Charakterystyka hodowlana stada szczurów LEW tl/tl

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
w Warszawie
Wydział Nauk o Zwierzętach
Anna Kosowska
Charakterystyka hodowlana
stada szczurów LEW tl/tl –
zwierzęcego modelu osteopetrozy
Praca dyplomowa na kierunku
„Zwierzęta laboratoryjne – hodowla, utrzymanie i użytkowanie”
Praca wykonana pod kierunkiem
Dr inż. Marty Gajewskiej
Warszawa, 2 lipca 2016r.
1
SPIS TREŚCI
1. WSTĘP'''''''''''''.'.''str. 3
a. HODOWLA ''''''''.''.....str. 4
b. UTRZYMANIE ZWIERZĄT''....''.str. 5
c. ROZRÓD ''''''''''.''.str. 7
2. CEL PRACY ''''''''''''''.str. 9
3. MATERIAŁY I METODY '''''..'.''.str. 9
4. WYNIKI I DYSKUSJA '''''''..''.str. 11
a. WYNIKI ROZRODU''''..''.'.str. 11
b. PORÓWNANIE RECESYWNYCH HOMOZYGOT Z
RODZEŃSTWEM'''''''''str. 13
c. ANALIZA GENETYCZNA''''...'str. 20
5. DYSKUSJA - MODEL SZCZURZEJ OSTEOPETROZY. ZNACZENIE
ZACHOWANIA MUTACJI'..'''''''.str. 21
6. WNIOSKI'''''''''''''''..str. 24
7. PIŚMIENNICTWO..''''''''.'''str. 26
2
1. Wstęp
Zwierzęta laboratoryjne stanowią modele szeregu chorób człowieka, wśród
nich wielu chorób rzadkich, czyli występujących z częstością mniejszą niż 1 na 1000
urodzeń. W
celu analizy
patogenezy,
zapobiegania
lub
leczenia
choroby
wykorzystuje się fakt, że podstawowe procesy biologiczne są podobne u różnych
gatunków, więc jest możliwe ich porównanie. Jedną z takich chorób rzadkich jest
osteopetroza - uwarunkowana genetycznie choroba kośćca. W chorobie tej dochodzi
do zaburzenia ilości i jakości materiału tkanki kostnej, co powoduje zmniejszoną
wytrzymałość kości i jest przyczyną złamań.
Ważną rolę w utrzymaniu prawidłowego metabolizmu tkanki kostnej ma
odpowiedni
stosunek
kościogubnych
komórek
(osteoklastów).
kościotwórczych
W
sposób
(osteoblastów)
cykliczny
zachodzi
do
komórek
wewnętrzna
przebudowa tkanki kostnej, u człowieka dorosłego około 10 % masy kostnej jest
wymienione w ciągu roku ( Manolagas i wsp. 2000). Kość taka cechuje się
zmniejszoną objętością jamy szpikowej. Zredukowana ilość szpiku powoduję, że jest
zmniejszona produkcja elementów morfotycznych krwi. Ograniczona jest również
przestrzeń dla przebiegających przez kość nerwów i naczyń krwionośnych. W
przebiegu osteopetrozy wszystkie kości są dotknięte chorobą, jednak, jak wykazują
badania radiologiczne, nasilenie zmian nie jest równomierne - niektóre kości
wykazują większą gęstość od pozostałych.
Właściwy model zwierzęcy powinno cechować podobieństwo do schorzenia
występującego u ludzi, umożliwiając badanie etiologii oraz możliwości leczenia.
Szczurzy model osteopetrozy „toothless” tl/tl wywołany jest spontaniczną recesywną
mutacją autosomalną, która powoduje znaczne obniżenie jakości tkanki kostnej. U
zwierząt dotkniętych tym defektem stwierdza się znaczny niedobór osteoklastów,
któremu towarzyszy niedobór makrofagów otrzewnowych. Osteopetrotyczne szczury
mają dużo gorszy metabolizm w stosunku do rodzeństwa. Wyraża się to poprzez
gorsze przyswajanie pokarmu, słabszą odporność organizmu. Dodatkowo ich
zdolność termoregulacji jest słaba, gdy nie są ogrzewane przez rodzeństwo to
marzną. Ich cechą charakterystyczną jest to, że są dużo mniejsze niż rówieśnicy i
często nie dożywają roku. Charakterystyczne jest dla nich również obniżenie
3
odporności i bezpłodność. Jedną z najbardziej typowych cech mutantów (której
zawdzięczają one swoją nazwę) jest brak zębów (toothless) (ryc.1).
Ryc. 1. Homozygota w wieku 16 dni. Widoczny brak zębów
Hodowla
Stado szczurów tl/tl utrzymywane jest od 1992 roku w Zwierzętarni Katedry i
Zakładu Histologii i Embriologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Zwierzęta
pochodziły z Uniwersytetu Medycznego w Massachusetts USA. Mutacja ta wystąpiła
spontanicznie w ośrodku, z którego pochodziły.
Obecnie prowadzenie hodowli szczurów LEW tl/tl ma na celu utrzymanie
zmienności w obrębie stada niekrewniaczego, przy jednoczesnym zachowaniu tej
cennej mutacji. Hodowla opiera się na właściwej selekcji oraz odpowiednim doborze
do kojarzeń. Planowane kojarzenia mają wskazać zwierzętach homozygotyczne, a
jednocześnie muszą być prowadzone w taki sposób, by zapobiegać wzrostowi
inbredu.
4
Szczury tl/tl są niezwykle rzadkimi i trudnymi do hodowli zwierzętami.
Trudności w hodowli wynikają ze specyfiki tego stada. Genotyp jakiego poszukujemy
to homozygoty recesywne, jednak są one bezpłodne, z tego powodu do kojarzenia
używa się płodne heterozygoty, posiadające gen recesywny. Zasadniczym
problemem powstającym podczas planowania kojarzeń i wyboru zwierząt do dalszej
hodowli jest to, że zwierzęta te nie są genotypowane, a obecność genu recesywnego
u heterozygot, nie ujawnia się fenotypowo w żaden sposób. Przydatność zwierząt do
dalszej hodowli i ocena czy posiadają gen recesywny odbywa się dopiero na
podstawie analizy urodzonego potomstwa. Samicę użytkuję się przeważnie tylko raz,
więc kojarzy się prawie wszystkie urodzone samice. Samce wybierane do dalszego
użytkowania pochodzą z miotów, w których urodziła się przynajmniej jedna
recesywna homozygota.. Po kilkukrotnym skojarzeniu samca, jeśli nie da potomstwa,
w którym urodzi się recesywna homozygota, wykreśla się go z użytkowania. Do
dalszych kojarzeń zostawia się samce dające mutanty. Trudne jest tu stosowanie
typowych metod kojarzeń z unikaniem pokrewieństwa (np. systemu hanowerskiego),
ponieważ z jednej strony chcemy zapobiec wzrostowi homozygotyczności a z drugiej
staramy się uzyskać jak najwięcej homozygot recesywnych. Zdarza się, że w celu
zachowania
opisywanej
mutacji
niezbędne
jest
zastosowanie
kojarzenia
krewniaczego. Kolejną specyfiką jest poligamiczność hodowli. Prowadzenie hodowli
monogamicznej
znacznie
wydłużyłoby
czas
oczekiwania
na
recesywne
homozygotyczne potomstwo. Dodatkowo zwiększyłby się czas sprawdzania
nosicielstwa pojedynczego samca, co w konsekwencji, mogłoby doprowadzić do
zestarzenia się zwierząt i zatrzymania rozrodu. Szczury tl/tl utrzymuje się w zatem
systemie
kojarzeń haremowych, gdzie do dwóch, trzech samic dokładany jest
samiec. Ciąża trwa 21 dni. Zwierzęta ze stada tl/tl są bardzo wrażliwe na stres,
Obecność samca podczas i po porodzie jest elementem stresującym, co mogłoby
skutkować zagryzieniem młodych. Aby nie niepokoić samicy przed porodem około 14
dnia ciąży samica jest umieszczana w indywidualnej klatce.
Utrzymanie zwierząt
Stado utrzymywane jest w warunkach konwencjonalnych, w pomieszczeniach
z klimatyzacją, regulowaną dobą świetlną (12h/12h) oraz regulowaną temperaturą
22-240C . Warunki utrzymania są wystandaryzowane, co zapewnia ujednolicenie
5
zdrowotne. Wszystkie zwierzęta w zwierzętarni podlegają okresowej kontroli zdrowia.
Ocena bakteriologiczna i parazytologiczna jest prowadzona zgodnie z wytycznymi
zalecanymi dla zwierząt laboratoryjnych i jest wykonywana przez Instytut Onkologii w
Warszawie. Zwierzęta są sprawdzane na obecność bakterii (Mycoplasma sp.,
sp.,
Salmonella
Yersinia
pseudotuberculosis,
Bordetella
bronchiseptica,
Corynobacterium murium Kutscheri, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa,
Klebsiella
pneumoniae,
Klebsiella
oxytoca,
Citrobacter
sp.,
Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus) oraz pasożytów (Giardia muris, Spironucleus
muris, Syphacia sp., Eimeria sp., Ectoparasites).
Ze względu na posiadaną zmianę genetyczną homozygoty tl/tl, jak wcześniej
wspomniano, są w dużo gorszej kondycji zdrowotnej niż zwierzęta bez takiej mutacji.
Znaczący wpływ na rozród i utrzymanie zwierząt w dobrej kondycji mają
warunki w jakich zwierzęta przebywają. Konieczne jest zapewnienie odpowiedniej
paszy o dobrej jakości oraz, w celu uzupełnienia braków żywieniowych wynikających
z osłabionego genami wchłaniania, odpowiednich dodatków żywieniowych. Wydaje
się na podstawie doświadczenia, że mleko dla niemowląt ma najbardziej właściwy
skład, pokrywający potrzeby żywieniowe tych zwierząt. Szczury żywione są paszą
granulowaną pełnoporcjową dla zwierząt laboratoryjnych Labofeed H. Pasza i woda
dostępne są ad libitum. Dla zwierząt bezzębnych pokarm jest specjalnie
przygotowywany. Granulki paszy są namaczane w gorącej wodzie i po ostygnięciu,
podaje się je szczurom. Ilość tak przygotowywanej paszy jest jednorazowa. Nie może
ona zostać na dłużej, ponieważ mogłaby ulec zepsuciu. Oprócz namoczonych
granulek, zwierzęta te dostają również pulpę zrobioną m.in. z mleka dla niemowląt.
Dodatkowo do karmienia zwierząt bezzębnych wykorzystuje się powstały z paszy
miał (ryc.2.).
.
Ryc. 2 Miał z paszy, którym karmione są szczury
bezzębne
6
Zwierzęta
homozygotyczne
recesywne
nie
mogą
być
utrzymywane
pojedynczo. Wiąże się to z faktem, że są mniejsze i słabsze od rówieśników i
wymagają dogrzewania przez nie. Do około 30 dnia życia utrzymuje się młode
bezzębne z matką i rodzeństwem. Po tym czasie zwierzę osteopetryczne umieszcza
się w klatce z dwójką rodzeństwa.
Rozród
Stado LEW tl/tl, podobnie jak inne szczury są zwierzętami synantropijnymi i
mogą rozmnażać przez cały rok, jednak można u nich zauważyć pewną okresowość
związaną z rytmem biologicznym. Pomimo, iż zapewniony mają właściwy cykl
świetlny - dzień/noc (12/12), to lepsze wyniki rozrodcze obserwujemy latem i na
wiosnę.
Liczba miotów roku, w których jest homozygota recesywna jest niewielka.
Samice są kojarzone. Dojrzałe, trzymiesięczne samice kojarzy się raz na dwa
miesiące, w systemie haremowym. W ciągu jednego pokolenia na trzydzieści siedem
miotów tylko w kilku (ostatnio w sześciu) jest mutant (ryc.3). Tak mała liczba
związana jest ze słabą przeżywalność tych zwierząt, a także wynika z losowego
wyboru rodziców do kojarzeń, gdzie nie mamy pewności czy użyte zwierzęta niosą
allel recesywny.
Podobnie
jak
w przypadku
innych
szczurów laboratoryjnych
samice
(heterozygotyczne i homozygoty wolne od mutacji) z tego stada osiągają dojrzałość
płciową w wieku około 8 tygodni a samce w wieku około 12 tygodni. Samice
przejawiają cykl rujowy o całkowitej długości ok. 5 dni, przy czym sama ruja trwa
niewiele ponad dobę. Do hodowli używa się samice w wieku około 12 tygodnia życia,
kiedy to uzyskać można najlepsze wyniki hodowlane. Samice są użytkowane
najczęściej raz. Kojarzenie samicy 4 – 5 miesięcznej po raz kolejny, kończy się
najczęściej niedonoszeniem ciąży lub nieodchowaniem młodych, jeśli się urodzą. Na
podstawie obserwacji stwierdzono obniżenie mleczności u matek, używanych po raz
kolejny. Samce są płodne do około roku czasu. Po tym czasie przestają interesować
się samicami, następuje u nich spadek masy ciała, obniżenie odporności, często na
łapach zaczynają się pojawiać odleżyny.
7
Na płodność i plenność tych zwierząt wydaje się w istotny sposób wpływać
mutacja, jaką w sobie noszą. Powoduje ona m.in. osłabienie wskaźników
rozrodczych (plenność, płodność). Oznacza to bardzo często problemy z
zapłodnieniem i donoszeniem ciąży przez samice heterozygotyczne. Dużym
problemem jest kanibalizm samic w stosunku do noworodków. Szczury są to
zwierzęta kierujące się instynktem i tendencją do pozostawiania jak najsilniejszego i
najlepszego
potomstwa.
