelef LA. 1994. Antimicrobial effects of lactates: a review. J. Food Prot,57:445–450. Shirahata S. Kabayama S. Nakano M. Miura T. Kusumoto K. Gotoh M. Hayashi H. Otsubo K. Morisawa S. Katakura Y. 1997. Electrolyzed-reduced water scavenges active oxygen species and protects DNA from oxidative damage. Biochem Biophys Res Commun. 234(1):269-74. 355 Małgorzata Łukasz, Aleksandra Cetera, Barbara Rusztowicz, Jerzy Świtalski Adres do korespondencji: mgr inż. Małgorzata Łukasz, mgr Jerzy Świtalski Katedra Mikrobiologii e-mail: [email protected], [email protected] mgr inż. Alaksandra Cetera mgr inż. Barbara Rusztowicz Katedra Chemii i Fizyki e-mail: [email protected], [email protected], Wydział Rolniczo-Ekonomiczny Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Wiesław Barabasz Autorzy pragną podziękować prof. dr hab. inż. Wiesławowi Barabaszowi za umożliwienie prowadzenia doświadczeń w Katedrze Mikrobiologii, dr inż. Markowi Ostafinowi – pomysłodawcy badań oraz mgr inż. Marcinowi Sinderze za wkład włożony w przygotowanie i udostępnienie szczepu S. cerevisiae oraz opracowanie metodyki pomiarów spektrofotometrycznych. 356 Katarzyna Małek Ilona Czyczyło-Mysza Izabela Marcińska Michał Dziurka EPISTEME 14/2012 s.357-364 ISSN 1895-4421 MAPOWANIE QTL PLONU I ZAWARTOŚCI SACHAROZY W STRESIE SUSZY U PSZENICY QTL MAPPING OF THE YIELD AND SUCROSE CONTENT UNDER DROUGHT STRESS IN WHEAT Abstrakt. Współcześnie kwestią priorytetową dla rolnictwa jest pozyskiwanie nowych, bardziej wydajnych odmian, o dobrym plonowaniu nawet w warunkach suszy. Powszechnie wiadomo, iż stres deficytu wody wpływa ujemnie na plon większości gatunków roślin uprawnych,w tym pszenicy. W obecności czynnika stresowego, w tym niedoboru wody, zarówno w liściach jak i w organach niefotosyntetyzujących, może nastąpić gromadzenie się sacharozy i produktów jej rozkładu. Celem badań była lokalizacja QTL plonu (ang. Quantitative Trait Loci) i zawartości sacharozy u pszenicy w warunkach niedoboru wody. Analizę QTL wykonano w populacji podwojonych haploidów CSDH pszenicy. Zmapowano 9 QTL dla obu cech. Zlokalizowano 4 QTL dla plonu na chromosomach: 7A (kontrola) i 4A, 7A, 2B (susza). Dla zawartości sacharozy w liściu flagowym zidentyfikowano 5 QTL na chromosomach: 5A, 7A, 2B (kontrola) i 4A (susza). Słowa kluczowe: plon, pszenica, QTL, sacharoza, susza Summary. Nowadays, the priority for agriculture is to obtain new, more efficient varieties with good yield even in the drought conditions. It is well known that water deficit stress affects negatively on majority crop species’ yield, including wheat. In the presence of stress factor, including water deficiency, in the leaves as well as in the non-photosynthetic organs, may taking place the accumulation of sucrose and its degradation products. The aim of this study was to localize the QTL (Quantitaive Trait Loci) for yield and sucrose content in wheat under water deficit conditions. QTL analysis was performed in CSDH doubled haploid lines population of wheat. Nine QTL were mapped for both traits. Four of the yield QTLs were located on chromosomes 7A (control) and 4A 7A, 2B (drought). Five QTL for sucrose content in the flag leaf were identified on chromosomes: 5A, 7A (control) and 4A (drought). Key words: sucrose, yield, QTL, wheat, drought 357 Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka WSTĘP Pszenica zwyczajna jest jednym z najważniejszych gatunków zbóż uprawnych w gospodarce człowieka, a efektywność jej produkcji jest ściśle uzależniona od dostępności wody w glebie. Komórkowy deficyt H2O u roślin wywołany stresem suszy prowadzi do redukcji przyswajania węgla, związanej w sposób fizjologiczny z zamykaniem się szparek liściowych, a biochemicznie przypisanej obniżeniu aktywności fotosyntetycznej, co nie pozostawia bez zmian również gospodarki węglowodanowej [Chaves i in. 2002]. Pomimo redukcji asymilacji dwutlenku węgla w liściach traktowanych stresem suszy, rośliny akumulują duże ilości węglowodanów rozpuszczalnych w wodzie, w tym sacharozę [Bartelsi Salamini 2001]. Cukry rozpuszczalne pełnią funkcje osmolityczne utrzymując turgor komórek liści, zabezpieczając integralność błon oraz zapobiegając denaturacji białek [Bartels i Sunkar 2005]. Sacharoza uczestniczy nie tylko w odpowiedzi na stresy abiotyczne, ale służy także jako składnik odżywczy i cząsteczka sygnałowa, modulująca aktywność szerokiego zakresu genów [Ciereszko 2002; Koch 2004]. Ze względu na wysoki potencjał antyoksydacyjny sacharoza jest rozważana jako czynnik wspomagający organizm roślinnyw przeciwdziałaniu szkodliwemu wpływowi wolnych rodników [Van den Ende i Valluru 2009]. Zmiany w środowisku znajdują odzwierciedlenie we wzmożonej produkcji nie tylko sacharozy, ale również produktów jej metabolizmu [Hare i in. 1998]. Przemiany metaboliczne sacharozy są ściśle związane z intensywnością przebiegu fotosyntezy i oddychania oraz różnorodnych szlaków – metabolicznych i transportowych. Susza wpływa negatywnie na procesy związane z asymilacją [Sharkey i Seeman 1989], co może prowadzić do braków w zaspokojeniu potrzeb rozwijających się ziaren [Schnyder 1993] i dużych strat w plonie. Wraz ze wzrostem dehydratacji tkanek czynnych fotosyntetycznie rośnie również możliwość trwałych uszkodzeń, a co za tym idzie znacznego obniżenia asymilacji węgla [Kaiser 1984]. Skrobia stanowi na ogół >65% suchej masy ziarna pszenicy [Duffus 1992], a stres suszy może znacznie obniżyć jej zawartość w plonie [Ahmadi i Baker 2001]. Wypełnienie ziarna u pszenicy zależy od bieżącej asymilacji oraz remobilizacji rezerw węglowodanowych, zarówno przed jak i po kwitnieniu, pomiędzy pędem, liśćmi,a ziarnami w kłosie [Wardlaw i Willenbrink 1994]. W poszukiwaniu odpowiedzi na genetyczne uwarunkowanie zmian ilościowych, zachodzących w niekorzystnych warunkach środowiska, w tym suszy, użytecznym narzędziem jest mapowanie loci cech ilościowych (ang. Quantitative Trait Loci, QTL). Zostało ono wykorzystane do lokalizacji QTL plonu i zawartości sacharozy na genomie pszenicy w warunkach niedoboru wody w glebie. 358 Mapowanie QTL plonu i zawartości sacharozy w stresie suszy u pszenicy... MATERIAŁ I METODY Materiał roślinny. Populacja CSDH, złożona z 94 linii podwojonych haploidów (ang. Doubled Haploid, DH), została wyprowadzona przez prof. Quarrie z mieszańca F1 krzyżówki Chinese Spring, formy modelowej pszenicy jarej, często wykorzystywanej w badaniach polowychi laboratoryjnych, wykazującej tolerancję na suszę oraz SQ1 (o podwyższonej zawartości ABA) [Quarrie i in. 2005]. Wielkość doświadczenia: (94 DH + 2 formy rodzicielskie) × 3 rośliny (roślina/wazon) × 2 traktowania (susza + kontrola) = 576 roślin Metody. Zwernalizowane siewki 94 linii CSDH oraz 2 form rodzicielskich umieszczonow wazonach (Ø15 cm, wys. 20 cm, siewka/wazon) wypełnionych mieszanką glebowąo składzie: ziemia ogrodnicza z substratem torfowym:piasek (v:v, 1:1). Wegetacja roślin przebiegała w otwartej hali wegetacyjnej, zabezpieczonej przed opadami, w warunkach zbliżonych do naturalnych, przy długości dnia i temperaturze powietrza przypadających na okres wiosenno-jesienny (V-IX). W stadium krzewienia u roślin przeznaczonych do traktowania suszą, zastosowano ostre ograniczenie nawadniania w celu uzyskania zawartości wody na poziomie 40% ppw (pojemność polowa wody), i utrzymywano je przez okres4 tygodni. W dniu zakończenia suszy pobrano liście flagowe pędów głównych do pomiaru zawartości sacharozy. Oceny wielkości plonu dokonano po zakończeniu wegetacjii uzyskaniu pełnej dojrzałości roślin: określono suchą masę ziaren/roślinę (plon [g]). Zamrożony materiał roślinny liści flagowych poddano liofilizacji przez 72h, a następnie rozdrobniono w młynku kulowym (Retsch, Kroll, Niemcy). Pomiar zawartości sacharozy wykonano przy użyciu zmodyfikowanej metody Janeczko i in. [2010], z wykorzystaniem chromatografu cieczowego (HPLC). Ekstrakcję sacharozy prowadzono w 1 ml dejonizowanej wody destylowanej przez 1h przy prędkości 50 obr·min.-1. Rozdział sacharozy prowadzono na kolumnie Hamilton RCX-10 250×4.1 mm. Poszukiwanie QTL wykonano w oparciu o mapę, o łącznej długości 3521,7 cM, opublikowaną przez Quarrie i in. [2005] zawierającą 567 markerów: SSR, RFLP, AFLP, obejmujących genom T. aestivum L. Analizy statystyczne i QTL. Podstawowe statystyki obliczono przy użyciu programu Excel 2007. Rozkład cechw populacji oraz korelacje pomiędzy nimi sprawdzono za pomocą programu Statistica. Analizy QTL prowadzono przy pomocy programu Windows QTLCartographer v. 2.5 software (Wang i in. 2004) metodami: analizy regresji liniowej (Single Marker Analysis, SMA) oraz złożonego mapowania interwałowego (Composite Interval Mapping, CIM). Wartość krytyczną LOD wyznaczono na podstawie testu permutacji dla 1000 powtórzeń. 359 Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka WYNIKI I DYSKUSJA Populacja CSDH, jest bardzo dobrze scharakteryzowana genotypowo (około 450 zlokalizowanych markerów), a w wyniku wcześniejszych badań także fenotypowo, ponadto dobrze poznane są obie formy rodzicielskie: Chinese Spring i SQ1. Różnią się one znacznie wydajnością plonu w odpowiedzi na suszę w warunkach polowych [Quarrie i in. 2005 i 2006; Habash i in. 2007], co potwierdzają nasze badania (Tab. 1). Uzyskane wartości średnich dla plonu i zawartości sacharozy w liściu flagowym dla roślin poddanych suszy i kontroli są wartościami pośrednimi wobec wartości minimalnych i maksymalnych dla populacji CSDH,a wartości odchyleń standardowych w populacji są wysokie, co razem wskazuje na duże zróżnicowanie fenotypowe oraz genetyczne populacji i bogaty zestaw alleli form rodzicielskich (Tab. 1). Maksima i minima dla plonu i zawartości sacharozy w liściu,w odniesieniu do wartości średnich dla form rodzicielskich, wskazują na istnienie linii potomstwa zarówno ze zmniejszoną, jak i zwiększoną ekspresją fenotypową badanych cech. Cecha Plon [g] Yld Sacharoza [µg·mg-1] LfSucC Populacja CSDH Obiekt Rodzice Symbol locus CS SQ1 Średnia SD Min. Max. Skośność Kurtoza K 3,38 2,80 3,05 0,79 0,40 4,82 -0,31 -0,02 S 1,63 1,66 1,43 0,47 0,24 2,77 0,19 0,15 K 112,3 91,5 73,9 15,5 20,8 123,5 0,42 0,51 S 106,6 77,2 78,2 27,2 17,6 174,7 0,68 0,86 Tab. 1. Średnie wartości badanych cech linii rodzicielskich i podwojonych haploidów (CSDH) oraz odchylenie standardowe (SD), minimum (min.), maksimum (max.), skośność i kurtoza dla linii CSDH w warunkach stresu suszy (S) i kontrolnych (K) oraz symbole ich loci. SD – odchylenie standardowe, K – kontrola, S – susza Dane umieszczone w Tab. 1, a przede wszystkim wartości skośności i kurtozy mieszczące się w granicy od -1 do 1 wskazują, że rozkład badanych cech był zbliżony do rozkładu normalnego, co dało podstawę do dalszej analizy QTL. Wykazano dodatnią korelację (dane nie przedstawione) dla zawartości sacharozy, co świadczy o tym, że susza wpływa na wzrost zawartości sacharozy, co jest zgodne z badaniami Ciereszko [1999]. Za pomocą złożonego mapowania interwałowego otrzymano łącznie 9 QTL dla badanych zmiennych: 4 QTL dla plonu i 5 QTL dla zawartości sacharozy (Tab. 2). Otrzymane QTL były zlokalizowane na chromosomach: 4A, 5A, 7A i 2B, na których zmapowano już wcześniej QTL dla plonu [Quarrie i in. 2005]. Uzyskane QTL charakteryzują się wysokimi wartościami współczyn360 Mapowanie QTL plonu i zawartości sacharozy w stresie suszy u pszenicy... nika R2 – od 9.2% do 21,2%, co świadczy o tym, że każdy z nich w istotny sposób reguluje omawiane cechy. QTL zmapowane dla plonu tłumaczą odpowiednio 14,1% i 34,5% zmienności fenotypowej występującej w populacji CSDH w warunkach kontrolnych i ostrego deficytu wody w glebie. Natomiast dla zawartości sacharozy zdefiniowane QTL wpływają odpowiednio na 60,9% (K) i 13,2% (S) zróżnicowania populacji. Na poziom plonowania, zarówno przy optymalnym poziomie nawodnienia jak i w warunkach stresu suszy, przeważający wpływ mają allele pochodzące od formy ojcowskiej SQ1. W badaniach Quarrie i in. [2005] wykazano, że na chromosomie 7Au pszenicy zlokalizowane są QTL istotne dla szeregu cech agronomicznych, w tym plonowania. Jest to potwierdzeniem dla naszych badań, w wyniku których otrzymano dla plonu QTL na chromosomie 7A – zarówno w kontroli jak i w suszy. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że w warunkach kontrolnych to allel SQ1 podwyższa plon, natomiast dla suszy allelem podnoszącym wartość tej cechy był allel pochodzący od rodzica tolerancyjnego, czyli CS. Opisany powyżej wpływ alleli SQ1 i CS jest zbieżny z charakterystyką form rodzicielskich: Chinese Spring wykazuje tolerancję na suszę, natomiast SQ1 odznacza się niższym plonowaniem w warunkach niedoboru wody w glebie w porównaniu z CS [Quarriei in. 2005 i 2006; Habash i in. 2007], co byłoby dodatkowym potwierdzeniem dla ważnej roli chromosomu 7A w plonowaniu u pszenicy [Quarrie i in. 2005, 2006]. Obecność loci QTL plonu na chromosomie 7A stwierdzili w swoich badaniach także: Kumar i in. [2006] i Habash i in. [2007]. Z użyciem SMA dodatkowo uzyskano 2 QTL na chromosomie 4A w pobliżu markerów: gwm30.2-4 i gwm165.3 dla warunków kontrolnych plonu i zawartości sacharozy. Allel podwyższający poszczególne cechy jest tu odmienny – dla plonu jest to allel SQ1, natomiast dla sacharozy – allel Chinese Spring, co wskazuje na zróżnicowany wpływ tych alleli na badane cechy. Ponadto, dla plonu i zawartości sacharozy w warunkach niedoboru wody zlokalizowano QTL na chromosomie 4A otrzymane metodą CIM, dla których podwyższającym wartość cechy jest allel CS, a jego wpływ na zawartość sacharozy w liściu flagowym jest znaczny. Wspomniane QTL wpływają na warunkowane przez nich cechy odpowiednio w 10,3%i 13,2%. QTL znaleziony w pobliżu markera m92p78.8 dla sacharozy w suszy jest istotny dla plonowania [Quarrie i in. 2005]. QTL związany z markerem wmc257, na chromosomie 2B, został wyznaczony dla wysokiej wartości ilorazu logarytmu wiarygodności (LOD=6,4) i w dużym stopniu wpływa na zawartość sacharozy w warunkach dobrego nawodnienia gleby (R2=21,2%). Wysoce pozytywny wpływ na zawartość sacharozy posiada tu allel Chinese Spring (a=8,035). Habash i in. [2007] przy użyciu metody analizy regresji liniowej na chromosomie 2B uzyskali aż 10 klastrów (w tym 4 QTL potwierdzono metodą CIM) odpowiadających m.in. za: wysokość 361 Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka Obiekt Sacharoza Plon Cecha rośliny, czas kwitnienia, zawartość białek rozpuszczalnych oraz barwę liścia, dla których wspólnym mianownikiem jest wyżej wspomniany marker. Salem i in. [2007] zmapowali3 QTL związane z remobilizacją rezerw cukrowych oraz utrzymaniem rozmiaru ziarnaw warunkach działania na liść substancji chemicznej o właściwościach osuszających na chromosomach 2D, 5D i 7D. QTL Chromosom Marker Pozycja LOD R2 a K QYld.csdh* 7A m51p65.7 132.8 3.8 14.1% - 0.235 QYld.csdh* 2B wmc360 141.9 4.5 15.0% - 0.132 QYld.csdh* 4A dupw004a 111.2 3.1 10.3% - 0.110 QYld.csdh 7A gwm635b 24.9 3.4 9.2% 0.179 QLfSucC.csdh 2B m59p78.1 12 3.1 10.0% - 5.476 QLfSucC.csdh 2B wmc257 34 6.4 21.2% 8.035 QLfSucC.csdh 5A vrn-A1 111 3.1 10.7% - 4.443 QLfSucC.csdh 7A wmc479 33 5.6 19.0% 5.963 QLfSucC.csdh 4A m92p78.8 34 3.9 13.2% 8.755 S K S Tab. 2. QTL zmapowane dla plonu i zawartości sacharozy z użyciem metody Composite Interval Mapping (CIM). LOD – iloraz logarytmu wiarygodności, R2 – współczynnik determinacji, a– efekt addytywny allela A (allela pochodzącego od rodzica Chinese Spring, CS), * – QTL potwierdzone metodą Single Marker Analysis (SMA) WNIOSKI Populacja CSDH jest zróżnicowana pod względem plonowania i zawartości sacharozy w liściu flagowym, mierzonych po zastosowaniu suszy glebowej, co pozwala na mapowanie tych cech. Selekcja wybranych linii o zwiększonych wartościach plonu czy zawartości sacharozy w stosunku do form rodzicielskich jest więc możliwa. Zawartość sacharozy w liściach pszenicy wzrasta w wyniku deficytu wody w glebie, a poziom jej akumulacji jest prawdopodobnie warunkowany genetycznie w sposób odmienny niż dla plonowania. Ważnym obszarem na genomie pszenicy jest chromosom 7A zawierający region, dla którego pozytywny wpływ na wartość plonu posiada allel Chinese Spring, odmiany znanej z tolerancji na suszę. Prezentowane wyniki stanowią efekt jednorocznego doświadczenia, dlatego też wymagają poparcia w postaci kolejnych lat badań. 362 Mapowanie QTL plonu i zawartości sacharozy w stresie suszy u pszenicy... LITERATURA Ahmadi A. Baker D.A. 2001. The effect of water stress on the activities of key regulatory enzymes of the sucrose to starch pathway in wheat. Plant Growth Regulation, 35: 81–91. Bartels D. Salamini F. 2001. Desiccation tolerance in the resurrection plant Craterostigma plantagineum: A contribution to the study of drought tolerance at the molecular level. Plant Physiol, 127(4): 1346-1353. Bartels, D. Sunkar R. 2005. Drought and salt tolerance in plants. Crit. Rev. in Plant Sci. 24(1): 241-36. Chaves M. M. Pereira J.S. Maroco J. Rodrigues M.L. Ricardo C.P.P. Osório M.L. Carvalho I. Faria T. Pinheiro C. 2002. How plants cope with water stress in the field. Photosynthesis and growth. Annals of Botany, 89: 907–916. Ciereszko I. 2002. Regulacyjna rola cukrów. Percepcja cukrów i przekazywanie sygnału w komórkach roślinnych. Post. Biol. Kom. 29: 269–289. Ciereszko I. Farrar J.F. Rychter A.M. 1999. Compartmentation and fluxes of sugars in roots of Phaseolus vulgaris under phosphate deficiency. Biol. Plant. 42: 223–231. Duffus C. M. 1992. Control of starch biosynthesis in developing cereal grains. Bioch. Soc. Tran. 20: 13–18. Habash D. Z. Stephanie Bernard S. Schondelmaier J. Weyen J. Quarrie S.A. (2007): The genetics of nitrogen use in hexaploid wheat: N utilisation, development and yield. Theor Appl Genet. 114(3): 403-19. Hare P. D. Cress A.W. van Staden J. 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Environ. 21: 535–553. Janeczko A., Biesaga–Kościelniak J., Oklestkova J., Filek M., Dziurka M., Szarek-Łukaszewska G., Kościelniak J. 2010. 24-Epibrassinolide in wheat production: physiological activity and uptake. Journal of Agronomy and Crop Science 196: 311-321. Kaiser W. M.1984. Response of photosynthesis and dark-CO2-fixation to light, CO2 and temperature in leaf slices under osmotic stress. Journal of Experimental Botany, 35: 1145-1155. Koch K. 2004. Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant developmnent. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 235–246. Kumar N. Kulwal P.L. Balyan H. S. Gupta P.K. 2007. QTL mapping for yield contributing traits in two mapping populations of bread wheat. Molecular Breeding, 19(2): 163-177. 363 Katarzyna Małek, Ilona Czyczyło-Mysza, Izabela Marcińska, Michał Dziurka Quarrie S. A. Steed A. Calestani C. Semikhodskii A. Lebreton C. Chinoy C. Steele N. Pljevljakusić D. Waterman E. Weyen J. et al. 2005. A high-density genetic map of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) from the cross Chinese Spring × SQ1 and its use to compare QTLs for grain yield across a range of environments. Theor Appl Genet. 110: 865-880. Quarrie S. A. Pekic Quarrie S. Radosevic R. Rancic D. Kaminska A. Barnes J.D. Leverington M. Ceoloni C. Dodig D. 2006. Dissecting a wheat QTL for yield present in a range of environments: from the QTL to candidate genes. Journal of Experimental Botany, 57: 2627-2637. Salem K. F. M. Röder M.S. Börner A. 2007. Identification and mapping quantitative trait loci for stem reserve mobilisation in wheat (Triticum aestivum L.). Cereal Research Communications, 35: 1367–1374. Schnyder H. 1993. The role of carbohydrate storage and redistribution in the sourcesink relations of wheat and barley during grain filling — a review. New Phytologist, 123: 233–245. Sharkey T. D. Seeman 1.R. 1989. Mild water stress effects on carbon-reduction-cycle intermediates, ribulose bis-phosphate carbohylase activity, and spatial homogenity in intact leaves. Plant Physiology, 89: 1060-1065. Van den Ende W. Valluru R. 2009. Sucrose, sucrosyl oligosaccharides, and oxidative stress: scavenging and salvaging? Journal of Experimental Botany, 60(1): 9-18. Wang S. Basten C.J. and Zeng Z.B. 2007. Windows QTL Cartographer, new version, Statistical Genetics. North Carolina State University. Wardlaw I. F. Willenbrink J. 1994. Carbohydrate storage and mobilization by the culm of wheat between heading and grain maturity: the relation to sucrose synthase and sucrose-phosphate synthase. Aust J Plant Physiol, 21:255–271 Adres do korespondencji: mgr Katarzyna Małek1, dr inż. Ilona Czyczyło-Mysza1, dr hab. Izabela Marcińska1, dr. Michał Dziurka2 1 Zakład Biotechnologii, 2Zakład Biologii Rozwoju Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk ul. Niezapominajek 21, 30-239 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr. hab. Izabela Marcińska, prof. PAN 364 Rafał Ogórek Katarzyna Kalinowska Bartosz Kozak EPISTEME 14/2012 s.365-372 ISSN 1895-4421 ZRÓŻNICOWANIE GENETYCZNE IZOLATÓW CANDIDA ALBICANS ZA POMOCĄ MARKERÓW ITS GENETIC DIVERSITY OF CANDIDA ALBICANS ISOLATES USING ITS MARKERS Abstrakt. Candida albicans jest wszechobecnym komensalem, jak również bardzo ważnym, oportunistycznym patogenem ludzkim, powodującym infekcje skóry, błon śluzowych czy paznokci. Mikroorganizm ten może wywołać ostre i przewlekłe grzybice inwazyjne. Są one bardzo groźne dla pacjentów z grup ryzyka np. osób z chorobami nowotworowymi lub osób po zabiegach chirurgicznych z cukrzycą bądź gruźlicą. Grupą pacjentów szczególnie predysponowaną do rozwinięcia zakażenia grzybiczego są chorzy na AIDS. W przypadku nie leczonych kandydoz głębokich może dojść do zgonu chorego. Przeprowadzone badania miały na celu określenie genetycznego zróżnicowania izolatów C. albicans. Do analiz wybrano 22 izolaty uzyskane od pacjentów z różnych miejsc chorobowo zmienionych. Do określenia zmienności wykorzystano markery ITS. Produkty uzyskane po reakcji PCR, trawiono enzymem restrykcyjnym Hinf I i rozdzielano je elektroforetycznie. Z przeprowadzonych badań wynika, że analizowane izolaty wykazały zróżnicowanie profilu genetycznego. Słowa kluczowe: zróżnicowanie genetyczne, Candida albicans, markery ITS Summary. Candida albicans is both an ubiquitous commensal, as well as very important opportunistic human pathogen causing skin infections, mucous membrane infections or nail infections. This microorganism may cause acute and chronic invasive fungal infections. It is very dangerous for patients from risk gropus, e.g. people with cancer, people after surgeries, who suffer from diabetes or tuberculosis. Group of patients particularly predisposed to the development of fungal infection are patients with AIDS. The prognosis is poor and untreated, deep candidiasis may cause death. The research was aimed to determine the genetic diversity of C. albicans isolates. 22 isolates selected for analysis, which were obtained from patients with different pathological changes. To determine the diversity used ITS markers. The product obtained after PCR, digested with the restriction enzyme Hinf I and them were separated by electrophoresis. The research showed that the analyzed isolates showed high genetic diversity. Key words: genetic diversity, Candida albicans, ITS markers 365 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak WSTĘP Grzyby drożdżakowe z rodzaju Candida należą do typu workowców (Ascomycota). Są pospolitymi saprotrofami, które zasiedlają organizm człowieka [Kasperska-Zając i Rogala 2002]. Szacuje się, że grzyby drożdakowe w tym Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, występują u 10 do 40 % ludzi zdrowych. Zasiedlają one cały ich przewód pokarmowy, począwszy od jamy ustnej, aż do odbytnicy [Szczepaniak i in. 2004]. Obecnie znanych jest około 196 gatunków Candida spp., z tego 15 ma właściwości chorobotwórcze [Kostecka 2011]. Są one główną przyczyną kandydoz błon śluzowych, układu moczowego, płciowego i dróg oddechowych u pacjentów z naturalnym lub wywołanym farmakologiczne niedoborem odporności [Krzyściak i in. 2011]. Spośród gatunków drożdżaków z tego rodzaju, najczęściej izolowanym i najbardziej patogenicznym dla człowieka jest C. albicans, który może być przyczyną infekcji i alergii u ludzi oraz zwierząt [Kasperska-Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009]. Szacuje się, że jest on przyczyną 80% kandydoz przewodu pokarmowego [Szczepaniak i in. 2004]. Natomiast pod względem uczuleniowym ustępuje grzybom strzępkowym z rodzaju Cladosporium, Alternaria i Aspergillus [Kasperska-Zając i Rogala 2002, Karkowska-Kuleta i in. 2009]. W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat obserwuje się stały wzrost zakażeń grzybiczych powierzchownych i głębokich, które prowadzą często do zgonu [Gustem 1994, Pfaller 1996, Batura-Gabryel i Młynarczyk 1998]. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym w grzybicach są drożdżaki z rodzaju Candida, a w szczególności gatunek C. albicans. Ryzyko rozwoju zakażeń grzybiczych jest powiązane z kondycją fizjologiczną organizmu gospodarza, czyli jego stanem zdrowia, wiekiem i sposobem odżywiania. Do innych czynników zwiększających ryzyko kandydoz należą zabiegi inwazyjne, antybiotykoterapie oraz pierwotne i wtórne niedobory immunologiczne (AIDS, cukrzyca) [Nawrot i Karpiewska 2002]. W ostatnich latach, istotny jest szczególnie problem zwiększenia ilości spożywanych antybiotyków. ESAC (European Surveillance of Antibiotic Consumption) donosi, że Polska znajduje się w pierwszej dziesiątce krajów europejskich pod względem ilości spożywanych antybiotyków na jednego mieszkańca. W Polsce na 1000 osób, 25 zażywa antybiotyki codziennie, a w okresie jesienno-zimowym nawet 100 [Kostecka 2011]. Powszechne stosowanie antybiotykoterapii zabija bakterie pasożytnicze oraz masowo niszczy pożyteczną florę bakteryjną przewodu pokarmowego. Zmiany te prowadzą także do wtórnych niedoborów witaminowych, które mają również wpływ na odporność przed zakażeniami grzybiczymi [Isenberg i in. 1960, Pappas i in. 2003]. Potwierdzają to doniesienia Campbell i Saslaw [1949], których wyniki badań klinicznych wykazały rozwój grzybic pod wpływem stosowanej streptomycyny. 366 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... Trudności związane z patogenicznością C. albicans mogą być spowodowane zmiennością fenotypową i genotypową tego patogena, która objawiają się m.in. różną zdolnością adhezji komórek drożdżaka do komórek nabłonka i śródbłonka gospodarza oraz różną produkcją pozakomórkowych enzymów [Odds i in. 1983, Nawrot i Karpiewska 2002]. Do oceny zróżnicowania genetycznego grzybów można wykorzystać technikę PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction -Restriction Fragment Length Polymorphism) [Godoy i in. 2004]. Jest to metoda w której produkty uzyskane w reakcji amplifikacji (PCR) poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Celem badań było określenie zróżnicowania genetycznego izolatów C. albicans, wyizolowanych z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów z wykorzystaniem techniki PCR-RFLP. MATERIAŁ I METODY Do badań użyto 22 izolaty Candida albicans, które pochodziły z chorobowo zmienionych miejsc u pacjentów – Tab. 1. Pochodziły one z kolekcji Katedry i Kliniki Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Akademii Medycznej we Wrocławiu. DNA do analiz molekularnych wyizolowano z koloni wyrosłych na podłożu Sabourauda. Kolonie zbierano ezą do 1,5 ml probówek Eppendorf i izolowano według metody Doyle i Doyle [1987], zmodyfikowanej przez Kozaka i in. . Ilość i jakość wyizolowanego materiału sprawdzano spektrofotometrycznie (długości fali: 260, 280, 230 nm). Do dalszych analiz przygotowano roztwory robocze o stężeniu DNA 30 ngx ml-1. Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze firmy Biometria. Mieszanina reakcyjna miała skład: 5,9 ml H2O, 1,5 ml buforu x 10 (Fermentas), 2,5 ml MgCl2 (25 mM, Fermentas), 1 ml dNTP (10 mM każdy, mix, Fermentas), 1,1 ml startera Forward (F) i Reverse (R), 0,2 ml polimerazy (5ux ml-1, Fermentas), genomowe DNA (30 ngx ml-1). Do analiz użyto dwóch kombinacji starterów ITS1: F 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’, R 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ oraz ITS2: F 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’, R 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’. Reakcję PCR przeprowadzono w 40 cyklach i składała się z następujących etapów: wstępna denaturacja 95°C przez 5 min, denaturacja 95°C przez 1 min, przyłączanie starterów 55°C przez 30 sek., amplifikacja 72°C przez 30 sek., końcowa amplifikacja 72°C przez 10 min. Produkty po PCR trawione były przy użyciu enzymu Hinf I w roztworze o składzie: 9 ml H2O, 1 ml bufor R (Fermentas), 1 ml Hinf I (Fermentas), 5 ml produkt po amplifikacji. Trawienie prowadzone było przez 16 godzin w 37 °C, po tym czasie enzym był dezaktywowany przez 5 min inkubację w 75 °C. 367 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Po trawieniu otrzymane produkty rozdzielono z użyciem elektroforezy kapilarnej na urządzeniu Qiaxel (Qiagen). Po analizie elektroforogramów utworzona została binarna macierz przy użyciu oprogramowania urządzenia Qiaxel, którą analizowano w programie NTSYSpc [Rohlf 1990]. Do stworzenia macierzy dystansu genetycznego wykorzystano algorytm Nei [1972]. Dendrogram utworzono przy wykorzystaniu metody UPGMA. WYNIKI Analiza matrycy binarnej, utworzonej na podstawie elektoforogramów uzyskanych w rozdziale produktów trawienia enzymem Hinf I, pozwoliła na wykrycie 6 polimorficznych prążków. Na tej podstawie utworzono macierz dystansu genetycznego oraz dendrogram zróżnicowania genetycznego w badanym materiale (Rys. 1). Rys. 1. Dendrogram UPGMA obrazujący dystans genetyczne pomiędzy badanymi izolatami C. albicans Utworzona macierz dystansu genetycznego i dendrogram zróżnicowania genetycznego, podzieliły badane izolaty na dwie grupy (I i II) i w każdej z nich wyróżniona trzy podgrupy (A, B i C) – obrazują to Tab. 1 i Rys. 1. Izolaty C. albicans z grupy I można uznać za plejotropowe, pojawiają się one na tkankach zewnętrznych i wewnętrznych, natomiast izolaty z grupy II występują tylko w tkankach wewnętrznych. Jednakże izolaty należące do obu grup, występowały na narządach rozrodczych – Tab. 1. 368 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... L.p. Nazwa szczepu Symbol 1 AM 1418 / 2011 A–1 2 AM 1481 / 2011 A–2 3 AM 1285 / 2011 A–3 4 AM 1235 / 2011 A–4 5 AM 1548 / 2011 A–5 6 AM 1185 / 2011 A–6 7 AM 900 / 2011 A –7 8 AM 90028 / 2011 A–8 9 AM 09 / 2011 A–9 10 AM 96 / 2011 A – 10 11 AM 10231 / 2011 A – 11 12 AM 08 / 2011 B–1 Miejsce izolacji paznokcie rąk przestrzeń międzypalcowa stóp paznokcie rąk jama ustna paznokcie rąk żołądź jama ustna Grupa IA IA IA IA IA IB II A IA IA IA II A II A 13 AM 53 / 2011 B–2 pachwiny IC 14 AM 73 / 2011 B–3 paznokcie stóp IA 15 AM 70 / 2011 B–4 pochwa II B 16 AM 1066 / 2011 B–5 jama ustna IA 17 AM 103 / 2011 B–6 paznokcie stóp IA 18 AM 325 / 2011 B–7 jama ustna II C 19 AM 1444 / 2011 B–8 20 AM 1768 / 2011 B–9 21 AM 06 / 2011 B – 10 22 AM 02 / 2011 B – 11 pochwa jama ustna IC IC IC IC Tab. 3. Zestawienie badanych izolatów C. albicans z podziałem na grupy uzyskane po analizie zmienności genetycznej DYSKUSJA We współczesnej medycynie metody identyfikacji grzybów izolowanych z chorobowo zmienionych miejsc do gatunku oraz ocena ich zmienności genetycznej, stały się bardzo ważnym elementem prowadzącym do skutecznej terapii. Za jedną z najlepszych metod uważana jest analiza sekwencji reprezentatywnych fragmentów genomu drobnoustroju, ale stosowanie tej metody ogranicza się głównie do laboratoriów referencyjnych. Znacznie tańszą i prostszą metodą jest analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) produktów reakcji PCR [Chen i in. 2001, Iwen i in. 2002, Mecler i Nawrot 2008]. 369 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Wyniki uzyskane za pomocą technika PCR-RFLP są specyficzne gatunkowo dla grzybów oraz pozwala jednocześnie na ocenę ich zmienności genetycznej [Nawrot i in. 2011]. Przydatność tej metody do oceny zmienności genetycznej grzybów, potwierdziły wyniki przeprowadzonych badań z izolatami C. albicans. Metoda ta pozwoliła na ocenę zmienności genetycznej w obrębie badanych izolatów, poprzez utworzenie macierzy dystansu genetycznego oraz dendrogramu zróżnicowania genetycznego w badanym materiale. Polimorfizm uzyskany przy wykorzystaniu metody RFLP-PCR nie odbiegał od tego uzyskanego przez innych autorów za pomocą technik RAPD oraz RFLP [Boerlin i in. 1996, Espinel-Ingroff i in. 1999]. WNIOSKI • Technika RFLP-PCR jest skuteczną metodą oceny zróżnicowania genetycznego grzybów w obrębie gatunku C. albicans. • Wyniki badań genetycznych wykazały zróżnicowanie izalotów C. albicans w zależności od miejsca ich izolacji. • Najsłabiej zróżnicowane pod względem genetycznym są izolaty uzyskane z powierzchniowo zmienionych części ciała. LITERATURA Batura-Gabryel H., Młynarczyk W. 1998. Uwaga grzybice narządowe atakują. Mikologia Lekarska, 5(1): 21–24. Boerlin P., Boerlin-Petzold F., Goudet J., Durussel C., Pagani J.L., Chave J.P., Bille J. 1996. Typing Candida albicans oral isolates from human immunodeficiency virusinfected patients by multilocus enzyme electrophoresis and DNA fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, 34:1 235 – 1248. Campbell C.C., Saslaw S. 1949. Enhancement of growth of certain fungi by streptomycin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 70: 562 – 563. Chen Y., Eisner J.D., Kattar M.M., Rassoulian-Barrett S.L., Lafe K., Bui U., Limaye A.P., Cookson B.T. 2001. Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts. Journal of Clinical Microbiology, 39: 4042 – 4051. Doyle J.J., Doyle J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19(1): 11 – 15. 370 Zróżnicowanie genetyczne izolatów Candida Albicans... Espinel-Ingroff A., Vazquez J.A., Boikov D., Pfaller M. A. 1999. Evaluation of DNAbased typing procedures for strain categorization of Candida spp. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 33: 231 – 239. Godoy P., Cano J., Gené J., Guarro J., Höfling-Lima A.L.,Colombo A.L. 2004. Genotyping of 44 Isolates of Fusarium solani, the Main Agent of Fungal Keratitis in Brazil. Journal of Clinical Microbiology, 42(10): 4494 – 4497. Gustem J.V. 1994. Prophylaxis of Candida and Aspergillus infection with oral administration of itraconazole. Mycoses, 37: 243 – 248. Isenberg H.D., Pisano M.A., Carito S. 1960. Factors leading to overt monilial disease. Preliminary studies of the ecological relationship between Candida albicans and intestinal bacterial. Antibiotics&Chemotherapy, 10: 353 –356. Iwen P.C., Hinrichs S.H., Rupp M.E. 2002. Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens. Medical Mycology, 40: 87 – 109. Karkowska-Kuleta J., Rapala-Kozik M., Kozik A. 2009. Fungi pathogenic to humans: molecular bases of virulence of Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus. Acta Biochimica Polonica, 56 (2): 211 – 224. Kasperska-Zając A., Rogala E. 2002. Candida albicans – czynnik przyczynowy chorób allergicznych. Alergia Astma Immunologia, 7(4): 170 – 173. Kostecka M. 2011. Kandydoza przewodu pokarmowego u osób leczonych antybiotykami – profilaktyczne stosowanie suplementów diety. Mikologia Lekarska, 18(1): 11 – 14. Krzyściak P., Skóra M., Macura A.B.: Atlas grzybów chorobotwórczych człowieka. MedPharm Polska, 148–153. Mecler I., Nawrot U. 2008. Metody molekularne stosowane w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Mikologia Lekarska, 15: 99 – 103. Nawrot U., Czmajduch N., Gościniak G. 2011. Identyfikacja grzybów z rodzaju Candida na podstawie analizy polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych rybosomalnego DNA. Mikologia Lekarska, 18(4): 192 – 196. Nawrot U., Karpiewska A. 2002. Patogeneza zakażeń wywołanych przez Candida albicans. Mikologia Lekarska, 9(3): 137 – 143. Nei M. 1972. Genetic distance between populations. The American Naturalist, 106(28): 3 – 29. Odds F.C., Abbot A.B., Stiller R.L., Scholer H.J., Polak A., Stevens D.A. 1983. Analysis of Candida albicans phenotypes from different geographical and anatomical sources. Journal of Clinical Microbiology, 18: 554–557. 371 Rafał Ogórek, Katarzyna Kalinowska, Bartosz Kozak Pappas P.G., Rex J.H., Lee J. 2003. Mycoses Study Group. A prospective observational study of candidemia: epidemiology, therapy and influences on mortality in hospitalized adult and pediatric patients. Clinical Infectious Diseases, 37: 634 – 643. Pfaller M. 1996. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservois and modes transmission. Clinical Infectious Diseases, 22(2): 89 – 94. Rohlf F. J. 1990. NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. ver. 2.02. Exeter software, Setauket, New York. Szczepaniak W., Zawirska A., Adamski Z., 2004. Rola grzybów drożdżopodobnych rodzaju Candida w etiopatogenezie wybranych schorzeń przewodu pokarmowego. Nowiny Lekarskie, 73(6): 475 – 478. Adres do korespondencji: mgr inż. Bartosz Kozak Zakład Genetyki i Biotechnologii Roślin Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected] mgr inż. Rafał Ogórek Zakład Fitopatologii i Mikologii Katedra Ochrony Roślin Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected] mgr inż. Katarzyna Kalinowska Katedra i Klinika Dermatologii, Wenerologii i Alergologii Akademia Medyczna we Wrocławiu Wybrzeże L. Pasteura 1, 50-367 Wrocław e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Ewa Sawicka - Sienkiewicz, dr hab. Elżbieta Pląskowska, prof. dr hab. Eugeniusz Baran 372 Hubert Okła Jan Słodki Krzysztof P. Jasik EPISTEME 14/2012 s.373-379 ISSN 1895-4421 ZAKAŻENIE KLESZCZY IXODES RICINUS TYPOWYMI PATOGENAMI NA TERENIE WYBRANYCH SIEDLISK WOJEWÓDZTWA ŚLĄSKIEGO INFECTION OF IXODES RICINUS TICKS WITH TYPICAL PATHOGENS FROM SELECTED REGIONS OF THE SILESIAN VOIVODSHIP Abstrakt. Kleszcze są wektorami wielu drobnoustrojów chorobotwórczych, które przekazywane są żywicielom podczas żerowania. Celem pracy było określenie stopnia zakażenia kleszczy z terenów województwa śląskiego czynnikami etiologicznymi boreliozy, anaplazmozy i babeszjozy. Na 78 przebadanych kleszczy 84,9% było zainfekowanych Borrelia burgdorferi s.l., 24,4% Anaplasma phagocytophilum a 1,3% Babesia spp. Ponadto 23,1% kleszczy wykazywało koinfekcję B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum a 1,3% koinfekcję B. burgdorferi s.l. i Babesia spp. Kleszcze I. ricinus na terenie województwa śląskiego są zakażone drobnoustrojami chorobotwórczymi. Słowa kluczowe: Ixodes ricinus, choroby odkleszczowe, PCR Summary: Ticks are vectors of various pathogens which are transmitted to hosts during feeding. The aim of this study was to verify the frequency of ticks infections with Borrelia burgdorferi s.l., Anaplasma phagocytophilum and Babesia spp. from selected regions of the Silesian voivodship. Among the 78 analysed ticks, 84,9% were infected with B. burgdorferi s.l., 24,4% -A. phagocytophilum and 1,3% - Babesia spp. Furthermore, in 23,1% of all cases the coinfection of B. burgdorferi s.l. with A. phagocytophilum and in 1,3% - B. burgdorferi s.l. with Babesia spp. was found. Ixodes ricinus ticks from selected regions of Silesia are infected with pathogenic microorganisms. Key words: Ixodes ricinus, tick-borne diseases, PCR 373 Hubert Okła, Jan Słodki, Krzysztof P. Jasik WSTĘP Kleszcze Ixodes ricinus są najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem kleszczy twardych (Ixodidae) w Polsce [Stańczak 2006]. Bytują głównie w lasach liściastych i mieszanych, łąkach śródleśnych oraz pastwiskach. Podczas szczytów swojej aktywności głodne osobniki skupiają się w wilgotnych trawiastych miejscach, gdzie atakują niemal wszystkie kręgowce, w tym człowieka. Ich ukąszenia są źródłem zakażeń drobnoustrojami wywołującymi infekcje czasem o niespecyficznym, często ciężkim przebiegu. Tym samym, kleszcze należą do jednych z najważniejszych stawonogów z punktu widzenia medyczno-weterynaryjnego [Skotarczak 2006]. Do typowych patogenów wywołujących choroby odkleszczowe należą: Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum, Babesia spp. i wirus kleszczowego zapalenia mózgu [Stańczak 2006]. Celem pracy była ocena stopnia zakażenia kleszczy I. ricinus w wybranych siedliskach województwa śląskiego typowymi patogenami: B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp. MATERIAŁY I METODY Materiał badany stanowiło 78 kleszczy I. ricinus zebranych metodą flagową w okresie wiosennego szczytu aktywności tego gatunku (od marca do czerwca 2010 roku) w Raciborzu w województwie śląskim. Ekstrakcję DNA z zebranych kleszczy przeprowadzono przy użyciu zestawu odczynników DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Kolejny etap stanowiła analiza molekularna polegająca na wykryciu w otrzymanych ekstraktach materiału genetycznego B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, Babesia spp. Do tego celu wykorzystano komercyjne zestawy diagnostyczne: PCR Borrelia – PK17, PCR Anaplasma – PK24 i PCR Babesia – PK25 (DNA Gdańsk, Polska). Wykrycie badanych mikroorganizmów opierało się na amplifikacji odpowiednich fragmentów genów: fla dla krętków Borrelia, 16S rDNA dla A. phagocytophilum i 18S rDNA dla Babesia spp. W skład mieszanin reakcyjnych PCR wchodziły: Master Mix, mieszanina nukleotydów dNTPs (8 mM), termostabilna polimeraza DNA Hypernova oraz matryca DNA. W przypadku PCR Anaplasma wykorzystano termostabilną polimerazę Delta 3. Reakcje amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze Personal Cycler (Biometra, Goettingen, Niemcy) w warunkach termicznych przedstawionych w Tab. 1. 374 Zakażenie kleszczy Ixodes Ricinus typowymi patogenami... Temperatura Czas Temperatura Czas PCR Babesia Czas PCR Anaplasma Temperatura PCR Borrelia Denaturacja początkowa 93oC 2 min. 94oC 5 min. 94oC 2 min. Denaturacja* o 93 C 30 sek. o 94 C 30 sek. o 94 C 45 sek. Przyłączanie starterów* o 52 C 1 min. o 56 C 30 sek. o 48 C 45 sek. Wydłużanie łańcucha DNA* 72oC 1 min. 72oC 30 sek. 72oC 45 sek. Końcowe wydłużanie 72oC 1 min. 72oC 5 min. 72oC 5 min. Etap Tab. 1. Warunki termiczne PCR Borrelia, PCR Anaplasma i PCR Babesia. * Etapy: denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie łańcucha DNA powtórzone 35 razy (Anaplasma) lub 40 razy (Borrelia, Babesia) Produkty reakcji PCR w kolejnym etapie zostały rozdzielone za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) przy napięciu ok. 120 V. Elektroforegramy przeanalizowano w transluminatorze UV (Biometra, Goettingen, Niemcy) i zarchiwizowano przy użyciu oprogramowania UVI-Doc (UVItec, Cambridge, Wielka Brytania). Oczekiwany rozmiar produktów amplifikacji dla krętków B. burgdorferi s.l. wynosił 442 pary zasad (pz), dla A. phagocytophilum – 227 pz a dla Babesia spp. – 560 pz. Rys. 1a. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Borrelia (ścieżka 1 – kontrola negatywna, ścieżka 2 – marker wielkości M100-500, ścieżka 3 – kontrola pozytywna, ścieżki 4, 5, 6, 7, 8, 9 – próbki badane - pozytywne) 375 Hubert Okła, Jan Słodki, Krzysztof P. Jasik WYNIKI Badania przeprowadzono na populacji liczącej 78 kleszczy I. ricinus. Wśród nich było 61 samic (78,2%) i 17 larw (21,8%). Analiza molekularna wykazała infekcje wielu kleszczy czynnikami etiologicznymi boreliozy, anaplazmozy i babeszjozy. W próbkach pozytywnych obserwowano występowanie odpowiedniej długości amplimerów (Rys. 1a, 1b, 1c ). Rys. 1b. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Anaplasma (ścieżka 1 –kontrola negatywna, ścieżka 2 – marker wielkości M100-500, ścieżka 4 – kontrola pozytywna, ścieżki 3, 5, 6, 8 – próbki badane – pozytywne, ścieżki 7, 9 – próbki badane - negatywne) Rys. 1c. Elektroforegram przedstawiający wynik reakcji PCR Babesia (ścieżka 1 – kontrola negatywna, ścieżka 2 - marker wielkości M100-1000, ścieżka 3 – kontrola pozytywna, ścieżki 4, 5, 6, 7, 8, 10 – próbki badane - negatywne, ścieżka 9 – próbka badana - pozytywna) Najwięcej kleszczy było zainfekowanych krętkami z kompleksu B. burgdorferi s.l. – 66 osobników (84,6%), w tym 53 samice (86,9%) i 13 larw (76,5%). Druga pod względem częstości występowania była A. phagocytophilum. Tą bakterią było zakażonych 19 kleszczy (24,4%), w tym 10 samic (16,4%) i 9 larw (52,9%). Badania w kierunku Babesia spp. wykazały obecność tego pierwotniaka u jednej samicy (1,3%). Ponadto zaobserwowano zjawisko koinfekcji. 18 kleszczy (23,1%), w tym 9 samic (14,8%) i 9 larw (52,9%) było jednocześnie zainfekowanych B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum. U jednej samicy (1,3%) stwierdzono współistnienie zakażenia B. burgdorferi s.l. i Babesia spp.. 376 Zakażenie kleszczy Ixodes Ricinus typowymi patogenami... DYSKUSJA I WNIOSKI Choroby odkleszczowe stały się w ostatnich latach dużym problemem epidemiologicznym [Skotarczak 2006]. Kleszcze stanowią zagrożenie nie tylko na terenach leśnych, ale także w parkach i na terenach rekreacyjnych w miastach [Słodki i in. 2011]. Czynnikiem etiologicznym boreliozy (choroby z Lyme) są Gram-ujemne bakterie z rodziny Spirochaetaceae [Skotarczak 2006, Strzelczyk i in. 2006]. W 1996 roku w Polsce wprowadzono obowiązek zgłaszania zachorowań na boreliozę. Od tego czasu zaobserwowano 13-krotny wzrost liczby zachorowań [Meldunki o zachorowaniach na choroby zakaźne, zakażeniach i zatruciach w Polsce 1996-2011, Paulo 2010]. Stopień zakażenia kleszczy jest zróżnicowany w różnych regionach Polski. Z analizy mapek terenów endemicznych występowania boreliozy tworzonych przez Zakład Epidemiologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie wynika, że na przestrzeni lat obszar występowania tej choroby przesuwa się z północno-wschodniej części Polski w głąb kraju [Paulo 2010]. W latach 2001–2003 Strzelczyk i in. [2006] przeprowadzili badania kleszczy na terenach rekreacyjnych w okolicach Zabrza i Tarnowskich Gór. Wykazali oni, że 14,2% osobników I. ricinus jest zainfekowanych krętkami z kompleksu B. burgdorferi s.l. Porównując odsetki zakażeń na przestrzeni lat zaobserwowali oni spadek infekcji kleszczy. We wcześniejszych badaniach Petko [2002] wykazał, że stopień zakażenia kleszczy krętkami Borrelia waha się w przedziale 4% - 15%. Anaplasma phagocytophilum jest czynnikiem etiologicznym anaplazmozy zwierząt (AGA - animal granulocytic anaplasmosis) i ludzi (HGA - human granulocytic anaplasmosis) [Rymaszewska i Grenda 2008]. Wyniki badań przeprowadzonych w okolicach Białegostoku pokazują, że 14,5% zebranych kleszczy było nosicielami A. phagocytophilum [Grzeszczuk 2006]. Dla porównania, w Wielkopolsce odsetek zakażeń wynosił 22,7% wśród samic i 9,1% wśród samców kleszczy [Michalik i in. 2009]. Kleszcze są nosicielami nie tylko bakterii, ale także pierwotniaków z rodzaju Babesia. Skotarczak i Sawczuk [2003] analizowali obecność B. microti w różnych stadiach rozwojowych I. ricinus. Na Pomorzu 10,9% samic i 9,9% samców kleszczy było nosicielami tego patogenu. Podobne badania przeprowadzone rok później wykazały wzrost odsetku zakażonych osobników (11,9% samic i 13,4% samców). Dodatkowo zostało udowodnione, że kleszcze mogą być nosicielami więcej niż jednego patogenu. Wójcik-Fatla i in. [2009] przedstawili dane, z których wynika, że u 2,16% przebadanych kleszczy występują koinfekcje. Najczęściej wykrywali współzakażenie 377 Hubert Okła, Jan Słodki, Krzysztof P. Jasik A. phagocytophilum i B. microti (1,05%) a najrzadziej B. burgdorferi s.l. i B. microti (0,12%). Koinfekcja B. burgdorferi s.l. i A. phagocytophilum występowała w 0,93% przypadków. Ponadto w jednym przypadku wykazali infekcję kleszcza trzema patogenami. Na terenie Polski obserwuje się zróżnicowany stopień zakażeń B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp. wśród kleszczy. W regionach endemicznych o wysokiej ekstensywności zakażeń odsetki osobników będących nosicielami patogenów sięgają nawet kilkudziesięciu procent [Stańczak 2006]. Podsumowując, kleszcze I. ricinus na terenie województwa śląskiego są zakażone drobnoustrojami chorobotwórczymi: B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum i Babesia spp.. Ponadto część z nich jest nosicielami więcej niż jednego patogenu. LITERATURA Grzeszczuk A. 2006. Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus ticks and human granulocytic anaplasmosis seroprevalence among forestry rangers in Białystok region. Advances in Medical Science, 51: 283-286. Meldunki o zachorowaniach na choroby zakaźne, zakażeniach i zatruciach w Polsce 19962011. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny w Warszawie. http://www.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/2011/index_mp.html. Michalik J. Stańczak J. Racewicz M. Cieniuch S. Sikora B. Szubert-Kruszyńska A. Grochowalska R. 2009. Molecular evidence of Anaplasma phagocytophilum infection in wild cervids and feeding Ixodes ricinus ticks from west-central Poland. Clinical Microbiology and Infection, 15(2): 81-83. Paulo M. 2010. Kleszcze: oferta na lato 2010. Medycyna Praktyczna. http://infekcje. mp.pl/ publicystyka/show.html?id=53240. Petko B. 2002. Lyme borreliosis in carpathian region of central Europe – ecological aspect of diagnostics. W: Buczek A. Błaszak C. red. Stawonogi w medycynie. Liber. Lublin. Rymaszewska A. Grenda S. 2008. Bacteria of the genus Anaplasma – characteristics of Anaplasma and their vectors: a review. Veterinarni Medicina, 53(11): 573–584. Skotarczak B. 2006. Biologia molekularna patogenów przenoszonych przez kleszcze. PZWL. Szczecin. Skotarczak B. Sawczuk M. 2003. Occurrence of Babesia microti in ticks Ixodes ricinus on selected areas of western Pomerania. Wiadomości Parazytologiczne, 49(3): 273-280. 378 Zakażenie kleszczy Ixodes Ricinus typowymi patogenami... Słodki J. Jasik KP. Kępa M. Idzik D. Wojtyczka RD. 2011. Tick-transmitted diseases caused by Apicomplexa. Acta Protozoologica, 50: 155–161. Stańczak J. 2006. Kleszcze (Acari, Ixodidae) jako przenosiciele patogenów rozwijajacych się chorób infekcyjnych i inwazyjnych („emerging infectious diseases”) na terenie Polski. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna w Gdańsku Strzelczyk JK. Wilczkowski A. Spausta G. Ciarkowska J. Zalewska-Ziob M. Izdebska-Straszak G. Strzelczyk J. Kasperczyk J. 2006. Obecność krętków Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy Ixodes ricinus na terenach rekreacyjnych okolic Tarnowskich Gór i Zabrza w latach 2001-2003. Przegląd Epidemiologiczny, 60: 589-595. Wójcik-Fatla A. Szymańska J. Wdowiak L. Buczek A. Dutkiewicz J. 2009. Coincidence of three pathogens (Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti) in Ixodes ricinus ticks in the Lublin macroregion. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 16(1): 151-158. Adres do korespondencji: mgr Hubert Okła, mgr Jan Słodki, dr hab. Krzysztof P. Jasik Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec e-mail: [email protected]. Opiekun naukowy: dr hab. n. biol. Krzysztof Jasik 379 Katarzyna Pisarska Mariusz Adamski EPISTEME 14/2012 s.381-388 ISSN 1895-4421 OCENA WPŁYWU ENDOFITYCZNEGO METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS NA WYBRANE CECHY KUKURYDZY (ZEA MAYS L.) INFLUENCE OF ENDOPHYTIC METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS ON SOME MAIZE FEATURES (ZEA MAYS L.) Abstrakt. W pracy badano wpływ dwóch endofitycznych izolatów Methylobacterium extorquens wyizolowanych z tkanek liści kukurydzy odmiany Król na wybrane cechy. Określono zdolność szczepów do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, obecność genu nifH oraz zdolność do ograniczania wzrostu fitopatogenów in vitro. Badane izolaty nie miały zdolności do wykorzystywania związków fenolowych jako jedynego źródła węgla i energii. Oba izolaty posiadały gen nifH. Jedynie izolat A5 ograniczał wzrost Fusarium graminearum IOR 1970 in vitro. Inokulacja nasion izolatem A5 wpłynęła istotnie hamująco na długość korzenia oraz zawartość suchej masy korzenia i epikotylu odmiany KB1902, na zawartość suchej masy korzenia odmian KB1903, Król i Cyrkon oraz zawartość suchej masy epikotylu odmiany KB1903. Słowa kluczowe: Methylobacterium, endofity, kukurydza, kwasy fenolowe, nifH, Fusarium Summary. Influence of two endophytic Methylobacterium extorquens strains, isolated from leaf tissue of Król variety, on selected features were tested. The ability to use selected phenolic compounds as a sole source of carbon and energy, the presence of nifH gene and the ability to inhibit the growth of phytopathogens in vitro were tested. Isolates had no ability to use phenolic compounds as sole source of carbon and energy. Both isolates had nifH gene. Only A5 inhibited growth of Fusarium graminearum IOR 1970 in vitro. Seeds inoculation with A5 showed negative significant effect on root length, dry matter yield of roots and epicotyl of KB1902 variety, dry matter yield of roots of KB1903, Król, Cyrkon varirties and on dry matter yield of epicotyl of KB1903 variety. Key words: Methylobacterium, endophytes, maize, phenolic acids, nifH, Fusarium 381 Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski WSTĘP Wśród bakterii endofitycznych stwierdza się stymulatory wzrostu roślin zwane PGP (ang. Plant Growth Promoting). Zdolność do stymulowania wzrostu i rozwoju jest efektem m.in. produkcji fitostymulatorów [Long i in. 2008, Martinez-Morales i in. 2003]. Niektóre endofity wykazują również zdolność do wiązania wolnego azotu [Elbeltagy i in. 2001] a wiarygodnym markerem tego procesu jest gen hifH, kodujący reduktazę nitrogenazy [Poly i in. 2001]. Ponieważ wiele bakterii endofitycznych ma zdolność do produkcji substancji antybiotycznych w stosunku do fitopatogenów [Cho i in. 2002] z powodzeniem mogą być one wykorzystywane jako biologiczne środki ochrony. Wykorzystanie endofitów może przyczynić się do ograniczenia zużycia syntetycznych pestycydów a jednocześnie mogą ograniczyć pojawianie się odpornych form patogenów. Związki fenolowe, obecne w tkankach roślin, stanowią naturalny mechanizm ochrony przed patogenami. Mają one charakter bakterio oraz grzybobójczy. Zdolność drobnoustrojów do tolerowania lub/i wykorzystywania takich substancji umożliwia im efektywne zasiedlanie tkanek roślinnych [Oksińska i in. 2011]. Bakterie z rodzaju Methylobacterium występują w fyllosferze, gdzie wykorzystują jednowęglowe związki wydzielane przez rośliny. Stwierdzane są również w rizosferze ze względu na zdolność wykorzystywania wielowęglowych substratów [Green 1991]. Bakterie z rodzaju Methylobacterium zasiedlają również zdrowe tkanki. Jako endofity zostały wyizolowane m.in. z ryżu [Madhaiyan i in. 2007], kukurydzy słodkiej oraz bawełny [McInroy i Kloepper, 1995] i zaliczane są do PGP [Jeounghyun i in. 2006] Celem niniejszej pracy była ocena zdolności endofitycznych bakterii Methylobacterium extorquens do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, ich zdolność do wydzielania substancji przeciwgrzybowych oraz obecność genu nifH. Oceniono również wpływ izolatu A5 na wybrane cechy różnych odmian kukurydzy w warunkach in vitro. MATERIAŁY I METODY Bakterie z rodzaju Methylobacterium wyizolowano z odmiany kukurydzy KRÓL uprawianej na polu doświadczalnym firmy „Nasiona Kobierzyce” w Kobierzycach w 2009 roku. Izolacji bakterii endofitycznych dokonano z liści powierzchniowo zdezynfekowanych 70% etanolem, zmacerowanych w 0,1 M MgSO4. Macerat tkankowy posiano na podłoże 1/3 TSA (Difko, USA) i inkubowano w 28oC, 72h. Wybrano kolonie o charakterystycznym czerwonym kolorze. 382 Ocena wpływu endofitycznego Methylobacterium Extorquens... Przynależność gatunkowa została określona na podstawie sekwencjonowania fragmentu 16S rDNA z wykorzystaniem dwóch par uniwersalnych primerów: FAM27f [5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’] i 1942R [5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’] hybrydyzujące do końcowych odcinków oraz 704F [5’-TGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA-3’] i 765R [5’-CTGTTTGCTCCCCACGCTTTC-3’] hybrydyzujące do odcinków środkowych. Zdolność do wykorzystywania kwasów fenolowych (p-kumarowy, o-kumarowy, ferulowy, chlorogenowy) jako źródło węgla i energii określono w pożywce mineralnej SWK (Syntetyczne Wydzieliny Korzeniowe) [Oksińska i wsp. 2011]. Podłoża inokulowano 10 μl zawiesiny bakterii (108 jednostek tworzących kolonie ml-1) i po 72 h oceniano wzrost na podstawie pomiaru OD540 w porównaniu do wzrostu w SWK z 0,1% dodatkiem ekstraktu drożdżowego oraz SWK bez źródła węgla. Dla izolatów, niezdolnych do wykorzystywania określonego związku, wyznaczono MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration) na podłożu King B. Zdolność do produkcji związków przeciwgrzybowych określono na podstawie stref zahamowania wzrostu w stosunku do Fusarium moniliforme IOR 728 oraz Fusarium graminearum IOR 1970 na podłożu PDA. Na szalce w odległości 50 mm umieszczano krążek z 8-dniowej hodowli grzyba o średnicy 10 mm i wykonano rysę bakterii z 48-godzinnej hodowli. Całość inkubowano do momentu, aż grzybnia na płytce kontrolnej przekroczyła promień 50mm. Doświadczenia prowadzono w trzech powtórzeniach. Identyfikację genu nifH przeprowadzono z wykorzystaniem primerów PolF & PolR [Poly i wsp. 2001] oraz 5xHot FIREPol Blend Master Mix (Solid Biodyne). Produkt reakcji poddano elektroforezie w 2% agarze, 60 min, 100V. Masy prążków zanalizowano przy użyciu programu GelixOne 1D Software (biostep GmbH, Niemcy). Szczep referencyjny stanowił Azospirillum barsieliense 35Bb [Król i Perzyński 2005]. Wpływ szczepu A5 na wzrost 6-ciu badanych odmian kukurydzy określono w teście probówkowym w 0,9% agarze wodnym z dodatkiem zawiesiny bakterii (6,6 x 107 j.t.k. ml-1 w 0,1 M MgSO4) w proporcji 1:9 (v/v) w porównaniu do jałowego agaru wodnego. Nasiona powierzchniowo zdezynfekowano 1% NaClO- (30 min) i płukano w sterylnej wodzie (2 x 5 min., 1 x 90 min.). Ziarniaki wyłożone na słupki inkubowano 7 dni w 20oC i następnie określono wybrane cechy biometryczne (długość korzeni, epikotylu, liczbę korzeni) oraz oznaczono suchą masę. Doświadczenie prowadzono w 10 powtórzeniach. Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem Statistica 9.1 PL (StatSoft Inc.). 383 Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski WYNIKI I DYSKUSJA Zdolność do wzrostu w obecności wybranych związków fenolowych, zdolność do pozakomórkowego wydzielania substancji przeciwgrzybowych oraz obecność genu nifH endofitycznych bakterii Methylobacterium extorquens przedstawia Tab. 1. Testowane izolaty nie wykorzystywały wybranych związków fenolowych jako jedynego źródła węgla i energii. Były jednak zdolne do wzrostu w ich obecności w stężeniach wyższych niż naturalnie występujące w tkankach roślinnych [���������������������������������� Maksimovic i wsp. 2008].���������� Kwasy ferulowy, o-kumarowy i p-kumarowy nie hamowały wzrostu izolatów nawet w stężeniach czterokrotnie większych niż stwierdzane w sokach roślinnych. Jedynie kwas chlorogenowy (lub produkty jego rozpadu) hamował ich wzrost w stężeniu dwukrotnie większym niż stwierdzane w tkankach kukurydzy. W literaturze opisano nieliczne szczepy Methylobacterium, które są endofitami roślin [m.in. McInroy i Kloepper, 1995] lub żyją w symbiotycznych układach z porostami [Żarnowski i in. 2002]. Tolerowanie kwasów fenolowych przez wybrane izolaty świadczy o ich zdolności do kolonizacji tkanek roślinnych i tworzenia asocjacji z roślinami. cecha Izolat A4 Izolat A5 Wykorzystanie kwasów fenolowych jako jedyne źródło węgla i energii brak brak Kwas o-kumarowy >1,44 >1,44 Kwas p-kumarowy >1,44 >1,44 Kwas ferulowy >1,80 >1,80 Kwas chlorogenowy 0,6 0,6 obecny obecny F. moniliforme 728 brak brak F. graminearum 1970 brak 2 mm MIC* (mg ml-1) Gen nifH Strefa zahamowania wzrostu Tab. 1. Zestawienie cech ����������������������������������������������������� Methylobacterium extorquens A4 oraz A5. ������������� *MIC dla kwasów fenolowych: kwas ferulowy 0,180%, kwas o-kumarowy i p-kumarowy 0,144% stężenie czterokrotnie większe niż w tkankach; kwas chlorogenowy 0,040% stężenie naturalnie występujące w tkankach Zdolność do asymilacji wolnego azotu przez endofity może stymulować wzrost i rozwój rośliny. Klaster genów odpowiedzialnych za wiązanie wolnego azotu bakterie mogą nabyć poprzez poziomy transfer genów [Yan i in. 2008]. Testowane izolaty posiadały gen nifH co umożliwia im wiązanie wolnego azotu. Końcowe produkty asymilacji N2, m.in. aminokwasy, stanowią łatwo dostępne dla gospodarza formy azotu. 