zestaw factor v leiden

ZESTAW FACTOR V LEIDEN
Do stosowania z aparatem LightCycler® 2.0
03 610 179 001
Zestaw na 32 reakcje dla maksymalnie 30 próbek
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
WAŻNA UWAGA:
INFORMACJE DOTYCZĄCE SERII ZESTAWU FACTOR V LEIDEN PODANO NA ODWROCIE NINIEJSZEJ ULOTKI DOŁĄCZONEJ DO
OPAKOWANIA W POSTACI ALFANUMERYCZNEJ LUB KODU KRESKOWEGO. INFORMACJE DOTYCZĄCE SERII MUSZĄ BYĆ
®
WPROWADZONE DO OPROGRAMOWANIA APARATU LIGHTCYCLER 2.0 RĘCZNIE LUB PRZEZ SKANOWANIE KODU KRESKOWEGO W TRAKCIE PRZEBIEGU PRACY. PRZED WPROWADZENIEM INFORMACJI NALEŻY UPEWNIĆ SIĘ, CZY NUMER SERII NA
ODWROCIE NINIEJSZEJ ULOTKI I NUMER SERII NA OPAKOWANIU ZESTAWU SĄ JEDNAKOWE.
PRZEZNACZENIE
Zestaw Factor V LEIDEN umożliwia wykrywanie i genotypowanie mutacji punktowej (G na A w pozycji 1691) genu ludzkiego czynnika V,
nazywanej mutacją Leiden czynnika V, z DNA wyizolowanego z pełnej krwi obwodowej człowieka. Test jest przeprowadzany w aparacie
®
LightCycler 2.0 z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu amplifikacji DNA czynnika V uzyskanego z próbek klinicznych
oraz fluorogennej hybrydyzacji swoistej dla sekwencji docelowej w celu wykrywania i genotypowania zamplifikowanego DNA czynnika V.
Test Factor V Leiden jest testem diagnostycznym in vitro służącym do wykrywania i genotypowania mutacji Leiden czynnika V, stanowiąc
®
pomoc w procesie diagnostycznym u pacjentów z podejrzeniem trombofilii. Test jest przeznaczony do stosowania w aparacie LightCycler 2.0
®
z użyciem oprogramowania LightCycler w wersji 4.05 lub 4.1. Przygotowanie próbek należy wykonywać zgodnie z opisanymi poniżej procedurami przebiegu pracy.
OBJAŚNIENIE TESTU
Wrodzona trombofilia predysponuje chorych do występowania stanów zakrzepowych, takich jak zakrzepica żylna, która jest trzecią co do
częstości występowania chorobą układu krążenia (1). Oporność na aktywowane białko C (APC) jest uważana za najbardziej rozpowszechnione zaburzenie krzepnięcia, które jest związane z zakrzepicą żylną (1,2). Mutacja punktowa w pozycji 1691 genu czynnika V,
nazywana mutacją Leiden czynnika V, powoduje zamianę argininy na glutaminę w pozycji 506 białka czynnika V i czyni je częściowo
opornym na inaktywację przez aktywowane białko C (APC). Analiza genetyczna wykazała, że mutacja ta stosunkowo często występuje
w populacji ogólnej (np. u około 5% ludzi rasy białej) i odpowiada za od 85% do 95% przypadków oporności na aktywowane białko C (APC) (2).
ZASADA TESTU/STRESZCZENIE
Przygotowanie próbki
Próbki można przygotowywać ręcznie lub automatycznie za pomocą zestawu High Pure PCR Template Preparation lub aparatu MagNA Pure
LC/MagNA Pure LC 2.0 z zastosowaniem zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I. Są to jedyne metody oczyszczania zatwierdzone do
użytku z testem Factor V Leiden.
Detekcja
1. Fragment genu czynnika V o długości 222 par zasad jest amplifikowany z ludzkiego genomowego DNA przy użyciu swoistych starterów.
2. Amplikon jest wykrywany przy użyciu fluorescencji za pomocą swoistej pary sond hybrydyzujących H. Sondy hybrydyzujące
H składają się z dwóch różnych oligonukleotydów, które hybrydyzują z wewnętrzną sekwencją amplifikowanego fragmentu
w trakcie fazy hybrydyzacji cyklu PCR. Jedna z sond jest znakowana na końcu 5' przy użyciu estru LightCycler® Red 640-Nhydroksysukcynimidu (ester Red 640-NHS) i jest modyfikowana na końcu 3' poprzez fosforylację, aby zapobiec wydłużaniu. Druga
sonda jest znakowana fluoresceiną na końcu 3'.
3. Dopiero po hybrydyzacji z matrycą DNA dwie sondy zbliżają się do siebie, w wyniku czego pomiędzy tymi dwoma fluoroforami dochodzi
do fluorescencyjnego rezonansowego przeniesienia energii (FRET). Fluoresceina, będąca fluoroforem donorowym, jest wzbudzana
®
®
podczas FRET przez źródło światła aparatu LightCycler 2.0 i część energii wzbudzenia zostaje przeniesiona na ester LightCycler
Red 640-N-hydroksysukcynimidu, będący fluoroforem akceptorowym.
®
®
4. Fluorescencja emitowana przez ester LightCycler Red 640-NHS jest mierzona przez aparat LightCycler 2.0.
Genotypowanie
Sondy hybrydyzujące H są również używane do określenia genotypu na podstawie przeprowadzania analizy krzywej topnienia po
zakończeniu cykli amplifikacji i gdy amplikon występuje w podwyższonym stężeniu.
• Sonda hybrydyzująca H znakowana substancją Red 640 hybrydyzuje z częścią sekwencji docelowej, która nie jest
zmutowana i pełni funkcję sondy kotwiczącej.
• Sonda hybrydyzująca H znakowana fluoresceiną obejmuje miejsce mutacji (sonda z mutacją).
Wzrost temperatury podczas analizy krzywej topnienia powoduje zmniejszenie fluorescencji, ponieważ krótsza z dwóch sond (sonda
z mutacją) oddysocjowuje jako pierwsza sprawiając, że cząsteczki dwóch barwników fluorescencyjnych przestają być w bliskiej odległości od
siebie. Jeśli mutacja Leiden czynnika V jest obecna, to niedopasowanie sondy z mutacją do sekwencji docelowej destabilizuje hybrydę,
powodując spadek fluorescencji przy niższej temperaturze. W genotypie występującym naturalnie niedopasowania nie wystąpią i w związku
z tym heterodupleks DNA ma wyższą temperaturę topnienia (Tm). Genotyp heterozygotyczny wykazuje charakterystyczne połączenie
właściwości.
1
ODCZYNNIKI — ROZTWORY ROBOCZE
1. Odczynnik FVL MD Mix
[Mieszanina detekcyjna mutacji Leiden czynnika V]
1 × 78 µl
2. Odczynnik FVL R Mix
[Mieszanina reakcyjna mutacji Leiden czynnika V]
1 × 78 µl
• < 0,01% starter sensowny i antysensowny FVL
• < 0,01% sonda hybrydyzująca H FVL
z barwnikiem Red 640
• < 0,01% sonda hybrydyzująca H
z fluoresceiną FVL
• Bufor Tris-HCl
• < 0,01% polimeraza Taq DNA, klasa GMP
• < 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
• Brij 35
• MgCl2
• Brij 35
• MgCl2
3. Odczynnik FVL CT
[Matryca kontrolna dla mutacji Leiden czynnika V]
1 × 50 µl
< 0,01% kontrolna matryca DNA
Zawiera plazmidy: pCRF5 WT i pCRF5MUT.
4. Odczynnik FVL DIL
[Rozcieńczalnik dla mutacji Leiden czynnika V]
1 × 1 ml
H2O, do zastosowań w metodzie PCR (stosowana również jako kontrola ujemna
w amplifikacji)
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI I OSTRZEŻENIA
Polimorfizm
W obrębie genu czynnika V oprócz mutacji FVL w pozycji 1691 istnieją dodatkowe mutacje, których miejsca są obejmowane przez sondę
mutacji. Trzy rzadkie mutacje (tj. mutacje A1692C, G1689A i A1696G) po wykonaniu analizy krzywej topnienia prowadzą do wyników
fałszywie dodatnich (tj. genotypu heterozygotycznego lub zmutowanego).
