MultiMix - Agilent

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human B Cell (FMC7)/FITC
Anti-Human CD23/RPE
Anti-Human CD19/APC
Nr kat. TC683
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC683 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek zawierających antygeny FMC7, CD23 i CD19.
Antygen FMC7 jest obecny w subpopulacji stosunkowo dojrzałych limfocytów B w prawidłowej krwi obwodowej
(1, 2). Ekspresja antygenu obserwowana jest w róŜnych rodzajach zaburzeń proliferacji limfocytów, w tym w
białaczce prolimfocytarnej z limfocytów B (B-PLL), białaczce włochatokomórkowej (HCL), chłoniaku z komórek
płaszcza (MCL), chłoniaku grudkowym (FCL), chłoniaku strefy brzeŜnej (MZL), chłoniaku tkanki limfatycznej
związanej z błoną śluzową (MALT), rozlanym chłoniaku z duŜych komórek (DLCL), chłoniaku Burkitta (BL) i
makroglobulinemii Waldenströma (1-4). Ekspresja FMC7 jest ograniczona lub antygen ten wcale nie występuje
w przewlekłym chłoniaku z komórek B/chłoniaku limfocytarnym z małych komórek B (B-CLL/SLL), ostrej
białaczce limfoblastycznej typu Null-ALL, ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B (B-ALL) i szpiczaku
mnogim (MM) (1-5). Antygen FMC7 nie występuje w ostrej białaczce szpikowej (AML), przewlekłej białaczce
szpikowej (CML), T- ALL i T-PLL (5).
Białko CD23 jest identyczne z receptorem IgE o niskim powinowactwie (FcεRII) występującym w komórkach B.
Ekspresję CD23 wykazują przede wszystkim komórki B i monocyty, szczególnie silna jest ona natomiast w
limfoblastach limfocytów B zainfekowanych przez EBV (6). CD23 występuje równieŜ w wielu innych rodzajach
komórek, takich jak komórki T, eozynofile, płytki krwi, komórki Langerhansa i podzbiór komórek nabłonka
grasicy (6). Ekspresję CD23 stwierdza się w komórkach nowotworowych z przypadków przewlekłej białaczki
limfoblastycznej z komórek B i w niektórych przypadkach chłoniaków centroblastycznych/centrocytarnych,
białko to nie występuje jednak w innych typach nowotworów limfoidalnych (7).
CD19 jest najszerzej rozpowszechnionym markerem powierzchniowym swoistym dla linii komórkowych
limfocytów B i występuje na powierzchni niemal wszystkich limfocytów B, łącznie ze wczesnymi komórkami
progenitorowymi typu B. Ekspresja CD19 utrzymuje się w limfocytach B, które przeszły zwyrodnienie
nowotworowe (8). UwaŜa się, Ŝe przeciwciała skierowane przeciwko CD19 mają kluczowe znaczenie we
wstępnej ocenie ostrych i przewlekłych zaburzeń proliferacji limfocytów (9).
Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych
— powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC683 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human B Cell (FMC7), Clone FMC7, sprzęŜone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD23, Clone MHM6, sprzęŜone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD19, Clone HD37, sprzęŜone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty wchodzące w skład odczynnika TC683 zostały wytworzone z oczyszczonych monoklonalnych
przeciwciał mysich naleŜących do izotypów IgM, kappa (Anti-B Cell (FMC7)), IgG1, kappa (Anti-CD23) i IgG1,
kappa (Anti-CD19). Odczynnik TC683 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy
surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. KaŜda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL
koniugatu dla leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała Anti-B Cell (FMC7) reagują z 3–6% prawidłowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.
Odpowiada to podzbiorowi komórek B wykazujących takŜe ekspresję powierzchniowej immunoglobuliny
błonowej (SmIg). Przeciwciała nie znakują komórek B bez SmIg, komórek T, ani monocytów (5). Stwierdzono,
Ŝe w zaburzeniach proliferacji limfocytów przeciwciała Anti-B Cell (FMC7) znakowały B-PLL (2/2 przypadki (1)),
HCL (14/14 przypadków (1)), MCL (15/15 przypadków (1) i 12/13 przypadków (2)), FCL (24/24 przypadki (1) i
46/62 przypadki (2)), MZL (20/20 przypadków (1) i 13/14 przypadków (2)), chłoniak MALT (14/17 przypadków
(2)), DLCL (54/64 przypadki (2)), BL (2/2 przypadki (1) i 1/1 przypadek (2)) oraz WM (5/6 przypadków (1) i
10/11 przypadków (4)).
Anti-B Cell (FMC7) wykazuje słabą reaktywność lub nie wykazuje reaktywności z w przypadkach B-CLL/SSL
(27/27 przypadków (2), 106/121 przypadków (1) i 17/17 przypadków (5)), Null-ALL (19/19 przypadków (5),
B-ALL (1/1 przypadek (2)), T-ALL (5/5 przypadków (5)), AML/CML (6/6 przypadków (5)), T-PLL (1/1 przypadek
(5)) i MM (26/26 przypadków (4)).