Dosyć
częstym
jest
usuwanie
z
miotu
młodych,
prawdopodobnie najsłabszych. Nie ma więc pewności, czy te co rodzą się martwe
lub bardzo słabe i ulegają zjawisku kanibalizmu, nie są to recesywne homozygoty.
Wybierając zwierzęta do dalszej hodowli, bierzemy pod uwagę ich pochodzenie
(preferowane są osobniki z miotów, w których była homozygota recesywna.
Ryc. 3. Graficzne przedstawienie liczby miotów gdzie pojawiły się zwierzęta bezzębne w stosunku do
miotów gdzie nie było mutantów
brat"m"
11.10.13
408
ur.12.01.2014
6(5♀1♂) ur.
13.11.14r.
8(5♀3♂) ur.
15.06.14r.
brat"m"
11.10.14
409
ur.12.01.2014
brat"m"
11.10.15
410
ur.12.01.2014
6(5♀1♂) ur.
13.11.14r.
8(4♀3♂+1♀b
z) ur.
31.05.14r.
12(6♀6♂)
ur.30.05.14r.
brat"m"
11.10.16
syn "m"
411
412
ur.12.01.2014 ur.19.01.2014
12(7♀5♂)ur.
3.12.14r
418
ur.31.05.2014
7(3♀4♂)ur.
1.04.15r
10(5♀5♂)ur.
7.02.15r
419
ur.31.05.2014
12(7♀5♂)ur.
6.04.15r
11(7♀4♂)ur.
12.04.15r
420
ur.31.05.2014
7(6♀1♂)ur.15.
05.15r
6(3♀3♂)ur.13.
08.15r
6(3♀3♂)ur.
17.06.15r
7(2♀5♂)ur.
5.04.15r
10(7♀3♂)ur.
7.06.15r
9(4♀1♂)ur.14.
08.15r
11(5♀6♂)ur.4.
10.15r
10(3♀7♂)ur.25
.09.15r
*
syn "m"
413
ur.19.01.2014
406
415
ur.4.03.2014
5(1♀4♂)
ur.7.5.15r.
1(1♀) ur.
29.03.15r.
406
416
ur.4.03.2014
4(2♀2♂)
ur.25.10.14r.
6(1♀3♂)
ur.25.10.14r.
424
ur.18.02.2015
8(4♀4♂)
ur.26.09.15r.
9(5♀4♂)
ur.22.07.15r.
421
ur.17.01.2015
422
ur.17.01.2015
10(3♀7♂)
ur.21.06.15r.
6(2♀4♂)
ur.12.10.15r.
3(1♀2♂)
ur.20.10.15r.
11(3♀8♂)ur.13. 12(5♀6♂)ur.1
12.15r
4.08.15r
7(2♀5♂)ur.
17.01.15r
7(3♀2♂+1♀bz
1♂bz)
ur.18.02.15r.
423
ur.18.02.2015
6(1♀3♂)
ur.12.8.15r.
7(4♀1♂+1♀bz
1♂bz)
ur.13.09.15r.
8(2♀6♂)ur.14. 4(1♀1♂+2♂bz
06.15r
) ur.29.08.15r.
syn "m"
414
ur.19.01.2014
3(1♀1♂+1♀bz
1) ur.14.12.15r.
6(3♀2♂+1♂bz)
ur.15.12.15r.
Czerwony kolor oznacza mioty, w których urodziły się recesywne homozygoty.
8
2. Cel pracy
1. Ocena parametrów hodowlanych stada LEW tl/tl.
2. Ocena wybranych parametrów morfologicznych zwierząt tl/tl i ich
prawidłowego rodzeństwa.
3. Przetestowanie, czy znana mutacja w genie Csf1 (insercja 10pz) jest
odpowiedzialna za zmiany obserwowane u szczurów tl/tl.
4. Opracowanie testu pozwalającego określać genotyp zwierząt używanych
do hodowli.
3. Materiał i metody.
W celu oceany parametrów rozrodu badanych zwierząt wykorzystano dane
hodowlane szczurów LEW tl/tl z dwóch pokoleń, 90 i 91. Oceną morfologiczną objęto
7 zwierząt (4szt. homozygoty tl/tl, 3szt. zwierząt nie wykazujących objawów mutacji)
z pokoleń 90 i 91. U badanych szczurów przeanalizowany następujące cechy: masę
ciała, długość ciała, długość czaszki .
Do badań molekularnych wykorzystano zgromadzony wcześniej materiał
tkankowy pochodzący od zwierząt tl/tl (4 szt.) i zwierząt niewykazujących objawów
mutacji (3szt.). DNA wyizolowano zestawem GenomicMini (A&A Biotechnology,
Polska), zgodnie z protokołem producenta dla tkanek zwierzęcych. Startery dla
mutacji opisanej w pracy Wesenbeeck i wsp. (2002) zaprojektowano w programie
Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/) (tab.1). Startery Csf1agF i Csf1agR zostały użyte do
oceny produktu na żelu agarozowym.
