Molekularne strategie terapeutyczne w chorobie Huntingtona

Molekularne strategie terapeutyczne w chorobie Huntingtona
Michał Milewski1,
Dorota Hoffman-Zacharska1,2
Jerzy Bal1
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, Warszawa
2
Instytut Genetyki i Biotechnologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa
1
Zakład Genetyki Medycznej, Instytut
Matki i Dziecka, ul. Kasprzaka 17a, 01-211
Warszawa; e-mail: michal.milewski@imid.
med.pl

Artykuł otrzymano 21 września 2014 r.
Artykuł zaakceptowano 27 listopada 2014
r.
Słowa kluczowe: choroba Huntingtona,
huntingtyna, neurodegeneracja, terapia
genowa, interferencja RNA, autofagia
Wykaz skrótów: AAV (ang. adeno-associated
virus) – wirus satelitarny adenowirusa;
ASO (ang. antisense oligonucleotides) –
antysensowne oligonukleotydy; (CAG)n –
trójnukleotydowa sekwencja powtórzona
cytozyna-adenina-guanina; BDNF (ang.
brain-derived neurotrophic factor) – czynnik
neurotroficzny pochodzenia mózgowego;
HD (ang. Huntington’s disease) – choroba
Huntingtona; HTT – gen lub białko
huntingtyny; miRNA (ang. micro RNA) –
mikrocząsteczka kwasu rybonukleinowego;
RNAi (ang. RNA interference) – interferencja
kwasu rybonukleinowego; siRNA (ang.
small interfering RNA) – mały interferujący
kwas rybonukleinowy; shRNA (ang. short
hairpin RNA) – mały kwas rybonukleinowy
o strukturze szpilki do włosów; UPR (ang.
unfolded protein response) – odpowiedź na
nieprawidłowo zwinięte białka
Podziękowania: Praca powstała podczas
realizacji projektu badawczego N N 401
375839.
18
STRESZCZENIE
C
horoba Huntingtona jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną o podłożu genetycznym, dla której wciąż brak jest skutecznego sposobu leczenia przyczynowego. W ostatnich latach podjęto szereg nowatorskich prób wypracowania molekularnych form terapii
tej choroby, wykorzystujących między innymi różne sposoby selektywnego wyciszania ekspresji zmutowanego genu odpowiedzialnego za chorobę oraz rozmaite formy neutralizacji
toksycznego produktu ekspresji tego genu. Niniejsze opracowanie omawia wszystkie najważniejsze molekularne strategie terapeutyczne dla choroby Huntingtona, próbując jednocześnie ocenić szanse ich powodzenia oraz możliwość ewentualnego zastosowania w leczeniu szeregu innych chorób neurozwyrodnieniowych z grupy proteinopatii, wykazujących
przypuszczalnie zbliżony mechanizm patogenezy.
WPROWADZENIE
Choroba Huntingtona (HD, ang. Huntington’s disease) jest uwarunkowaną genetycznie chorobą neurodegeneracyjną, której najbardziej charakterystycznym
objawem klinicznym jest występowanie mimowolnych ruchów pląsawiczych,
od których zwykło się ją nazywać pląsawicą Huntingtona. Pełen obraz kliniczny
HD jest w rzeczywistości znacznie szerszy i obejmuje nie tylko szereg zaburzeń
różnych funkcji motorycznych i poznawczych, ale także nasilające się objawy
psychiatryczne, co łącznie przyczynia się do drastycznego obniżenia komfortu
życia chorych i ich rodzin [1]. HD ma charakter postępujący i pozostaje przy
tym wciąż schorzeniem nieuleczalnym. Chorzy umierają zwykle po upływie 1520 lat od zaobserwowania pierwszych objawów, pojawiających się na ogół pod
koniec trzeciej lub w czwartej dekadzie życia.
Ponieważ HD jest chorobą dziedziczoną autosomalnie dominująco, do wystąpienia jej objawów wystarcza obecność patogennej mutacji w jednym z dwóch
alleli genu HTT, znanego też pod nazwami HD lub IT15. Mutacja ta ma przy
tym zawsze postać nadmiernie wydłużonego ciągu trójnukleotydowych powtórzeń (CAG)n zlokalizowanego w pierwszym eksonie genu HTT. Ciąg ten
u osób zdrowych zawiera mniej niż 36 kopii CAG (na ogół 10-26 powtórzeń),
podczas gdy u osób chorych liczba ta najczęściej przekracza 40 powtórzeń. Ten
charakterystyczny typ mutacji, polegający na wydłużeniu się mikrosatelitarnej
sekwencji powtórzonej składającej się najczęściej z trójnukleotydowych powtórzeń, określa się często terminem mutacji dynamicznej [2], gdyż wykazuje ona
tendencję do wydłużania się patogennej liczby powtórzeń podczas przekazywania zmutowanego genu potomstwu, czemu zwykle towarzyszy zjawisko tzw.
antycypacji genetycznej, czyli coraz wcześniejsze występowanie początków choroby oraz zaostrzanie się jej objawów w kolejnych pokoleniach. Na poziomie
białka mutacja ta przejawia się w tym przypadku wydłużeniem kodowanego
przez sekwencję (CAG)n ciągu poliglutaminowego (poli-Q), zlokalizowanego
w pobliżu aminowego końca dużego białka o nazwie huntingtyna. Białko to,
oznaczane powszechnie skrótem HTT, pełni kluczową, choć nie w pełni jeszcze poznaną rolę w rozwoju układu nerwowego człowieka, przy czym jego
zmutowana postać ulega wzmożonej proteolizie, prowadzącej do powstawania
krótkich N-końcowych fragmentów zmutowanej huntingtyny, wykazujących
tendencję do wzmożonej agregacji i gromadzących się w cytoplazmatycznych
lub jądrowych ciałach inkluzyjnych, obserwowanych post mortem w mózgach
chorych osób. Choć wewnątrzkomórkowe inkluzje zmutowanej huntingtyny są
znakiem rozpoznawczym HD, wciąż nie wiadomo czy są one główną przyczyną
choroby, czy jedynie nieszkodliwym efektem ubocznym lub nawet pożyteczną
formą obrony komórek przed toksycznym działaniem krótkich, agregujących
fragmentów zmutowanego białka, przy czym ostatnio większość badaczy zdaje
się przychylać właśnie ku tej ostatniej opcji [3]. Efektem końcowym długotrwałej
ekspresji zmutowanego genu huntingtyny jest pojawiająca się w dorosłym (lub
www.postepybiochemii.pl
rzadziej młodzieńczym) okresie życia postępująca neurodegeneracja niektórych obszarów mózgu, obserwowana najczęściej w obrębie prążkowia, a w mniejszym stopniu także w kilku innych strukturach jąder podstawnych mózgu
[4]. Choć obecności zmutowanego białka towarzyszą liczne
zmiany patologiczne rejestrowane zarówno na poziomie
molekularnym, jak i komórkowym, wciąż nie znany jest dokładny mechanizm patofizjologiczny prowadzący od mutacji do pojawienia się kluczowych objawów klinicznych HD.
