cwiczenie 1

Zastosowanie niskociśnieniowej chromatografii adsorpcyjnej do separacji barwników ze
szpinaku
Wstęp
Celem ćwiczenia jest zastosowanie adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej do
izolacji barwnych związków z ekstraktu szpinaku. Pomysł eksperymentu został zaadaptowany
z Pavia D.L. et al, Introduction to Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach,
2005.
Barwniki występujące w liściach szpinaku: chlorofile a i b, feofityny a i b, β-karoten
oraz ksantofile zostaną wyekstrahowane za pomocą acetonu a następnie rozdzielone na żelu
krzemionkowym. W trakcie ćwiczenia zostanie wykonana analiza metodą chromatografii
cienkowarstwowej (TLC) ekstraktu oraz wydzielonych związków. Technika TLC zostanie
również wykorzystana do dobrania odpowiedniego składu fazy ruchomej do separacji
barwników metodą chromatografii kolumnowej (LC). Izolowane i analizowane związki są
barwnikami, dzięki czemu można łatwo monitorować zarówno rozdział LC jak i TLC.
C2 H5
CH3
R
R = CH3 chlorofil a
O
N
N
N
R = CHO chlorofil b
COOMe
H
Mg
N
H
H2C
H
H3C
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
H3C
H3C
H3C
H3C
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
β -karoten
Rys. 1. Wzory strukturalne chlorofilu a, chlorofilu b oraz β-karotenu.
Chlorofile są barwnikami niezbędnymi w procesie fotosyntezy. W chloroplastach
roślinnych występują przeważnie w dwóch formach: jako niebieskozielony chlorofil a oraz
żółtozielony chlorofil b (rys. 1.). Chlorofile zawierają rdzeń porfirynowy, w którym znajduje
się atom magnezu łączący się z atomami azotu każdego z pierścieni rdzenia porfirynowego.
Chlorofil b różni się od chlorofilu a obecnością grupy aldehydowej w bocznym pierścieniu
pirolowym zamiast grupy metylowej. Budowa strukturalna feofityny a i b jest podobna do
1
budowy chlorofilu a i b, z tym, że w miejscu jednego atomu magnezu w cząsteczce feofityny
występują dwa atomy wodoru. Feofitynę można uzyskać poprzez działanie kwasem na
chlorofil. Oprócz chlorofili w chloroplastach występują także karoteny, m.in. żółty β-karoten,
czyli prowitamina A, oraz ksantofile.
Zielony kolor chlorofili jest efektem tego, że silnie absorbują światło w czerwonej i
niebieskiej części widma promieniowania widzialnego, natomiast słabo w części zielonej.
Jesienią zabarwienie liści zmienia się na żółtawe ze względu na rozkład chlorofilu, co ujawnia
barwę obecnych w liściach żółtych barwników.
W chromatografii adsorpcyjnej kolejność elucji związków chemicznych z kolumny
zależy od ich polarności. Związki o niskiej polarności eluują jako pierwsze a następnie eluują
związki o większej polarności. Barwniki, izolowane z liści szpinaku, różnią się polarnością,
co powoduje, że będą eluowały w następującym porządku zgodnym z ich wzrastającą
polarnością (w nawiasach podane są kolory związków):
1. karoteny (intensywnie żółty kolor),
2. feofityna a (intensywnie szary),
3. feofityna b (szary, może być niewidoczny),
4. chlorofil a (niebieskozielony, bardziej intensywny niż chlorofil b),
5. chlorofil b (zielony),
6. ksantofile (żółty).
W zależności od stanu próbki szpinaku oraz warunków eksperymentu mogą wystąpić
pewne różnice w obserwowanych barwnikach. Mogą powstać nowe związki w wyniku reakcji
utleniania, hydrolizy lub innych reakcji zachodzących pod wpływem światła, tlenu i innych
czynników. Próbki szpinaku i wyizolowane barwniki należy przechowywać w ciemności,
jeśli jest to możliwe.
Część doświadczalna
Ekstrakcja
Odważyć około 1–1,4 g mrożonego szpinaku (około 1/10 części brykietu szpinaku) za
pomocą wagi precyzyjnej w zlewce o V = 100 ml. Poczekać, aż szpinak się rozmrozi, dodać
1–1,4 g bezwodnego siarczanu magnezu. Wymieszać i rozetrzeć. Ekstrahować próbkę
acetonem (20 ml) w łaźni ultradźwiękowej w czasie 15 min. Dodać do próbki 8 g
bezwodnego siarczanu sodu, wymieszać i pozostawić na 5-10 min. Zdekantować i przesączyć
ekstrakt do kolby. Pozostały osad przemyć acetonem (10 ml), zdekantować, przesączyć i
2
połączyć ekstrakty w kolbce. Odparować aceton na odparowywaczu obrotowym w temp. ≤
30°C. Jeżeli w kolbce pozostała woda to rozpuścić ekstrakt w około 5 ml heksanu, pobrać
tylko warstwę organiczną i ponownie wysuszyć ją bezwodnym siarczanem sodu. Ekstrakt
zatężyć do objętości 0,5 ml.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC
Analiza TLC ekstraktu ze szpinaku pozwala dobrać warunki rozdziału na kolumnie z
żelem krzemionkowych. Należy wykonać analizy TLC ekstraktu ze szpinaku przy użyciu
następujących faz ruchomych:
- faza 1: aceton,
- faza 2: eter naftowy,
- faza 3: chlorek metylenu,
- faza 4: eter diizopropylowy.
Należy zidentyfikować badane związki na podstawie ich barw i kolejności elucji.
Policzyć wartości współczynników opóźnienia (RF) dla rozdzielanych związków oraz ich
różnice (∆RF). Wybrać optymalną fazę ruchomą do rozdziału LC. Różnica współczynników
rozdzielenia dla związków powinna być jak największa; zadowalające efekty uzyskuje się,
gdy ∆RF ≥ 0,15. Wybrana faza ruchoma powinna dawać RF około 0,15 - 0,4. Jeżeli jest to
konieczne to rozważyć zastosowanie elucji gradientowej w LC. Należy zaproponować
optymalne warunki rozdziału LC i porównać je z warunkami zaproponowanymi w ćwiczeniu.
Dalszą część doświadczenia można wykonać według warunków zaproponowanych w
ćwiczeniu (faza ruchoma: eter naftowy-aceton), albo wybrać własną propozycję.
W celu sprawdzenia warunków elucji gradientowej w LC należy wykonać analizy
TLC ekstraktu ze szpinaku przy użyciu następujących faz ruchomych:
- faza 5: eter naftowy-aceton (9:1 v/v),
- faza 6: eter naftowy-aceton (7:3 v/v).
Po wykonaniu rozdziału ekstraktu ze szpinaku za pomocą chromatografii kolumnowej
należy wykonać analizę TLC uzyskanych frakcji a następnie ocenić jakość rozdziału LC.
Procedura analizy TLC. Napełnić komorę chromatograficzną odpowiednią fazą
ruchomą (V = 3 ml) i pozostawić na około 5-10 min. W tym czasie przygotować płytki TLC,
czyli narysować delikatnie miękkim ołówkiem:
- linię startową około 0,8 cm od dolnego brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia
próbek,
3
- linię końcową około 1 cm od górnego brzegu płytki.
Nanieść na płytkę po około 3 - 5 µL roztworów badanych próbek, uważając, aby
plamka nie miała średnicy większej niż 2 mm; im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie
plamki w czasie rozwijania chromatogramu. Można powtarzać nanoszenie roztworu po jego
wyschnięciu na płytce. Ilość nanoszonego roztworu zależy od jego stężenia. Badane związki
są barwnikami, co powoduje, że łatwo można kontrolować ilość nanoszonego roztworu.
Należy nanieść taką ilość roztworu, aby uzyskać intensywne żółte, zielone lub szare
zabarwienie plamki.
Delikatnie, przy pomocy pęsety, wstawić płytkę TLC z naniesionymi substancjami do
komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory. Zamknąć komorę
i rozwijać chromatogram, do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości 1 cm
od górnego brzegu płytki, następnie wyjąć i wysuszyć płytkę.
Zrobić zdjęcie lub zeskenować płytkę TLC i dołączyć do sprawozdania. Należy zrobić
to jak najszybciej po wysuszeniu płytki, ponieważ niektóre z barwników mogą zmienić
zabarwienie pod wpływem powietrza. Wyznaczyć współczynniki opóźnienia RF i zanotować
zabarwienie dla wszystkich związków. Przedyskutować zasadność wyboru faz ruchomych 1 –
6 do rozdziału barwników ze szpinaku oceniając ich selektywność i polarność.
Chromatografia niskociśnieniowa LC
W kolbie Erlenmeyera (V = 100 ml) naważyć 4 g żelu krzemionkowego a następnie
dodać 30 ml roztworu eter naftowy-aceton (9:1 v/v). Wymieszać i pozostawić na 5-10 min.
Zamocować kolumnę w statywie i zamknąć odpływ z kolumny. Umieścić na dnie kolumny
małą ilość zwiniętej waty szklanej. Wprowadzić 2 ml roztworu eter naftowy-aceton (9:1 v/v).
Usunąć powietrze z waty szklanej naciskając bagietką a następnie wprowadzić krążek z
bibuły.
Uważnie wprowadzić zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny, za pomocą pipety
z szerokim otworem wyjściowym lub poprzez lejek, otwierając jednocześnie odpływ z
kolumny. Zrobić to w taki sposób, aby uzyskać w miarę płaskie dno oraz płaski wierzch fazy
stacjonarnej. Od momentu wprowadzenia do kolumny żelu krzemionkowego jego
powierzchnia musi być stale przykryta cieczą. Jeżeli w kolumnie będą bąble powietrza to
proces rozpocząć od początku. Roztwór eter naftowy-aceton wypływający z kolumny
zachować do zakończenia eksperymentu – posłuży do umycia kolumny oraz pipety i kolby
zabrudzonej ekstraktem ze szpinaku.
NIE WOLNO DOPROWADZIĆ DO PRZESUSZENIA KOLUMNY!!
4
Gdy wysokość złoża w kolumnie będzie stała należy ją zmierzyć i zanotować jej
wymiary. Wprowadzić krążek z bibuły na wierzch kolumny. Pozostawić około 3 cm słupa
cieczy nad złożem. Ostrożnie wprowadzić niewielką ilość piasku (około ¼ małej łyżki
metalowej) za pomocą lejka tak, aby poziom piasku nad złożem chromatograficznym wynosił
około 0,5 cm. Ważne jest, aby wierzch fazy stacjonarnej oraz wierzch warstwy piasku były
idealnie płaskie.
Należy wcześniej przygotować wszystkie roztwory potrzebne do elucji barwników:
- roztwór A: eter naftowy-aceton (9:1 v/v), V =20 ml,
- roztwór B: eter naftowy-aceton (7:3 v/v), V =20 ml,
- roztwór C: aceton, V = 20 ml.
Wyrównać poziom fazy ruchomej w kolumnie do poziomu warstwy piasku i zamknąć
odpływ z kolumny. Ostrożnie wprowadzić do kolumny około ½ części ekstraktu ze szpinaku
za pomocą pipety Pasteura i otworzyć odpływ z kolumny.
OD MOMENTU WPROWADZENIA PRÓBKI DO KOLUMNY ROZPOCZYNA SIĘ
PROCES CHROMATOGRAFICZNY.
Wprowadzić próbkę do fazy stacjonarnej przemywając 5 razy po 0,5 ml roztworem A
aż do momentu, gdy cała próbka znajdzie się w fazie stacjonarnej (zaniknie zielone
zabarwienie roztworu nad powierzchnią fazy stacjonarnej). Ostrożnie wprowadzić do
kolumny pozostałą część roztworu A, a następnie roztwór B oraz roztwór C. Zbierać kolejne
frakcje fazy ruchomej zawierające wydzielone barwniki roślinne do kolejnych 6 cylindrów
miarowych. Należy zanotować objętości uzyskanych frakcji.
Frakcje:
1– bezbarwna, V = około 5 ml,
2 – żółta, V = około 5 ml,
3 – bezbarwna, V = około 14 ml,
4 – szara, V = około 5 ml,
5 – niebiesko-zielona, V = około 10 ml,
6 – żółto-zielona, V = około 10 ml.
Zebrane frakcje zatężyć do około 0,5 ml i pozostawić do analizy TLC. Wykonać
analizę TLC uzyskanych frakcji i ekstraktu stosując jako fazę ruchomą roztwór B: eter
naftowy-aceton (7:3 v/v). Zidentyfikować barwniki. Ocenić jakość rozdziału LC na podstawie
wykonanych analiz TLC.
5
Literatura
1. Pałczyński A., Podbielkowski Z., Polakowski B., Botanika. PWN, Warszawa, 1995.
2. Still W.C., Kahn M., Mitra A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate
resolution. J. Org. Chem., 1978, 43 (14), 2923–2925.
3. Stryer L. Biochemia. PWN, Warszawa, 2000.
4. Pavia D.L., Lampman G.M., Kriz G.S., Engel R.G. Introduction to organic laboratory techniques: a small
scale approach. Thomson Brooks/Cole, 2005.
Szkło i odczynniki
6 komór chromatograficznych do TLC,
metalowa pęseta,
Ekstrakcja:
pipeta V = 5 ml,
płytka + nóż do krojenia,
chlorek metylenu V = 100 ml,
zlewka V = 100 ml,
eter diizopropylowy V = 100 ml,
zlewka V = 50 ml,
linijka oraz miękki ołówek
zlewka V = 25 ml,
łyżka metalowa,
LC:
średni tłuczek porcelanowy,
żel krzemionkowy LC60A 60-200 MICRON firmy
cylinder miarowy V = 25 ml,
DAVISIL,
kolbka do odparowywacza V = 100 ml,
kolumna szklana o wymiarach 1 × 15 cm wraz z
reduktor do odparowywacza,
przedłużką,
lejek średni + pasujące sączki,
statyw do kolumny,
pipeta V = 5 ml,
lejek średni pasujący do kolumny z dużym
pompka do pipet,
otworem
łaźnia ultradźwiękowa,
krzemionkowego,
bezwodny siarczan magnezu,
3 cylindry miarowe V = 25 ml
bezwodny siarczan sodu,
3 cylindry miarowe V = 10 ml
aceton V = 250 ml,
3 kolbki Erlenmeyera V = 50 ml + pasujący korek
eter naftowy V = 250 ml,
szklany,
pisak do szkła,
1 kolbka Erlenmeyera V = 100 ml + pasujący korek
statyw do lejka
szklany,
wyjściowym
do
zawiesiny
żelu
pipeta Pasteura do ekstraktu ze szpinaku,
TLC:
6 kolbek do odparowywacza V = 50 ml,
płytki do TLC silica gel 60 firmy Merck, o
bagietka szklana,
wymiarach 4 × 6,5 cm oraz 2 × 6,5 cm,
krążki z bibuły do kolumny,
strzykawka do TLC,
piasek,
chlorek metylenu do mycia strzykawki V = 25 ml,
wata szklana
Uwaga: Nie wolno suszyć komór chromatograficznych w suszarce, ponieważ pękają!
6