9
Tab. 1. Startery użyte w badaniach.
nazwa
sekwencja 5’-3’
startera
Csf1agF
AAGGAAGCGAACGAACCAG
Csf1agR
GCCACGGTTGCAGCTTAC
długość produktu
długość produktu
tl
wt
123 pz
113 pz
Reakcję PCR przeprowadzono wg standardowych warunków opisanych
poniżej (tab.2a,2b.). Ocenę wielkości fragmentów wykonano na 4% żelu agarozowym
wysokiej rozdzielczości Metapfore (NuSieve, USA) z dodatkiem bromku etydyny.
Jako markera wielkości użyto DNA low range ladder (Fermentas, Litwa).
Tab. 2a. Reakcja PCR – skład mieszaniny reakcyjnej:
Składnik
Objętość na 1 próbkę
ReadyMix (2 x ReadyMix)
5µl
Startery (10µM)
0,1 µl x 4 (lub x 2)*
Woda
2,2 µl (lub 2,4 µl)*
DNA (80 ng/µl)
2,4 µl
Tab. 2b Reakcja PCR - profil termiczny:
Etap reakcji PCR
Temperatura
Czas
denaturacja wstępna
94°C
3 min.
denaturacja
94°C
30 s
przyłączanie starterów
55°C
30 s
wydłużanie starterów
72°C
1 min.
wydłużanie końcowe
72°C
3 min.
utrwalenie produktu
4°C
∞
cykl*
10
4. Wyniki i dyskusja:
Wyniki rozrodu
Liczebność miotów nie jest stała i nie jest cechą typowa dla stada. Samice
rodzą zarówno po 8-10 jak też po 1-2 młode. Średnia liczebność miotów, w których
pojawił się mutant wynosi około 6 szt. a w miocie bez homozygoty recesywnej około
8 szt (tab.3). W hodowli dąży się do wyeliminowania samic rodzących mała liczbę
młodych.
Szczury
„bezzębne”
muszą
pozostawać
stale
w
towarzystwie
heterozygotycznego rodzeństwa. W przypadku, gdy urodzi się mała liczba młodych w
miocie, rodzeństwo, u którego nie ujawniła się mutacja a może być nosicielem
recesywnego allelu, nie zostanie użyte do dalszej hodowli.
Tab. 3.Porównanie liczebności miotów
Liczba zwierząt w
miocie, gdzie
urodziła się
bezzębna
homozygota
Liczba zwierząt w
miocie bez
homozygoty
recesywnej
8
7
7 4 3 6
średnia Odchylenie
standartowe
5,83
1,94
10 11 6 9 6 6 7 8 3 11 12 10 9 8,31
2,59
Przebieg postnatalnego wzrostu młodych uzależniony jest zarówno od
czynników genetycznych, jak i środowiskowych. Homozygoty tl/tl w pierwszym
okresie swojego wzrostu nie różnią się fenotypowo od rodzeństwa nie wykazującego
znamion mutacji. (Ryc.4.)
11
Ryc. 4. Rodzeństwo homo – i heterozygotyczne w wieku 16 dni
Różnice te zaczynają być widoczne w wieku około trzech tygodni, kiedy to
zaczyna zanikać laktacja u matek. Dorosłe homozygoty są nawet o połowę mniejsze
od rodzeństwa (ryc.5).
Ryc.5. dorosłe samce; osobniki mniejsze są to osteopetryczne
samce, samiec na górze – ich brat z jednego miotu
12
Porównanie recesywnych homozygot z
rodzeństwem, u którego mutacja się nie ujawnia
Cechy homozygoty recesywnej
• Obfite porfiryny przy oczach
• Mniejsza masa ciała w stosunku do rodzeństwa
• Wyraźnie mniejsze od rodzeństwa
• Wolniejsze ruchy
• Nastroszona, dosyć rzadka (brzydka) sierść,
• Mniej odporne
• Brak zębów
Zwierzęta osteopetrotyczne cechuje mniejsza masa ciała. Potwierdza to analiza
wskaźników morfologicznych. Średnia masa ciała zwierząt osteopetrycznych wynosi
174,5 g natomiast zwierząt bez upośledzonego fenotypu to aż 400,67 g. W
przypadku miotów gdzie jest więcej niż jedna homozygota recesywna, różnice są
również między tymi osobnikami. Różnice te przedstawiają wykresy (wyk. 1, wyk. 2,
wyk. 3)
Objaśnienia:
BZ – zwierzę bezzębne, osteopetrotyczne
NORM – zwierzę nie wykazujące objawów mutacji
dł. ciała - mierzona od nosa do nasady ogona
długość czaszki – mierzona od nosa do nasady uszu
13
1. miot z którego pochodziły oceniane zwierzęta:
5 szt.(3 ♀1♂ + 1 ♂ bz) ur. 15.02.2016r
Rodzeństwo; dwa samce urodzone
15.02.2016r
1 ♂ bz. ur. 15.02.2016r (pomiar wykonany w wieku trzech miesięcy):
• Masa ciała – 152g
• Długość ciała – 16 cm
• Długość ogona – 14 cm
• Długość czaszki – 3 cm
1 ♂ ur. 15.02.2016r (pomiar wykonany w wieku trzech miesięcy):
•
Masa ciała – 398g
•
Długość ciała – 22 cm
•
Długość ogona – 16 cm
•
Długość czaszki – 5 cm
2. miot z którego pochodziły oceniane zwierzęta:
5szt.( 3♀1♂ + 1 ♀ bz) ur. 14.12.2015r
14
Rodzeństwo; samice urodzone
14.12.2015r.
1 ♀ bz. ur. 14.12.2015r (pomiar wykonany w wieku pięciu miesięcy):
•
Masa ciała – 176g
•
Długość ciała – 16 cm
•
Długość ogona – 14 cm
•
Długość czaszki – 4 cm
1 ♀. ur. 14.12.2015r (pomiar wykonany w wieku pięciu miesięcy):
•
Masa ciała – 276g
•
Długość ciała – 21 cm
•
Długość ogona – 19 cm
•
Długość czaszki – 5 cm
15
3. miot z którego pochodziły oceniane zwierzęta:
4 szt.(1 ♀1♂ + 2 ♂ bz) ur. 29.08.2015r
Rodzeństwo; samce urodzone
29.08.2015r
1 ♂ bz. ur. 29.08.2015r (pomiar wykonany w wieku dziewięciu miesięcy):
•
Masa ciała – 144g
•
Długość ciała – 14 cm
•
Długość ogona – 12 cm
•
Długość czaszki – 4 cm
1 ♂ bz. ur. 29.08.2015r (pomiar wykonany w wieku dziewięciu miesięcy):
•
Masa ciała – 226g
•
Długość ciała – 17 cm
•
Długość ogona – 13 cm
•
Długość czaszki – 4 cm
1 ♂ ur. 29.08.2015r (pomiar wykonany w wieku dziewięciu miesięcy):
•
Masa ciała – 528g
•
Długość ciała – 23 cm
•
Długość ogona – 20 cm
•
Długość czaszki – 5,5 cm
16
Tab.4. Porównanie mas ocenianych zwierząt.
Masa ciała BZ
Masa ciała
NORM
152
398
176
276
144
528
226
ŚREDNIA
174,50
400,67
ODCHYLENIE
36,93
126,02
STANDARDOWE
Wyk. 1 Porównanie masy ciała zwierząt osteopetrycznych i ich rodzeństwa
17
Tab. 5. Porównanie długości ciał ocenianych zwierząt
Długość ciała BZ
Długość ciała NORM
16
22
16
21
14
23
17
ŚREDNIA
ODCHYLENIE
15,75
22,00
1,26
1,00
STANDARDOWE
Wyk. 2 Porównanie długości ciała zwierząt osteopetrycznych i ich
rodzeństwa
18
Tab. 6. Porównanie długości czaszki ocenianych zwierząt
Długość czaszki BZ
Długość czaszki NORM
3
5
4
5
4
5,5
4
0
ŚREDNIA
3,75
3,88
ODCHYLENIE
0,50
2,59
STANDARDOWE
Wyk. 3 Porównanie długości czaszki zwierząt osteopetrycznych i
ich rodzeństwa
19
Analiza genetyczna
Przeprowadzone testy wykazały u badanych zwierząt obecność mutacji
opisywanej wcześniej przez Wesenbeeck i wsp. (2002) (Ryc. 5). Zastosowanie pary
starterów Csf1agF i Csf1agR pozwala na zaproponowanie prostego testu,
umożliwiającego genotypowanie zwierząt przed włączeniem ich do hodowli. Jak
widać na załączonym zdjęciu możliwe jest jednoznaczne określenie genotypu
zwierzęcia i na tej podstawie wybranie do hodowli zwierząt heterozygotycznych.