Klasyczny monogenowy sposób dziedziczenia choroby
Huntingtona wyróżnia ją niewątpliwie spośród wielu pozostałych neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych [5],
takich jak chociażby znacznie częściej występująca choroba
Alzheimera (AD, ang. Alzheimer’s disease) czy też choroba
Parkinsona (PD, ang. Parkinson’s disease), które mogą być
wywołane mutacjami w różnych genach. U zdecydowanej
większości chorych na AD lub PD nie udaje się nawet zidentyfikować żadnego defektu genetycznego odpowiedzialnego za chorobę, podczas gdy wszyscy chorzy na HD nie tylko wykazują mutację w tym samym genie, ale w dodatku
jest to zawsze ten sam typ mutacji. Teoretycznie powinno
to sprzyjać rozwojowi rozmaitych „celowanych” strategii
terapeutycznych, ukierunkowanych na zmutowaną formę
konkretnego genu lub białka i skutecznie zapobiegających
chorobie lub też znacząco łagodzącej jej objawy. Tymczasem dotychczasowy brak spektakularnych sukcesów w tej
dziedzinie, czyli brak skutecznego leku przeciwko chorobie Huntingtona, jest nie tylko złą wiadomością dla tysięcy
osób cierpiących na HD, ale także niezbyt dobrym prognostykiem dla badaczy poszukujących efektywnej terapii dla
pozostałych neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych,
cechujących się znacznie bardziej skomplikowanym podłożem genetycznym.
W ostatnim czasie zaobserwować można znaczną intensyfikację prac nad nowymi podejściami terapeutycznymi
do choroby Huntingtona, co daje uzasadnioną nadzieję na
wypracowanie skutecznego sposobu jej leczenia (Ryc. 1).
Celem niniejszego opracowania jest scharakteryzowanie
wszystkich najbardziej obiecujących strategii leczenia HD,
w których główną rolę odgrywają elementy molekularne,
a które jednocześnie są efektem znacznego wzbogacenia
naszej wiedzy na temat przynajmniej niektórych aspektów
molekularnej patogenezy choroby Huntingtona.
jawia. W ciągu kilku ostatnich lat przeprowadzono szereg
badań w pełni potwierdzających słuszność powyższego założenia, przynajmniej w przypadku testowania tej strategii
na mysich modelach choroby Huntingtona, gdzie obniżenie
poziomu ekspresji zmutowanego genu HD prowadziło nie
tylko do zahamowania postępu choroby, ale nawet do cofnięcia się obserwowanych wcześniejszych objawów HD.
W większości dotychczasowych badań skuteczne wyciszenie ekspresji genu HD osiągano wykorzystując mechanizm interferencji RNA (RNAi, ang. RNA interference) [6,7],
przy czym z powodzeniem wykorzystywano zarówno
technologie oparte na siRNA (ang. small interfering RNA),
jak i na miRNA (ang. micro RNA) lub na zbliżonych do nich
strukturalnie cząsteczkach shRNA (ang. short hairpin RNA)
[8,9]. Rozpoczęcie testów klinicznych wykorzystujących
mechanizm RNAi napotyka jednak szereg przeszkód, co
wiąże się z co najmniej trzema głównymi zastrzeżeniami
wysuwanymi wobec tego podejścia terapeutycznego, z których wszystkie związane są z kwestiami bezpieczeństwa
pacjentów poddanych ewentualnemu leczeniu. Pierwsze z
tych zastrzeżeń odnosi się do generalnie niskiego stopnia
specyficzności cząsteczek terapeutycznych wykorzystujących mechanizm RNAi, co ilustrowane jest dość częstymi
przypadkami zaburzenia profilu ekspresji innych genów
[10,11] i trudnym do określenia ryzykiem pojawienia się
niekorzystnych skutków ubocznych.
Drugie zastrzeżenie wysuwane wobec strategii terapeutycznych opartych na RNAi dotyczy niewielkich możliwości regulowania czasu trwania terapii, co wiąże się zarówno
z małą stabilnością stosowanych w niektórych terapiach
cząsteczek siRNA (a co za tym idzie stosunkowo krótkim
czasem ich półtrwania i koniecznością częstego powtarzania procedury podawania leku), jak i z trudnościami dotyczącymi kontrolowania czasu działania dostarczanych
przez wektor wirusowy cząsteczek shRNA lub miRNA,
które zapewniają co prawda długoterminowe działanie,
ale nie umożliwiają skutecznego kontrolowania ich aktywności, włącznie z ewentualną możliwością zatrzymania
terapii [6]. Warto jednak zaznaczyć, że niektóre badania
przeprowadzone na modelu mysim wskazują na skuteczne powstrzymanie rozwoju choroby nawet w wyniku sto-
ZAHAMOWANIE EKSPRESJI
ZMUTOWANEGO GENU HD
W świetle powyższych informacji na temat patofizjologii
choroby Huntingtona, próba zablokowania ekspresji zmutowanego genu wydaje się najbardziej oczywistą strategią
przy wyborze optymalnego sposobu leczenia HD. Wynika
to między innymi z tego, że całkowite usunięcie lub naprawa zmutowanego genu wydają się w chwili obecnej zbyt
trudne do przeprowadzenia od strony technicznej (choć jest
to teoretycznie osiągalne), natomiast samo zahamowanie
ekspresji genu kodującego zmutowaną huntingtynę powinno prowadzić do wystarczającego terapeutycznie obniżenia
poziomu produkcji toksycznej formy białka, nawet jeśli dotąd nie wiadomo dokładnie w czym ten kluczowy element
toksyczności zmutowanej huntingtyny się właściwie przePostępy Biochemii 61 (1) 2015
Rycina 1. Schemat przedstawiający potencjalne cele molekularnych strategii terapeutycznych dla choroby Huntingtona.