Uwaga: Test Factor V Leiden można wykonać dodatkowo lub po funkcjonalnym teście wykrywającym fenotypową oporność na aktywowane
białko C (APC). Tylko mutacja Leiden czynnika V wiąże się z opornością na aktywowane białko C — nie dotyczy to trzech rzadkich mutacji
podanych powyżej.
Wymagania dotyczące użytkowania
• DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. Produkt ten powinien być używany wyłącznie przez osoby wykwalifikowane
w technikach PCR.
• Podjąć standardowe środki ostrożności niezbędne przy użytkowaniu wszystkich odczynników laboratoryjnych.
• Test jest przeznaczony do stosowania wyłącznie z ludzką pełną krwią pobraną na antykoagulant EDTA lub cytrynian. Wykazano, że
heparyna może zakłócać PCR i z tego powodu nie może być stosowana w tej procedurze.
• Przebieg pracy laboratorium musi być zgodny z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej (GLP), a ponadto należy postępować w sposób
®
jednokierunkowy (tj. przygotowanie próbek, nastawianie reakcji PCR i przebieg PCR w aparacie LightCycler 2.0 muszą być fizycznie
rozdzielone).
• Nie zlewać odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. Zamknąć wszystkie butelki bezpośrednio po użyciu w celu
uniknięcia wycieku i aby nie dopuścić do wystąpienia różnych stężeń buforu lub warunków układu buforowego. Po otwarciu wszystkie
butelki i fiolki przechowywać w pozycji pionowej.
• Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii.
• Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
• Nie dopuszczać do kontaktu Lysis/Binding Buffer i Wash Buffer I z zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I lub Binding Buffer oraz
Inhibitor Removal Buffer z zestawu High Pure PCR Template Preparation ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do
kontaktu, należy to miejsce natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do
oparzeń. W razie rozlania odczynnika należy przed wytarciem rozcieńczyć wodą.
• Nie dopuścić do kontaktu Lysis/Binding Buffer z zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I, zawierającego tiocyjanian guanidyny,
z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem) lub roztworami o dużej kwasowości. Połączenie to może skutkować wytworzeniem silnie
trującego gazu.
Procedury laboratoryjne
• Wszelkie materiały pochodzenia ludzkiego i odpady należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować
wszystkie powierzchnie robocze przy użyciu środków dezynfekujących zalecanych przez władze lokalne.
• Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarze roboczym laboratorium.
• Nie należy pipetować za pomocą ust.
• Przy obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią
ochronę oczu.
• Przy pobieraniu poszczególnych objętości odczynników z butelek należy unikać skażenia bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia nukleazami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet.
• Po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce.
Postępowanie z odpadami
• Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
• Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) są dostępne na żądanie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche.
Przygotowanie próbki
• W celu uzyskania informacji na temat przetwarzania i usuwania należy przeczytać instrukcje bezpieczeństwa opisane w ulotce dołączonej
do opakowania zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I lub zestawu High Pure PCR Template Preparation.
• Zestawy MagNA Pure LC DNA Isolation I i High Pure PCR Template Preparation należy przechowywać w temperaturze pokojowej
(od +15°C do +25°C). Wstrząsnąć Lysis/Binding Buffer z zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I przed użyciem w celu rozpuszczenia
osadu. Nie przechowywać w temperaturze niższej niż temperatura pokojowa.
• W tej procedurze używać wyłącznie pojemników MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (nr kat. 03 004 058 001) lub MagNA Pure LC
Reagent Tub (large) (nr kat. 03 004 040 001) w odpowiednich pozycjach wskazanych przez aparat MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
2
Amplifikacja i detekcja
®
• Przed użyciem tego zestawu w diagnostyce in vitro zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika aparatu LightCycler 2.0.
®
• Utwórz odręczny spis zgodny z numerem identyfikacyjnym obrotowego pojemnika LightCycler . Spis musi zawierać pozycję obrotowego
®
pojemnika na próbki LightCycler , numer kapilary i nazwę powiązaną z każdą próbką, aby zapewnić poprawną identyfikację próbki.
• Nie dotykać powierzchni kapilar. Przy obchodzeniu się z kapilarami należy mieć zawsze założone rękawice.
PRACA Z ODCZYNNIKAMI
1. Odczynnik FVL MD Mix (żółta zakrętka, fiolka 1), gotowy do użycia
2. Odczynnik FVL R Mix (czerwona zakrętka, fiolka 2), gotowy do użycia
3. Odczynnik FVL CT (fioletowa zakrętka, fiolka 3), gotowy do użycia
4. Odczynnik FVL DIL (bezbarwna zakrętka, fiolka 4), gotowy do użycia
•
•
•
•
•
Należy przechowywać w temperaturze od –15°C do –25°C.
Chronić przed światłem.
Należy przechowywać w temperaturze od –15°C do –25°C.
Należy przechowywać w temperaturze od –15°C do –25°C.
Należy przechowywać w temperaturze od –15°C do –25°C.
PRZECHOWYWANIE/STABILNOŚĆ (ODCZYNNIKÓW)
• Nieotwarty zestaw powinien być przechowywany w temperaturze od –15°C do –25°C do momentu upływu daty ważności wydrukowanej
na etykiecie.
• Chronić przed światłem odczynnik FVL MD Mix (fiolka 1, żółta zakrętka).
• Rozmrozić elementy zestawu Factor V Leiden, delikatnie zamieszać i przechowywać w lodzie.
• Zamrozić bezpośrednio po użyciu.
• Odczynniki z zestawu mogą być zamrażane i rozmrażane do pięciu razy.
POBIERANIE/PRZYGOTOWANIE I STABILNOŚĆ PRÓBEK
W celu przygotowania genomowego DNA z ludzkiej krwi należy dokonać oczyszczenia kwasów nukleinowych przy użyciu zestawu High Pure
PCR Template Preparation (nr kat. 11 796 828 001) lub zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I (nr kat. 03 003 990 001) w aparacie MagNA
Pure LC (nr kat. 12 236 931 001) lub aparacie MagNA Pure LC 2.0 (nr kat. 05 197 686 001), jak opisano poniżej.
• Obwodowa krew ludzka z dodatkiem antykoagulantu EDTA lub cytrynianu jest stabilna przez co najmniej 7 dni w temperaturze od +2°C do
+8°C. Może być przechowywana w zamrożeniu w temperaturze –20°C do 12 miesięcy i rozmrożona jeden raz.
• Eluowany DNA może być przechowywany w szczelnie zamkniętej kasecie na próbki lub w zakręcanych probówkach Sarstedt
w temperaturze od +2°C do +8°C przez maksymalnie 7 dni. Zachowuje stabilność przy przechowywaniu przez dłuższy czas (ok. 3 tygodnie)
w temperaturze od –15°C do –25°C. Eluowany DNA może być zamrażany i rozmrażany do trzech razy.
MATERIAŁY DOSTARCZANE
Patrz „Odczynniki — roztwory robocze” na stronie 2.
MATERIAŁY I URZĄDZENIA WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
®
• Izopropanol do analizy
• H2O, podwójnie destylowana, sterylna, wolna od nukleaz
• Aparat MagNA Pure LC (nr kat. 12 236 931 001)
z oprogramowaniem MagNA Pure LC w wersji 3.011 lub
nowszej lub
Aparat MagNA Pure LC 2.0 (nr kat. 05 197 686 001) z dowolnym
oprogramowaniem
• Zestaw MagNA Pure LC DNA Isolation I (nr kat. 03 003 990 001)
• Wirówka LC 2.0 na obrotowy pojemnik kubełkami do rotora [nr kat.
03 709 582 001 (230 V) lub nr kat. 03 709 507 001 (115 V)]. Jeśli
została już zakupiona wirówka LC na obrotowy pojemnik
[nr kat. 12 189 682 001 (230 V) lub nr kat. 03 030 512 001 (115 V)],
®
wymagany jest także zestaw wirnika LightCycler 2.0 na obrotowy
pojemnik (nr kat. 03 724 697 001)*.
• Zakręcane probówki Sarstedt, 1,5 ml, jałowe
* Jeśli wirówka LC na obrotowy pojemnik jest niedostępna,
to należy zapoznać się z instrukcją użytkownika aparatu
®
LightCycler 2.0, oprogramowaniem w wersji 4.05 lub 4.1 do
stosowania w diagnostyce in vitro lub skontaktować się
z pomocą techniczną w celu uzyskania specyfikacji równoważnej
wirówki. W takim przypadku wymagane są również adaptery
®
do wirowania LightCycler (nr kat. 11 909 312 001).
• Aparat LightCycler 2.0 (nr kat. 03 531 414 201);
Uwaga: W USA obowiązują inne numery katalogowe.
W celu uzyskania szczegółowych informacji należy skontaktować
się z biurem sprzedaży w USA.
(Numer seryjny 1415001 i wyższe są zatwierdzone do
zastosowań w diagnostyce in vitro z tym zestawem. Aparaty
z numerem seryjnym poniżej 1415001 także zostały zatwierdzone do stosowania z tym zestawem, po tym jak zatwierdzono
je do użytku w diagnostyce in vitro poprzez specjalną procedurę
uaktualnienia. W celu uzyskania szczegółowych informacji na
temat tej procedury uaktualnienia należy skontaktować się
z miejscowym działem obsługi klienta).
®
• Oprogramowanie aparatu LightCycler w wersji 4.05
(nr kat. 04 717 392 001) lub 4.1 (nr kat. 04 898 915 001)
®
• Kapilary LightCycler (20 µl) (nr kat. 04 929 292 001)
• Zestaw High Pure PCR Template Preparation
(nr kat. 11 796 828 001)
• Probówki do mikrowirówki, 1,5 ml, sterylne, wolne od nukleaz
®
• Adaptery do wirowania LightCycler (nr kat. 11 909 312 001)
• Czytnik kodów kreskowych (nr kat. 04 557 174 001)
• Makropolecenie Factor V Leiden (nr kat. 04 586 913 001)
• Etanol do analizy
MATERIAŁY OPCJONALNE
• Płyta CD zawierająca protokoły Post-Elution do wykrywania
trombofilii (nr kat. 04 378 784 001)
• Drukarka kodów kreskowych MagNA Pure LC TLP 2844
(nr kat. 03 576 094 001)
• Taśma do drukarki kodów kreskowych MagNA Pure LC
(nr kat. 03 531 538 001)
• Blok chłodzący MagNA Pure LC, obrotowy pojemnik na
próbki LC (nr kat. 12 189 704 001)
®
• Narzędzie do zamykania LightCycler (nr kat. 03 357 317 001)
• Ogólne wyposażenie laboratoryjne
3
PROCEDURA TESTU
WAŻNA UWAGA:
INFORMACJE DOTYCZĄCE SERII ZESTAWU FACTOR V LEIDEN PODANO NA ODWROCIE NINIEJSZEJ ULOTKI DOŁĄCZONEJ DO
OPAKOWANIA W POSTACI ALFANUMERYCZNEJ LUB KODU KRESKOWEGO. INFORMACJE DOTYCZĄCE SERII MUSZĄ BYĆ
®
WPROWADZONE DO OPROGRAMOWANIA APARATU LIGHTCYCLER 2.0 RĘCZNIE LUB PRZEZ SKANOWANIE KODU
KRESKOWEGO W TRAKCIE PRZEBIEGU PRACY. PRZED WPROWADZENIEM INFORMACJI NALEŻY UPEWNIĆ SIĘ, CZY NUMER
SERII NA ODWROCIE NINIEJSZEJ ULOTKI I NUMER SERII NA OPAKOWANIU ZESTAWU SĄ JEDNAKOWE.
ª
Zautomatyzowana procedura przygotowania próbek dla 15 lub 30 próbek przy użyciu zestawu MagNA Pure LC DNA Isolation I
(nr kat. 03 003 990 001) razem z aparatem MagNA Pure LC (nr kat. 12 236 931 001) lub aparatem MagNA Pure LC 2.0
(nr kat. 05 197 686 001)
A. OCZYSZCZANIE
Przed rozpoczęciem
Rozpocznij wstępne schładzanie bloku chłodzącego MagNA Pure LC i obrotowego pojemnika na próbki LC (nr kat. 12 189 704 001)
w lodówce w temperaturze od +2°C do +8°C (przez co najmniej 2 godziny).
Uruchamianie aparatu i oprogramowania MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0
1. Włącz aparat MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, a następnie uruchom komputer.
2. W przypadku oprogramowania MagNA Pure LC: uruchom oprogramowanie MagNA Pure LC, a następnie na ekranie Main Menu
kliknij przycisk Sample Ordering.
W przypadku oprogramowania MagNA Pure LC 2.0: otwórz kartę Workplace i w niej wybierz kartę Ordering.
3. W przypadku MagNA Pure LC: na ekranie Sample Ordering wybierz protokół zatytułowany DNA I Blood Cells Fast, a następnie
wprowadź numery serii zestawów MagNA Pure LC DNA Isolation I (nr kat. 03 003 990 001) i Factor II (Prothrombin) G20210A,
®
i wprowadź numer identyfikacyjny obrotowego pojemnika LightCycler (nie zmieniaj pozostałych ustawień).
W przypadku MagNA Pure LC 2.0: w karcie Ordering wybierz protokół zatytułowany DNA I Blood Cells Fast, a następnie wprowadź
numery serii zestawów MagNA Pure LC DNA Isolation I (nr kat. 03 003 990 001) i Factor II (Prothrombin) G20210A oraz wprowadź
®
numer identyfikacyjny obrotowego pojemnika LightCycler (nie zmieniaj pozostałych ustawień).
4. W wierszu 1 tabeli Sample Order (pozycja A1) wprowadź kontrolę ujemną (FVL DIL, fiolka 4, bezbarwna zakrętka), wpisując
„Negative Control”. Wpisz 50 µl jako objętość próbki i 0 µl jako objętość rozcieńczania (ustawienie domyślne). Objętość elucji jest
ustawiona domyślnie na 100 µl.
5. Począwszy od wiersza 1 (pozycja B1), wpisz nazwy próbek lub użyj czytnika kodów kreskowych MagNA Pure LC Barcode Reader
(opcjonalnie). Wpisz 50 µl jako objętość próbki i 0 µl jako objętość rozcieńczania (ustawienie domyślne). Objętość elucji jest
ustawiona domyślnie na 100 µl.
6. Zapisz i wydrukuj informację zawartą w pliku kolejności próbek.
7. Użyj funkcji Print Sample Names w celu wykonania wydruku przedstawiającego nazwy próbek i ich prawidłowe położenie w kasecie
na próbki (opcjonalnie).
8. Wydrukuj etykiety (Print Cartridge Barcode) w trzech egzemplarzach (opcjonalnie).
9. Oznakuj kasetę na próbki (do elucji) i wydruki przy użyciu etykiet z kodem kreskowym (opcjonalnie).
10. Kliknij kartę Stage Setup.
Przygotowanie roztworu roboczego proteinazy K
(wystarczający dla 32 próbek)
1. Dodaj 3 ml Elution Buffer (butelka 6, żółta zakrętka) do jednej fiolki z liofilizowaną proteinazą K (fiolka 4, różowa zakrętka). Po
całkowitym rozpuszczeniu proteinazy K dodaj dodatkowe 2 ml Elution Buffer, aby dopełnić do końcowej objętości 5 ml.
2. Zamknij i dobrze wymieszaj fiolkę.
Uwaga: Jeśli przygotowany roztwór nie zostanie użyty tego samego dnia, należy przechowywać go w fiolce 4 w temperaturze
od +2°C do +8°C (do 4 tygodni).
Wszystkie pozostałe odczynniki są gotowe do użycia.