384 Ocena wpływu endofitycznego Methylobacterium Extorquens... Zdolność endofitów do wydzielania substancji przeciwgrzybowych jest czynnikiem, który umożliwia im łatwiejsze zasiedlanie tkanek. W przypadku pozyskanych izolatów tylko A5 hamował wzrost grzybni F. graminearum 1970. Bakterie endofityczne zdolne do produkcji takich substancji są potencjalnymi kandydatami biologicznej ochrony roślin. Wpływ badanego szczepu na wybrane cechy różnych odmian kukurydzy przedstawia Tab. 2. Inokulacja nasion badanym izolatem nie wpłynęła istotnie na liczbę korzeni roślin oraz długość epikotylu, miała natomiast istotnie negatywny wpływ na długość korzeni oraz suchą masę korzeni i epikotylu. Po inokulacji badanym izolatem, w przypadku odmiany KB1902, zaobserwowano istotne zmniejszenie długości korzenia, zmniejszenie suchej masy korzenia i epikotylu. Istotne zmniejszenie suchej masy korzenia i epikotylu zaobserwowano także dla odmian KB1903. Spadek suchej masy korzenia odnotowano również u odmian Król i Cyrkon. Obserwowany spadek zawartości suchej masy kukurydzy, a także zmniejszenie długości korzenia można powiązać z wydzielaniem przez A5 niezbadanych w tej pracy inhibitorów wzrostu. A5 woda A5 woda A5 2a Długość korzenia [mm] 39,4 26,3 a* b a a s.m. korzenia [mg] 4,9 a 4,1 b 4,0 a Długość epikotylu [mm] 18,4 14,3 a s.m. epikotylu [mg] 5,3 a KOSMO230 woda 1a CYRKON A5 2a KRÓL woda woda Liczba korzeni KB2704 A5 A5 KB1903 woda KB1902 1a 1a 1a 3a 3a 3a 3a 3a 2a 21,3 21,6 28,4 27,5 32,3 27,6 28,4 21,0 24,6 21,2 a a a a a a a a 3,1 b 3,8 a 3,9 a 8,8 a 8,0 b 6,8 a 5,4 b 5,8 a 5,6 a 13,6 9,0 11,1 12,0 22,7 21,3 22,2 19,1 16,7 15,0 a a a a a a a a a a a 4,1 b 4,4 a 2,9 b 4,4 a 5,3 a 6,9 a 7,3 a 6,8 a 6,8 a 5,5 a 5,3 a Tab. 2. Wpływ inokulacji izolatem A5 na wybrane parametry różnych odmian kukurydzy. * wartości w wierszach dla poszczególnych odmian oznaczone tymi samymi literami nie różnią się istotnie wg testu Duncana (p=0,05) Jeounghyun i in. [2006] opisali pozytywny wpływ Methylobacterium spp. pozyskanych z tkanek ryżu, na siewki pomidora oraz pieprzu. Zasiedlanie tkanek roślinnych przez endofity cechuje selektywność. Przykładem hamującego wpływu endofitów są niektóre szczepy z rodzaju Pseudomonas, izolowane ze zdrowych tkanek roślin pomidora, które w momencie reinokulacji siewek pomidora hamowały ich wzrost [Van Peer i in. 1990]. Nasze badania 385 Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski pokazują wybiórczość na poziomie odmiany. Obserwowane efekty oddziaływania na wybrane odmiany sugeruje istotną rolę, metabolizowanych przez bakterie, wydzielin korzeniowych. Rizodepozyty zawierają szereg związków [Dakora i Phillips 2002], jednak ich skład zależy od wielu czynników, m.in. odmiany rośliny [Carvalhais i wsp. 2011, Nardi i in. 1997]. Relacje pomiędzy M. extorquens a różnymi odmianami kukurydzy nadal pozostają niewyjaśnione. WNIOSKI • Stwierdzono istotnie zróżnicowany wpływ izolatu M. extorquens A5 na rozwój siewek 6-ciu odmian kukurydzy (KB1902, KB1903, KB2704, Król, Cyrkon, Kosmo230). • Izolaty M. extorquens A4 i A5 posiadały gen nifH oraz tolerowały kwasy fenolowe: ferulowy, chlorogenowy, p-kumarowy, o-kumarowy. • Izolat M. extorquens A5 hamował wydłużanie korzeni oraz ograniczył przyrost suchej masy korzenia i epikotylu odmiany KB1902. • Izolat M. extorquens A5 ograniczył przyrost suchej masy korzenia odmian KB1903, Król, Cyrkon. • Izolat M. extorquens A5 ograniczył przyrost suchej masy epikotylu odmiany KB1903. LITERATURA Carvalhais L.C., Dennis P.G., Fedoseyenko D., Hajirezaei M.R., Borriss R., Von Wiren N. 2011. Root exudation of sugar, amino acids, and organic acids by maize as affected by nitrogen, phosphorus, potassium, and iron deficiency. J. Plant Nutr. Soil Sci. 174: 3-11. Cho S.J., Park S.R., Kim M.K., Lim W.J., Ryu S.K., An C.L., Hong S.Y., Lee Y.H., Jeong S.G., Cho Y.U., Yun H.D. 2002. Endophytic Bacillus sp. isolated from the interior of ballon flower root. Biosci Biotechnol Biochem, 66: 1270-1275. Dakota F.D., Phillips D.A. 2002. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments. Plan Soil 245: 35-47. Elbeltagy A., Nishioka K., Sato T., Suzuki H., Ye B., Harnada T., Isawa T., Mitsiu H., Minarnisawa K. 2001. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Applied Environ Microbiol, 67(11): 5285-5293. 386 Ocena wpływu endofitycznego Methylobacterium Extorquens... Green P.N. 1991. The Prokaryotes, chapter 117 “The Genus Methylobacterium”, Second Edition, Edited by Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., Schliefer K.H., 2342-2349. Jeounghyun R., Madhaiyan M., Poonguzhali P., Yim W., Indiragandhi P., Kim K., Anangham R., Yun J., Kim K.H., Sa T. 2006. Plant growth substances produced by Methylobacterium spp. and their effect on tomato (Lycopersicon esculentum L.) and red pepper (Capsicum ennuum L.) growth. J.Microbiol. Biotechnol., 16(10):1622-1628. Król M.J., Perzyński A. 2005. Wykorzystanie benzenu jako jedynego źródła węgla w wiązaniu wolnego azotu przez bakterie z rodzaju Azospirillum i Pseudomonas stutzeri. Pamiętnik Puławski, 140:103-116. Long H.H., Schmidt D.D., Baldwin I.T. 2008. Native bacterial endophytes promote host growth in a specoes-specyfic manner, phytohormone manipulations do not result in common growth responses. PLoS ONE 3: e2702. Madhaiyan M., Poonguzhali S. 2007. Metal tolerating methylotrophic bacteria reduces nickel and cadmium toxicity and promotes plant growth of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Chemosphere 69: 220-228. Maksimovic, J.D., Maksimovic, V., Zivanovic, B., Sukalovic, V.H.T., Vuletic, M. 2008. Peroxidase activity and phenolic compounds content in maize root and leaf apoplast, and their association with growth. Plant Science, 175: 656–662. Martinez-Morales L.J., Soto-Urzua L., Baca B.E., Schanchez-Ahedo A. 2003. Indole3-butyric acid (IBA) production in culture medium by wild stain Azospirillum brasilenese. FEMS Micriobiol. Lett., 228: 167-173. McInroy J.A., Kloepper J.W. 1995. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. Plant Soil. 173: 337-342 Nardi S., Reneiro F., Concheri G. 1997. Soil organic matter mobilization by root exudates of three maize hybrids. Chemosphere 35: 2237-2244. Oksińska M.P., Wright S.A.I., Pietr S.J. 2011. Colonization of wheat seedlings (Triticum aestivum L.) by strains of Pseudomonas spp. with respect to their nutrient utilization profiles. Eur. J. Soil Biol., 47: 356-373. Poly F., Monrozier L.J., Bally R. 2001. Improvement in the RLPH procedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogen fixers in soil. Res. Microbiol., 152:95-103 Yan Y., Yang J., Dou Y., Chen M., Ping S., Peng J., Lu W., Zhang W., Yao Z., Li H., Liu W., He S., Geng L., Zhang X., Yang F., Yu H., Zhan Y., Li D., Lin Z., Wang Y., Elmerich C., Lin M., Jin Q. 2008. Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501. PNAS, 105(21): 7564-7569. 387 Katarzyna Pisarska, Mariusz Adamski Van Peer R., Punte H.L.M., De Weger L.A., Schippers B. 1990. Characterization of root surface and endorhizosphere Pseudomonas in relation to their colonization of roots. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2462-2470. Żarnowski R., Felske A., Ellis R.J., Geuns J.M.C., Pietr S.J. 2002 A Methylobacterium – like organism from algal crustes covering silicone rubber electric insulators in Africa. J. Applied. Microbiol. 93: 1012-1219. Adres do korespondencji: mgr Katarzyna Pisarska1,2, mgr Mariusz Adamski2 Zakład Mikrobiologii Rolniczej Katedra Ochrony Roślin Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 25, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Stanisław J. Pietr Badania realizowane z grantu1 nr NCN 2011/01/N/NZ9/02332 oraz w ramach programu2 współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego „Przedsiębiorczy doktorant – inwestycja w innowacyjny rozwój regionu” 388 Jan Słodki Hubert Okła Krzysztof P. Jasik EPISTEME 14/2012 s.389-393 ISSN 1895-4421 TRANSMISJA WERTYKALNA PIERWOTNIAKA BABESIA MICROTI U SZCZURÓW VERTICAL TRANSMISSION OF PROTOZOAN BABESIA MICROTI IN RATS Abstrakt. Kleszcze są wektorami wielu drobnoustrojów zagrażających zdrowiu człowieka i zwierząt.������������������������������������������������������������ Prezentowane ����������������������������������������������������������� badania oceniają możliwości transmisji protistów Babesia microti z zarażonych ciężarnych samic szczurów szczepu Wistar do tkanek płodu.�������������������������������������������������������������� Aby ������������������������������������������������������������� wykluczyć������������������������������������������������ ����������������������������������������������� ryzyko zarażenia okołoporodowego wykonano sekcje przed rozwiązaniem ciąży. Trzytygodniowe samice szczurów zakażono szczepem wzorcowym Babesia microti. W 21 dniu dokonano sekcji pobierając wybrane narządy samicy i płodu. Obecność protistów w wybranych narządach potwierdzono metodą PCR. Monitorowanie parazytemii samic dokonano poprzez obserwację rozmazów krwi, którą pobierano w tygodniowych odstępach czasu. Rozmazy krwi barwiono metodą May-Grunwalda-Giemsy i obserwowano w mikroskopie świetlnym. Zarówno metody molekularne jak i analiza rozmazów potwierdziły możliwość przenikania B. microti poprzez łożysko do potomstwa. Słowa kluczowe: Babesia microti, babeszjoza wrodzona, transmisja wertykalna Summary. Ticks are vectors of many microbes that threaten human and animal health. The present study evaluates the possibility of transmission of protozoan from infected pregnant rats belonging to Wistar stock to fetal tissue. To avoid the risk of perinatal infection, postmortem examinations were performed prior to the termination of pregnancy. Three-week female rats were infected with Babesia microti reference strain. On the 21st day postmortem examinations were performed in order to collect selected female and fetal organs. Protozoan presence in selected organs was confirmed by PCR. The monitoring of female parasitaemia was made by observation of blood smears which was collected every week. Blood smears were stained by May-Grunwald-Giemsa and observed by means of light microscopy. Both molecular methods and analysis of the smears confirmed the possibility of penetration of B. microti through the placenta to the offspring. Key words: Babesia microti, congenital babesiosis, vertical transmission 389 Jan Słodki, Hubert Okła, Krzysztof P. Jasik WSTĘP Babesia microti to przedstawiciel Protista z rodziny Babesidae, którego wektorem w Polsce jest kleszcz pospolity – Ixodes ricinus [Wójcik-Fatla i in. 2006]. Babesia spp. są czynnikami etiologicznymi babeszjozy, choroby zwierząt [Sawczuk 2007], a sporadycznie także człowieka [Wójcik-Fatla i in. 2006]. Ma to znaczenie weterynaryjno-medyczne, gospodarcze oraz epidemiologiczne. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym babeszjozy u ludzi jest Babesia microti [Teal i in. 2011]. Choroba ta jest rzadko rozpoznawana, z powodu nieznanego patomechanizmu, trudnej diagnostyki oraz podobieństwa do pasożytów Plasmodium [Teal i in. 2011].����������������������������������������������������������������� Ze ���������������������������������������������������������������� względu na nieliczne doniesienia literaturowe opisujące kazuistyczne przypadki babeszjozy wrodzonej, bardzo istotna jest analiza możliwości przenikania Babesia spp. przez łożysko i następstwa tego zjawiska dla potomstwa. MATERIAŁY I METODY Materiałem badanym były tkanki pochodzące od siedmiu samic szczurów szczepu Wistar inokulowanych szczepem wzorcowym Babesia microti oraz płodów, pochodzących od zarażonych samic. Wykonano dootrzewnową inokulację 0,5 ml hodowli szczepu wzorcowego (ATCC® 30221™). Zarażenie samic badano poprzez analizę w mikroskopie świetlnym rozmazu krwi, pobieranej z żyły ogonowej wybarwianego metodą May-Grunwald-Giemsa. Dodatkowo w odstępach tygodniowych z żyły grzbietowej ogona była pobierana krew do analizy molekularnej w celu wykrycia materiału genetycznego B. microti metodą PCR. Zarażone samice zostały pokryte i w 21 dniu ciąży poddane eutanazji ��� poprzez iniekcję dootrzewnową (i.p.) tiopentalu z ketaminą w dawce 20 mg/ kg m.c. W trakcie sekcji pobrano śledzionę i wątrobę samicy, łożysko, oraz mózgowie, serce i wątrobę płodu. Tkanki przeznaczone do badań molekularnych zostały umieszczone w proZ �������������������������� tkanek tych zostało wyibówkach typu Eppendorf w temperaturze -20oC.��������������������������� zolowane DNA przy użyciu zestawu odczynników High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Niemcy) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wyizolowany DNA była przechowany w -20oC do dalszej diagnostyki. Obecność patogenu w tkankach potwierdzano za pomocą PCR, przy użyciu komercyjnego zestawu diagnostycznego PCR Babesia (DNA Gdańsk, Polska). W zestawie tym wykorzystano startery komplementarne do fragmentu genu 18S rDNA. 390 Transmisja wertykalna pierwotniaka... W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodziły: Master Mix, dNTPs (8 mM), termostabilna polimeraza DNA Hypernova oraz matryca DNA. Reakcje amplifikacji przeprowadzono w termocyklerze Personal Cycler (Biometra, Goettingen, Niemcy) w warunkach termicznych przedstawionych w tabeli 1. Etap PCR Babesia Temperatura Czas Denaturacja początkowa o 94 C 2 min. Denaturacja* 94oC 45 sek. Przyłączanie starterów* o 48 C 45 sek. Wydłużanie łańcucha DNA* o 72 C 45 sek. Końcowe wydłużanie 72oC 5 min. * Etapy: denaturacja, przyłączanie starterów i wydłużanie łańcucha DNA powtórzone 40 razy Tab. 1. Warunki reakcji PCR dla Babesia microti WYNIKI Rozmazy krwi samic szczurów wykonane metodą May-Grunwald-Giemsa wykazały obecność B.microti w erytrocytach potwierdzając zarażenie (Rys. 1). Zarażenie zostało również potwierdzone za pomocą PCR wykonanych z krwi samic - widoczny produkt amplifikacji na wysokości 560pz. (Rys. 2). Za pomocą PCR udało się potwierdzić obecność B.microti w tkankach płodów uzyskanych z zarażonych samic – widoczny produkt amplifikacji DNA B.microti w łożyskach, wątrobie płodowej, płodzie, wątrobie oraz w sercu płodowym (Rys. 3). Rys. 1. Babesia microti w erytrocytach (preparat barwiony metodą May-GiemsaGrunwald) 391 Jan Słodki, Hubert Okła, Krzysztof P. Jasik Rys. 2. Wyniki PCR z próbek krwi samic szczurów ,potwierdzające zarażenie (ścieżka 1 – kontrola negatywna, ścieżka 2 – marker wielkości M100-1000, ścieżka 3 – kontrola pozytywna, ścieżki 4, 5 – próbki badane pozytywne) Rys. 3. Wyniki PCR z tkanek samic i płodów (ścieżka 1 – marker wielkości M100-1000, ścieżka 2 – kontrola pozytywna, ścieżka 3 – kontrola negatywna, ścieżka 4 - łożysko ścieżka 5 - wątroba płodowa, ścieżka 6 - płód, ścieżka 8 - wątroba i serce płodowe, ścieżka 9 – łożysko) DYSKUSJA Problem związany z ryzykiem infekcji płodu babeszjozą jest sporadycznie wspominany w literaturze. Temat ten został po raz pierwszy zasygnalizowany ok 30 lat temu. Opisano wówczas efekty zarażenia Babesia spp. w postaci poronień lub śmierci noworodków. Esernio-Jenssen i in. [1987] przedstawili przypadek okołoporodowego zarażenia dziecka. Podobny przypadek został zasygnalizowany przez New��������������������������������������������� i in. w 1997�������������������������������� . W 2009 r. udokumentowano wrodzone zarażenie babeszjozą [Sethi i in. 2009]. Do tej pory nie udowodniono mechanizmu przenikania Babesia microti poprzez łożysko do płodu. W Japonii, w 2005 wykonano eksperyment, polegający na analizie potomstwa zdrowego psa z suką zarażoną B. gibsonii. Efektem tego jedno ze szczeniąt urodziło się martwe a pozostałe cztery zdechły w okresie od 14 do 39 dnia po urodzeniu [Fukumoto i in. 2005]. Doświadczenie to nie dowodzi jednak czy do zakażenia doszło poprzez łożysko, czy okołoporodowo. Jest to istotny problem, zwłaszcza, że z roku na rok notuje się coraz większą ilość zachorowań na babeszjozę. Znając dokładnie mechanizm zarażenia będzie można skupić się na problemach diagnostyki czy leczenia i profilaktyki. Przedstawione wyniki stanowią etap wstępny obszerniejszych badań, obejmujacych problematykę skutków babeszjozy wrodzonej, jej objawów i wpływu B. microti na proces embriogenezy. 392 Transmisja wertykalna pierwotniaka... WNIOSKI We krwi i w wybranych narządach pobranych podczas sekcji potwierdzono, że zarażona matka przekazuje potomstwu przez łożysko badane patogeny. Wyniki te stanowią dowód, że pierwotniak Babesia microti jest przekazywany wertykalnie z zarażonej samicy poprzez łożysko do płodu. LITERATURA Fukumoto S. Suzuki H. Igarashi I. Xuan X. 2005. Fatal experimental transplacental Babesia gibsoni infections in dogs. International Journal for Parasitology, 35(9): 1031-1035. New DL. Quinn JB. Qureshi MZ. Sigler SJ. 1997. Vertically transmitted babesiosis. The Journal of Pediatrics, 131(1 Pt 1): 163-164. Sawczuk M. 2007. Cattle babesiosis. Wiadomości parazytologiczne, 53(2): 73-79. Sethi S. Alcid D. Kesarwala H. Tolan RW Jr. 2009 Probable Congenital Babesiosis in Infant, New Jersey, USA. Emerging Infectious Disease Journal, 15(5): 788-791. Teal AE. Habura A. Ennis J. Keithly JS. Madison-Antenucci S. 2011. A New Real-Time PCR Assay for Improved Detection of the Parasite Babesia microti. Journal of Clinical Microbiology. Wójcik-Fatla A. Cisak E. Chmielewska-Badora J. Zwoliński J. Buczek A. Dutkiewicz J. 2006. Prevalence of Babesia microti in Ixodes ricinus ticks from Lublin region (eastern Poland). Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 13(2): 319-322. Adres do korespondencji: mgr Jan Słodki, mgr Hubert Okła, dr hab. Krzysztof P. Jasik Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. n. biol. Krzysztof Jasik 393 Katarzyna Stalmach Małgorzata Borek Katarzyna Śniegowska EPISTEME 14/2012 s.395-408 ISSN 1895-4421 FIZJOLOGICZNE ASPEKTY ODPOWIEDZI ROŚLIN JĘCZMIENIA JAREGO (HORDEUM VULGARE L.) NA STRES SUSZY PHYSIOLOGICAL ASPECTS OF RESPONSES SPRING BARLEY (HORDEUM VULGARE L.) TO DROUGHT STRESS Abstrakt. Niedobór wody jest głównym czynnikiem środowiskowym ograniczającym produktywność roślin, a jego wpływ manifestuje się zmianami niemalże w każdym procesie fizjologicznym. Celem badań było poznanie różnych aspektów reakcji odmian jęczmienia na stres suszy tj. linie jęczmienia jarego o zróżnicowanej reakcji na deficyt wody. Pomiary parametrów fluorescencji chlorofilu wykonano na roślinach optymalnie nawadnianych i poddanych działaniu suszy glebowej a ich celem było ustalenie optymalnego czasu działania suszy dla zróżnicowania odmian jęczmienia pod względem wydajności reakcji fotochemicznych. Pomiary wykonano w fazie siewki po ukazaniu się 4 liścia. Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu a przeprowadzono przy użyciu fluorymetru Handy PEA. Stwierdzono, że największe zróżnicowanie aktywności fotochemicznej odmian siewek jęczmienia, pod względem wrażliwości na deficyt wody, wystąpiło po 10 dniach suszy. Słowa kluczowe: stres suszy, jęczmień jary, parametry fizjologiczne Summary. Water shortage is a major environmental factor limiting plant productivity, and it influences almost every physiological process. Thus, we undertook a research aimed at understanding aspects of the plants response to drought stress. Material consisted of spring barley lines with different susceptibility to water deficit. Measurements of different parameters o chlorophyll fluorescence were carried out on plants well watered and exposed to soil drought. The aim was to determine the optimal length of drought that enables a differentiation of barley varieties in terms of photochemical reactions efficiency. Measurements were taken at the seedling stage after the appearance of the fourth leaf. Measurements of fast kinetics of chlorophyll fluorescence were performed using a fluorometer Handy PEA. It was found that the greatest variation of photochemical activity of barley varieties as a response to water deficit, occurs after 10 days of drought. Key words: drought stress, spring barley, physiological parameters 395 Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska WSTĘP Rolnictwo jak żadna inna gałąź gospodarki czułe jest na oddziaływanie zmian klimatu i związanych z nim zjawisk atmosferycznych takich jak zmiany nasłonecznienia, temperatury i opadów. W miarę intensyfikowania produkcji roślinnej, znaczenie czynników pogodowych wzrasta [Bac i in.1998]. Warunki pogodowe w Polsce są czynnikiem najmniej stabilnym w uprawie zbóż. Wszelkie anomalia pogodowe mogą w znaczący sposób wpłynąć na wielkość i jakość plonu ziarna. Odporność na suszę i efektywna gospodarka wodna roślin jest ważnym elementem dostosowania się systemu produkcji rolnej do zmian klimatu. Hodowcy poszukują genotypów, które charakteryzują się wysokim potencjałem plonowania i cechami fizjologicznymi sprzyjającymi odporności na suszę [Gonzalez i in. 1999]. Fotosynteza jest procesem, którego intensywność zależy od ilości wody w środowisku, jak również od jej dostępności dla roślin. U roślin wyższych jest ona wysoce wrażliwa na działanie suszy. Proces fotosyntezy jest ściśle związany z zawartością chlorofilu jako jednego z głównych składników chloroplastów [Li Rong-hua i in. 2006]. Fluorescencja chlorofilu jest parametrem fotosyntezy odzwierciedlającym wrażliwość roślin na stres suszy [Flexas i in. 2002]. Niestety jak dotąd niewiele wiadomo na temat zmian zawartości chlorofilu i parametrów jego fluorescencji jakie zachodzą u roślin jęczmienia pod wpływem deficytu wody [Li Rong-hua i in. 2006]. Prowadzone badania miały na celu określenie poziomu suszy najbardziej różnicującego badane odmiany jęczmienia pod względem reakcji fotosyntetycznych. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na 8 odmianach jęczmienia (Cam/B1, Georgia, Harmal, Lubuski, M.Dingo, Maresi, Morex, Stratus). Po zaprawieniu ziarno wysiano do doniczek o pojemności 9 L, napełnionych glebą (piasek gliniasty mocny) z domieszanym do niej piaskiem (7 gleba : 2 piasek, w/w). W wazonach rosło początkowo po 15 siewek, a później ich liczbę obniżono do 10. Po wschodach rośliny umieszczono na 14 dni w komorze wegetacyjnej przy temperaturze 10/5 oC (dzień noc). Następnie przeniesiono rośliny do klimatyzowanej szklarni, gdzie utrzymywano temperaturę 20/17 oC (dzień noc), aż do fazy strzelania w źdźbło, a potem temperaturę (23/14 oC). Wilgotność względna powietrza wynosiła od 25% do 60%. Wilgotność podłoża w wazonach była kontrolowana wagowo (na podstawie krzywej retencji wodnej) i wynosiła początkowo 11% (masa wody w s. masie gleby). Suszę glebową (4.0%) zastosowano w fazie wegetacji: po ukazaniu się 4. liścia przez 10 dni. Rośliny dokarmiono pożywką zaleconą przez IUNG w Puławach. Pomiary wykonano u roślin dobrze podlewanych i poddanych działaniu suszy glebowej po ukazaniu się 4. liścia w 1, 5 i 10 dniu suszy. 396 Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... Pomiar szybkiej kinetyki fluorescencji. Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu a przeprowadzono przy użyciu fluorymetru Handy PEA (Hansatech Ltd., Kings Lynn, UK) na liściu 1 (dolny liść), 2 i 3 w fazie 4. liścia. Intensywność promieniowania wzbudzającego fluorescencję wynosiła 3 mmol m-2 s-1 (maksimum 650 nm). Pomiary przeprowadzono po 30 minutowej adaptacji liści do ciemności. Intensywność fluorescencji zmierzono fotodiodą-PIN po przepuszczeniu promieniowania przez filtr przepuszczający promieniowanie długofalowe. Dane te zostały wykorzystane do obliczenia wskaźników testu JIP na podstawie teorii przepływu strumienia energii przez PSII [Srivastava i Strasser 1977; Strasser i Strasser 1995; Lazár 1999; Lazár i Pospíšil 1999; Strasser i in. 2000]: ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS, RC/ CSm i PICS. Pomiary przeprowadzono w 15 powtórzeniach. Wyniki pomiarów fotosyntezy dla każdego okresu suszy (1, 5 i 10 dni) przedstawiono jako wskaźnik SI (Stres index). Wskaźnik ten opisuje zmianę badanego parametru w suszy względem dobrze podlewanych roślin określając stopień odporności na suszę. Był on obliczany na podstawie wzoru: SI(%) = (X1/X2) x 100, gdzie X1 oznacza wartość pomiarową uzyskaną dla roślin suszy, a X2 dla roślin dobrze podlewanych. Obliczenia statystyczne. Dla wszystkich danych pomiarowych przeprowadzono wieloczynnikową analizę wariancji. Dla oceny istotności zróżnicowania średnich dla odmian obliczono wartości NRI, przy P<0.05. Istotność zróżnicowania par X1 i X2 zbadano na podstawie testu „t” Studenta gdzie X1 oznacza wartość pomiarową uzyskaną dla roślin suszy, a X2 dla roślin dobrze podlewanych. WYNIKI I DYSKUSJA Celem pomiarów fizjologicznych było ustalenie długości suszy optymalnej dla zróżnicowania odmian jęczmienia pod względem wydajności reakcji fotochemicznych. Analiza wariancji wykazała, że wszystkie uwzględnione w doświadczeniu czynniki (odmiana, wiek liści, wilgotność podłoża i długość suszy) miały istotny wpływ na aktywność fotochemiczną PSII roślin adaptowanych do ciemności. Funkcjonowanie fotosystemu PS II jest bardzo czułym wskaźnikiem działania różnorodnych czynników stresowych na rośliny [Jansen i in.1995, Smille i in.1987]. Stwierdzono, że statystycznie istotne były także efekty współdziałania wymienionych czynników, świadczące między innymi o tym, że fotoukład II (PSII) odmian w zróżnicowany sposób odpowiadał na suszę. Przedłużanie okresu niedoboru wody w podłożu hamowało przechwytywanie energii promienistej przez anteny PSII (ABS/CS), zmniejszało wielkość strumieni energii przepływających do centrów reakcji CR (TRo/CS) i poza te centra (ETo/CS), a ponadto obniżyło ilość energii wypromieniowywanej poza PSII (DIo/CS) i zmniejszyło zagęszczenie aktywnych centrów reakcji (RC/CS) jak i ogólną sprawność PSII (PICS) (Tab. 1). 397 398 3 (górny) 1629.7 1259.4 746.0 370.3 732.5 38373.4 18.6 18.6 12.5 4.0 10.0 943.3 0.05 LSD 45556.1 836.1 382.3 831.9 1408.6 1790.9 2 (środek) 45287.3 807.0 406.5 889.5 1486.0 1892.5 1 (dolny) 1434.4 854.5 393.3 822.3 45319.8 27.6 26.3 9.7 24.2 2413.8 PICS RC/CS DIo/CS ETo/CS TRo/CS ABS/CS 985.7 9.9 4.0 12.3 15.2 21.0 LSD 0.05 1827.6 45.0 Liść Stratus LSD 0.05 38373.4 732.5 370.3 746.0 1259.4 1629.7 10 45322.0 825.0 390.2 836.3 1407.3 1797.5 Morex 45556.1 836.1 382.3 831.9 1408.6 1790.9 5 45022.1 812.3 394.0 855.4 1426.2 1820.2 Maresi 1372.3 817.8 384.5 794.5 43510.3 1356.3 784.3 381.1 756.9 38982.9 45287.3 807.0 406.5 889.5 1486.0 1892.5 PICS RC/CS DIo/CS ETo/CS TRo/CS ABS/CS Dzień suszy 1756.8 1737.4 1 Lubuski M.Dingo 763.9 7.7 3.1 8.3 11.8 14.2 LSD 0.05 43955.2 801.4 399.2 855.9 1430.3 1829.5 Harmal 38477.5 742.1 378.3 771.6 1314.0 1692.3 susza 38955.4 731.7 368.5 761.0 1288.0 1656.5 Georgia 47667.0 841.7 394.5 873.3 1455.3 1849.8 kontrola 43510.1 790.9 380.2 814.3 1362.4 1742.6 Cam/B1 PICS RC/CS DIo/CS ETo/CS TRo/CS ABS/CS Uwodnienie PICS RC/CS DIo/CS ETo/CS TRo/CS ABS/CS Genotyp Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska Tab. 1. Średnia wartość przepływu strumieni energii przez PSII w 1, 2 i 3 liściu siewek w zależności od genotypu, uwodnienia podłoża i długości suszy (1, 5 i 10 dni suszy) Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... Rapacz i in. 2010 zaobserwowali wysoką korelację między liczbą aktywnych centrów reakcji (RC/CS) oraz parametrami charakteryzującymi przepływ energii w PSII u roślin jęczmienia browarnego i pastewnego traktowanych suszą. Wpływ czynnika odmianowego i przedłużającej się suszy glebowej oraz wieku liści (Rys. 1) na przebieg reakcji fotochemicznych był bardzo wyraźny. Z przedstawionych danych wynika, że zróżnicowanie odpowiedzi odmian na suszę nie wynikło z różnic pod względem wydajności przepływu energii, ale bardziej z różnych ilości transportowanej energii. GEORGIA - 10 DZIEŃ SUSZY MOREX 3 LIŚĆ 3 LIŚĆ 1 dzień 1786 1850 5 dzień 1417 1470 1638 890 1 LIŚĆ 1 LIŚĆ 1268 10 dzień 718 369 901 1 LIŚĆ 148 1271 379 966 41 369 legenda: 497 ET/CS ABS/CS 11 legenda: ABS/CS ET/CS TR/CS DI/CS 304 DI/CS TR/CS GEORGIA 1 dzień 1896 5 dzień 1495 1511 1 LIŚĆ 1151 873 10 dzień 148 575 401 41 354 legenda: ABS/CS TR/CS 107 Rys. 1. Strumienie przepływu energii w dolnym liściu siewek odmiany Morex i Georgia w 1, 5 i 10 dniu suszy glebowej oraz strumienie przepływu energii w górnym i dolnym liściu siewek odmiany Georgia w 10 dniu suszy glebowej (na podstawie testu JIP) 11 ET/CS DI/CS 107 399 400 97.3 n.s. 819.0 94.1 n.s. 53682.2 98.7 n.s. 100.4 n.s. 833.5 95.4 n.s. 50206.9 90.5 n.s. 5.9 69.0 5.9 7524.6 9.9 101.1 n.s. 769.9 97.8 n.s. 37785.3 90.2 n.s. 91.2 n.s. 670.4 79.8 * 22564.0 58.1 * 102.8 n.s. 799.6 90.6 n.s. 38604.2 79.1 n.s. 683.2 76.4 * 24487.2 48.2 * 95.3 n.s. 369.4 406.8 27.1 375.9 354.1 405.1 372.3 98.3 n.s. 96.5 n.s. 6.8 94.4 n.s. 72.5 * 91.7 n.s. 70.2 * 928.6 90.7 749.5 574.9 815.7 622.4 98.4 n.s. 5.2 95.1 n.s. 80.7 * 94.0 n.s. 80.4 * 1515.1 118.4 1296.1 1157.0 1413.6 1189.4 98.8 n.s. 5.2 96.4 n.s. 83.0 * 95.8 n.s. 83.5 * 890.4 96.4 n.s. 1417.1 96.6 n.s. 1786.5 1921.9 1818.7 1561.6 144.9 Morex 1672.0 Stratus 1511.1 Harmal Lubuski Cam/B1 SD Georgia 5 99.2 n.s. 55437.0 97.8 n.s. 876.7 100.8 n.s. 69.1 * 36555.2 81.8 * 707.5 91.8 n.s. 348.6 82.2 * 100.3 n.s. 401.3 740.4 85.9 * 1267.4 87.1 * 1616.0 98.4 n.s. 92.1 n.s. 50309.3 94.5 n.s. 100.3 n.s. 52204.2 789.0 92.3 n.s. 892.0 105.4 n.s. 383.4 92.0 n.s. 103.2 n.s. 401.3 914.0 93.3 n.s. 102.7 n.s. 927.1 1461.8 93.1 n.s. 103.3 n.s. 1534.3 1845.2 Harmal 1935.5 M.Dingo Lubuski 966.5 99.1 n.s. 1561.3 99.4 n.s. 1962.5 Maresi 1 94.0 n.s. 87.2 n.s. 36155.5 93.5 n.s. 100.0 n.s. 44431.3 709.2 89.1 n.s. 103.2 n.s. 832.6 335.5 88.7 n.s. 720.4 93.1 n.s. 1253.0 92.2 n.s. 1588.5 Cam/B1 401.0 97.5 n.s. 873.6 98.9 n.s. 1495.8 99.8 n.s. 1896.8 Georgia (%%) PIcs (%%) RC/CS (%%) DIo/CS (%%) ETo/CS (%%) TRo/CS (%%) ABS/CS SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza Genotyp Dzień suszy Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska 27193.9 497.0 65.8 * 304.0 74.8 * 533.1 71.2 * 18993.5 653.2 75.4 * 343.7 89.2 n.s. 671.9 79.1 * 28343.2 237.0 28.6 90.5 22.7 228.4 27.3 10954.6 56.7 * 74.9 * 72.2 * 83.6 * 28.4 58.9 * 616.9 966.8 1205.2 401.6 27.7 95.5 n.s. 72.8 * 84.8 * 27.1 60.1 * 376.1 79.3 * 675.3 82.8 * 1169.0 85.5 * 1545.1 1270.8 1548.9 490.5 Maresi Morex Stratus SD 49.7 * 23120.6 6494.4 20.4 * 75.1 * 626.6 96.6 n.s. 363.6 75.2 * 612.7 84.8 * 1137.6 87.4 * 1501.1 Lubuski 48.9 * 377.6 79.8 * 324.9 42.5 * 326.0 59.4 * 841.7 63.9 * 1166.7 M.Dingo 10 62.8 * 30771.0 82.8 * 730.6 97.4 n.s. 390.2 81.9 * 725.1 89.1 * 1317.7 90.9 n.s. 1707.9 Harmal 0.1 * 26.8 2.1 * 17.3 28.6 * 106.8 1.4 * 11.3 3.0 * 41.3 8.5 * 148.1 8.3 68.4 4.4 17.9 9.4 83.7 6.0 97.5 5.5 113.8 SD 24523.3 35538.8 90.3 * 16.0 68.7 * 49.1 * 75.6 * 88.8 n.s. 87.5 n.s. 82.2 n.s. 631.7 769.0 810.9 55.5 * 26925.7 75.9 * 675.8 92.1 n.s. 98.2 n.s. 92.7 n.s. 93.6 n.s. 358.1 369.2 370.0 346.0 85.5 n.s. 80.5 * 73.1 * 717.9 736.5 1212.9 73.2 * 85.7 n.s. 86.6 n.s. 1118.6 83.0 * 641.2 1268.5 1329.6 85.0 n.s. 1571.0 606.9 87.2 n.s. 88.0 n.s. 1464.6 M.Dingo 80.7 * 1637.7 1699.6 Maresi 81.7 * Morex Stratus 23308.9 6835.9 36536.0 81.0 * 581.0 86.5 * 353.6 86.9 * 587.0 81.0 * 1050.6 82.3 * 1404.3 Georgia Cam/B1 Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... Tab. 2. Aktywność fotochemiczna PSII pierwszego (dolnego) liścia siewek jęczmienia na podstawie testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka przy SI oznacza, że różnice pomiędzy kontrolą i roślinami poddanymi działaniu suszy były istotnie (P<0.05) na podstawie testu “t” Studenta; n.s. różnice nieistotne statystycznie (P<0.05) 401 402 98.6 n.s. 397.2 98.7 n.s. 837.3 93.6 n.s. 55715.5 94.6 n.s. 99.3 n.s. 1465.7 99.2 n.s. 919.8 99.7 n.s. 397.1 99.3 n.s. 774.2 98.3 n.s. 48288.8 99.4 n.s. 1.1 31.6 1.2 29.0 0.6 6.0 1.5 39.8 2.6 4518.4 2.4 94.3 n.s. 1325.8 93.5 * 827.2 98.3 n.s. 367.0 97.3 n.s. 819.6 97.2 n.s. 47035.2 98.5 n.s. 86.2 * 1159.8 84.7 * 676.1 84.7 * 354.7 91.7 * 675.4 84.5 * 31280.1 78.4 * 97.5 n.s. 1350.8 98.1 n.s. 823.0 100.8 n.s. 367.8 95.2 * 803.1 98.9 n.s. 44461.1 101.9 n.s. 88.7 * 1244.6 86.1 * 728.1 81.9 * 373.2 98.6 n.s. 736.0 84.8 * 35346.8 66.7 * 952.2 98.2 n.s. 1496.0 98.3 n.s. 1893.2 1862.9 34.8 1692.8 1514.5 1718.6 Morex 1617.8 Stratus Cam/B1 Georgia Harmal SD Lubuski 5 96.7 n.s. 51589.7 97.9 n.s. 96.4 n.s. 48115.9 98.3 n.s. 762.3 93.4 n.s. 49940.5 99.4 n.s. 810.9 810.3 99.2 n.s. 392.3 98.1 n.s. 937.8 811.6 100.4 n.s. 382.2 99.8 n.s. 874.7 100.7 n.s. 1423.1 100.6 n.s. 1805.3 Cam/B1 94.9 n.s. 40326.6 98.7 n.s. 52212.8 100.1 n.s. 47104.2 98.7 n.s. 102.1 n.s. 101.7 n.s. 718.0 99.6 n.s. 103.6 n.s. 100.3 n.s. 100.2 n.s. 828.2 399.5 99.1 n.s. 390.3 99.7 n.s. 869.8 386.0 99.6 n.s. 907.4 99.1 n.s. 101.1 n.s. 101.1 n.s. 100.5 n.s. 896.0 1493.7 1423.4 1457.6 99.1 n.s. 100.8 n.s. 101.6 n.s. 100.4 n.s. 1419.6 1885.9 Georgia 1822.8 Harmal 1847.9 Lubuski 1805.6 M.Dingo 395.5 98.8 n.s. 922.8 98.5 n.s. 1476.0 98.9 n.s. 1871.5 Maresi 1 (%%) PIcs (%%) RC/CS (%%) DIo/CS (%%) ETo/CS (%%) TRo/CS (%%) ABS/CS SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza Genotyp Dzień suszy Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska 1584.2 90.8 * 1215.8 88.9 * 727.1 87.4 * 368.5 97.6 n.s. 680.5 84.7 * 33837.2 74.5 * 7.8 130.0 9.4 95.8 10.8 19.6 6.2 87.0 10.4 8033.4 16.5 Stratus 136.5 SD 89.8 n.s. 60.9 * 77.6 * 49.8 * 21057.8 71.2 * 580.9 90.5 * 102.0 n.s. 731.3 350.0 70.2 * 575.1 77.8 * 1094.1 80.6 * 1444.1 M.Dingo 391.3 91.3 n.s. 769.8 93.6 n.s. 1277.3 95.5 n.s. 1668.5 Maresi 27982.7 36658.9 76.7 * 649.2 97.5 n.s. 380.2 78.1 * 654.9 79.2 * 1106.0 83.2 * 1486.2 Morex 10 60.5 * 25511.9 80.3 * 584.3 100.9 n.s. 362.7 83.1 * 629.3 87.3 * 1053.0 90.4 * 1415.7 Lubuski 83.1 * 35169.2 92.5 n.s. 724.5 97.3 n.s. 376.6 91.1 n.s. 742.6 93.4 n.s. 1264.4 94.3 n.s. 1641.0 Harmal 37.3 * 14744.9 61.7 * 470.1 97.4 n.s. 374.2 59.9 * 480.2 65.4 * 878.7 72.5 * 1252.9 Georgia 7.3 60.8 2.6 8.8 7.6 61.6 5.9 74.7 4.7 78.0 SD 82.2 * 13.7 36226.6 6627.6 87.* 663.4 82.9 * 328.5 82.5 * 678.7 84.1 * 1105.8 83.8 * 1434.4 Cam/ B1 96.8 n.s. 43520.3 98.4 n.s. 818.5 91.9 * 359.9 94.7 n.s. 794.7 94.1 n.s. 1334.8 93.6 n.s. 1694.7 Stratus 90.0 n.s. 46441.5 86.6 * 808.6 94.1 * 373.8 90.6 * 815.3 86.1 * 1318.4 87.8 * 1692.2 Morex 82.1 * 40357.1 90.1 * 777.1 97.4 n.s. 383.3 89.6 * 782.4 90.4 n.s. 1298.4 91.9 n.s. 1681.8 Maresi 67.6 * 30701.3 80.0 * 677.2 94.5 * 367.5 80.1 * 685.2 80.4 * 1172.4 83.3 * 1539.8 M.Dingo Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... Tab. 3. Aktywność fotochemiczna PSII drugiego (środkowego) liścia siewek jęczmienia na podstawie testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka przy SI oznacza, że różnice pomiędzy kontrolą i roślinami poddanymi działaniu suszy były istotnie (P<0.05) na podstawie testu “t” Studenta; n.s. różnice nieistotne statystycznie (P<0.05) 403 404 97.1 n.s. 1540.6 99.5 n.s. 955.4 103.1 n.s. 392.1 1430.2 97.7 n.s. 841.8 90.1 n.s. 388.5 890.2 96.8 n.s. 53363.3 95.8 n.s. 834.6 96.7 n.s. 45958.4 75.9 * 104.6 n.s. 98.1 n.s. 901.8 99.2 n.s. 99.1 n.s. 89.7 n.s. 53532.6 99.0 n.s. 922.2 97.5 n.s. 379.7 95.8 n.s. 1470.3 96.2 n.s. 1850.0 1932.7 1818.7 Georgia Harmal Lubuski 5 2.1 51.5 2.6 12.9 3.5 48.3 1.6 60.2 1.6 58.3 98.4 n.s. 5.8 55421.7 5974.4 96.0 n.s. 883.9 92.1 n.s. 378.6 102.4 n.s. 924.4 93.4 n.s. 1463.4 93.1 n.s. 1841.9 Cam/B1 SD 93.2 n.s. 28780.3 103.0 n.s. 743.1 101.0 n.s. 458.8 106.7 n.s. 819.1 104.6 n.s. 1500.3 103.7 n.s. 1959.1 Stratus 93.1 n.s. 98.4 n.s. 39672.1 98.8 n.s. 101.3 n.s. 32614.8 828.4 100.9 n.s. 442.7 100.2 n.s. 917.8 100.3 n.s. 1628.3 100.4 n.s. 2070.9 Maresi 824.9 95.6 n.s. 443.2 105.7 n.s. 879.2 99.5 n.s. 1545.8 98.6 n.s. 1988.9 Morex 92.0 n.s. 35300.7 102.0 n.s. 777.4 97.4 n.s. 433.4 104.7 n.s. 878.0 100.2 n.s. 1514.8 99.5 n.s. 1948.3 M.Dingo 1 99.8 n.s. 35014.7 87.7 n.s. 27342.7 84.6 n.s. 101.3 n.s. 46165.2 101.9 n.s. 105.3 n.s. 35538.9 866.8 777.8 103.0 n.s. 101.2 n.s. 102.7 n.s. 712.3 427.9 102.2 n.s. 424.1 103.9 n.s. 931.5 458.8 96.1 n.s. 872.8 101.8 n.s. 102.1 n.s. 100.5 n.s. 784.9 1587.5 1481.3 102.1 n.s. 101.9 n.s. 101.0 n.s. 1449.7 2015.4 Cam/B1 1905.4 Georgia 1908.5 Harmal 101.4 n.s. 99.0 n.s. 830.7 101.0 n.s. 445.7 99.9 n.s. 851.3 100.6 n.s. 1580.2 100.7 n.s. 2025.8 Lubuski (%%) PIcs (%%) RC/CS (%%) DIo/CS (%%) ETo/CS SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza SI Susza TRo/ CS (%%) SI Susza (%%) ABS/ CS Genotyp Dzień suszy Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska 1426.6 96.7 n.s. 869.9 94.7 n.s. 389.0 99.4 n.s. 875.8 95.8 n.s. 50534.7 105.0 6.0 73.5 7.2 21.0 4.9 80.2 8.3 6743.5 88.3 n.s. 97.3 n.s. 5.5 12.4 1815.6 Stratus 123.8 SD 88.8 n.s. 49535.6 91.9 * 823.2 94.9 n.s. 370.8 98.1 n.s. 851.0 92.3 n.s. 1348.5 92.9 n.s. 1719.3 Morex 95.5 n.s. 46932.9 93.8 n.s. 786.8 97.6 n.s. 392.3 97.6 n.s. 864.2 96.0 n.s. 1377.9 96.3 n.s. 1770.2 Maresi 77.5 * 36862.8 83.7 * 712.2 86.3 * 336.0 83.7 * 715.2 85.3 * 1221.4 85.6 * 1557.4 M.Dingo 10 51713.3 684.3 79.4 * 344.3 91.5 n.s. 640.2 75.7 * 33429.4 839.0 90.7 * 390.1 100.4 n.s. 835.1 94.8 n.s. 45427.9 778.8 88.6 * 374.7 100.0 n.s. 71.4 * 40373.8 88.6 * 64.2 * 103.0 n.s. 80.8 * 95.5 n.s. 94.2 n.s. 78.7 * 856.8 1112.9 1395.0 1277.2 747.2 94.8 n.s. 83.1 * 96.5 n.s. 95.4 n.s. 100.7 n.s. 373.2 98.7 n.s. 865.2 97.3 n.s. 1361.5 96.8 n.s. 1734.8 1457.2 1785.1 1651.9 Cam/B1 Georgia Harmal Lubuski 9.9 5163.5 3.8 40.7 3.9 8.4 6.3 44.2 2.9 41.9 2.5 44.4 SD 1912.7 Maresi 1510.0 94.3 n.s. 54298.2 94.3 n.s. 910.4 95.9 n.s. 865.4 46285.5 91.8 n.s. 90.0 n.s. 55946.5 398.3 87.8 n.s. 847.8 91.4 n.s. 1447.4 93.6 n.s. 1845.7 M.Dingo 70.3 * 42505.8 86.9 * 821.4 99.8 n.s. 102.6 n.s. 402.7 97.9 n.s. 93.8 n.s. 936.0 100.6 n.s. 391.8 97.2 n.s. 104.0 n.s. 103.4 n.s. 386.4 885.3 949.5 97.9 n.s. 98.1 n.s. 1521.9 98.5 n.s. 98.4 n.s. 1913.7 Morex 938.8 98.9 n.s. 1532.9 98.3 n.s. 1919.3 Stratus Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... Tab. 4. Aktywność fotochemiczna PSII trzeciego (górnego) liścia siewek jęczmienia na podstawie testu JIP i wartość wskaźnika SI w różnych okresach wegetacji w warunkach suszy. Gwiazdka przy SI oznacza, że różnice pomiędzy kontrolą i roślinami poddanymi działaniu suszy były istotnie (P<0.05) na podstawie testu “t” Studenta; n.s. różnice nieistotne statystycznie (P<0.05) 405 Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska Celem porównania wrażliwości procesów fotochemicznych poszczególnych odmian na suszę, wyliczone zostały wskaźniki SI (Tab. 2-4). Hamowanie aktywności tych procesów u zdecydowanej większości odmian nie ujawniło się w pierwszym dniu suszy, ale stało się dobrze widoczne w 5 dniu, a jeszcze silniej w dniu 10. Wyjątkową wrażliwość na suszę wykazała odmiana M.Dingo, której najstarszy liść (dolny) silnie obniżył niemal wszystkie wartości SI już w 1 dniu. Wśród trzech badanych liści siewek, starsze pośród nich (1 i 2 liść) charakteryzowały się większą wrażliwością procesów fotochemicznych na suszę niż liść młodszy (3 liść). Świadczą o tym wyraźnie obniżone wartości wskaźnika SI wszystkich parametrów fluorescencji 1 i 2 liścia zarówno w 5 jak i 10 dniu suszy. Silny spadek wartości SI w reakcji na stres suszy wykazał wskaźnik efektywności funkcjonowania PSII (PICS). Największą tolerancyjność obu starszych liści - według PIcs - stwierdzono w 10 dniu suszy u odmian Cam/B1 oraz Harmal, najmniejszą zaś u odmiany Georgia. Fotochemiczny wskaźnik PICS silniej niż inne wskaźniki aktywności fotochemicznej zróżnicował badane odmiany pod względem reakcji na suszę. Zróżnicowanie odmian pod względem PICS powiększało się wraz z czasem działania suszy i było największe u liścia najstarszego. W 5 i 10 dniu rozstęp wartości wskaźnika wrażliwości (SI) dla PICS odmian wynosił dla tego właśnie liścia odpowiednio ok. 63% i 181%. Podobną prawidłowość zaobserwowano dla innych wskaźników testu JIP. Rezultat ten sugeruje, że największego zróżnicowania odmian pod względem wrażliwości na suszę należy oczekiwać po 10 dniach suszy. Kinetyka indukcji fluorescencji chlorofilu jest przydatna w określaniu tolerancji roślin na stres temperaturowy, herbicydowy, w ocenie przeżywalności siewek, a także w hodowli do selekcjonowania roślin o pożądanym genotypie [Jansen i in.1995, Smille i in.1987]. Ponieważ na aktywność fotochemiczną w suszy najstarszego liścia mogły nałożyć się specyficzne efekty współdziałania ze starzeniem się, bezpiecznie będzie można przyjąć, że zróżnicowanie aktywności fotochemicznej należy badać po 10 dniach suszy na 2 liściu. Pomiary takie okazały się - jak wynika z przytoczonych danych - reprezentatywne dla pozostałych liści, a zarazem są wykonywane w okresie największego zróżnicowania reakcji odmian na suszę. 406 Fizjologiczne aspekty odpowiedzi roślin jęczmienia jarego... WNIOSKI • Przedłużanie czasu działania stresu powiększa wyraźnie z hamowanie procesów fotochemicznych u siewek jęczmienia. • Przedłużanie suszy bardziej wpływa na ilość energii transportowanej niż na wydajność jej przepływu przez PSII. • Wrażliwość (SI) na suszę liści młodszych jest mniejsza u niż starszych. • Zróżnicowanie odmian pod względem wrażliwości na suszę jest większe po dłuższej (10 dni) suszy. LITERATURA Bac S., Koźmiński C., Rojek M., 1998 r. Agrometeorologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, s.130-133,172-173, 261-270. Flexas J., Escalona J. M., Evain S., Gulías J., Moya I., Barry Osmond C., Medrano H., 2002 r. Steady-state chlorophyll fluorescence (Fs) measurements as a tool to follow variations of net CO2 assimilation and stomatal conductance during waterstress in C3 plants. Physiologia plantarum 114, s. 231–240. Gonzàlez A., Martín I., Luis Ayerbe L., 1999r. Barley yield in water-stress conditions. The influence of precocity, osmotic adjustment and stomatal conductance. Field Crops Research 62. s. 23-34. Jansen L. H. J., van Oevaren J. C., van Hasselt P. R., Kuiper P. J. C.: Genotypic variation in chlorophyll fluorescence parameters, photosynthesis and growth of tomato grown at low temperature and low irradiance. Photosynthetica, 31, 301314, 1995. Lazár, D., Pospíšil, P.: Mathematical simulation of chlorophyll a fluorescence rise measured with3-(3’,4’-dichlorophenyl)-1,1dimetylurea-treated barley leaves at room and high temperatures. Eur. biophys. J.28: 468-477, 1999. Lazár, D.: Chlorophyll a fluorescence induction. – Biochim. biophys. Acta 1412: 1-28, 1999. LI Rong-hua, GUO Pei-guo, Baum M., Grando S., Ceccarelli S.,2006 r. Evaluation of Chlorophyll Content and Fluorescence Parameters as Indicators of Drought Tolerance in Barley. Agricultural Sciences in China5 (10), s. 751-757. Michałek W., Sawicka B., 2005 r Zawartość chlorofilu i aktywność fotosyntetyczna średnio późnych odmian ziemniaka w warunkach pola uprawnego w środkowo-wschodniej Polsce; Acta Agrophysica, 2005, 6 (1), 183-195 407 Katarzyna Stalmach, Małgorzata Borek, Katarzyna Śniegowska M. Rapacz, J. Kościelniak, B. Jurczyk, A. Adamska, M. Wójcik J. 2010, Different patterns of physiological and molecular response to drought in seedlings of malt- and feed-type barleys (Hordeum vulgare). Agronomy & Crop Science (2010) ISSN 0931-2250 Smillie C. R., Nott R., Hetherington S. E., Oquist G.: Chilling injury and recovery in detached and attached leaves measured by chlorophyll fluorescence. Physiol. Plant., 69, 419-427, 1987. Srivastava, A., Strasser R. J. Constructive and destructive actions of light on the photosynthetic apparatus. Journal of Scientific and Industrial Research 56, 133-148, 1977. Strasser B. J., Strasser R. J. Measuring fast fluorescence transients to adress environmental questions: the JIP test. In: Mathis P (eds). Photosynthesis: from light to biosphere. Kluwer Academic, Dordrecht, pp. 977–980, 1995. Strasser R. J., Srivatava A., Tsimilli-Michael M. The fluorescence transient as tool to characterize and screen photosynthetics samples. In: Yunus M, Pathre U, Mohanty P (eds). Probing photosynthesis: mechanism, regulation and adaptation. Taylor and Francis, Bristol, pp. 45–483, 2000. Adres do korespondencji: mgr inż. Katarzyna Stalmach, mgr inż. Małgorzata Borek mgr inż. Katarzyna Śniegowska Katedra Fizjologii Roślin Wydział Rolniczo-Ekonomiczny Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Janusz Kościelniak Finansowanie projektu POLAPGEN-BD i zgodność z Programem Operacyjnym Innowacyjna Gospodarka 2007-2013 408 Marta Strzetelska, Anna Latacz Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec EPISTEME 14/2012 s.409-416 ISSN 1895-4421 PROTEKCYJNA ROLA MET-ENKEFALINY W CENTRALNYM UKŁADZIE NERWOWYM W WARUNKACH HIPOGLIKEMII PROTECTION ROLE OF MET-ENKEPHALIN IN CENTRAL NERVOUS SYSTEM IN HYPOGLYCEMIC CONDITIONS Abstrakt. Met-enkefalina jest endogennym peptydem opioidowym występującym w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych pełniącym rolę ochronną podczas stresu lub przy braku składników energetycznych. Szczególnie wrażliwą strukturą na niedobór glukozy jest podwzgórze. Celem badania było określenie wpływu hipoglikemii na stopień in vitro wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza myszy kontrolnych i traktowanych naltreksonem, antagonistą receptorów opioidowych. W mediach hodowlanych oznaczono stężenie wolnej Met-enkefaliny metodą radioimmunologiczną, a białka metodą BCA (metoda z kwasem bis-cynchoninowym). Naltrekson wywołał istotny spadek spontanicznego wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza, który został pogłębiony przez warunki hipoglikemiczne hodowli (obniżenie stężenia glukozy o 50%). Natomiast zmniejszające się w czasie spontaniczne wydzielanie opioidu z podwzgórza myszy kontrolnych było istotnie spowolnione w warunkach niedostatku glukozy. Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na protekcyjną rolę endogennych peptydów opioidowych w centralnym układzie nerwowym w warunkach niedoboru glukozy. Słowa kluczowe: Met-enkefalina, podwzgórze, hipoglikemia Summary. Met-enkephalin is an endogenous opioid peptide found in the central nervous system and peripheral tissues acting as a protector during stress or in the absence of energy. Particularly sensitive brain structure for glucose deficiency is hypothalamus. The aim of this study was to determine the effect of hypoglycemia on the degree of in vitro release of Met-enkephalin in the hypothalamus of the control mice and treated with naltrexone. In the media free Met-enkephalin was indicated by radioimmunoassay and the protein by BCA. Naltrexone caused significant decrease of spontaneous secretion of Met-enkephalin from the hypothalamus, which was exacerbated by the hypoglycemic conditions (reduced glucose levels by 50%). While decreasing in time the spontaneous secretion of hypothalamic opioid of control mice was significantly slowed down in hypoglycemic conditions. The results clearly indicate the protective role of endogenous opioid peptides in the central nervous system in conditions of glucose deficiency. Key words: Met-enkephalin, hypothalamus, hypoglycemia 409 Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec WSTĘP Wyróżniamy trzy podstawowe grupy peptydów opioidowych: endorfiny, enkefaliny i dynorfiny. Endorfiny syntezowane są z propiomelanokortyny, enkefaliny z preproenkefaliny natomiast dynorfiny z preprodynorfiny [Rao i in.1986]. Receptory opioidowe należą do rodziny receptorów błonowych metabotropowych sprzężonych z białkiem G tzw. GPCR i po aktywacji działają w sposób zależny od stężenia liganda [Holzer 2009]. Receptory opioidowe dzielą się na klasy mu-(μ) (MOP-R), kappa-(κ) (KOP-R), delta-(δ) (DOP-R) i NOP-R (ORL-1) [Henriksen i Willoch 2008], a ich ilość jest różna w zależności od struktury mózgu [Simon 1986]. Największa jest w okolicy jądra półleżącego, jądra migdałowatego, prążkowia oraz warstwy I i III kory mózgowej [Templer i in. 1990]. Endogenni agoniści receptorów opioidowych to między innymi pentapeptydy takie jak Met-enkefalina i Leu-enkefalina z grupy enkefalin. Są one neurotransmiterami występującymi naturalnie w mózgu wielu gatunków zwierząt [Koneru i in. 2009]. Endogenne opioidy są odpowiedzialne między innymi za analgezję, zmiany ciśnienia krwi umożliwiające np. przystosowanie do wysiłku fizycznego, reakcję organizmu na stres [Pierzchała i Loon 1990], zmiany w zachowaniu dotyczące pobierania pokarmu czy polepszenia nastroju oraz posiadają szeroki wpływ na układ pokarmowy, co związane jest z regulacją motoryki, odczuwaniem łaknienia czy wydzielaniem różnorodnych hormonów [Członkowski i in. 1989, Vuong i in. 2010]. Opioidy stymulują wydzielanie soku żołądkowego, natomiast podawanie naltreksonu powoduje spadek jego wydzielania [Olsen i in. 1982, Minowa i in. 2003]. Małe ilości morfiny powodują wzrost łaknienia i pragnienia, natomiast przy dużych dawkach pobranie płynów spada [Reid 1985]. Aktywacja receptorów μ-opioidowych w komórkach mięśniówki przewodu pokarmowego powoduje hamowanie perystaltyki jelit, opróżnienia żołądka, wzrost skurczów mięśnia zwieracza oraz zahamowanie sekrecji jonów i płynów co prowadzi do zaparć, jednego z najczęstszych i najbardziej uciążliwych niepożądanych efektów terapii przeciwbólowej [Holzer 2009]. Ze zmniejszeniem pobierania pokarmu spada ilość glukozy we krwi. Niedobór tlenu i składników odżywczych wpływa negatywnie na komórki mózgowe. W warunkach niedokrwienia, podczas nagłego zatrzymania przepływu krwi, jako jedne z pierwszych ulegają trwałemu uszkodzeniu i obumierają. Celem badania było określenie stopnia wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza w warunkach hipoglikemii. MATERIAŁY I METODY Badania wykonano na 12 myszach (n = 6 + 6) szczepu Swiss o średniej masie ciała 26 g. Zwierzęta utrzymywane były w standardowych warunkach, w klatkach ze stałym dostępem do wody i paszy. Doświadczenie prowadzo410 Protekcyjna rola met-enkefaliny w centralnym ukadzie nerwowym... no na dwóch grupach myszy. Grupa kontrolna otrzymywała dootrzewnowe iniekcje soli fizjologicznej (100 µl), natomiast doświadczalna dootrzewnowe iniekcje naltreksonu (3 mg/kg m.c) godzinę przed pobraniem tkanek. Próbki podwzgórza skierowano do wydzielania w buforze Krebsa z dodatkiem albuminy bydlęcej BSA (0,3 g glukozy/100 ml, 0,1 g BSA/100 ml ) lub hipoglikemicznym buforze Krebsa (0,15 g glukozy/100 ml). Po okresie stabilizacji (10 minut, 37oC) przystąpiono do właściwej inkubacji przekładając próbki do kolejnych dołków z buforem wg schematu: A – 10 min w roztworze Krebsa (stabilizacja), B – 60 min w warunkach hipoglikemii, C – 60 min w warunkach hipoglikemii, D – 10 min w roztworze Krebsa (stabilizacja). Po zakończeniu inkubacji w mediach oznaczono stężenie wolnej Met-enkefaliny metodą radioimmunologiczną. Wykonano kolumny z Porapakiem Q, przygotowanym dzień wcześniej przez dodanie 25 g substancji do 350 ml absolutnego etanolu. Na krótko przed podaniem próbek kolumny zostały trzykrotnie przemyte 1 ml wody destylowanej i odsączone. Następnie dodawano po 300 µl medium hodowlanego. Wolna Met-enkefalina została w całości związana na kolumnach z Porapakiem. Met-enkefalina została eluowana dwukrotnym przelaniem kolumn 1 ml stężonego 96 % etanolu. Próbki zostały zliofolizowane i poddane oznaczeniu radioimmunologicznemu [Pierzchała i in.1987]. Pozostałe tkanki zhomogenizowano w 0,5 ml buforze fosforanowego o pH = 6.5, a następnie zwirowano w czasie 10 minut w 12 000 x g. Ilość białka całkowitego w homogenacie oznaczono metodą BCA (QuantiPro BCA Assay Kit). Rys. 1. Schemat protokołu użytego do zbadania wpływu jednorazowej iniekcji naltreksonu na poziom wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza w warunkach hipoglikemii Otrzymane wyniki zostały poddane analizie statystycznej przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. Prawdopodobieństwo na poziomie 0,05 było uznawane za wskaźnik różnic między średnimi. Wyniki zostały przedstawione jako średnie ± SEM. 411 Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec Rys. 2, Stopień wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza w określonych przedziałach czasowych inkubacji w grupie kontrolnej i traktowanej naltreksonem w warunkach hipoglikemii. Wyniki podano jako średnie ± SEM, różnice statystyczne między grupami (*) określono z prawdopodobieństwem p<0,05. Użyte skróty: K – kontrola, Nal -naltrekson, Hip- hipoglikemia WYNIKI Warunki hipoglikemii spowodowały wzrost całkowitego wydzielenia Met-enkefaliny o około 13,8 % w stosunku do wydzielania spontanicznego w grupie kontrolnej. Natomiast w grupie doświadczalnej naltrekson wywołał istotny spadek spontanicznego wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza (1,396±0,05 pg/mg białka) o około 38 % w stosunku do grupy kontrolnej (2,257±.0,1 pg/mg białka), który został pogłębiony przez warunki hipoglikemiczne inkubacji (obniżenie stężenia glukozy o 50%), powodujące obniżenie wydzielania Met-enkefaliny o 47,1% (1,194±0,05 pg/mg białka) w stosunku do wydzielania spontanicznego w kontroli. Zarówno w grupie kontrolnej jak i doświadczalnej największe wydzielanie spontaniczne zaobserwowano podczas okresu stabilizacji oraz w ostatnich 10 min inkubacji (94 % całkowitego wydzielania). Różnice w stężeniu Met-enkefaliny w kolejnych przedziałach czasowych inkubacji w stosunku do okresu stabilizacji były statystycznie istotne. Spontaniczne wydzielanie opioidu z podwzgórza myszy kontrolnych było istotnie spowolnione w warunkach niedostatku glukozy w grupie doświadczalnej. 412 Protekcyjna rola met-enkefaliny w centralnym ukadzie nerwowym... DYSKUSJA Wzmożone wydzielanie Met-enkefaliny z komórek podwzgórza w warunkach hipoglikemii sugeruje rolę ochronną jaką może ten opioid spełniać w stosunku do komórek nerwowych. Inne badania potwierdzają neuroprotekcyjne działanie agonistów receptorów opioidowych, których podanie w warunkach hipoglikemii zmniejsza uszkodzenia neuronów kory mózgowej [Monyer i Choi 1988], hipokampa i prążkowia [Yang i in. 2011]. O neuroprotekcyjnej roli opioidów świadczą również inne badania [Zhao i in. 2006, Pateliya i in. 2008, Borlongan i in. 2009, Kawalec i in. 2011, Yang i in. 2011]. Rola ta może wynikać z faktu ich oddziaływania na spadek stężenia cytotoksycznych lipopolisacharydów i interferonu gamma w komórkach glejowych biorących udział w ochronie komórek nerwowych przed degeneracją [Gwak i Zuo 2010], aktywność kinazy białkowej C (nPKC) [Liu i in. 2008] lub na spadek stężenia pro-apoptotyczych białek Bax czy Hsp 70 [Chen i in. 2008]. Inne badania nie potwierdziły neuroprotekcyjnej funkcji agonistów receptorów opioidowych (np.DADLE- syntetycznego peptydu opioidowego) na komórki nerwowe w warunkach niedokrwienia [Iwata i in. 2007]. Badania Ammon-Treiber i in.[2005] prowadzone na komórkach nerwowych hipokampa w hodowli in vitro wykazały szkodliwe działanie endogennych opioidów na te komórki w warunkach hipoglikemii poprzez znaczne opóźnianie proliferacji. Podawanie antagonistów receptorów opioidowych zmniejszało ten negatywny efekt, a morfina kumulowała negatywne działanie endogennych opioidów. Natomiast podawanie morfiny na kilka-kilkanaście godzin przed pobraniem tkanek do doświadczenia wpływało neuroprotekcyjnie na komórki i przyspieszyło ich odnowę. Stężenie wydzielanej w doświadczeniach in vivo i in vitro Met-enkefaliny w mózgu zależy od warunków hodowli i podawanych zwierzęciu substancji. W prezentowanym doświadczeniu krótkotrwałej inkubacji zaobserwowano znaczny spadek wydzielania Met-enkefaliny z podwzgórza po podaniu naltreksonu. Natomiast inne badania, gdzie długotrwale blokowano receptory opioidowe, donoszą o istotnym wzroście stężenia Met-enkefaliny [Osborne i Herz 1980, Templer i in.1984, 1990, Voung i in. 2010]. WNIOSKI • Blokowanie receptorów opioidowych powoduje spadek wydzielania endogennych opioidów z podwzgórza. • Warunki hipoglikemii pogłębiają hamujące działanie naltreksonu na wydzielanie Met-enkefaliny z podwzgórza. • Warunki hipoglikemii powodują przyspieszenie oraz wzrost całkowitego wydzielenia Met-enkefaliny. • Endogenne peptydy opioidowe pełnią protekcyjną rolę w centralnym układzie nerwowym w warunkach niedoboru glukozy. 413 Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec LITERATURA Ammon-Treiber S. Stolze D. Schröder H. Loh H. Höllt V. 2005. Effects of opioid antagonists and morphine in a hippocampal hypoxia/hypoglycemia model. Neuropharmacology, 49(8):1160-90. Borlongan C. Hayashi T. Oeltgen P. Tsung-Ping S. Wang Y. 2009. Hibernation-like state induced by an opioid peptide protects against experimental stroke. BMC Biology, 7:31. Chen Q. Cui J. Zhang Y. Yu L. 2008. Prolonged morphine application modulates Bax and Hsp70 levels in primary rat neurons. Neuroscience Letters, 441(3):311-314. Członkowski A. Makulska-Nowak H.E. 1989. Opioidy endogenne. PZWL. W-wa. Gwak M. Li L. Zuo Z. 2010. Morphine preconditioning reduces lipopolysaccharide and interferon-gamma-induced mouse microglial cell injury via delta 1 opioid receptor activation. Neuroscience, 167(2):256-60. Henriksen G. Willoch F. 2008. Imaging of opioid receptors in the central nervous system. Brain,131(5): 1171-96. Holzer P. 2009. Opioid receptors in the gastrointestinal tract. Regulatory Peptides, 155(1-3): 11–17. Iwata M. Inoue S. Kawaguchi M. Kurita N. Horiuchi T. Nakamura M. Konishi N. Furuya H. 2007. Delta opioid receptors stimulation with [D-Ala2, D-Leu5] enkephalin does not provide neuroprotection in the hippocampus in rats subjected to forebrain ischemia. Neuroscientific Letters, 414(3):242-6. Kawalec M. Kowalczyk J. Beresewicz M. Lipkowski A. Zablocka B. 2011. Neuroprotective potential of biphalin, multireceptor opioid peptide, against excitotoxic injury in hippocampal organotypic culture. Neurochemical Resources, 36(11): 2091-2095. Koneru A. Satyanarayana S. Rizwan S. 2009. Endogenous opioids: their physiological role and receptors. Global Journal of Pharmacology, 3(3): 149-153. Liu Y. Li J. Yang J. Ji F. Bu X. Zhang N. Zhang B. 2008. Inhibition of PKCgamma membrane translocation mediated morphine preconditioning-induced neuroprotection against oxygen-glucose deprivation in the hippocampus slices of mice. Neuroscience Letters, 444(1):87-91. Minowa S. Ishihara S. Tsuchiya S. Horie S. Watanabe K. Murayama T. 2003. Involvement of glutamate and γ-amino-butyric acid receptor systems on gastric acid secretion induced by activation of κ-opioid receptors in the central nervous system in rats. British Jurnal of Pharmacology, 138(6): 1049–1058. 414 Protekcyjna rola met-enkefaliny w centralnym ukadzie nerwowym... Monyer H. Choi D. 1988. Morphinans attenuate cortical neuronal injury induced by glucose deprivation in vitro. Brain Resources, 12;446(1):144-8. Olsen P. Kirkegaard P. Petersen B. Christiansen J. 1982. Effect of naloxone on met-enkephalin-induced gastric acid secretion and serum gastrin in man. Gut, 23(1): 63-65. Osborne H. Herz A.1980. K+-evoked release of Met-Enkephalin from rat striatum in vitro: effect of putative neurotransmitters and morphine. Archives of Pharmacology, 310(3):203-209. Pateliya B. Singh N. Jaggi A. 2008. Possible role of opioids and KATP channels in neuroprotective effect of postconditioning in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 31(9):1755-60. Pierzchała K. Houdi A. Van Loon GR. 1987. Nicotine-induced alterations in brain regional concentrations of native and cryptic Met- and Leu-enkephalin. Peptides, 8(6):1035-43 Pierzchała K. Glen R. Van Loon GR. 1990. Plasma native and peptidase-derivable responses to restraint stress in rats Met-Enkephalin. Jurnal of Clinical Investment, 85: 861-73. Rao S. Rapaka R. Hawks R. 1986. Opioid peptides: molecular pharmacology, biosynthesis, and analysis, NIDA Research Monograph 70. Reid L. 1985. Endogenous opioid peptides and regulation of drinking and feeding. The american Jurnal of Clinical Nutrition, 42(5):1099-1132 Rónai A. 2004. Natural opioid peptides, synthetic analogs, peptidases: pharmacological analysis and drug design, Ph.D. Dissertation, Department of Pharmacology and Pharmacotherapy Semmelweis University, Budapest. Simon E. 1986. Progress in the characterization of the opioid receptor subtypes: peptides as probes. Future directions, NIDA Research Monograph 70. Tempel A. Gardner E. Zukin R. 1984. Visualization of opiate receptor upregulation by light microscopy autoradiography. Proc Natl Acad Sci U S A., 81(12): 3893-3897. Tempel A. Kessler J. Zukin S. 1990. Chronic naltrexone treatment increases expression of preproenkephalin and preprotachykinin mRNA in discrete brain regions. Neuroscience, 10(3): 741-747. Vuong C. Stan H. M. Van Uum, O’Dell L. Lutfy K. Friedman T. 2010. The effects of opioids and opioid analogs on animal and human endocrine systems. Endocrine Reviews, 31(1): 98 –132. 415 Marta Strzetelska, Anna Latacz, Ewa Stypka, Krystyna Pierzchała-Koziec Yang L. Shah K. Wang H. Karamyan V. Abbruscato T. 2011. Charakteryzation of neuroprotective effects of biphalin, an opioid receptor agonist, in a model of focal brain ischemia. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 339(2):499-508. Yang L. Wang H. Shah K. Karamyan V. Abbruscato T. 2011. Opioid receptor agonists reduce brain edema in stroke. Brain Research, 1383:307-16. Zhao P. Huang Y. Zuo Z. 2006. Opioid preconditioning induces opioid receptor-dependent delayed neuroprotection against ischemia in rats. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 65(10): 945-52. Adres do korespondencji: mgr inż. Marta Strzetelska, mgr Anna Latacz, Ewa Stypka prof. dr hab.inż. Krystyna Pierzchała-Koziec Katedra Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. inż. Krystyna Pierzchała-Koziec Praca finansowana z DS.3243/KFEZ/2011 416 Katarzyna Śniegowska Katarzyna Stalmach EPISTEME 14/2012 s.417-421 ISSN 1895-4421 THE COMPARISON OF HVA1 AND SRG6 GENES EXPRESSION PROFILES IN SEEDLING AND FLOWERING STAGE IN A SPRING BARLEY (HORDEUM VULGARE L.) CULTIVARS DURING DROUGHT TREATMENT PORÓWNANIE PROFILU EKSPRESJI GENÓW HVA1 ORAZ SRG6 W STADIUM SIEWKI I KWITNIENIA U ROŚLIN JĘCZMIENIA JAREGO (HORDEUM VULGARE L.) W ODPOWIEDZI NA STRES SUSZY Summary. Drought is considered to be the main environmental factor causing lower crop productivity, including that of barley. Drought tolerance in this crop is highly correlated with the expression of two genes: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1) encodes a LEA (Late Embryogenesis Abundant) protein and SRG6 (stress-responsive gene 6) encodes a hydrophobic regulatory protein. A research was conducted in seven cultivars of spring barley drought-treated in seedling and heading stage. Level of HVA1 and SRG6 gene expression during drought stress were carried out by real time PCR method after 10 days drought treatment. In the present study an increase in SRG6 gene expression in seedlings compared to the later stage was showed. Differentiation of HVA1 gene expression between growing stages in drought was noticed. Key words: drought stress, the gene expression profile, HVA1, SRG6, spring barley Abstrakt. Susza jest jednym z czynników środowiskowych obniżających plon zbóż, w tym także jęczmienia. Jego odporność na stres suszy jest ściśle związana z ekspresją dwóch genów: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1) gen kodujący białko z grupy LEA (Late Embryogenesis Abundant) oraz Srg6 (stress-responsive gene 6) kodujący hipotetyczny czynnik transkrypcyjny. Badania przeprowadzono na siedmiu odmianach jęczmienia jarego w stadium siewki i kwitnienia. Poziom ekspresji badanych genów określono za pomocą metody Real-Time PCR po 10-dniowym stresie suszy. Wykazano wzrost poziomu ekspresji genu SRG6 w stadium kwitnienia w porównaniu ze stadium przed kwitnieniem. Zauważono także zróżnicowanie profilu ekspresji genu HVA1 pomiędzy roślinami w badanych stadiach rozwojowych. Słowa kluczowe: stres suszy, profil ekspresji genów, HVA1, SRG6, jęczmień jary 417 Katarzyna Śniegowska, Katarzyna Stalmach INTRODUCTION Drought is considered to be the main environmental factor causing lower crop productivity. In Poland, barley yield can be reduced by 20% because of water deficit, hence the need for a simple tool for drought tolerant varieties selection. There are two genes that are probably connected with the drought tolerance of barley: HVA1 (Hordeum vulgare aleurone 1) and SRG6 (stressresponsive gene 6). Transgenic plants modified with these genes seemed to be more resistant to water deficit [Xu et al. 1996, Tong et al. 2007]. Also the association between HVA1 and SRG6 transcript accumulation and drought tolerance of barley was observed [Rapacz 2010]. The reliability of physiological and biochemical drought tolerance markers depends on species, genotypes [Kumar 2005, Praba et al. 2009] and developmental stage [Szira et al. 2008]. The aim of this study was to observe if the same dependence exists in case of molecular traits, studying differences in the HVA1 and SRG6 transcript accumulation in seedling and flowering stage of different spring barley varieties under drought conditions. MATERIAL AND METHODS The experiments were performed on seven barley varieties with different drought resistance (Georgia, Harmal, Lubuski, M.Dingo, Maresi, Morex, Stratus). Plants were grown in a growth room in pots filled with a mixture of clay and sand (7:2, v/v) in 25%-60% air humidity, for a 16-h photoperiod. The temperature varied according to the developmental stage; namely: during germination (4 days), a constant temperature of 29°C was maintained, whereas after emergence (also during the drought treatment), the temperature was 25/17°C (day/night). All genotypes were treated with water deficit in soil (4% - mass of water in the dry mass of soil) for 10 days. Plants of each genotype grown under normal watering conditions were a control. Drought stress was started after reaching a certain stage: seedling in first experiment and flowering in the second one. Accumulation of SRG6 and HVA1 transcript were studied in the second leaves harvested last day of the stress treatment. There were five biological samples collected from each genotype studied, in each of the two experimental series. The further analysis were performed on three samples, each PCR reaction was performed in three replicates. The quality and concentration of cDNA were determined spectrophotometrically. Real time PCR with TaqMan-MGB probes was used as the relative quantification method detection of the amplification products, with ubiquitin gene as the internal standard. The mRNA copy number for each cultivar was calculated as a relative value to control. 418 The commparison of HVA1 and SRG6 genes expression profiles... RESULTS Induction of SRG6 gene expression was observed in all tested varietes (Fig. 1) before and after flowering. In case of six varieties (Georgia, Harmal, Lubuski, M. Dingo, Morex and Stratus) increase of analyzed gene transcript accumulation was noticed. In five cases, with exception of the Harmal variety, the difference was statistically significant. The greatest increase was observed in the M.Dingo variety, where the relative SRG6 gene expression in flowering stage was three times higher than the expression observed before flowering. Just in the case of Maresi cultivar SRG6 gene transcript accumulation was slightly higher in seedling stage, but the difference is statistically insignificant. Therefore it can be assumed, that the expressions in both stages were comparable. The expression of HVA1 in most cases was slightly noticed (Fig. 2). Very high accumulation of analyzed transcript was noticed in Georgia variety in flowering stage and in Maresi in seedling stage. Level of HVA1 transcript accumulation in both stages was comparable in M.Dingo variety. However, these results seemed to be imprecise and will be repeated. 8 relative SRG6 mRNA copy number 7 6 5 seedling stage 4 flowering stage 3 2 1 0 Georgia Harmal Lubuski M.Dingo Maresi Morex Stratus cultivar Fig. 1. Relative (to the well-watered plants) change in SRG6 gene expression observed after 10 days of drought treatment in barley cultivars(mean ± standard error) 419 Katarzyna Śniegowska, Katarzyna Stalmach relative HVA1 mRNA copy number 250 200 seedling stage 150 flowering stage 100 50 0 Georgia Harmal Lubuski M.Dingo Maresi Morex Stratus cultivar Fig. 2. Relative (to the well-watered plants) change in HVA1 gene expression observed after 10 days of drought treatment in barley cultivars (means) DISCUSSION A wide range of variation in drought response was observed among studied genotypes. Drought-induced relative transcript accumulation of SRG6 was higher in seedling stage than in flowering stage. These results correspond with previous results [Szira et al. 2008], which indicate that expression of genes correlated with water deficit depends on development stage. The expression of these genes is lower in plants in seedling stage, because plants before flowering are generally less susceptible to drought stress. The higher expression of SRG6 gene in the flowering stage may results from greater water demand during this period. The increased expression of genes responsible for plant tolerance to water deficit at flowering stage may be related to the adaptation of selected spring barley cultivars to environmental conditions in which they were bred. The expression profile of HVA1 (encoding LEA protein) gene obtained in this study was incomplete. These results suggest, that this experiment should be repeated under modified conditions. 420 The commparison of HVA1 and SRG6 genes expression profiles... REFERENCES Kumar, D., 2005: Breeding for drought resistance. In: M. Ashraf, and P. J. C. Harris, eds. Abiotic Stresses. Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches: 145–176. Praba, M. L., J. E. Cairns, R. C. Babu, and H. R. Lafitte, 2009: Identification of physiological traits underlying cultivar differences in drought tolerance in rice and wheat. J. Agron. Crop Sci. 195, 30–46. Rapacz M, Kościelniak J, Jurczyk B, Adamska A, Wójcik M. 2010. Different Patterns of Physiological and Molecular Response to Drought in Seedlings of Malt- and Feed type Barleys (Hordeum vulgare). Journal of Agronomy and Crop Science 196: 9-19. Szira, F., A. F. Ba´lint, A. Bo¨rner, and G. Galiba, 2008: Evaluation of drought-related traits and screening methods at different developmental stages in spring barley. J. Agron. Crop Sci. 194, 334–342. Tong S, Ni Z, Peng H, Dong G, Sun Q. 2007. Ectopic overexpression of wheat TaSRG6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis. Plant Science 172: 10791086. Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho T-HD, Wu R. 1996. Expression of late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficits and salt stress in transgenic rice. Plant Physiology 110: 249-257. Postal address: Katarzyna Śniegowska, Katarzyna Stalmach Faculty of Agriculture and Economics Agricultural University of Cracow al. Mickiewicza 21, 31-120 Kraków e-mail: [email protected], [email protected] Supervisor: prof. dr hab. Marcin Rapacz This work was supported by the European Regional Development Fund through the Polish Innovative Economy Program 2007 – 2013, project WNDPOIG.01.03.01-00-101/08 POLAPGEN-BD „Biotechnological tools for breeding cereals with increased resistance to drought”. 421 Katarzyna Wolny-Koładka Anna Lenart EPISTEME 14/2012 s.423-430 ISSN 1895-4421 AEROZOL MIKROBIOLOGICZNY W WYBRANYCH POMIESZCZENIACH UNIWERSYTETU ROLNICZEGO W KRAKOWIE MICROBIAL AEROSOL IN SELECTED PREMISES AT THE UNIVERSITY OF AGRICULTURE IN CRACOW Abstrakt. Przeprowadzone eksperymenty miały na celu ocenę zagrożenia mikrobiologicznego w wybranych salach Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Ocenianymi pomieszczeniami były: laboratoria, pokoje pracowników i sale wykładowe. Próbki pobrano w następujących godzinach: 8 rano i 18 popołudniu za pomocą impaktora MAS-100 (Merck). Uzyskane wyniki wskazują, że pomimo obecności bakterii (z uwzględnieniem gronkowców), promieniowców i grzybów w badanych pomieszczeniach, nie zostały przekroczone wytyczne zawarte w Polskich Normach dotyczących czystości powietrza. Ponadto zaobserwowano wzrost stężenia bioaerozolu w ciągu dnia. Biorąc pod uwagę fakt, że ludzie znajdujący się wewnątrz budynków działają jako wektory dla mikroorganizmów i mogą być głównym źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza, ważne jest, aby monitorować skład i koncentrację aerozolu mikrobiologicznego w pomieszczeniach zamkniętych. Słowa kluczowe: bioaerozol, powietrze, bakterie, grzyby, promieniowce, gronkowce Summary. The aim of this study was to evaluate the microbiological hazards in selected premises of the University of Agriculture in Cracow. The examined rooms were: laboratories, employers’ rooms and lecture halls. The samples were taken in the following hours: 8 A.M and 6 P.M. with a MAS-100 (Merck) impactor. The results indicate that, despite the presence of bacteria (including staphylococci), actinomycetes and fungi in the studied areas, the guidelines contained in the Polish Standards for air quality were not exceeded. In addition, bioaerosol concentration increased during the day. Considering the fact, that people located in the investigated rooms act as vectors for microorganisms and can be major sources of microbial contamination of air, it is important to monitor the composition and concentration of indoor microbial aerosols. Key words: bioaerozol, air, bacteria, fungi, actinomycetes, staphylococci 423 Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart WSTĘP Poznanie i charakterystyka aerozolu biologicznego w pomieszczeniach zasługuje na szczególną uwagę. Ekspozycja na bioaerozol zawierający zarodniki grzybów, komórki bakterii i promieniowców może stać się przyczyną brzemiennych w skutki zakażeń górnych i dolnych dróg oddechowych a także alergii oraz astmy [Grinshpun i in. 1997]. Mając na uwadze charakter edukacyjny uczelni wyższych oraz bezpieczeństwo studentów i pracowników przeprowadzono badania monitoringowe w celu oceny składu bioaerozolu w wybranych salach Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono w 6 pomieszczeniach na terenie budynku Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie: • sala ćwiczeń Katedry Mikrobiologii, • sala ćwiczeń Katedry Fizjologii i Endokrynologii Zwierząt, • pokój pracowników I, • pokój pracowników II, • sala wykładowa I, • sala wykładowa II, • kontrola – przed budynkiem UR. Badania wykonywano dwukrotnie w ciągu dnia: w godzinach porannych (przed zajęciami) od 7:00 do 9:00 oraz w godzinach popołudniowych (po zajęciach) od 17:00 do 19:00, przy użyciu impaktora typu MAS-100 (Merck). Próbki powietrza o objętości 0,1m3 pobierano z wysokości 1,5 m nad podłożem (w strefie respiracyjnej człowieka). Badanie wykonano w trzech powtórzeniach. Zgodnie z zaleceniami Polskich Norm [PN-89/Z-04111/02, PN-89/Z-04111/03] oznaczano: ogólną liczbę bakterii, grzybów i promieniowców, liczebność gronkowców hemolizujących oraz Pseudomonas fluorescens. Wyniki wyrażono w postaci jtk (jednostki tworzące kolonie) w m3 pobranego powietrza (jtk·m-3). W oparciu o informacje zawarte w kluczach diagnostycznych dokonano identyfikacji dominujących rodzajów bakterii, grzybów i promieniowców. Oznaczono przynależność gatunkową najczęściej izolowanych grup drobnoustrojów [Barnett i Hunter 1972, Fassatiova 1983, Holt 1989]. 424 Aerozol mikrobiologiczny w wybranych pomieszczeniach... Przy pomocy programu Statistica v. 10 (StatSoft, Polska) wyznaczono średnie liczebności poszczególnych grup mikroorganizmów oraz odchylenia standardowe z uwzględnieniem czasów poboru próbek. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Punkt poboru Uzyskane wyniki dotyczące występowania aerozolu mikrobiologicznego przedstawiono w tabeli 1. 1 2 3 4 5 6 7 Liczebność drobnoustrojów (jtk·m-3) Czas poboru Grzyby Bakterie Promieniowce Gronkowce Pseudomonas fluorescens rano 13 190 3 0 0 popołudniu 220 220 3 7 0 rano 177 450 0 7 0 popołudniu 187 940 13 0 0 rano 47 110 6,7 3 0 popołudniu 130 213 0 17 0 rano 27 290 13 10 0 popołudniu 173 123 17 0 0 rano 213 423 0 0 0 popołudniu 430 180 3 0 0 rano 43 93,3 0 0 0 popołudniu 247 627 3 0 0 rano 120 113 20 3 0 popołudniu 135 130 25 6 0 Tab. 1. Liczebność drobnoustrojów w powietrzu (jtk·m-3) Na podstawie przeprowadzonych analiz stwierdzono, iż liczba grzybów mikroskopowych we wszystkich badanych pomieszczeniach oraz przed budynkiem UR (kontrola) nie przekroczyła wartości zalecanych przez Polską Normę [PN-89/Z-04111/03]. Można w związku z tym uznać, że przebywanie we wszystkich testowanych pomieszczeniach nie stanowi zagrożenia dla zdrowia studentów i pracowników. Podobne obserwacje poczyniono 425 Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart w przypadku aerozolu bakteryjnego. W żadnym z badanych pomieszczeń nie doszło do przekroczenia dopuszczalnych stężeń ogólnej liczby bakterii [PN-89/Z-04111/02], natomiast liczebność promieniowców przekroczyła dopuszczalne normy w następujących pomieszczeniach: sala ćwiczeń KFiEZ (popołudniu), pokój pracowników II (cały dzień) oraz na zewnątrz budynku UR. We wszystkich trzech punktach powietrze zaklasyfikowano jako średnio-zanieczyszczone [PN-89/Z-04111/02]. Obecność gronkowców stwierdzono w sali ćwiczeń KM (popołudniu), sali ćwiczeń KFiEZ (rano), pokoju pracowników I (cały dzień) oraz w pokoju pracowników II (rano). Powyższe rezultaty świadczą, iż powietrze w wymienionych miejscach było średnio-zanieczyszczone [PN-89/Z-04111/02]. Przeprowadzona statystyczna analiza wyników wykazała, że ilość mikroorganizmów w powietrzu badanych pomieszczeń była wyższa w godzinach popołudniowych (Tab. 2). Zwiększona liczba mikroorganizmów w powietrzu w tym czasie jest konsekwencją faktu, iż człowiek jest jednym z głównych źródeł drobnoustrojów [Wanner i in. 1993]. Należy zaznaczyć, że badane pomieszczenia są intensywnie użytkowane w ciągu dnia – wykłady jak i ćwiczenia odbywają się od rana do późnego popołudnia. Czas poboru Statystyka Grzyby Bakterie Promieniowce Gronkowce Pseudomonas aeruginosa Na podstawie analizy statystycznej wyników stwierdzono także dużą zmienność liczebności badanych mikroorganizmów zarówno rano jak i po południu. Jest to zrozumiałe, z uwagi na to, że badane pomieszczenia różniły się między sobą pod względem sposobu użytkowania i liczby osób w nich przebywających. Wyniki analizy jakościowej powietrza przedstawiono w Tab. 3. Rano Odchylenie standardowe 79,09879 151,1746 7,771958 3,9036 0 Średnia 91,42857 238,4714 6,1 3,285714 0 Odchylenie standardowe 102,7989 313,3916 9,352871 6,395683 0 Średnia 217,4286 347,5714 9,142857 4,285714 0 Popołudniu Tab. 2. Analiza statystyczna otrzymanych wyników 426 Aerozol mikrobiologiczny w wybranych pomieszczeniach... Punkt poboru Czas poboru Liczebność drobnoustrojów (jtk·m-3). Grzyby Bakterie Promieniowce Gronkowce rano Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+) laseczki, G (+) ziarniaki Streptomyces albus brak popołudniu Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+)laseczki Streptomyces albus Staphylococcus spp. rano Aspergillus flavus, Penicillium spp., Cladosporium spp. G (+) ziarniaki brak Staphylococcus spp. popołudniu Aspergillus flavus, Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+) ziarniaki Streptomyces albus brak rano Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+)laseczki Streptomyces albus Staphylococcus spp. popołudniu Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans G (-) pałeczki brak Staphylococcus spp. rano Aspergillus niger, Penicillium spp. G (-) pałeczki Streptomyces albus Staphylococcus spp. popołudniu Aspergillus niger, Penicillium spp., Cladosporium spp. Bacillus mycoides, G (+) ziarniaki Streptomyces albus brak rano Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans G (-) pałeczki brak brak popołudniu Aspergillus flavus, Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+) ziarniaki Streptomyces albus brak 1 2 3 4 5 427 Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart 6 rano Cladosporium spp., Rhizopus nigricans G (-) pałeczki brak brak popołudniu Fusarium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans Bacillus mycoides, G (+)laseczki Streptomyces albus brak rano Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans G (+) ziarniaki Streptomyces albus Staphylococcus spp. popołudniu Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp. G (+) ziarniaki brak brak 7 Tab. 3. Skład jakościowy aerozolu mikrobiologicznego w badanych pomieszczeniach Zidentyfikowane rodzaje oraz gatunki mikroorganizmów stanowią typowy skład mikroflory powietrza pomieszczeń zamkniętych [Araujo i in. 2008, Lee i Jo 2006, Prasad i in. 2004, Wanner i in. 1993]. Na szczególną uwagę zasługuje stwierdzenie gronkowców w badanym powietrzu. Niemniej jednak sam fakt ich obecności nie świadczy o istnieniu zagrożenia epidemiologicznego. Należałoby przeprowadzić szczegółową diagnostykę i ocenić przynależność gatunkową wyizolowanych szczepów. Dodatkowo wśród grzybów pleśniowych zidentyfikowano gatunki potencjalnie toksynotwórcze, jak A. flavus lub A. niger, a także grzyby z rodzaju Cladosporium, których zarodniki w wyższych stężeniach mogą przyczyniać się do powstawania reakcji alergicznych u ludzi. Dlatego tak ważna jest kontrola stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego pomieszczeń, a także ich odpowiednia wentylacja oraz dbałość o stan i regularne zabiegi konserwacji urządzeń klimatyzacyjnych. WNIOSKI • Biorąc pod uwagę koncentrację aerozolu mikrobiologicznego we wszystkich badanych pomieszczeniach, nie stwierdzono przekroczenia wytycznych zawartych w Polskich Normach dotyczących czystości powietrza. • W badanym bioaerozolu dominowały następujące mikroorganizmy: Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium spp., Penicillium spp., Cladosporium spp., Rhizopus nigricans, Bacillus mycoides, Streptomyces albus oraz bakterie z rodzaju Staphylococcus spp. 428 Aerozol mikrobiologiczny w wybranych pomieszczeniach... • Zwiększenie zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza w godzinach popołudniowych wskazuje, iż człowiek jest jednym z głównych źródeł mikroorganizmów we wnętrzach budynków. LITERATURA Araujo R., Cabral J.P., Rodrigues A.G. 2008. Air filtration systems and restrictive access conditions improve indoor air quality in clinical units: Penicillium as a general indicator of hospital indoor fungal levels, Am. J. Infect. Control 36, 2, 129-134 Barnett H.L., Hunter B.B. 1972. Illustrated genera of Imperfect Fungi, Burgess Publishing Company Fassatiova O. 1983. Grzyby mikroskopowe w mikrobiologii technicznej, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, Polska Grinshpun S.A., Reponen T., Willeke K. 1997. Aerosol characteristics of airborne actinomycetes and fungi, J. Aerosol Sci. 28, suppl. 