Ocena przydatności markerów molekularnych do identyfikacji genów

Ocena przydatności markerów molekularnych do identyfikacji genów
odporności na mączniaka prawdziwego w materiałach hodowlanych żyta
Henryk Bujak, Kamila Nowosad,
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Katedra Genetyki, Hodowli Roślin i Nasiennictwa
Wstęp
Tab. 1. Średnie porażenie badanych genotypów żyta przez mączniaka prawdziwego (Blumeria graminis)
i ich podział na grupy jednorodne testem Duncana
Jedna z najpoważniejszych chorób żyta wywoływana jest przez
mączniaka prawdziwego, który zasiedla powierzchnie blaszek
liściowych rozwijających się roślin powodując zmniejszenie ich
powierzchni asymilacyjnej, co w konsekwencji może prowadzić do
obniżenia produkcyjności zainfekowanych roślin. Stąd potrzeba
wprowadzania do materiałów hodowlanych nowych genów
odporności. Ułatwieniem w poszukiwaniu genów odporności
mogą być markery molekularne.
Lp.
Nazwa obiektu
Średnia po transformacji
Średnia
1 CHD Ma 285
1,000
1,0
a
2 CHD Ma 289
1,000
1,0
a
3 CHD Ma 292
1,000
1,0
a
4 CHD Ma 294
1,000
1,0
a
5 CHD Ma 295
1,000
1,0
a
6 CHD Ma 315
1,000
1,0
a
7 LAD Ma 166
1,000
1,0
a
8 LAD Ma 186
1,000
1,0
a
9 LAD Ma 193
1,000
1,0
a
SOA Ma 1
1,000
1,0
a
SOA Ma 23
1,000
1,0
a
SOA Ma 28
1,000
1,0
a
SOA Ma 29
1,000
1,0
a
WTD 16
1,000
1,0
a
WTD 20
1,000
1,0
a
CHD Ma 287
1,114
1,2
b
LAD Ma 177
1,114
1,2
b
LAD Ma 178
1,114
1,2
b
LAD Ma 179
1,114
1,2
b
LAD Ma 182
1,114
1,2
b
LAD Ma 184
1,114
1,2
b
LAD Ma 185
1,114
1,2
b
LAD Ma 190
1,114
1,2
b
LAD Ma 191
1,114
1,2
b
SOA Ma 2
1,114
1,2
b
SOA Ma 22
1,114
1,2
b
SOA Ma 27
1,114
1,2
b
CHD Ma 323
1,213
1,5
c
LAD Ma 163
1,213
1,5
c
LAD Ma 171
1,213
1,5
c
…
…
4,0
o
4,0
o
4,0
o
4,0
o
4,0
o
4,0
o
10
11
12
13
14
15
16
Celem badań
17
Celem badań była weryfikacja odporności genotypów żyta ozimego
na aktualne rasy mączniaka prawdziwego w warunkach sztucznej
inokulacji oraz określenie obecności genów odporności z
zastosowaniem specyficznych markerów molekularnych. Ocena
porażenia w wyniku sztucznej inokulacji pozwoliła na wytypowanie
genotypów żyta zawierających efektywne geny odporności, a do
identyfikacji genów wykorzystane zostały opracowane i znane z
literatury sekwencje starterowe dające markery molekularne
sprzężone z tymi genami.
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
… …
…
WTD 71
Materiał badawczy stanowiły materiały wyjściowe do hodowli nowych odmian żyta
ozimego, linie wsobne z kolekcji oraz zarejestrowane odmiany, które zostały użyte jako
wzorce:
CHD Ma 293 – CHD Ma 327, LAD Ma 163 - LAD Ma 207, SOA Ma 1 – SOA Ma 30, WTD1 –
WTD105, HRSM 254-R – HRSM 330-R, UP5_1 – UP5_198
Łącznie testowano 203 genotypy żyta ozimego w doświadczeniach infekcyjnych w celu
poszukiwania genów odporności na mączniaka prawdziwego (Blumeria graminis). Były to
dostarczone przez hodowców linie wsobne, populacje oraz odmiany wzorcowe, a także
własne linie wsobne pochodzące z kolekcji Katedry Genetyki, Hodowli Roślin i
Nasiennictwa Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.
Ocenę podatności genotypów żyta na porażenie przez Blumeria graminis
przeprowadzono w doświadczeniu szklarniowym zgodnie z metodyką przedstawioną w
pracy Zamorski i wsp. (1994) . Posługiwano się czterostopniową skalą porażenia (1–4),
gdzie 1 – oznaczało brak objawów natomiast 4 – bardzo silne porażenie z koloniami
mączniaka zajmującymi 75–100% powierzchni blaszek liściowych. Szklarniowe
doświadczenia infekcyjne przeprowadzano wykorzystując polową populację patogena
utrzymywaną na siewkach wrażliwej odmiany żyta. Materiał z namnożoną populacją
mączniaka prawdziwego otrzymano z Hodowli Roślin Smolice Sp. z o. o. Grupa IHAR.
Inokulację przeprowadzano w fazie trzech liści metodą „miotełkową”. Następnie rośliny
umieszczano w komorze o wysokiej wilgotności powietrza. Dodatkowo obok ocenianego
materiału ustawiono rośliny z namnożonym patogenem, co sprzyjało porażaniu. Stopień
porażenia roślin oceniano po dwóch tygodniach od inokulacji, posługując się
wspomnianą wyżej skalą.
Do badań molekularnych wybrano 12 linii odpornych i 12 linii podatnych na patogena. W
sumie wyizolowano DNA z 24 genotypów żyta. Materiał do izolacji genomowego DNA
stanowiły liście siewek. Do izolacji całkowitego DNA z roślin wykorzystano metodę
oczyszczania przy użyciu zestawów do izolacji Qiagen DNeasy Palnt kit. Ponieważ dla żyta
nie ma opracowanych markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności na
mączniaka prawdziwego sprawdzano przydatność kolejnych markerów opracowanych dla
innych zbóż, w tym pszenicy i pszenżyta. W tabeli podano użyte do reakcji PCR startery w
celu amplifikacji markerów molekularnych sprzężonych z genami odporności na
mączniaka prawdziwego, ich sekwencje oraz nazwy linii referencyjnych.
2,000
198
Materiał i metody
Grupy jednorodne
WTD 72
2,000
199
WTD 79
2,000
200
WTD 80
2,000
201
WTD 88
2,000
202
WTD 89
2,000
203
NIR
0,014
Tab. 2. Geny odporności na mączniaka prawdziwego i opracowane dla nich markery molekularne
Gen
Pm22
Pm4d
Pm36
Pm40
Pm41
Pm42
Pm46
Pm50
Pm49
PmG25
Pm07J126
PmHNK
MIAB10
Pm2026
PmE
PmU
Pm47
PmTm4
Pm4
Typ markera Nazwa primera
SSR/AFLP
STS
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
EST-SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
SSR
GWM344
Xgwm526-2B
BJ261635
Xgwm297
BE489472
BF146221
Xgwm205
Xgwm294-2A
CA695634
Xbarc232
Xbarc183
Xwmc291
Xwmc445-5A
MAG2170
Xgwm297
Xgwm273-1B
Xgwm46
Xwmc276-7B
ResPm4
Primer F
Primer R
CAAGGAAATAGGCGGTAACT
CAATAGTTCTGTGAGAGCTGCG
TAGCCTGGTACCATTCTGCC
ATCGTCACGTATTTTGCAATG
graingenes…
ATTTGAGTCTGAAGTTTGCA
CAACCCAAATACACATTCTCA
TGTAATGGAGGTGCAGCTTG
TGCGTAAGTCTAGCATTTTCTG
graingenes…
Odmiana/Linia
Literatura
Virest
Singrun et al., 2003
Tm27d2
Schmolke et al., 2012
MG29896
Blanco et al., 2008
GRY19
Luo et al., 2009
IW2/Chinese Spring
Li et al., 2009
CTTGGAGGTGTCGTCCTTGT
CTTCCTCATCAACAATGGAGGT
G-303-1M
Hua et al., 2009
CGACCCGGTTCACTTCAG
AGTCGCCGTTGTATAGTGCC
Tabasco
Gao et al., 2012
GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG
GCAGAGTGATCAATGCCAGA
K2
Mohler et al., 2013
TGCAGATAGCTTCAGCAGGA
CTCAATCGCAGGTGCAAGTA
MG5323
Piarulli et al., 2012
CGCATCCAACCATCCCCACCCAACA CGCAGTAGATCCACCACCCCGCCAGA
N0308
Alam et al., 2013
CCCGGGACCACCAGTAAGT
GGATGGGGAATTGGAGATACAGAG
07jian126
Yu et al., 2012
TACCACGGGAAAGGAAACATCT
CACGTTGAAACACGGTGACTAT
Zhoumai 22
Xu et al., 2010
AGAATAGGTTCTTGGGCCAGTC
GAGATGATCTCCTCCATCAGCA
NC97BGTAB10
Maxwell et al., 2010
TCGCAGAACAGCAAGTTCG
TGAAGAGACCGACCTCCG
TA2026
Xu et al., 2008
ATCGTCACGTATTTTGCAATG
TGCGTAAGTCTAGCATTTTCTG
Xiaohan/4*Bainong3217
Ma et al., 2007
ATTGGACGGACAGATGCTTT
AGCAGTGAGGAAGGGGATC
UR206/Laizhou
Qiu et al., 2005
GCACGTGAATGGATTGGAC
TGACCCAATAGTGGTGGTCA
Hongyanglazi
Xiao et al., 2013
GACATGTGCACCAGAATAGC
AGAAGAACTATTCGACTCCT
Tangmai 4
Hu et al., 2008
TGTCCGGTTTGGTTACCTTTCTTC
GGGACGCTTCCTATAATCACGC
Schmolke et al., 2012
Wnioski
Wśród badanych genotypów żyta stwierdzono występowanie formy całkowicie odpornej na
mączniaka prawdziwego (Blumeria graminis f. sp. secalis) CHD Ma 322, która może stanowić
potencjalne źródło odporności w programach hodowlanych żyta. Stwierdzono także dwa
genotypy, które w niewielkim stopniu ulegały porażeniu - CHD Ma 324 i SOA Ma 30.
Wykazano, że do poszukiwania genów odporności na mączniaka prawdziwego u żyta mogą
zostać wykorzystane markery mikrosatelitarne związane z genami Pm4 oraz PmU. Produkty
amplifikacji charakterystyczne dla tych markerów występowały jedynie w grupie genotypów
żyta najmniej porażonych przez mączniaka, co wskazuje na ich sprzężenie z cechą odporności.
Markery te wymagają jednak sprawdzenia na większej liczbie genotypów odpornych na
mączniaka prawdziwego u żyta.
Praca realizowana w ramach badań na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej finansowanych przez
Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi