Nr 3 249 KOLUMNY POWINOWACTWA IMMUNOLOGICZNEGO W

Kolumny powinowactwa immunologicznego ROCZN.
w analiziePZH,
ochratoksyny
A 3, 249–253
2004, 55 NR
249
Nr 3
LUDWIK CZERWIECKI1, KAMILA CZY¯YK2, GRA¯YNA WILCZYÑSKA1,
AGNIESZKA KWIECIEÑ1
KOLUMNY POWINOWACTWA IMMUNOLOGICZNEGO W ANALIZIE
OCHRATOKSYNY A W ZBO¯ACH TECHNIK¥ HPLC
CZ. II. OCENA METODY EKSTRAKCJI ACETONITRYLEM Z WOD¥
IMMUNOAFFINITY COLUMNS AND DETERMINATION
OF OCHRATOXIN A IN CEREALS BY HPLC
PART II. EVALUATION OF EXTRACTION USING ACETONITRILE /WATER
Zak³ad Analizy ¯ywnoœci Instytut Biotechnologii Przemys³u Rolno-Spo¿ywczego
02-532 Warszawa, ul. Rakowiecka 36
Kierownik: prof. dr hab. B. Szteke
e-mail: [email protected]
1
2
Miêdzywydzia³owe Studium Ochrony Œrodowiska
Szko³a G³ówna Gospodarstwa Wiejskiego
02-776 Warszawa, ul. Nowoursynowska 159
Kierownik: prof. dr hab. J. ¯elazo
Do oznaczania ochratoksyny A w ziarnach zbó¿ wykorzystano ekstrakcjê mieszanin¹ acetonitrylu z wod¹. Do oczyszczania ekstraktów zastosowano kolumny
powinowactwa immunologicznego (IAC), a ochratoksynê A analizowano technik¹
HPLC z detekcj¹ fluorymetryczn¹. Œredni odzysk metody wynosi³ 74-89%, granica wykrywalnoœci oraz granica oznaczalnoœci, odpowiednio 0,015 i 0,025 mg/kg.
WSTÊP
Ochratoksyna A jest mikotoksyn¹ o szerokim spektrum niekorzystnego oddzia³ywania
na organizm ludzki i zwierzêcy. Jest m.in. zwi¹zkiem nefrotoksycznym [1, 5], posiada
w³aœciwoœci immunosupresyjne [1, 8 ]; nie mo¿na te¿ wykluczyæ dzia³ania rakotwórczego
ochratoksyny A w stosunku do cz³owieka [1, 7]. G³ównym jej Ÿród³em s¹ zbo¿a i przetwory zbo¿owe. Zatem wiarygodne i pewne metody wykrywania i oznaczania ochratoksyny A
odgrywaj¹ znacz¹c¹ rolê w dziedzinie szeroko pojêtego bezpieczeñstwa ¿ywnoœci i surowców rolnych.
Praca jest kontynuacj¹ badañ opisanych w pierwszej czêœci publikacji, dotycz¹cych zastosowania kolumn powinowactwa immunologicznego i techniki HPLC w analityce ochratoksyny A [4]. Zastosowano wtedy ekstrakcjê metanolem z wod¹ (80:20). Poniewa¿ niezale¿nie od metody oczyszczania ekstraktów, sposób ekstrakcji posiada decyduj¹cy wp³yw
na koñcowy wynik oznaczenia, celem pracy by³o zbadanie wp³ywu nowej mieszaniny eks-
250
L. Czerwiecki i in.
Nr 3
trakcyjnej – acetonitrylu z wod¹ (60:40) na podstawowe parametry charakteryzuj¹ce metodê analityczn¹. Do oczyszczania ekstraktów, podobnie jak w poprzedniej publikacji, zastosowano kolumny powinowactwa immunologicznego.
MATERIA£ I METODY
Wyposa¿enie
Wykorzystano zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej firmy Knauer sk³adaj¹cy
siê z elementów wymienionych we wczeœniejszej publikacji [4].
Odczynniki i materia³y pomocnicze
Równie¿ wszystkie stosowane odczynniki i materia³y pomocnicze, w³¹cznie z acetonitrylem do
HPLC i wod¹ oraz z kolumnami powinowactwa immunologicznego wymieniono w czêœci I pracy
[4].