19
sunkowo krótkotrwałego wyciszenia ekspresji genu HD
[12]. Podejrzewa się więc, że nawet chwilowe zahamowanie ekspresji zmutowanego genu daje komórkom szansę na
szybkie pozbycie się nadmiaru toksycznego polipeptydu i
niejako „wyzerowanie” jego poziomu, co może skutecznie
odwlekać ponowne pojawienie się objawów choroby, wymagające niewątpliwie długotrwałej akumulacji toksycznej
formy huntingtyny, o czym świadczy chociażby stosunkowo późny wiek zachorowania na HD.
Trzecia kontrowersja dotycząca terapeutycznego stosowania RNAi w chorobie Huntingtona wiąże się z faktem, że
większość metod opartych na interferencji RNA nie różnicuje pomiędzy zmutowanym i prawidłowym allelem genu,
co prowadzi do jednoczesnego obniżenia poziomu obu
form huntingtyny w neuronach. Co prawda wiele wskazuje na to, że obecność prawidłowej huntingtyny jest niezbędna głównie na etapie rozwoju zarodkowego ssaków, a
późniejszemu istotnemu obniżeniu poziomu tego białka nie
towarzyszą żadne znaczące patologie [13,14], jednak wielu
badaczy zdecydowało się na opracowanie takich wariantów
opisywanej metody, które selektywnie wyciszają jedynie
zmutowane warianty genu. Zaprojektowanie stosunkowo
krótkiej cząsteczki terapeutycznej o sekwencji skutecznie
rozpoznającej jedynie patogennie wydłużone ciągi (CAG)n,
a nie ich nieco krótsze odpowiedniki, nie jest jednak łatwe,
więc postanowiono w tym celu wykorzystać rozmaite warianty polimorficzne, które u danej osoby mogą być sprzężone jedynie ze zmutowanym allelem genu. W tym kontekście należy wspomnieć o skutecznym zastosowaniu w tym
celu zupełnie innej formy terapeutycznych oligonukleotydów, które w odróżnieniu od siRNA lub miRNA są jednoniciowymi cząsteczkami DNA (a nie RNA), a w procesie
wyciszania genów wykorzystują nie interferencję RNA,
lecz zupełnie inny mechanizm oparty na degradacji rozpoznawanej sekwencji RNA przez RNAzę H. Metoda wykorzystująca takie chemicznie modyfikowane antysensowne
jednoniciowe cząsteczki DNA (ASO, ang. antisense oligonucleotides) do wyciszenia wybranych wariantów danego genu
została z powodzeniem wykorzystana do specyficznego
wyłączania zmutowanych kopii genu HTT [15-17], co zostało ogłoszone jako wstęp do nowej zindywidualizowanej
formy leczenia HD [18], wymagającej projektowania leku
pod kątem danego pacjenta, którego zmutowany gen HD
zawiera specyficzny zestaw polimorfizmów typu SNP (ang.
single nucleotide polymorphism), towarzyszących mutacji.
WIĄZANIE ORAZ INAKTYWACJA TOKSYCZNEGO
WARIANTU HUNTINGTYNY
Nieco mniej intensywnie badaną potencjalną metodą skutecznego leczenia HD jest strategia polegająca na wykorzystaniu przeciwciał specyficznie rozpoznających zmutowane
warianty huntingtyny [19,20]. Chodzi tu nie tyle o klasyczne formy przeciwciał, co o ich zmodyfikowane przy użyciu
inżynierii genetycznej fragmenty produkowane wewnątrz
komórki i skierowane przeciwko wewnątrzkomórkowym
białkom docelowym. W piśmiennictwie anglojęzycznym
określa się tego typu przeciwciała terminem „intrabodies”
lub rzadziej „nanobodies”. Wewnątrzkomórkowe przeciwciała projektowane pod kątem terapii HD rozpoznają często
nie tyle zmutowaną sekwencję aminokwasową hunting-
20
tyny, co raczej charakterystyczną strukturę przestrzenną
przyjmowaną przez przypuszczalnie toksyczne N-końcowe fragmenty zmutowanego białka. Mechanizm, dzięki
któremu wiązanie się wewnątrzkomórkowych przeciwciał
z fragmentami zmutowanego białka obniża poziom toksycznych peptydów huntingtyny w komórce, wpływając
jednocześnie na zahamowanie procesu ich akumulacji w
ciałach inkluzyjnych, nie jest do końca jasny. Można jednak z dużym prawdopodobieństwem przypuszczać, że
oddziaływania takie stabilizują prawidłową nietoksyczną
konformację zmutowanej huntingtyny, co z jednej strony
powinno chronić ją przed wzmożoną agregacją, a z drugiej
powinno ułatwiać jej degradację w proteasomach, które w
innym przypadku są nie tylko niezdolne do skutecznego
degradowania zmutowanej huntingtyny, ale też próby takiej degradacji nieprawidłowo zwiniętego białka powodują
zablokowanie proteasomu, co jest jednym z hipotetycznych
mechanizmów odpowiedzialnych za patogenezę HD.
Wysoka specyficzność wewnątrzkomórkowych przeciwciał w odniesieniu do zmutowanej formy huntingtyny
jest często przeciwstawiana znacznie niższemu poziomowi specyficzności osiąganemu w przypadku wyciszania
zmutowanego genu HD z zastosowaniem RNAi lub ASO,
co pozwala budzić duże nadzieje na szczególnie wysoką
skuteczność terapeutyczną omawianych przeciwciał. Warto
jednak zaznaczyć, że niektóre wewnątrzkomórkowe przeciwciała skierowane przeciwko zmutowanej huntingtynie
mogą wykazywać w pewnych okolicznościach działanie
odwrotne od zamierzonego, inicjując na przykład agregację białka lub zwiększając toksyczność komórkową. Z kolei
dość powszechnie używane przeciwciała skierowane przeciwko wydłużonemu ciągowi poli-Q wykazują znaczące
powinowactwo do innych białek zawierających wydłużone
ciągi poliglutaminowe, co oczywiście zwiększa szanse ich
zastosowania w leczeniu dość licznej grupy chorób poliglutaminowych, ale jednocześnie zwraca uwagę na potencjalne
efekty uboczne związane ze zmniejszoną specyficznością.
