POPULARYZATORSKI OPIS REZULTATÓW PROJEKTU (Wersja w

Nr wniosku: 205156, nr raportu: 8177. Kierownik (z rap.): mgr Jakub Andrzej Kochan
POPULARYZATORSKI OPIS REZULTATÓW PROJEKTU (Wersja w języku polskim)
Nie tylko obecność RNA w konkretnych komórkach, ale jego lokalizacja
wewnątrzkomórkowa decyduje o jego funkcji. W nowotworach, a także w przypadku innych
schorzeń, transkrypty są często znajdywane w niewłaściwych dla nich lokalizacjach. Z tego powodu
w ciągu ostatnich lat coraz więcej badań skupia się na analizie położenia RNA oraz poszukiwaniu
metod obrazowania transkryptów.
Świadomość, że ekspresja genów w poszczególnych komórkach w sposób znaczący różni
się od uśrednionego zachowania całych populacji przyczyniła się do rozwoju nowych metod
pozwalających na ilościowe oznaczenie RNA w pojedynczych komórkach. Jedną z nich jest
smRNA FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ do detekcji RNA połączona z analizą
mikroskopową uzyskanych preparatów. Metoda ta pozwala na uzyskanie nieosiągalnej do tej pory
czułości, specyficzności sygnału i znakomitej jakości obrazu. Jest to jedyna dostępna metoda
pozwalająca na proste, precyzyjne i stosunkowo szybkie oznaczanie ilości RNA w utrwalonych
komórkach.
Prawdziwe wyzwanie stanowi jednak połączenie smRNA FISH z immunofluorescencyjną
detekcją białek. Realizacja projektu pozwoliła na opracowanie i sprawdzenie w naszym
laboratorium procedury pozwalającej na jednoczesną detekcję białka oraz RNA opartą o metodę
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do detekcji pojedynczych cząsteczek RNA (smRNA FISH).
Połączenie tych metod otwiera nowy rozdział w badaniach oddziaływania białek z RNA, w tym na
obrazowanie szczególnie interesujących świat naukowy w ostatnich latach białek regulujących czas
półtrwania transkryptów (Rycina 1). Wykorzystując opracowaną procedurę po raz pierwszy w
sposób bezpośredni potwierdzono oddziaływanie białka MCPIP1 z mRNA IL-6. Ponadto
zbadano oddziaływanie transkryptu i białka MCPIP1 z białkami odpowiedzialnymi za regulację
stabilności mRNA.
Rycina 1 | Weryfikacja opracowanej procedury jednoczesnej detekcji białek i mRNA. (A)
Reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe komórek HeLa stymulowanych interleukiną 1β (IL-1β)
oraz komórek kontrolnych poddanych opracowanej procedurze IF › FISH (DAPI - jądra
komórkowe, NFkB - przeciwciało 1°: p65, przeciwciało 2°: Fluorescein (FITC), MCPIP1 - zestaw
sond wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym Quasar® 570). (B) Analiza ilości mRNA
MCPIP1 - względny poziom mRNA MCPIP1 obliczony w oparciu o smRNA FISH. Wartości
średnie ± SEM (smRNA FISH, n ≥ 35).