1, 667-668 Holt J.G. (ed) 1989. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1 Williams & Wilkins, Baltimore Lee J-H., Jo W-K. 2006. Characteristics of indoor and outdoor bioaerosols at Korean apartment buildings, Environmental Research 101, 11-17 PN-89/Z-04111/02. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną PN-89/Z-04111/03. Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby grzybów mikroskopowych w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną Prasad M., Van Der Wefr P., Brinkmann A. 2004. Bioaerosols and Composting, A Literature Evaluation, CRE Composting Association of Ireland TEO Wanner H., Verhoeff A., Colombi A., Flannigan B., Gravesen S., Mouilleseaux A., Nevalainen A., Papadakis J., Seidel K. 1993. European Collaborative Action Indoor air quality and its impact on man, Environment and Quality of Life, Report No. 12 Biological Particles in Indoor Environments. 429 Katarzyna Wolny-Koładka, Anna Lenart Adres do korespondencji: mgr inż. Katarzyna Wolny-Koładka, dr inż. Anna Lenart Katedra Mikrobiologii Wydział Rolniczo – Ekonomiczny Uniwersytet Rolniczy w Krakowie al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków e-mail: [email protected] Opiekun naukowy: prof. dr hab. Wiesław Barabasz 430 Isaura Zaleska Marta Wawrzyszyn EPISTEME 14/2012 s.431-438 ISSN 1895-4421 DYNAMIKA EKSPRESJI GENÓW FOXP3, JAK1, STAT1 W TRAKCIE ROZWOJU CIA U SZCZURÓW DYNAMICS OF FOXP3, JAK1 AND STAT1 GENES EXPRESSION DURING THE DEVELOPMENT OF CIA IN RATS Abstrakt. Model CIA (z ang. Collagen Induced Arthritis) pozwala poznać u zwierząt molekularne mechanizmy zachodzace w trakcie rozwoju chorób autoagresywnych. Ostatnie lata badań udowadniają że istotną rolę w procesach autoagresji odgrywają komórki T regulatorowe CD4+ CD25+ FOXP3+, które dzięki swojej supresyjnej funkcji mogą skutecznie chronić przez rozwojem chorób autoagresywnych. W niniejszej pracy przedstawiono dynamikę ekspresji genów foxp3, jak1 i stat1 oraz kinetykę zmian liczby komórek T regulatorowych CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) w trakcie rozwoju modelowego CIA u szczurów Wistar. Słowa kluczowe: modelowe reumatoidalne zapalenie stawów, foxp3, jak1, stat1, Treg Summary. CIA animal model (Collagen Induced Arthritis) allows exploring the molecular mechanisms that occur during the development of self-aggressive diseases. Recent years of studies have proven that regulatory T cells CD4+ CD25+FOXP3+ play a pivotal role in autoimmune processes, which due to their suppressive function can effectively protect the development of self-aggressive diseases. This paper presents the dynamics of foxp3 gene expression, jak1 and stat1, and the kinetics of change in the number of regulatory T cells, CD4 +CD25 + FOXP3 + during the development of the CIA model in Wistar rats. Key words: collagen induced arthritis, foxp3, jak1, stat1, Treg 431 Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn WSTĘP Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest schorzeniem przewlekłym i układową, zapalną i autoimmunologiczną chorobą tkanki łącznej o charakterze postępującym [Balcer i Bednarek, 2009]. U podstaw patogenezy reumatoidalnego zapalenia stawów leży aktywacja limfocytów Th1 błędnie identyfikujących autoantygeny obecne w chrząstkach stawowych, co powoduje zapalenie w błonie maziowej stawów i naciek makrofagów, fibroblastów i komórek dendrytycznych [Marcińska i Szczepanik 2010]. Za regulację odpowiedzi odpornościowej odpowiadają limfocyty T regulatorowe o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ [Sakaguchi i in.2008; Maślanka,2010]. W powstawaniu i regulowaniu funkcji Treg główną rolę pełni czynnik transkrypcyjny Foxp3 [Myśliwska i Ryba, 2010]. U szczurów i myszy modelem doświadczalnym RZS jest indukowane kolageneem typu II CIA, które podobnie jak RZS wywołuje obrzęk kończyn, napływ komórek odpornościowych i niszczenie chrząstki i kości [Marcińska i Szczepanik 2010]. Kodowane przez ten gen stat1 białko-STAT1, należy do rodziny czynników transkrypcyjnych STATs (signal transducers and activators of transcription), biorących udział w regulacji odpowiedzi odpornościowej. Białka te mogą wpływać m.in. na różnicowanie i proliferację komórek, czy wydzielanie cytokin i czynników wzrostu [Łukomski i Starska, 2008]. STAT1 jest aktywowane w komórkach płynu stawowego [Wincewicz i in. 2005]. Aktywność białek STAT regulowana jest przez rodzinę wewnątrzkomórkowych kinaz tyrozynowych JAK (z ang. Janus kinases) [Świst i Pajtasz-Piasecka, 2011]. Celem niniejszej pracy jest zbadanie dynamiki ekspresji genów foxp3, jak1 i stat1 w trakcie rozwoju CIA. MATERIAŁY I METODY Zwierzęta doświadczalne. W pracy wykorzystano materiał biologiczny pochodzący od 12-tu samic 6-cio tygodniowych szczurów Wistar o wadze 150200 g (Akademia Medyczna im.Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Anatomii Patologicznej, Polska). Zwierzęta otrzymywały wodę i karmę bytową at libitum i utrzymywane były w pomieszczeniu dla zwierząt, które było codziennie oświetlone przez 12 godzin (7:00-19:00), w temperaturze pokojowej 24°C. Szczury podzielono na 3 grupy doświadczelne L1, L2 i L3 zgodnie z nastepującymi po sobie terminami eutanazji: grupę L1 poddawano eutanazji po 1 tyg., L2 po dwóch i L3 po 3 tygodnich od drugiej immunizacji po 4 zwierzęta w każdej, a w obrębie każdej z grup podzielono zwierzęta na podrupy kontrolną i właściwą. Doświadczenie z wykorzystaniem zwierząt 432 Dynamika ekspresji genów FOXP3, JAK1, STAT1... doswiadczalnych było wykonywane w oparciu o zgodę nr 08/2009 II Lokalnej Komisju Etycznej we Wrocławiu. Wywołanie modelowego CIA. Zwierzęta z podgrup właściwych były, w odstępie 7 dni, dwukrotnie immunizowane u nasady ogona mieszaniną 1:1 kolagenu bydlęcego typu II i IFA (Incomplete Freund’s Adjuvant). Podgrupy kontrolnych były immunizowane roztworem IAF z dodatkiem 0,01M CH3COOH, w stosunki 1:1. Po 7 dniach od drugiej immunizacji zaobserwowano okołostawową opuchnilznę tylnych łap, a po kolejnych 2 tygodniach opuchlizna się zmiejszyła natomiast zaobserwowano zmiany zwyrodnieniowe paliczków. Zwierzęta poddano eutanazji poprzez narkozę wziewną izofluranu i dyslokację kręgów szyjnych, grupę L1 poddano eutanazji w 7. dniu po 2-giej immunizacji, grupę L2 w 14 dniu, a grupę L3 w 28 dniu. Badany materiał biologiczny. Po eutanazji pobierano od szczurów śledziony, z których izolowano leukocyty oraz krew obwodową, z której uzyskiwano surowicę. Test ELISA. W surowicach szczurów określono poziom przeciwciał anty-CII w klasie IgG z użyciem testu ELISA. Płytki Nunc Maxisorp opłaszczano 2µg/mL kolagenem bydlęcym (BD Bioscience, nr kat.354257) w 0,1 M buforze węglanowym o pH=9,6 poprzez całonocną inkubację w 4oC. Analizowane surowice rozcieńczono 500-krotnie w roztworze PBS+0,05% Tween20 i inkubowano 1,5 h w 37oC. Do identyfikacji poziomu anty-CII użyto anty-IgG szczura (BIOKOM, nr kat. 212-035-082), skoniugowanych z peroksydazą chrzanową. Do wywołania reakcji zastosowano substrat TMB-supersensitive (100µl/dołek), reakcję przerwano po 15 minutach z udziałem 2M H2SO4 (50 µl/dołek). Gęstość optyczną określano przy λ=450nm z użyciem czytnika BioTek µQuantum. Cytometria Przypływowa. Limfocyty w liczbie 1x106 kom poddano barwieniu przy użyciu koniugatów mysich przeciwciał monoklonalnych: anti-rat CD4 FITC (E-bioscience, nr kat. 11-0040-85), anti-rat CD25 PE (E-bioscience, nr kat. 12-0390-82), i Anti-Mouse/Rat Foxp3 Alexa Fluor 647 (E-bioscience, nr kat. 51-5773-82). Komórki analizowano przy użyciu cytometru przepływowego FACScan i oprogramowania CELLQUEST (Becton Dickinson). Izolacja RNA i RT-PCR. Z limfocytów śledzionowych izolowano całkowite mRNA na kolumnach Qiagen Rneasy Mini Kit (Qiagen, nr kat. 74104). RNA przepisano na cDNA na drodze reakcji RT-PCR z wykorzystaniem High Capacity cDNA RT Kit (Applied Biosystems, nr kat. 4368814). Real-time PCR. Ilościowy real-time PCR wykonano z użyciem SYBR Green I (Applied Biosystems, nr kat. 4385616) i genu referencyjnego gapdh. Zestawy starterów dla genów foxp3, jak1, stat1 i gapdh przedstawiono w tabeli nr.1. Reakcja była prowadzona według programu: A) początkowa 433 Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn denaturacja 95 °C/1:30 min, B) denaturacja 95 °C/3 sekundy, C) Przyłączanie 60 °C/:30 min. Etapy B i C przeprowadzono w 40 cyklach. Po etapie detekcji przyrostu produktu przeprowadzono etap sprawdzajacy przyrost specyficznego produktu na krzywej topnienia. Reakcję prowadzono w aparacie Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System. Analizę wyników według metodyki Livaka wykonano w Applied Biosystems 7300 Real Time PCR System SDS Version 1.4 Patch 2. WYNIKI I DYSKUSJA U zwierząt immunizowanych kolegenem bydlęcym typu II (CII) rozwinęło się modelowe CIA, natomiast szczury immunizowane IFA z dodatkiem 0,01M CH3COOH nie wykazywały objawów choroby. Detekcja przeciwciał anty-CII w surowicy testem ELISA (Rys. 1) wykazała obecność tych przeciwciał tylko u szczurów, którym podawano IFA+CII a różnice pomiędzy poszczególnymi grupami L1, L2 i L3 są nieistotne statystycznie. Lp Gen Primer forward Primer reverse 1 foxp3 ATGGGAGTTGCTGTTGAAGTCA CCGAGGGCCCACTAAAGG 2 jak1 GAGCCAGCTCTACTCTGCAC CCTCGAAGACCTTCTCACAA 3 stat1 CATCCCAGTCTCTGTGCTGA AGCAGCCACACTCAGGTTCT 4 gapdh TCACCATTGTTGCAGAGAGC CGATCGGATAACACCTGCTT Tab. 1. Primery zastosowane w metodzie real-time PCR Z wyizolowanych śledzion od wszystkich zwierząt wyizolowano limfocyty, które poddano barwieniu zewnątrzkomórkowych markerów CD4+CD25+ i wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego Foxp3. Komórki T regulatorowe były obecne u wszytskich badanych zwierząt i nieznacznie różniły się liczbą (Rys. 3) pomiędzy badanymi podgrupami właściwą i kontrolną w każdej z grup badawczych (L1,L2 i L3). U zwierząt immunizowanych IFA+CII liczba komórek T regulatorowych była zawsze wyraźnie wyższa niż u zwierząt kontrolnych. Dynamika liczby komórek T regulatorowych w trakcie rozwoju CIA wykazuje wyraźną tendencję wzrostową co pomimo niestotnej statystycznie korelacji wydaje się być spowodowane niską liczbą osobników uczestniczących w doświadczeniu. Ekspresję genów foxp3, jak1 i stat1 badano metodą real-time PCR wobec genu referencyjnego gapdh. Przedstawione na Rys. 4 wyniki ekspresji genów pokazują, że ekspresja badanych genów w każdym przypadku jest wyższa u zwierząt immunizowanych IFA+CII niż u zwierząt kontrolnych. 434 Dynamika ekspresji genów FOXP3, JAK1, STAT1... Uzyskane wyniki pomimo braku istotnych statystycznie różnic w korelacji czasu i ekspresji genów (przyczyną nieodrzucenia hipotezy o braku korelacji w populacjach nawet w przypadku wysokich wartości współczynników korelacji w próbach wydają się być małe liczebności prób) pokazują zróżnicowaną dynamikę ekspresji genów foxp3, jak1, stat1 w trakcie rozwoju CIA u szczurów. Rys. 1. Dynamika przeciwciał anty-CII u szczurów z CIA. Przeciwciała anty-CII nie były obecne u zwierząt immunizowanych IAF+0,01M CH3COOH, natomiast zwierzęta, które były immunizowane IFA+CII w każdej grupie czasowej zidentyfikowano podobną ilość przeciwciał anty-CII W przypadku RZS obserwowana zarówno zwiększoną jak i zmniejszoną frekwencję Treg [Miyara i wsp., 2011]. Nasze obserwacje wskazują, że indukowana odpowiedź wobec antygenów tkankowo swoistych może polaryzować obwodową odpowiedź odpornościową w kierunku Treg, na co wskazuje wzrost liczby Treg u badanych zwierząt. Chociaż, jak wskazuje przyrost liczby komórek Treg w grupie kontrolnej w przebiegu immunizacji samym adiuwantem, charakter czynnika indukującego ekspansję komórek Treg jest niejasny. Wzrost ekspresji foxp3 w trakcie rozwoju CIA może być skorelowany ze wzrostem liczby komórek Treg. Rola białek STAT w początkowym okresie patogenezy reumatoidalnego zapalenia stawów nadal jest niejasna. Zarówno w danych literaturowych jak i w przeprowadzonych badaniach dowiedziono, że ekspresja genu stat1 ulega skokowemu wzrostowi przy pełnoobjawowym CIA. Analogicznie jak badaniach Sokalskej−Jurkiewicz, uzyskane wyniki pokazują, że ekspresja tego genu jest wyższa w grupie doświadczalnej niż w kontrolnej, co może świadczyć o istotnej roli tego białka w patogenezie CIA [Sokalska−Jurkiewicz i wsp. 2008]. Aktywacja szlaku białek JAK / STAT jest ściśle uzależniona od obecności cytokin, które wiążąc się z odpowiadającymi im receptorami wywołują kaskadę reakcji zmieniającą potencjał transkrypcyjny komórki [Kisseleva i wsp., 435 Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn 2002]. Na obecnym etapie prowadzonych badań nie jest możliwe bezpośrednie zweryfikowanie tych danych, niemniej jednak, bazując na uzyskanych wynikach udało się wykazać tendencję wzrostową w dynamice ekspresji genu jak1, co pośrednio wskazuje na zwiększoną aktywność cytokin w śledzionie u zwierząt w trakcie rozwoju CIA. Rys. 2. Przyrost liczby komórek T regulatorowych w trakcie rozwoju CIA u szczurów. Liczba komórek wzrasta w kolejnych tygodniach od immunizacji IFA+CII lub IFA+0,01M CH3COOH Analiza statystyczna wyników polegała na wyznaczeniu parametrów linii regresji oraz obliczenia współczynnika korelacji Persona dla prób, w których zmiennymi były czas i ekspresja genów. Następnie przeprowadzono test istotności statystycznej współczynnika korelacji na poziomie istotności 5% [Aczel, 2006]. We wszystkich przypadkach nie zdołano odrzucić hipotezy zerowej o braku korelacji między zmiennymi w populacjach, z których pochodzą próby. Rys. 3. Dynamika ekspresji genów foxp3,jak1 i stat1 w trakcie rozwoju CIA u szczurów Wistar. Analiza wyników metoda Livaka wykazała wyższą ekspresję badanych genów u zwierząt immunizowanych IFA+CII niż u zwierząt kontrolnych 436 Dynamika ekspresji genów FOXP3, JAK1, STAT1... Nawet w przypadku, gdy współczynnik korelacji w próbie wyniósł R=0,99464 (typowo, przekroczenie progu 0,9 przez wartość bezwzględną z R uznawane jest za przejaw silnej korelacji między zmiennymi), test nie pozwolił na przyjęcie hipotezy alternatywnej o istotnej statystycznie korelacji w populacji na poziomie istotności 5%. Powodem tego stanu rzeczy jest mała liczebność prób, co skutkuje niewielką liczbą stopni swobody układu (w krańcowym przypadku otrzymywano układ o jednym stopniu swobody), a w konsekwencji wysokimi wartościami krytycznymi testu t-Studenta. WNIOSKI • Ekspresja foxp3 wyraźnie wzrasta u szczurów, które były immunizowane IAF+CII. Liczba komórek CD4+CD25+FOXP3+ zmienia się wraz z rozwojem modelowego schorzenia z autoagresji - CIA. Jednakże podaż samego niekompletnego adiuwantu Freunda zwiększa liczbę śledzionowych limfocytów Treg. • Liniowa dynamika ekspresji jak i gwałtowny wzrost liczby transkryptomów stat1 wydaje sie być skorelowana z rozwojem stanu zapalnego. LITERATURA Aczel A. 2006. Statystyka w zarządzaniu. Pełny wykład. Wydawnictwo Naukowe PWN Balcer N. Bednarek A. 2009. Leki biologiczne stosowane w reumatologii– część 1. Farmacja Współczesna. 2: 156-164 Kisseleva T., Bhattacharya S., Braunstein J., Schindler C.W. 2002. Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 285; 1-24. Łukomski M. Starska K. 2008. Regulacja różnicowania i proliferacji komórek immunokompetentnych, wydzielania cytokin i czynników wzrostu w przebiegu choroby nowotworowej oraz hamowania karcynogenezy i wzrostu guza w mechanizmie aktywacji rodziny cząsteczek SOCS/CIS. Postępy Biologii Komórki, 35: 485-498 Marcińska K. Szczepanik M. 2010. Mechanizmy regulacji odpowiedzi immunologicznej w modelu zwierzęcym reumatoidalnego zapalenia stawów u myszy (CIA). Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 64: 372-385 Maslanka T. 2010. Komórki regulatorowe z populacji limfocytów CD4+. Medycyna wet., 66(12); 827-832 437 Isaura Zaleska, Marta Wawrzyszyn Miyara M., Gorochov G., Ehrenstein M., Musset L., Sacaguchi S., Amoura Z.2011 Human FoxP3+ regulatory T cells in systemie autoimmune diseases. ��������� Autoimmunity Revews, 10, 744-755 Myśliwska J. Ryba M. 2010. Limfocyty T CD4+CD25+Foxp3+: naturalnie występujące limfocyty T regulatorowe. Pediatric Endocrinology, Diabetes and Metabolism, 16: 289-294 Sakaguchi S., Tomoyuki Yamaguchi T., Takashi Nomura T., and Masahiro Ono www. cell.com/abstract/S0092-8674(08)00624 -7 - aff1 M. 2008. Regulatory T Cells and Immune Tolerance. Cell, Volume 133, Issue 5, 775-787 Sokalska−Jurkiewicz M., Madej M., Nowak B., Czarny A., Zaczyńska E., Wiland P. 2008. Activation of STAT−1, −3, and − 6 Proteins in Early ArthritisAdv Clin Exp Med 17, 4, 399–404 Świst K., Elżbieta Pajtasz-Piasecka E. 2011. Wpływ czynników transkrypcyjnych na różnicowanie limfocytów T CD4+. Postepy Hig Med Dosw (online), 2011; 65: 414-426 Wincewicz A. i in. 2005. Udział białek STAT w patogenezie chorób autoimmunologicznych. Advances in Clinical and Experimental Medicine, 14: 785-790 Adres do korespondencji: mgr inż. Isaura Zaleska, inż. Marta Wawrzyszyn Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. Norwida 31, 50-375 Wrocław e-mail: [email protected], [email protected] Opiekun naukowy: dr hab. Anna Chełmońska-Soyta, prof. nadzw. UP 438