Te i inne aspekty potencjalnie leczniczego działania przeciwciał wewnątrzkomórkowych sprawiają, że badania nad
ich zastosowaniem w terapii HD są jeszcze na bardzo wczesnym etapie badań przedklinicznych i nie należy raczej
oczekiwać szybkiego rozpoczęcia fazy klinicznej.
Wspomniany powyżej aspekt stabilizacji prawidłowej
konformacji przestrzennej białka przez oddziaływanie z
przeciwciałami wewnątrzkomórkowymi przypomina oczywiście podobny mechanizm działania białek opiekuńczych.
Nic więc dziwnego, że jednym z poważnie rozpatrywanych
wariantów leczenia nie tylko choroby Huntingtona, ale także innych chorób związanych z patogenną agregacją białek,
jest nadprodukcja wybranych białek opiekuńczych lub też
innych białek lub peptydów o podobnym działaniu [21]. W
przypadku choroby Huntingtona na szczególną uwagę zasługują zwłaszcza udane próby wykorzystania w tym celu
białka szoku termicznego Hsp40 (ang. heat shock protein 40
kDa) oraz wykrytego metodą przesiewową peptydu o nazwie PBQ1 (ang. polyQ-binding peptide 1) [22], w obu przypadkach dotyczące na razie jedynie badań przedklinicznych.
www.postepybiochemii.pl
Wiele opisanych powyżej form terapii molekularnej,
zarówno tych związanych z nadprodukcją wewnątrzkomórkowych przeciwciał lub białek opiekuńczych, jak i tych
wykorzystujących mechanizm RNAi, można zaliczyć do
klasycznych postaci terapii genowej, bowiem w każdym takim przypadku mamy do czynienia z wprowadzeniem do
leczonego organizmu nowego genu, kodującego białko lub
cząsteczkę kwasu nukleinowego o działaniu terapeutycznym [23]. Kluczowym elementem takiej terapii genowej jest
wybranie odpowiedniego wektora i sposobu jego wprowadzania do organizmu, tak aby zapewnić wysoką skuteczność dostarczania terapeutycznego genu do odpowiedniego rodzaju komórek. W przypadku terapii HD najczęściej
wykorzystywanym do tego celu wektorem jest satelitarny
wirus adenowirusa AAV (ang. adeno-associated virus), który
nie tylko cechuje się wyjątkowo niską immunoreaktywnością, ale ponadto zapewnia skuteczne wprowadzenie genu
do niedzielących się komórek nerwowych w odpowiednich
obszarach mózgu. Na uwagę zasługuje też obserwacja, że
obniżenie poziomu zmutowanego białka wymagane jest
w tym przypadku nie tylko w odniesieniu do prążkowia,
a więc miejsca szczególnie narażonego na neurodegenerację w chorobie Huntingtona, ale także, lub może nawet
przede wszystkim, do kory mózgu [24]. Jest to zgodne z
hipotezą, że toksyczne działanie zmutowanej huntingtyny
obejmuje przede wszystkim wpływ na obniżenie produkcji
czynników neurotroficznych przez korę mózgu, co dotyczy
w szczególności czynnika BDNF (ang. brain-derived neurotrophic factor), produkowanego przez korę i dostarczanego
następnie do komórek prążkowia, które w przypadku pozbawienia dostępu do BDNF ulegają przyśpieszonej śmierci
komórkowej [25].
POWSTRZYMYWANIE ŚMIERCI KOMÓRKOWEJ
Sugerowana powyżej kluczowa rola braku czynników
neurotroficznych jako głównej przyczyny podwyższonej
podatności komórek prążkowia na śmierć wywołaną toksycznym działaniem zmutowanej huntingtyny wskazuje na
możliwość skutecznego leczenia choroby Huntingtona poprzez osłabienie wrażliwości komórek nerwowych na toksyczność huntingtyny i tym samym znaczące zwiększenie
ich przeżywalności. Powstrzymanie postępującego procesu neurodegeneracji w prążkowiu wydaje się możliwe do
osiągnięcia na przykład poprzez dostarczenie tamtejszym
neuronom wystarczającej dawki czynników neurotroficznych. Poza wspomnianym już powyżej czynnikiem BDNF
rozpatrywane jest także wykorzystanie w tym celu innych
czynników troficznych, takich jak GDNF (ang. glial cell line-derived neurotrphic factor), blisko z nim spokrewniona
neurturyna (NRTN), lub też CNTF (ang. ciliary neurotrophic
factor) [23,26]. Oprócz dostarczenia neuronom tych czynników troficznych w postaci wektorów wirusowych AAV,
zawierających cDNA odpowiadających im genów, rozważa
się także wykorzystanie niskocząsteczkowych związków
będących agonistami receptorów komórkowych dla tychże
czynników. Obejmować to może chociażby liczne związki
o działaniu potencjalnie agonistycznym wobec kinazy TrkB
(ang. tropomyosin related kinase B), które miałyby za zadanie
uruchomić szlak pobudzany przez BDNF, a więc czynnik
troficzny, który wykonuje swą podstawową funkcję koPostępy Biochemii 61 (1) 2015
mórkową właśnie poprzez łączenie się z receptorem TrkB.
Niestety stosunkowo niska wydajność tego konkretnego
wariantu terapeutycznego nie wydaje się zapewniać oczekiwanego efektu leczniczego [27]. Warto jednak zwrócić
uwagę na nieco bardziej obiecującą pokrewną strategię terapeutyczną dotyczącą próby wykorzystania innych niskocząsteczkowych związków do osłabienia obserwowanej w
przypadku HD represji transkrypcyjnej genu BDNF, wywołanej działaniem czynnika transkrypcyjnego REST (ang.
RE1-silencing transcription factor), znanego też jako NRSF (ang.
neuron-restrictive silencer factor) [28].
Innym potencjalnym sposobem powstrzymywania
śmierci komórkowej w HD jest wykorzystanie licznej grupy
związków o działaniu przeciwutleniającym, wpływających
ochronnie na funkcjonowanie neuronów. W kontekście terapii HD szczególne nadzieje wiąże się zwłaszcza z zastosowaniem peroksydazy glutationowej, która nie tylko wyróżnia się skutecznością w łagodzeniu objawów neurologicznych obserwowanych w mysim modelu choroby, ale także,
w przeciwieństwie do wielu innych przeciwutleniaczy o
potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym, nie hamuje
procesu autofagii, odgrywającego prawdopodobnie kluczową rolę w usuwaniu zmutowanej huntingtyny z komórki
(patrz dalej) [29].
Warto zwrócić też uwagę na fakt, że powstrzymywanie
samego procesu śmierci komórek nerwowych, będącego w
gruncie rzeczy ostateczną przyczyną wystąpienia objawów
klinicznych choroby, jest strategią mogącą mieć potencjalne
zastosowanie nie tylko w chorobie Huntingtona, ale także w
całej, bardzo licznej grupie chorób neurodegeneracyjnych,
zwłaszcza w przypadku chorób związanych dodatkowo z
agregacją toksycznych, nieprawidłowo zwiniętych białek.
Dotyczy to przede wszystkim tych strategii terapeutycznych, które oparte są na blokowaniu rozmaitych szlaków
kluczowych dla indukcji i przebiegu procesu apoptozy,
czyli programowanej śmierci komórkowej. Szczególną rolę
w leczeniu chorób agregacyjnych odgrywać może przy tym
zablokowanie apoptozy będącej wynikiem odpowiedzi na
pojawienie się w komórce nadmiernej ilości nieprawidłowo zwiniętych białek (UPR, ang. unfolded protein response)
[30]. Istnieje wiele potencjalnych dróg blokowania tychże
procesów, ale warto zauważyć, że jedna z nich spotkała się
ostatnio ze szczególnym zainteresowaniem nie tylko wielu
badaczy zajmujących się tą tematyką, ale także licznych mediów na całym świecie. Chodzi mianowicie o zeszłoroczną
bardzo udaną próbę skutecznego powstrzymania śmierci
neuronów w mysim modelu choroby prionowej [31], co
osiągnięto blokując enzym o nazwie PERK (ang. protein
kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase), stanowiący jeden z głównych regulatorów odpowiedzi UPR. Choć wielu
fachowych komentatorów ostrzega przed zbyt wczesnym
entuzjazmem, trudno nie zauważyć, że ewentualny sukces
badań klinicznych z użyciem tej formy terapii stanowiłby
prawdopodobnie przełom w leczeniu licznej grupy neurodegeneracyjnych chorób agregacyjnych [32], co budzi szczególne nadzieje u ogromnej rzeszy osób, których krewni cierpią na chorobę Alzheimera, ale podobnych korzyści można
także oczekiwać w przypadku choroby Huntingtona.
21
AKTYWACJA SZLAKÓW USUWANIA
ZMUTOWANEJ HUNTINGTYNY
Ostatnia z omawianych tutaj grup molekularnych strategii leczenia HD obejmuje te podejścia terapeutyczne, które
skupiają się na aktywacji lub przyspieszeniu różnych procesów prowadzących do usunięcia zmutowanej huntingtyny z komórki. Naturalny proces degradacji prawidłowej
huntingtyny obejmuje udział zarówno systemu ubikwitynowo-proteasomalnego (UPS, ang. ubiquitin-proteasome
system), jak i autofagosomalnej drogi degradacji białka. Jak
wspomniano już powyżej, pojawienie się zmutowanej huntingtyny z nadmiernie wydłużonym ciągiem poli-Q blokuje
funkcję proteasomu [33], co oczywiście znacząco zmniejsza
szansę na wykorzystanie tej drogi degradacji w terapii HD.
Prowadzone są jednak próby wykorzystania niektórych
aktywatorów ścieżki proteasomalnej do przyśpieszenia degradacji zmutowanej huntingtyny, i choć brak jest na razie
spektakularnych sukcesów w tej dziedzinie, to warto podkreślić, że jeden z takich aktywatorów o nazwie NUB1 (ang.
NEDD8 ultimate buster-1) wykazuje pożądaną aktywność u
muszki owocowej, obniżając poziom zmutowanej huntingtyny i redukując jej toksyczność [34], a nieopublikowane
jeszcze wyniki badań na mysim modelu choroby wydają się
być równie obiecujące, zwłaszcza w świetle faktu, że podwyższenie poziomu NUB1 można osiągnąć podając interferon β, stosowany już w leczeniu stwardnienia rozsianego
[35].
W ostatnim czasie znacznie więcej uwagi zwraca się jednak na alternatywną ścieżkę degradacji huntingtyny, czyli autofagię, przy czym dotyczy to zarówno tzw. autofagii
związanej z białkami opiekuńczymi (CMA, ang. chaperone-mediated autophagy), jak i klasycznej makroautofagii,
do której odnosi się zazwyczaj sam termin autofagia [36].
Już po pojawieniu się pierwszych doniesień sugerujących
kluczową rolę autofagii w degradacji białek poliglutaminowych [37] wskazywano na potencjalne zastosowanie
tej ścieżki degradacji zmutowanej huntingtyny w leczeniu
HD. Dotychczasowe badania w tym kierunku obejmowały
testowanie rozmaitych molekularnych modulatorów procesu autofagii przy użyciu różnych mysich modeli choroby
Huntingtona, przy czym wszystkie te badania wskazywały
bez wyjątku na znaczącą poprawę fenotypu chorych myszy,
czemu towarzyszyło zawsze obniżenie poziomu akumulacji
huntingtyny w agregatach białkowych [34]. Warto zaznaczyć, że skuteczne okazało się wykorzystywanie dwóch
różnych szlaków aktywacji autofagii, a więc zarówno tego
zależnego, jak i niezależnego od mTOR (ang. mammalian target of rapamycin). Do najciekawszych testowanych modulatorów autofagii zaliczyć można trehalozę, czyli nietoksyczny cukier, który można podawać doustnie, a także inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC, ang. histone deacetylase).
Przypadek HDAC jest o tyle znamienny, że białko to było
od dawna podejrzewane o zaangażowanie w proces patogenezy nie tylko choroby Huntingtona, ale także wielu innych
chorób neurodegeneracyjnych. HDAC oddziałuje z różnymi białkami poliglutaminowymi i uważany jest za kluczowe ogniwo łączące niewydolny system UPS z alternatywną
ścieżką degradacji na drodze autofagii [38,39].
22
Choć na ogół uważa się, że autofagia przyczynia się głównie do eliminacji zagregowanej formy zmutowanej huntingtyny, istnieją dowody na to że CMA, czyli wariant autofagii
przebiegający za pośrednictwem białek opiekuńczych, jest
ukierunkowany głównie na niezagregowane (rozpuszczalne) formy N-końcowych fragmentów zmutowanej huntingtyny [40], które podejrzewa się powszechnie o szczególnie
wysoką toksyczność, co znajduje odbicie w znaczącym
spadku toksyczności huntingtyny pod wpływem indukcji
CMA w mysim modelu choroby [41]. Sprawia to oczywiście, że tę konkretną postać molekularnej terapii HD uważa
się obecnie za jedną z najbardziej obiecujących.
Intensywnym badaniom nad zaangażowaniem modulatorów autofagii w proces leczenia HD towarzyszy dyskusja
dotycząca wyboru optymalnego momentu indukcji autofagii u osób chorych. Przypuszcza się bowiem, że o ile stosunkowo wczesna aktywacja procesu autofagii powinna być
korzystna dla pacjentów, umożliwiając im pozbycie się toksycznych form agregującego białka zanim doprowadzą one
do pojawienia się istotnych zmian patologicznych, o tyle
zaawansowane przypadki choroby mogą cechować się na
tyle poważnym rozregulowaniem systemu proteasomalnego i lizosomalnego, że wydajność indukcji procesu autofagii
okaże się na tym etapie choroby znikoma. Przyszłe badania
powinny zweryfikować te przypuszczenia, dostarczając danych pozwalających opracować optymalną procedurę takiej
terapii.
INNE PODEJŚCIA TERAPEUTYCZNE
Choć prezentowane opracowanie poświęcone jest zasadniczo tylko tym potencjalnym formom terapii choroby Huntingtona, które opierają się przede wszystkim na technikach
molekularnych, należy też wspomnieć o dwóch innych
obiecujących sposobach leczenia HD, którym poświęca się
ostatnio niemal równie wiele uwagi. Pierwsza z tych nowo
opracowywanych metod leczenia przewiduje wykorzystanie przeszczepu komórek do związanych z patogenezą
choroby obszarów mózgu, przy czym teoretycznie możliwe
jest wykorzystanie w tym celu zarówno płodowych komórek prążkowia, jak i zarodkowych komórek macierzystych
lub też indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC, ang. induced pluripotent stem cells) pochodzących od samego pacjenta i poddanych wcześniej korekcie
defektu genetycznego w genie HTT [42,43]. Każdy z tych
wariantów wiąże się niestety nie tylko z określonymi ograniczeniami technicznymi, ale często także z dość poważnymi dylematami natury etycznej, co sprawia, że ten sposób
leczenia jest przez wielu uważany za co najmniej kontrowersyjny.
Drugie z sygnalizowanych niemolekularnych podejść
terapeutycznych do choroby Huntingtona dotyczy magnetycznej lub elektrycznej stymulacji mózgu, techniki stosowanej z dość dużym powodzeniem w przypadki niektórych
innych chorób neurologicznych. W leczeniu HD próbuje się
wykorzystać zarówno nieinwazyjne techniki stymulacji
mózgu, takie jak przezczaszkowa stymulacja magnetyczna
(TMS, ang. transcranial magnetic stymulation) [44], jak i głęboką stymulację mózgu (DBS, ang. deep brain stimulation)
www.postepybiochemii.pl
[45,46], co w obu przypadkach wydaje się głównie redukować objawy pląsawicze.
UWAGI KOŃCOWE
W przypadku przynajmniej niektórych spośród wymienionych powyżej potencjalnych metod leczenia HD, ich
skuteczność zależeć będzie w ogromnej mierze od tego,
czy pozwolą one na usunięcie głównej przyczyny choroby
Huntingtona, co w świetle naszej bardzo ograniczonej wiedzy o patofizjologii tego schorzenia jest niestety dość trudne
do przewidzenia. Jeśli ostatecznie potwierdzą się ostatnie
doniesienia sugerujące, że podstawowy patomechanizm
odpowiedzialny za wszystkie choroby poliglutaminowe, w
tym także za HD, wykorzystuje odkryty niedawno proces
RAN-translacji (ang. repeat-associated non-ATG translation),
polegający na produkowaniu przez nadmiernie wydłużone
sekwencje mikrosatelitarne licznych transkryptów kodujących kilka rodzajów toksycznych peptydów homopolimerowych, odczytywanych z sekwencji RNA przy użyciu
różnych ramek odczytu [47], może to oznaczać, że wszelkie terapie ukierunkowane na zablokowanie lub usunięcie
zmutowanej formy huntingtyny okażą się niewystarczająco
skuteczne, gdyż nie wyeliminują równoległego szlaku patogenezy, być może odgrywającego kluczową rolę w rozwoju
choroby. Pokazuje to bardzo dobitnie, jak ogromną rolę w
planowaniu skutecznej terapii odgrywają badania zmierzające do zidentyfikowania kluczowego mechanizmu patogenezy choroby Huntingtona [48,49].
W świetle powyższego zagadnienia należy zwrócić uwagę na znaczną liczbę leków lub potencjalnie terapeutycznych związków niskocząsteczkowych wykrywanych przy
okazji rozmaitych badań przesiewowych, których mechanizm działania nie jest do końca poznany, jednak mogą one
być z powodzeniem wykorzystywane w przyszłej terapii, o
ile tylko pomyślnie przejdą wszystkie etapy wymaganych
testów klinicznych. W tym kontekście ciekawy wydaje się
też fakt, że wiele spośród powszechnie stosowanych leków
psychotropowych, w tym także tych, które stosuje się w leczeniu objawów psychiatrycznych u chorych z HD, wykazuje także dodatkowe działanie neuroprotekcyjne, które jest
przedmiotem dość intensywnych badań, prowadzonych zarówno na etapie przedklinicznym, jak i klinicznym [50].
PIŚMIENNICTWO
1. Walker FO (2007) Huntington’s disease. Lancet 369: 218-228
2. Milewski M, Bal J (1993) Mutacje dynamiczne. Funkcja niestabilnych
sekwencji DNA w niektórych chorobach genetycznych człowieka. Postepy Biochem 39: 228-236
3. Truant R, Atwal RS, Desmond C, Munsie L, Tran T (2008) Huntington’s disease: revisiting the aggregation hypothesis in polyglutamine
neurodegenerative diseases. FEBS J 275: 4252-4262
4. Gil JM, Rego AC (2008) Mechanisms of neurodegeneration in Huntington’s disease. Eur J Neurosci 27: 2803-2820
5. Bąk D, Milewski M (2005) Choroby związane z agregacją białek. Postepy Biochem 51: 297-307
6. Wyszko E, Szaflarski W, Barciszewski J (2003) Interferencyjny RNA molekularny regulator ekspresji genu. Postepy Biochem 49: 2-8
7. Bąk D (2003) RNAi - interferencja RNA - skuteczny sposób na ciszę.
Postepy Biochem 49: 136-146
8. Harper SQ (2009) Progress and challenges in RNA interference therapy for Huntington disease. Arch Neurol 66: 933-938
Postępy Biochemii 61 (1) 2015
9. Zhang Y, Friedlander RM (2011) Using non-coding small RNAs to
develop therapies for Huntington’s disease. Gene Ther 18: 1139-1149
10.McBride JL, Boudreau RL, Harper SQ, Staber PD, Monteys AM, Martins I, Gilmore BL, Burstein H, Peluso RW, Polisky B, Carter BJ, Davidson BL (2008) Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in
the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. Proc
Natl Acad Sci USA 105: 5868-5873
11.Denovan-Wright EM, Rodriguez-Lebron E, Lewin AS, Mandel RJ
(2008) Unexpected off-targeting effects of anti-huntingtin ribozymes
and siRNA in vivo. Neurobiol Dis 29: 446-455
12.Aronin N, DiFiglia M (2011) Huntingtin-lowering strategies in Huntington’s disease: Antisense oligonucleotides, small RNAs, and gene
editing. Mov Disord 29: 1455-1461
13.Boudreau RL, McBride JL, Martins I, Shen S, Xing Y, Carter BJ, Davidson BL (2009) Nonallele-specific silencing of mutant and wild-type
huntingtin demonstrates therapeutic efficacy in Huntington’s disease
mice. Mol Ther 17: 1053-1063
14.Drouet V, Perrin V, Hassig R, Dufour N, Auregan G, Alves S, Bonvento G, Brouillet E, Luthi-Carter R, Hantraye P, Déglon N (2009) Sustained effects of nonallele-specific Huntingtin silencing. Ann Neurol
65: 276-285
15.Kordasiewicz HB, Stanek LM, Wancewicz EV, Mazur C, McAlonis
MM, Pytel KA, Artates JW, Weiss A, Cheng SH, Shihabuddin LS,
Hung G, Bennett CF, Cleveland DW (2011)Sustained therapeutic reversal of Huntington’s disease by transient repression of huntingtin
synthesis. Neuron 74: 1031-1044
16.Østergaard ME, Southwell AL, Kordasiewicz H, Watt AT, Skotte NH,
Doty CN, Vaid K, Villanueva EB, Swayze EE, Bennett CF, Hayden MR,
Seth PP (2013) Rational design of antisense oligonucleotides targeting
single nucleotide polymorphisms for potent and allele selective suppression of mutant Huntingtin in the CNS. Nucleic Acids Res 41: 96349650
17.Skotte NH, Southwell AL, Ostergaard ME, Carroll JB, Warby SC, Doty
CN, Petoukhov E, Vaid K, Kordasiewicz H, Watt AT, Freier SM, Hung
G, Seth PP, Bennett CF, Swayze EE, Hayden MR (2014) Allele-specific
suppression of mutant huntingtin using antisense oligonucleotides:
providing a therapeutic option for all huntington disease patients.
PLoS One 9: e107434
18.Kay C, Skotte NH, Southwell AL, Hayden MR (2014) Personalized
gene silencing therapeutics for Huntington disease. Clin Genet 86: 2936
19.Butler DC, McLear JA, Messer A (2012) Engineered antibody therapies
to counteract mutant huntingtin and related toxic intracellular proteins. Prog Neurobiol 97: 190-204
20.Messer A, Joshi SN (2013) Intrabodies as neuroprotective therapeutics.
Neurotherapeutics 10: 447-458
21.Nagai Y, Fujikake N, Popiel HA, Wada K (2010) Induction of molecular chaperones as a therapeutic strategy for the polyglutamine diseases. Curr Pharm Biotechnol 11: 188-197
22.Popiel HA, Takeuchi T, Fujita H, Yamamoto K, Ito C, Yamane H, Muramatsu S, Toda T, Wada K, Nagai Y (2012) Hsp40 gene therapy exerts
therapeutic effects on polyglutamine disease mice via a non-cell autonomous mechanism. PLoS One 7: e51069
23.Ramaswamy S, Kordower JH (2012) Gene therapy for Huntington’s
disease. Neurobiol Dis 48: 243-254
24.Wang N, Gray M, Lu XH, Cantle JP, Holley SM, Greiner E, Gu X, Shirasaki D, Cepeda C, Li Y, Dong H, Levine MS, Yang XW (2014) Neuronal
targets for reducing mutant huntingtin expression to ameliorate disease in a mouse model of Huntington’s disease. Nat Med 20: 536-541
25.Zuccato C, Cattaneo E (2007) Role of brain-derived neurotrophic factor
in Huntington’s disease. Prog Neurobiol 81: 294-330
26.Zuccato C, Liber D, Ramos C, Tarditi A, Rigamonti D, Tartari M, Valenza M, Cattaneo E (2005) Progressive loss of BDNF in a mouse model
of Huntington’s disease and rescue by BDNF delivery. Pharmacol Res
52: 133-139
27.Todd D, Gowers I, Dowler SJ, Wall MD, McAllister G, Fischer DF, Dijkstra S, Fratantoni SA, van de Bospoort R, Veenman-Koepke J, Flynn
G, Arjomand J, Dominguez C, Munoz-Sanjuan I, Wityak J, Bard JA
23
(2014) A monoclonal antibody TrkB receptor agonist as a potential
therapeutic for Huntington’s disease. PLoS One 9: e87923
28.Rigamonti D, Mutti C, Zuccato C, Cattaneo E, Contini A (2009) Turning REST/NRSF dysfunction in Huntington’s disease into a pharmaceutical target. Curr Pharm Des 15: 3958-3967
29.Mason RP, Casu M, Butler N, Breda C, Campesan S, Clapp J, Green
EW, Dhulkhed D, Kyriacou CP, Giorgini F (2013) Glutathione peroxidase activity is neuroprotective in models of Huntington’s disease.
Nat Genet 45: 1249-1254
30.Hetz C, Chevet E, Harding HP (2013) Targeting the unfolded protein
response in disease. Nat Rev Drug Discov 12: 703-719
31.Moreno JA, Halliday M, Molloy C, Radford H, Verity N, Axten JM,
Ortori CA, Willis AE, Fischer PM, Barrett DA, Mallucci GR (2013) Oral
treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med
5: 206ra138
32.Scheper W, Hoozemans JJ (2013) A new PERKspective on neurodegeneration. Sci Transl Med 5: 206fs37
33.Ortega Z, Díaz-Hernández M, Lucas JJ (2007) Is the ubiquitin-proteasome system impaired in Huntington’s disease? Cell Mol Life Sci 64:
2245-2257
34.Lu B, Al-Ramahi I, Valencia A, Wang Q, Berenshteyn F, Yang H, Gallego-Flores T, Ichcho S, Lacoste A, Hild M, Difiglia M, Botas J, Palacino
J (2013) Identification of NUB1 as a suppressor of mutant Huntington
toxicity via enhanced protein clearance. Nat Neurosci 16: 562-570
35.Yu S, Liang Y, Palacino J, Difiglia M, Lu B (2014) Drugging unconventional targets: insights from Huntington’s disease. Trends Pharmacol
Sci 35: 53-62
36.Cortes CJ, La Spada AR (2014) The many faces of autophagy dysfunction in Huntington’s disease: from mechanism to therapy. Drug Discov Today 19: 963-971
37.Ravikumar B, Duden R, Rubinsztein DC (2002) Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by
autophagy. Hum Mol Genet 11: 1107-1117
38.Pandey UB, Nie Z, Batlevi Y, McCray BA, Ritson GP, Nedelsky NB,
Schwartz SL, DiProspero NA, Knight MA, Schuldiner O, Padmanabhan R, Hild M, Berry DL, Garza D, Hubbert CC, Yao TP, Baehrecke
EH, Taylor JP (2007) HDAC6 rescues neurodegeneration and provides
an essential link between autophagy and the UPS. Nature 447: 859-863
39.Jia H, Kast RJ, Steffan JS, Thomas EA (2012) Selective histone deacetylase (HDAC) inhibition imparts beneficial effects in Huntington’s disease mice: implications for the ubiquitin-proteasomal and autophagy
systems. Hum Mol Genet 21: 5280-5293
40.Qi L, Zhang XD (2014) Role of chaperone-mediated autophagy in degrading Huntington’s disease-associated huntingtin protein. Acta Biochim Biophys Sin 46: 83-91
41.Bauer PO, Goswami A, Wong HK, Okuno M, Kurosawa M, Yamada
M, Miyazaki H, Matsumoto G, Kino Y, Nagai Y, Nukina N (2010) Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation
of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol 28: 256-263
42.Chen Y, Carter RL, Cho IK, Chan AW (2014) Cell-based therapies for
Huntington’s disease. Drug Discov Today 19: 980-984
43.Ross CA, Akimov SS (2014) Human-induced pluripotent stem cells:
potential for neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet 23: R17-R26
44.Berardelli A, Suppa A (2013) Noninvasive brain stimulation in Huntington’s disease. Handb Clin Neurol 116: 555-560
45.Demeestere J, Vandenberghe W (2011) Experimental surgical therapies for Huntington’s disease. CNS Neurosci Ther 17: 705-713
46.Gonzalez V, Cif L, Biolsi B, Garcia-Ptacek S, Seychelles A, Sanrey E,
Descours I, Coubes C, de Moura AM, Corlobe A, James S, Roujeau
T, Coubes P (2014) Deep brain stimulation for Huntington’s disease:
long-term results of a prospective open-label study. J Neurosurg 121:
114-122
47.Pearson CE (2011) Repeat associated non-ATG translation initiation:
one DNA, two transcripts, seven reading frames, potentially nine toxic
entities! PLoS Genet 7:e1002018
48.Golde TE (2009) The therapeutic importance of understanding mechanisms of neuronal cell death in neurodegenerative disease. Mol Neurodegener 4: 8
49.Munoz-Sanjuan I, Bates GP (2011) The importance of integrating basic and clinical research toward the development of new therapies for
Huntington disease. J Clin Invest 121: 476-483
50.Lauterbach EC (2013) Neuroprotective effects of psychotropic drugs in
Huntington’s disease. Int J Mol Sci 14: 22558-22603
Molecular therapeutic strategies for Huntington’s disease
Michał Milewski1,, Dorota Hoffman-Zacharska1,2, Jerzy Bal1
Department Medical Genetics, Institute of Mother and Child, 17a Kasprzaka St., 01-211 Warsaw, Poland
Institute of Genetics and Biotechnology, Warsaw University, 5a Pawińskiego St., 02-106 Warsaw, Poland
1
2

e-mail: [email protected]
Key words: Huntington’s disease, huntingtin, neurodegeneration, gene therapy, RNA interference, autophagy
ABSTRACT
Huntington’s disease is a progressive neurodegenerative disorder of genetic origin that still lacks an effective treatment. Recently, a number
of new attempts have been undertaken to develop a successful molecular therapy for this incurable condition. The novel approaches employ,
among others, some new methods to selectively silence the mutated gene or to neutralize its toxic protein product. This paper reviews all
major strategies that are currently considered for molecular therapy of Huntington’s disease while discussing their potential effectiveness
regarding the treatment of both the Huntington’s disease and a large group of related neurodegenerative disorders associated with abnormal
protein aggregation.
24
www.postepybiochemii.pl