Ryc. 5. Wyniki przeprowadzonych testów za pomocą techniki PCR
Objaśnienia skrótów:
tl - mutanty,
wt - osobniki wolne od mutacji,
het - heterozygota,
M -marker wielkości
20
Dyskusja
5. Model szczurzej osteopetrozy – znaczenie
zachowania mutacji tl/tl
Prowadzenie badań nad osteopetrozą bez udziału zwierząt byłoby praktycznie
niemożliwe. Badań nad szczurzym modelem osteopetrozy oraz możliwościami jej
leczenia podjął się m. in. Prof. Wojtowicz. W cyklu swoich wieloletnich badań opisał
fenotyp szczegółowo stwierdzany u szczurów tl/tl. Celem jego badań było znalezienie
przyczyn zahamowanej resorpcji tkanki kostnej. Profesor Wojtowicz i inni badacze
wykazali, że na proces resorpcji i kościotworzenia wpływają różne czynniki, m.in.
hormony i cytokiny. Tworzą one stymulatory i inhibitory resorpcji kościotworzenia.
Czynnikami stymulującymi resorpcję kości jest m.in. aktywna witamina D3- 1,25(OH)
2D3, cytokiny hematopoetyczne, będące czynnikami wzrostowymi (M-CSF) oraz
RANKL-ligand RANK. Głównym inhibitorem resorpcji kości są osteoprotegryna
(OPG), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), kalcytonina i estrogeny.
Osteoklasty powstają z jednojądrowych komórek prekursorowych. Różnicowanie się
prekursorów osteoklastów jest możliwe pod wpływem cytokiny M-CSF (ang.
Macrophage colony stimulating factor)- czynnik stymulujący powstawanie kolonii
komórkowych linii monocyt-makrofag. (ryc. 6.)
Ryc. 6. Proces dojrzewania osteoblastu.
Stwierdzony u osteopetrycznych mutantów szczurzych niedobór MCSF,
stworzył nowe możliwości terapeutyczne osteopetrozy, to właśnie badaniom na tym
21
modelu zwierzęcym można przypisać pojawienie się nowych metod leczenia.
Wykazano, że osteopetroza może być wynikiem deficytu w genie CSF-1. Powoduje
to, że kości mutantów tl/tl są znacząco zmienione. Ponadto podawanie egzogennego
MCSF spowodowało znaczną poprawę parametrów u mutantów. U młodych zwierząt
nastąpiło przyspieszenie wzrostu masy ciała i wzrostu kości długich, poprawiła się
morfologia nasady kości poprzez zwiększenie resorpcji kości, nastąpiło zwiększenie
objętości szpiku kostnego. Wykazano również, że zawartość minerałów w kościach
długich u młodych tl/tl mutantów nie było znacząco różne od heterozygotycznego
rodzeństwa, natomiast krystalizacja minerałów w kości była słabsza w porównaniu z
kontrolą (Marks i wsp. 1992)
W innym badaniu prowadzonym na szczurach toothless stwierdzono, że
mutacja powoduje znaczne zahamowanie resorpcji kości ma skutek dużego deficytu
osteoklastów i ich prekursorów. Badanie wykazało, że przebudowa kości jest mocno
obniżona. Terapeutyczne dla tego schorzenia okazało się, podobnie jak w
poprzednim badaniu, podawanie czynnika CSF-1. Powoduje to przywrócenie
aktywności kościotwórczej (Wojtowicz i wsp. 1997)
Działanie
czynnika
CSF-1
zostało
potwierdzone
w
innym
badaniu
przeprowadzonym na szczurach z łagodniejszą formą mutacji (mib/mib). Podawanie
CSF-1 spowodowało poprawę procesów przebudowy kości, nastąpiła normalizacja
liczby osteoklastów oraz ich funkcjonowania.( Wojtowicz i wsp. 1998)
Badania prowadzone na szczurzych mutantach w innym ośrodku, zdają się
potwierdzać uzyskane wyniki. Zmapowano i zsekwencjonowao gen niosący mutację
tl/tl.
Wykazano
tu
korzystny
wpływ
podawania
MCSF.
Poprawie
ulegają
obserwowane zmiany fenotypowe. Najbardziej podatne na poprawę są makrofagi
otrzewnowe i populacje osteoklastów trzonu i nasady kości. Dowiedziono
jednocześnie, że MCSF jest czynnikiem niezbędnym również w czasie rozwoju płodu
Podawanie tego czynnika po porodzie daje mniejsze korzyści od oczekiwanych (Van
Wesenbeeck i wsp.2002).
Kluczowa rola MCSF w utrzymaniu prawidłowej homeostazy kości u szczurów
tl/tl podkreślają jest w innym badaniu (Dobbins i wsp. 2002). Uważa się, że w mutacji
tej białko Csf1 jest skrócone i nie może osiągnąć biologicznej aktywności. Zaburzenia
homeostazy spowodowanej nieprawidłowym działaniem białka nie można odwrócić
22
wykonując przeszczepy szpiku kostnego od zdrowego rodzeństwa. Mutacja
szczurów tl/tl została zmapowana i poprzez porównanie tego regionu
z
homologicznym regionem mysim i ludzkim, stwierdzono, że jest to ta część genomu
w której znajduje się gen odpowiadający odpowiada za kodowanie białka Csf1.
Wyniki pokazały, że osteopetroza u szczurów tl/tl jest efektem 10-nukleotydowej
insercji sekwencji kodującej genu Csf1.
Zaproponowany w niniejszej pracy test genetyczny pozwoli na precyzyjniejszy
dobór zwierząt do kojarzeń, przy jednoczesnym zachowaniu zmienności genetycznej
(unikanie kojarzeń krewniaczych). Pozwoli również na ograniczenie namnażania
zwierząt, poprzez zmniejszenie liczby klatek hodowlanych niezbędnych do
utrzymania mutacji w hodowanym stadzie. Będzie to praktyczne wdrożenie zasady
3R do hodowli tej grupy zwierząt.
23
6. Wnioski
1. Przeprowadzona analiza wykazała, ze wskaźniki rozrodcze takie jak
dojrzałość płciowa i hodowlana w stadzie LEW tl/tl jest podobna jak u
innych szczurów laboratoryjnych. To, co je wyróżnia to zdecydowanie
przydatność do dalszej hodowli. Samice w stadzie LEW tl/tl użytkuje się
znacznie krócej w porównaniu do innych grup szczurów hodowanych w
naszej jednostce.
2. Badania wykazały, że średnia wielkości miotów, w których jest bezzębna
homozygota w porównaniu do miotów gdzie nie było mutanta jest podobna
i nie różni się znacząco od innych szczurów utrzymywanych w
laboratoriach.
3. Przedstawiona analiza morfologiczna stada LEW tl/tl wykazała, że szczury
tl/tl w porównaniu do zdrowego rodzeństwa wykazują znacząco mniejszą
masę ciała, długość ciała oraz długość czaszki.
4. Przeprowadzona analiza genetyczna wykazała obecność mutacji w genie
Csf1. Obecność mutacji w układzie homozygotycznym ujawnia się
fenotypowo m.in. poprzez zmniejszenie rozmiarów ciała, skrócenie
długości życia, brak zębów oraz powoduje bezpłodność.
5. W przeprowadzonym badaniu użycie odpowiednich starterów pozwoliło na
wprowadzenie testu pozwalającego określić genotyp zwierząt. Losowy
dobór zwierząt do dalszej hodowli znacznie zwiększa liczbę osobników
niezbędnych do utrzymania tej cennej mutacji. Zastosowanie testu
umożliwiającego genotypowanie pozwoli znacznie ograniczyć tę liczbę.
24
Piśmiennictwo
David E Dobbinsa, Raman Soodb, Akira Hashiramotoc, Carl T Hansend, Ronald L Wildere,
Elaine F Remmers (2002): Mutation of macrophage colony stimulating factor (Csf1) causes
osteopetrosis in the tl rat. Biochem Biophys Res Commun.;294(5):1114-20.
S.C.Manolagas (2000): Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and
implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocr Rev;21(2):115-37
Liesbeth Van Wesenbeeck, Paul R. Odgren, Carole A. MacKay, Marina D'Angelo, Fayez F.
Safadi,Steven N. Popoff, Wim Van Hul*, Sandy C. Marks, Jr.(2002):The osteopetrotic mutation
toothless (tl) is a loss-of-function frameshift mutation in the rat Csf1 gene: Evidence of a crucial role
for CSF-1 in osteoclastogenesis and endochondral ossification. Proc Nat Acad Sci
USA.;99(22):14303-8.
Marks SC Jr., Wojtowicz A, Szperl M, Urbanowska E, MacKay CA, Wiktor-Jedrzejczak W,
Stanley ER, Aukerman SL (1992): Administration of colony stimulating factor-1 corrects some
macrophage, dental, and skeletal defects in an osteopetrotic mutation (toothless, tl) in the rat.
Bone;13(1):89-93
Wojtowicz, A. Dziedzic-Goclawska, A. Kaminski, W. Stachowicz, K. Wojtowicz, S.C. Marks
Jr., M. Yamauchi,(1997): Alteration of mineral crystallinity and collagen cross-linking of bones in
osteopetrotic toothless (tl/tl) rats and their improvement after treatment with colony stimulating factor1. Bone;20(2):127-32
Wojtowicz A., Yamauchi M, Sotowski R, Ostrowski K. (1998): Normalization of periodontal
tissues in osteopetrotic mib mutant rats, treated with CSF-1. J Periodontal Res.;33(8):486-90
25