Identyfikacja podłoża molekularnego rozszczepu dłoni i/lub

Anna Sowińska-Seidler
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych
za strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Identyfikacja podłoża molekularnego rozszczepu dłoni i/lub stóp w
populacji polskiej
Rozszczep dłoni i/lub stóp (SHFM – ang. split hand/foot malformation) jest poważną
wadą rozwojową prowadzącą do niepełnosprawności fizycznej i stanowiącą ogromny
dyskomfort psychiczny dla chorego. Wada ta polega na całkowitym lub częściowym braku
lub niedorozwoju palców dłoni i/lub stopy, oraz nierzadko odpowiednich kości śródręcza/
śródstopia. Częstość występowania SHFM wynosi 1 na 8500-25000 żywo urodzonych
noworodków, co stanowi ok. 8-17% wrodzonych malformacji kończyn. Wady o typie SHFM
cechują się znaczną heterogennością kliniczną i etiologiczną. Przyczynę wystąpienia
rozszczepu dłoni i/lub stóp stanowić mogą czynniki środowiskowe oraz, znacznie częściej,
czynniki genetyczne.
Pomimo znacznego postępu wiedzy przyczyna genetyczna ok. 50% wad ze
spektrum SHFM pozostaje niewyjaśniona. Celem niniejszej pracy doktorskiej była
identyfikacja przyczyny molekularnej wady o typie SHFM zarówno u pacjentów nie objętych
do tej pory poradnictwem genetycznym, jak również u tych, u których wykluczone zostały
znane zmiany molekularne odpowiadające za fenotyp rozszczepu dłoni i/lub stóp. Na
potrzeby
diagnostyki
przesiewowej
opracowano
metodologię
umożliwiającą
analizę
sekwencji/kopijności znanych genów (TP63, WNT10B, DLX5)/regionów (10q24.31-32,
17q13.3) zaangażowanych w patogenezę SHFM oraz genów kandydujących, o potencjalnym
znaczeniu patogennym.
Badaniami objęto grupę 33 pacjentów zarówno z izolowaną jak i zespołową formą
wady o spektrum SHFM, którzy włączeni zostali do badań genetycznych po uprzedniej
ocenie klinicznej przeprowadzonej przez lekarza genetyka specjalizującego się w
diagnostyce klinicznej i molekularnej wrodzonych wad kończyn. U 15 pacjentów, u których
nie wykonywano do tej pory badań molekularnych podjęto próbę identyfikacji częstych w tej
chorobie zmian genetycznych, w tym mutacji w genie TP63 oraz duplikacji w regionach
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
10q24.31-32 i 17p13.3. W wyniku powyższej analizy określono przyczynę wady u 2
probandów.
U
31
pacjentów
z
prawidłowym
wynikiem
badań
przesiewowych
przeprowadzono sekwencjonowanie genów WNT10B oraz DLX5 (dziedziczenie autosomalne
recesywne) a także genów kandydujących (m.in. BHLHA9). Następnie przeprowadzono
analizę wysokorozdzielczej porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy
oligonukleotydowej (aCGH). Zgodnie z ostatnimi doniesieniami literaturowymi coraz większą
rolę w patogenezie chorób genetycznych, w tym wad ze spektrum rozszczepu dłoni i/lub
stóp,
odgrywają
submikroskopowe
rearanżacje
genomowe
(mikrodelecje
lub
mikroduplikacje). Schorzenia te określa się mianem "chorób genomowych". Technika aCGH
umożliwia
identyfikację w/w zmian,
zarówno
w obrębie genów jak
i sekwencji
regulatorowych. Wyniki badania aCGH poddano analizie bioinformatycznej polegającej na
odrzuceniu wszystkich polimorficznych wariantów liczby kopii (CNV), które nie mają
znaczenia patogennego, występują z relatywnie wysoką częstotliwością w populacji i
stanowią o zmienności międzyosobniczej. Pozostałe zmiany zbadano pod kątem obecności
w ich obrębie, bądź sąsiedztwie genów mogących mieć znaczenie w rozwoju embrionalnym
kończyn. Powyższej weryfikacji dokonano korzystając z baz danych takich jak DGV, OMIM,
MGI, Eurexpress czy EMAGE. W wyniku powyższej analizy zidentyfikowano przyczynę
molekularną wady u dwóch pacjentów. U kilku pozostałych probandów wykryto nieopisane,
potencjalnie patogenne zmiany, które są aktualnie w trakcje weryfikacji.
Autorka przeprowadziła analizę sekwencjonowania eksomu (całość sekwencji
kodującej w genomie) u 10 pacjentów z prawidłowym wynikiem aCGH. W rezultacie
niniejszych badań, u jednego pacjenta udało się zidentyfikować potencjalnie patogenną
homozygotyczną mutację w genie kandydującym wykazującym wysoki poziom ekspresji w
zawiązkach kończyn u myszy, co wskazuje na jego wysoce prawdopodobne znaczenie w
etiologii SHFM. Wynik ten został potwierdzony sekwencjonowaniem metodą Sangera u
probanda, jak również w badaniach rodzinnych. U kilku pozostałych pacjentów, u których
wykonano sekwencjonowanie eksomu stwierdzono potencjalnie patogenne mutacje, które
będą poddane dalszej weryfikacji.
Poradnictwo genetyczne dla pacjentów z wrodzonymi wadami kończyn było do
niedawna niedostępne w Polsce (w tym w Wielkopolsce). Autorka realizuje założenia
niniejszej pracy doktorskiej w jedynym w kraju zespole badawczym oferującym diagnostykę
molekularną wrodzonych wad kończyn, co stanowi o innowacyjności i wysokiej wartości
poznawczej prowadzonych badań umacniając tym samym konkurencyjność regionu
wielkopolskiego. W toku realizowanej pracy doktorskiej opracowano i wdrożono do
diagnostyki
szereg
testów
genetycznych
umożliwiających
identyfikację
przyczyny
molekularnej rozszczepu dłoni i/lub stóp. Wyniki uzyskane w badaniach z wykorzystaniem
techniki mikromacierzy aCGH oraz sekwencjonowania eksomu umożliwią opracowanie
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
nowych testów genetycznych, poszerzając tym samym ofertę diagnostyczną dla pacjentów z
wrodzonymi wadami kończyn i ich rodzin. Poprawa stanu wiedzy z zakresu genetycznych
uwarunkowań SHFM umożliwi lekarzom o specjalizacji z genetyki medycznej w wiarygodny
sposób wyjaśnić pacjentom i ich krewnym przyczynę wystąpienia wady oraz tryb jej
dziedziczenia. Wyniki badań przyczynią się do umocnienia potencjału badawczorozwojowego Wielkopolski.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego