QUANTA LiteTM dsDNA

NOVA Lite® Thyroid
708350
Do diagnostyki in vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Test NOVA LiteTM tarczycy to pośredni test immunofluorescencyjny do badań przesiewowych i półilościowego
oznaczania przeciwciał mikrokosmków tarczycy i koloidowych/tyroglobuliny w surowicy ludzkiej. Obecność
przeciwciał mikrokosmkowych i/lub koloidowych może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i
innymi badaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę chorób autoimmunologicznych tarczycy.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Szeroko implikowano udział krążeniowych autoprzeciwciał tarczycy w etiologii chorób autoimmunologicznych
tarczycy i w praktyce klinicznej zarówno przeciwciała tyroglobulinowe oraz mikrokosmkowe są rutynowo
oznaczane.1,2 Autoprzeciwciała surowicy przeciwko antygenom mikrokosmkowym tarczycy powszechnie
występują u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi tarczycy i ich występowanie dobrze koreluje ze
zmianami histologicznymi w przypadku choroby Hashimoto.3 Test pośredniej immunofluorescencji przeciwciał
przeciwko antygenom mikrokosmkowym tarczycy daje wynik pozytywny u 70–90% pacjentów z przewlekłym
zapaleniem tarczycy. Te przeciwciała występują także u 64% pacjentów z pierwotną niedoczynnością
tarczycy, 50% z tyreotoksykozą, 10% z wolem prostym i 17% z guzami tarczycy4 Autoprzeciwciała
tyroglobulinowe są wykrywane w wysokich mianach głównie w przypadku autoimmunologicznego zapalenia
tarczycy (choroba Hashimoto) oraz chorobie Gravesa. Metodą immunofluorescencji autoprzeciwciała
surowicy przeciwko tyroglobulinie/kolidowi stwierdzano u 40–70% pacjentów z przewlekłym zapaleniem
tarczycy i u niewielkich odsetków pacjentów z tyreotoksykozą oraz wolami nietoksycznymi5,6 Autoprzeciwciała
tarczycowe badano klasycznie za pomocą reakcji precypitacji,7 wiązania lateksu8, hemoaglutynacji9 oraz
immunofluorescencji.10,11 Immunofluorescencja w wykrywaniu autoprzeciwciał tarczycowych okazała się
zarówno czuła oraz swoista. W odróżnieniu od powszechnie stosowanych technik hemoaglutynacji,
immunofluorescencja wykryje przeciwciała, które nie ulegają precypitacji i nie wpływa na nią negatywnie
obecność czynników hamujących aglutynację12 lub przeciwciał heterofilnych.
Zasada badania
W przypadku pośredniej techniki immunofluorescencji próbki są inkubowane z substratem antygenu, a
przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są wypłukiwane. Substrat jest inkubowany ze swoistym
absorbowanym koniugatem naczelnych znakowanym fluoresceiną, a następnie niezwiązany odczynnik jest
wypłukiwany. Próbki zawierające autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą
wykazywać jasnozieloną fluorescencyjną barwę w miejscach tkanki tarczycy, gdzie nastąpiło związanie
autoprzeciwciał.
Odczynniki
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tarczyca (tarczyca naczelnych), 8 dołków/preparat, z osuszaczem
Absorbowany koniugat naczelnych IgG przeciw-ludzkich (kozi), znakowany fluoresceiną w buforze
zawierającym błękit Evansa i 0,09% azydku sodu, 7 ml
Kontrola pozytywna tarczycy, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu oraz przeciwciała
surowicy ludzkiej przeciw tarczycy, wstępnie rozcieńczona, 0,5 ml
Systemy kontroli negatywnej IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu bez przeciwciał
surowicy ludzkiej przeciw tarczycy, wstępnie rozcieńczona, 0,5 ml
Koncentrat PBS (40x), wystarcza na 1000 ml
Środek do osadzania preparatu, 0,09% azydek sodu, 7 ml
Szkiełka nakrywkowe
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie zawierają
przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie
zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym
kontrola pozytywna tarczycy i systemy kontroli negatywnej IFA powinny być obsługiwane w taki sam
sposób jak materiał potencjalnie zakaźny.13
Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w
przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z
ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli
do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie
dopuścić do gromadzenia się azydku.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych
przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro.
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
1
3.
4.
5.
6.
7.
Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi
urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w
stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest
potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w
akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, moc lampy używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania,
dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i
powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji.
Z czasem absorbowany koniugat naczelnych IgG przeciw-ludzkiej może zmienić kolor z powodu
ekspozycji na światło. Jednak zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Warunki przechowywania
1.
2.
Wszystkie zestawy odczynników przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać. Odczynniki są
trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami.
Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do
próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne
zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub
lipemicznej surowicy albo próbek.
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące
warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin.
2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli
badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w
temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze
wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
10
1
1
1
1
1
1
8-dołkowe preparaty substratu tarczycy
7 ml absorbowanego koniugatu naczelnych FITC IgG
0,5 ml kontroli pozytywnej tarczycy
0,5 ml systemu kontroli negatywnej IFA
25 ml koncentratu PBS (40x)
7 ml środku do osadzania preparatu
10 szkiełek nakrywkowych
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety o pojemności 15-1000 µL
Woda destylowana lub dejonizowana
Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura
Komora wilgotna
Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS)
Barwiacz Coplina
Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20 - 26oC) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat PBS: WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodając
zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie
wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do płukania.
Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°;C.
Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta:
a.
Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku 1:10
rozcieńczonym buforem PBS (tj. dodać 100 µL surowicy do 900µL buforu PBS).
b.
Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbek
pozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforu PBS
(tj. 1:20, 1:40... 1:2560).
Procedura badania
1.
Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć
temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1
kroplę (70–90 µL) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2. Do
pozostałych dołków dodać 1 kroplę (70–90µL) rozcieńczonych próbek pochodzących od pacjenta.
2
2.
3.
4.
5.
6.
Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 + 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik
papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni
odpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania.
Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby delikatnie
przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumień bufora PBS w taki
sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać kierowania strumienia
bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu. Jeśli jest to wymagane,
można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z rozcieńczonym buforem PBS.
Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat z
powrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu
fluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe 30 ±5 minut.
Wypłukać preparaty: Powtórzyć punkt 3.
Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od
laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura:
a.
Umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.
b.
Nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka
nakrywkowego.
c.
Strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka
nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby
środek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez formowania
pęcherzyków powietrza.
Kontrola jakości
Kontrola pozytywna tarczycy i system kontroli negatywnej IFA powinny być oznaczane dla każdego preparatu,
aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działają prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice
kontrolne można przygotować dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze <
-70oC. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe
kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako
nieważne i badanie powinno zostać powtórzone.
1.
Kontrola pozytywna tarczycy musi być >3+.
2.
System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny.
Interpretacja wyników
Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie cytoplazmy komórek
nabłonkowych (mikrokosmków) lub koloidu (tyroglobuliny) jest równe lub mniejsze niż systemu kontroli
negatywnej IFA.
Reakcja pozytywna wobec przeciwciał mikrokosmkowych. Ta reakcja manifestuje się jako barwienie
fluorescencyjne cytoplazmy komórek nabłonkowych. Jądro zazwyczaj jest niezabarwione.
Reakcja pozytywna wobec przeciwciał koloidu/tyroglobuliny. Ta reakcja manifestuje się jako wzór
barwienia kłaczkowatego lub „szlifowanego szkła” koloidu.
Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów:
4+
Jaskrawo jasnozielona fluorescencja
3+
Jasna jasnozielona fluorescencja
2+
Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja
1+
Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia cytoplazmy
komórek nabłonkowych (mikrokosmków) lub koloidu (tyroglobuliny) od fluorescencji tła
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Gdy w jednej próbce występuje dwa lub więcej autoprzeciwciał, może wystąpić „zjawisko interferencji”.
Charakteryzuje się ono różnymi wzorami fluorescencji przy różnych rozcieńczeniach próbki oraz
niespójnymi mianami punktu końcowego. Należy zgłosić obecność obu rodzajów przeciwciał.
Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego
mikroskopu fluorescencyjnego, moc i wiek lampy, stosowane powiększenie, system filtrów oraz
badacz.
Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowo-przepustowy, może wystąpić
zwiększone zabarwienie artefaktowe.
Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do
pisania może spowodować zabarwienie artefaktowe.
Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych
pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników może
spowodować zabarwienie artefaktowe.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
3
Spodziewane wartości
Test NOVA Lite® tarczycy został użyty do oceny 24 pacjentów z przewlekłym zapaleniem tarczycy (choroba
Hashimoto). Zbadano także piętnastu pacjentów z cukrzycą typu I oraz 67 wybranych losowo krwiodawców
bez zgłaszanych nieprawidłowości tarczycy. Wyniki znajdują się poniżej:
Grupa pacjentów
Numer
Przewlekłe zapalenie tarczycy
24
Cukrzyca typu I
15
Normalne
67
Mikrokosmkowe
20
0
2
Kolidalne
13
0
0
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Davies TF and DeBernardo, E: Thyroid autoantibodies and disease. In Autoimmune Endocrine
Disease, TF Davies, ed., Wiley, New York, NY, 1983, p. 127.
Wall JR and Kuroki, T: Immunologic Factors in Thyroid Disease. Medical Clinics of North America 69:
913, 1985.
Hall R and Evered, DC: Autoimmune thyroid disease: thyroiditis. In Endrocrinology, DeGroot LJ et. al.,
eds., Grune and Stratton, New York, NY, 1979, p. 461.
Delespesse G. et. al.: Thyroid autoimmunity. In Thyroiditis and Thyroid Function, P.A. Bastenie and
A.M. Evans, eds., Pergamon Press, Oxford, 1972, p. 39.
Balfour BM, et. al.: Fluorescent antibody studies in human thyroiditis: autoantibodies to an antigen of
the thyroid colloid distinct from thyroglobulin. Br. J. Exp. Pathol. 43:307, 1961.
Tung KSK, et. al.: Antithyroid antibodies in juvenile lymphocytic thyroiditis. Am. J. Clin. Pathol. 61:
549, 1974.
Doniach D and Roitt, IM: Autoimmunity in Hashimoto's disease and its implications. J. Clin.
Endocrinol. Metab. 17: 1293, 1957.
Philip JR, et. al.: A latex particle precipitation test in the diagnosis of thyroid disease. J. Clin. Pathol.
15: 148, 1962.
Fulthorpe AJ, et. al.: A stable sheep cell preparation for detecting thyroglobulin autoantibodies and its
clinical applications. J. Clin. Pathol. 14: 654, 1961.
Holborrow J, et. al.: Cytoplasmic localization of complement-fixing auto-antigen in human thyroid
epithelium. Br. J. Exp. Pathol. 40: 583, 1959.
Doniach D: Thyroid autoimmune disease: symposium on thyroid gland. J. Clin. Pathol. 20: 385, 1966.
Wilkikn TJ, et. al.: A passive hemagglutination (TRC) inhibitor in thyrotoxic serum. J. Clin. Endocrinol.
10: 507, 1979.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and
Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007
NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady):
877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628350POL
Merzec 2011
Wersja 0
4