Do badañ stosowano jednolite próbki pszenicy i ¿yta nie zawieraj¹ce wykrywalnych poziomów
ochratoksyny A.
METODY BADAÑ
Zbadano jedn¹ z procedur ekstrakcji ochratoksyny A i oczyszczania ekstraktów, zalecan¹ przez
producenta kolumn powinowactwa immunologicznego (IAC) [6]. W przypadku wysokosprawnej
chromatografii cieczowej, zastosowano w³asn¹, sprawdzon¹ w Zak³adzie Analizy ¯ywnoœci Instytutu Biotechnologii Przemys³u Rolno-Spo¿ywczego, metodykê [2, 3].
Ekstrakcja ochratoksny A i oczyszczanie ekstraktów na kolumnach
powinowactwa immunologicznego
50 g rozdrobnionej próbki pszenicy lub ¿yta ekstrahowano 100 ml mieszaniny acetonitrylu
z wod¹ (60:40) w homogenizatorze w czasie 1 min. Homogenat s¹czono do zlewki poj. 200 ml przez
s¹czek fa³dowany. Do dalszej analizy pobierano 10 ml klarownego przes¹czu, który rozcieñczano
40 ml wody. Po dok³adnym wymieszaniu, roztwór s¹czono do kolejnej zlewki poj. 200 ml przez
s¹czek drobnow³óknisty. Nastêpnie 10 ml klarownego przes¹czu nanoszono na kolumnê IAC. Elucjê prowadzono przy prêdkoœci przep³ywu 1-2 krople/sek. reguluj¹c przep³yw pompk¹ strzykawkow¹. Z³o¿e osuszano przepuszczaj¹c przez kolumnê powietrze. Nastêpnie kolumnê przemywano
10 ml buforu (Mycotoxin wash buffer) z prêdkoœci¹ jak poprzednio. Oba eluaty odrzucano, a kolumnê przemywano 10 ml wody, po czym z³o¿e osuszano ponownie strumieniem powietrza. Eluat
odrzucano. Ochratoksynê A eluowano 1,5 ml metanolu z prêdkoœci¹ 1 kropla/sek. do naczynka
reakcyjnego. Eluat odparowywano do sucha w bloku grzejnym, w temp. 60°C, w strumieniu azotu.
Such¹ pozosta³oœæ, bezpoœrednio przed analiz¹ HPLC, rozpuszczano w 1 ml mieszaniny metanolu
z wod¹ (1:1).
Analiza HPLC
Analizê HPLC z wykorzystaniem detekcji fluorymetrycznej, przy d³ugoœciach fali wzbudzenia
i emisji 330/460 nm, wykonywano analogicznie jak to opisano poprzednio [4] nanosz¹c 100 ml
badanego ekstraktu na kolumnê RP C18 Nucleosil.
Do wykreœlenia krzywej wzorcowej sporz¹dzano roztwory wzorcowe o ró¿nych stê¿eniach w zakresie i w iloœciach odpowiadaj¹cych poziomom fortyfikacji od 0,05 mg/kg do 100 mg/kg. Zawartoœæ
ochratoksyny A w próbce obliczano na podstawie wykreœlonej krzywej wzorcowej.
Potwierdzanie obecnoœci ochratoksyny A
W celu potwierdzenia wyników pozytywnych, tworzono estry metylowe ochratoksyny A u¿ywaj¹c jako reagenty metanolowego kompleksu trifluorku boru [4] .
Kolumny powinowactwa immunologicznego w analizie ochratoksyny A
Nr 3
251
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Dla okreœlenia podstawowych parametrów statystycznych metody, próbki pszenicy fortyfikowano ochratoksyn¹ A na poziomie: 0,1; 1,0; 10 i 100 mg/kg. W przypadku ¿yta zbadano poziom fortyfikacji 10 mg/kg. Wartoœci œredniego odzysku, odchylenie standardowe i
jego wzglêdn¹ miarê (RSD%) dla badanych poziomów fortyfikacji przedstawiono w tabelach I, II.
Œredni odzysk ochratoksyny A w fortyfikowanych próbkach pszenicy waha³ siê w zale¿noœci od rodzaju zbo¿a i poziomu fortyfikacji w granicach 74,4-88,6%. Wartoœci te by³y
wy¿sze ni¿ w przypadku ekstrakcji mieszanin¹ metanolu z wod¹ (65,1-78,1%) – co stwierdzono w pierwszej czêœæ publikacji [4]. Jest to zgodne z danymi podanymi przez Vicam [6]
w odniesieniu do pszenicy. Precyzja metody, jako wartoœæ wzglêdnego odchylenia standardowego (RSD%) dla badanego zakresu fortyfikacji zawiera³a siê w granicach 8,5-13,4%.
Nale¿y zwróciæ uwagê, ¿e w porównaniu z wynikami uzyskanymi w wariancie ekstrakcji
metanolem z wod¹ [4] by³y to jednak wartoœci wy¿sze; jest to szczególnie wyraŸne przy
poziomie fortyfikacji 1 i 10 mg/kg (pszenica) (tabela I). Wartoœci RSD w metodzie metanolowej wynosi³y, odpowiednio: 5,5 i 4,6% [4]. Mo¿na zatem uznaæ, ¿e metoda „acetonitrylowa” charakteryzuje siê mniejsz¹ precyzj¹, ale wiêkszym odzyskiem, a zatem wiêksz¹
Tabela I. Œredni odzysk i powtarzalnoœæ metody oznaczania ochratoksyny A w próbkach pszenicy
Mean recovery and repeatability of the method in wheat samples
3R]LRPIRUW\ILNDFML JNJ
JNJ
RG]\VN
JNJ
RG]\VN
JNJ
RG]\VN
JNJ
RG]\VN
UHGQLHVW HQLH JNJ UHGQLRG]\VN
2GFK\OHQLHVWDQGDUGRZH6' JNJ56'
L. Czerwiecki i in.
252
Nr 3
Tabela II. Œredni odzysk i powtarzalnoœæ metody oznaczania ochratoksyny A w próbkach ¿yta fortyfikowanych na poziomie 10 mg/kg
Mean recovery and repeatability of the method in rye samples at fortification level 10 mg/kg
,OR üR]QDF]RQD JNJ
2G]\VN
UHGQLHVW
HQLH JNJ
UHGQLRG]\VN
2GFK\OHQLHVWDQGDUGRZH6' JNJ
:]JO GQHRGFK\OHQLHVWDQGDUGRZH56'
dok³adnoœci¹.
W przypadku próbek ¿yta wartoœci œredniego odzysku dla poziomu fortyfikacji 10 mg/kg by³y zbli¿one jak dla pszenicy, œrednia wartoœæ tego parametru wynosi³a ok.
87% (¿yto) przy RSD 8,8%. Œredni odzysk dla tego samego poziomu wzmocnienia i zbo¿a
w metodzie „metanolowej” by³ znacznie ni¿szy – 65%, podobnie jak prawie 2-krotnie
mniejszy by³ wspó³czynnik RSD – 4,1% [4]. Niezale¿nie od tego, uzyskane wartoœci parametrów œredniego odzysku jak i RSD% (odchylenie standardowe w warunkach powtarzalnoœci) obu metod spe³niaj¹ wymagania wymienione w wytycznych Komisji Europejskiej,
jakie s¹ stawiane metodom oznaczania ochratoksyny A w ¿ywnoœci [9]. Metoda opisana
powy¿ej odznacza siê wyraŸnie wiêkszym odzyskiem (o ok. 15%) dla poziomów fortyfikacji 1,0; 10 mg/kg (pszenica) w porównaniu z postêpowaniem przedstawionym w pierwszej czêœci pracy (ekstrakcja metanolem) [4]. Dla ¿yta ró¿nica ta jest jeszcze wiêksza, bo
dochodzi do ok. 22%. Charakteryzuje siê ona natomiast wyraŸnie gorsz¹ precyzj¹ w stosunku do metody „metanolowej”.
Granice wykrywalnoœci i oznaczalnoœci opisanej obecnie metody okreœlono w sposób
analogiczny jak w poprzedniej pracy [4 ]. S¹ one identyczne w obu wersjach ekstrakcji
i wynosz¹, odpowiednio: LOD: 0,015 mg/kg, LOQ: 0,025-0,03 mg/kg.
Liniowoœæ odpowiedzi detektora obejmowa³a obszar stê¿eñ zawartych w przedziale 0,02800 mg/kg (wartoœæ wspó³czynnika korelacji r = 0,998). Jako roboczy zakres krzywej wzorcowej przyjêto przedzia³ 0,1-300 mg/kg. Wartoœæ 300 mg/kg stanowi zarazem maksymalne
stê¿enie ochratoksyny A jakie mo¿e byæ naniesione na kolumnê IAC, a wiêc okreœla jej
pojemnoϾ.
WNIOSKI
1. Opisana metoda, w której zastosowano ekstrakcjê acetonitrylem z wod¹, charakteryzuje siê, podobnie jak metoda ekstrakcji metanolem, dobrymi parametrami analitycznymi,
Nr 3
Kolumny powinowactwa immunologicznego w analizie ochratoksyny A
253
przy czym jej odzysk, dla wiêkszoœci zbadanych poziomów fortyfikacji by³ wy¿szy, przy
gorszej precyzji, ni¿ w przypadku ekstrakcji metanolem z wod¹.
2. Poniewa¿ wspomniane parametry metody „acetonitrylowej” i „metanolowej” mieszcz¹
siê w zaleceniach Komisji Europejskiej, mo¿na uznaæ oba sposoby ekstrakcji jako równocenne i przydatne w iloœciowej analizie ochratoksyny A w pszenicy i ¿ycie. W pewnych
jednak przypadkach wydaje siê bardziej korzystne stosownie metody ekstrakcji
z metanolem, która mimo mniejszej dok³adnoœci odznacza siê lepsz¹ precyzj¹.
L. C z e r w i e c k i, K. C z y ¿ y k, G. W i l c z y ñ s k a, A. K w i e c i e ñ
IMMUNOAFFINITY COLUMNS AND DETERMINATION
OF OCHRATOXIN A IN CEREALS BY HPLC
PART II. EVALUATION OF EXTRACTION USING ACETONITRILE/WATER
Summary
Ochratoxin A from wheat and rye grain was extracted with acetonitrile:water (60:40). After cleanup of extracts using immunoaffinity columns (IAC), ochratoxin was determined by high-performance
liquid chromatography using C18 column and fluorometric detection at 330 nm excitation and 460 nm
emission. The mean recovery of ochratoxin A at fortification levels 0,1-100 mg/kg, was 74-89%. The
limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0,015 and 0,025 mg/kg, respectively. The
positive results were confirmed by reaction with BF3 complex in methanol.
PIŒMIENNICTWO
1. Castegnaro M., Gregor Mc. D.: Carcinogenic risk assessment of mycotoxins. Revue Medicine
Veterinaire. Mycotox 98. International Symposium Mycotoxins in Food Chain. Processing and
Toxicological Aspects. 2-4 July, Toulouse, 1998, 671.
2. Czerwiecki L.: Determination of ochratoxin A in infant and children cereal foods by reversed
phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Pol. J. Food Nutr. Sci. 1994 3/44
(2), 67-73.
3. Czerwiecki L. i wsp.: Ocena zanieczyszczenia zbó¿ polskich i s³owackich wybranymi mikotoksynami i flor¹ grzybow¹. Sprawozdanie IBPRS, Warszawa, 2003, 1-43.
4. Czerwiecki L., Czy¿yk K., Kwiecieñ A., Wilczyñska G.: Kolumny powinowactwa immunologicznego w analizie ochratoksyny A w zbo¿ach technik¹ HPLC. Cz. I. Ocena metody ekstrakcji metanolem z wod¹. Roczn. PZH 2004, 55, 133-138.
5. IARC: IARC Monographs on the evaluation of cancerogenic risks of chemicals to human. Vol. 56:
Some naturally occurring substances: some food items and constituents, heterocyclic aromatic
amines and mycotoxins. IARC, Lyon, 1993 b.
6. Ochratest: Instruction Manual, Vicam, 1997, April 4, 31.
7. Pittet A.: Natural occurrence of mycotoxins in foods and feeds – an updated review. Revue Medicine Veterinaire. Mycotox 98. International Symposium Mycotoxins in Food Chain. Processing
and Toxicological Aspects. 2-4 July, Toulouse, 1998, 479-492.
8. Pohland A. E., Nesheim S., Friedman L.: Ochratoxin A: A review. Pure Appl. Chem. 1992, 64,
1029-1046.
9. Richtlinie 2002/26/EG der Kommission vom 13 März 2002 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Kontrolle der Ochratoxin A-Gehalte in Lebensmitteln.
Otrzymano: 2004.01.26