Przeciwciała Anti-CD23, MHM6, opisano podczas warsztatów Second, Third, Fourth, and Fifth International
Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens (2., 3., 4. i 5. międzynarodowe
warsztaty i konferencje na temat antygenów róŜnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD23
została potwierdzona przez wiele laboratoriów (6).
Przeciwciała Anti-CD19, HD37, opisano podczas warsztatów Second, Third, Fourth and Fifth International
Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens (2., 3., 4. i 5. międzynarodowe
warsztaty i konferencje na temat antygenów róŜnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD19
została potwierdzona przez wiele laboratoriów (10,11).
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z
(113662-002)
TC683/PL/JLA/2010.10.15 str.1/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na
opakowaniu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do
opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o
niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy
wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie
moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem, naleŜy
się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC683 i ostroŜnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 1 5–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8 °C. Próbki powinny zosta ć poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
NaleŜy pamiętać, Ŝe koniugaty fluorochromowe są wraŜliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do kaŜdego pomiaru moŜna dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w celu
weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się
zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w
kaŜdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzęŜonego przeciwciała.
Etapy 4 i 5: Jeśli uŜywany jest inny odczynnik do lizy komórek, naleŜy przy jego doborze kierować się
poniŜszymi zaleceniami. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza
(np. Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba Ŝe
próbka zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób moŜna oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. MoŜe to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niŜ jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Dzięki
minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC ich połączenie umoŜliwia
wyjątkowo łatwą analizę.
Ograniczenia swoiste dla
produktu
Liza próbek krwi za pomocą odczynników do lizy zawierających środek utrwalający przed inkubacją
opisywanego z odczynnikiem TC683 moŜe spowodować zniszczenie epitopu rozpoznawanego przez
przeciwciała Anti-Human B Cell (FMC7)/FITC.
Piśmiennictwo
1.
Ahmad E, Garcia D, Davis BH. Clinical utility of CD23 and FMC7 antigen coexistent expression in B-cell
lymphoproliferative disorder subclassification. Cytometry 2002;50:1-7.
2.
Garcia DP, Rooney MT, Ahmad E, Davis BH. Diagnostic usefulness of CD23 and FMC-7 antigen
expression patterns in B-cell lymphoma classification. Am J Clin Pathol 2001;115:258-65.
3.
Zola H, Neoh SH, Potter A, Melo JV, De Oliveria MSP, Catovsky D. Markers of differentiated B cell
leukaemia: CD22 antibodies and FMC7 react with different molecules. Dis Markers 1987;5:227-35.
4.
San Miguel JF, Caballero MD, Gonzalez M, Zola H, Lopez Borrasca A. Immunological phenotype of
neoplasms involving the B cell in the last step of differentiation. Br J Haematol 1986;62:75-83.
(113662-002)
TC683/PL/JLA/2010.10.15 str.2/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
5.
Brooks DA, Beckman IGR, Bradley J, McNamara PJ, Thomas ME, Zola H. Human lymphocyte markers
defined by antibodies derived from somatic cell hybrids. IV. A monoclonal antibody reacting specifically
with a subpopulation of human B lymphocytes. J Immunol 1981;126:1373-7.
6.
Sarfati M, Ishihara H, Delespesse G. B7. CD23 workshop panel report. In: Schlossman SF, Boumsell L,
Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White celldifferentiation
antigens. Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA.
Oxford, New York,Tokyo: Oxford University Press; 1995. Volume 1. p. 530-3.
7.
Pallesen G. B2.5. The distribution of CD23 in normal human tissues and in malignant lymphomas. In:
McMichael AJ, Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte
typing III. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and
Conference; 1986 Sept 21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987.
p. 383-6.
8.
Sato S, Tedder TF. BC3. CD68 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG,
Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 133-5.
9.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate
hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001;46:23-7.
10.
Nadler LM. B cell/leukemia panel workshop: summary and comments. In: Reinherz EL, Haynes BF,
Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the 2nd International Workshop on
Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston, USA. New York, Berlin, Heidelberg,
Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 3-43.
11.
Mason DY, Ladyman H, Gatter KC. Immunohistochemical analysis of monoclonal anti-B cell antibodies.
In: Reinherz EL, Haynes BF, Nadler LM, Bernstein ID, editors. Leukocyte typing II. Proceedings of the
2nd International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens; 1984 Sept 17-20; Boston,
USA. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo: Springer-Verlag; 1986. Volume 2. p. 245-55.
Objaśnienie symboli
(113662-002)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed słońcem (patrz
sekcja nt. przechowywania)
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
TC683/PL/JLA/2010.10.15 str.3/3
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17