Ładowanie odczynników i materiałów zużywalnych
Uwaga: •
1.
2.
3.
4.
5.
Nie używać pojemnika MagNA Pure LC Tub 30. W tej procedurze używać wyłącznie pojemnika MagNA Pure LC Medium
Reagent Tub 20 (nr kat. 03 004 058 001) lub MagNA Pure LC Reagent Tub (large) (nr kat. 03 004 040 001) w odpowiednich pozycjach wskazanych przez aparat MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
•
Stan Heat Unit i Cool Units 1 & 2 musi być wyświetlony jako PASS przed wypełnieniem odpowiedniego pojemnika na
odczynnik zawiesiną cząsteczek magnetycznych (MGP).
Przy użyciu objętości podanych na ekranie Start Information (aparat MagNA Pure LC) lub w zakładce Stage Setup (aparat MagNA
Pure LC 2.0) (na graficznym widoku Stage Layout) napełnij ręcznie pojemniki na odczynniki (poza obrębem aparatu MagNA Pure
LC/MagNA Pure LC 2.0), a następnie zamknij je przy użyciu odpowiednich pokryw pojemników na odczynniki i zamknięć pokryw
pojemników. Umieść napełnione pojemniki na odczynniki w statywie na pojemniki z odczynnikami w pozycjach wskazanych na
ekranie Start Information (aparat MagNA Pure LC) lub w zakładce Stage Setup (aparat MagNA Pure LC 2.0) (z wyjątkiem
zawiesiny MGP, patrz punkt 4).
Dodatkowe niezbędne jednorazowe elementy plastikowe (zgodnie ze wskazaniami) i przygotowany statyw na pojemniki
z odczynnikami umieść na platformie z odczynnikami/próbkami zgodnie z informacjami podanymi na ekranie Start Information
(aparat MagNA Pure LC) lub w karcie Stage Setup (aparat MagNA Pure LC 2.0).
Przenieś ręcznie 50 μl próbek obwodowej pełnej krwi ludzkiej, z dodatkiem antykoagulantu EDTA lub cytrynianu, bezpośrednio do
kasety na próbki (poza obrębem aparatu Magna Pure LC) zgodnie z listą kolejności próbek.
Bezpośrednio przed rozpoczęciem przebiegu dokładnie wymieszaj szklaną fiolkę z MGP, napełnij pojemnik na odczynniki zawiesiną
MGP, zamknij ją pokrywą pojemnika na odczynniki i umieść na platformie odczynników/próbek aparatu w pozycji określonej na
ekranie Start Information (aparat MagNA Pure LC) lub w zakładce Stage Setup (aparat MagNA Pure LC 2.0).
Umieść kasetę na próbki w aparacie MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
4
Przebieg oczyszczania
1. Klikając opcje na ekranie Start Information (aparat MagNA Pure LC) lub w zakładce Stage Setup (aparat MagNA Pure LC 2.0),
potwierdź każdą załadowaną pozycję w aparacie MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0. Po potwierdzeniu wszystkich pozycji pojawi
się przycisk OK (aparat MagNA Pure LC) lub przycisk Start (aparat MagNA Pure LC 2.0).
2. Wyjmij zamknięcia pokryw pojemnika i zamknij blokadę zabezpieczającą oraz drzwi aparatu MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0.
3. W celu rozpoczęcia przebiegu kliknij przycisk OK (aparat MagNA Pure LC) lub przycisk Start (aparat MagNA Pure LC 2.0). Pojawi
się ekran Batch Status (aparat MagNA Pure LC) lub ekran Run Status (aparat MagNA Pure LC 2.0) i przemieszczająca się od lewej
do prawej strony fioletowa linia wskazująca bieżący postęp procedury izolacji.
4. W aparacie MagNA Pure LC: po ukończeniu przebiegu pojawi się ekran Result.
W aparacie MagNA Pure LC 2.0: wyniki przebiegu oczyszczania będą przedstawione w zakładce Batch Results.
5. Zapisz wyniki i wydrukuj zawartość ekranu Result/zakładki Batch Results (opcjonalnie).
6. Opcjonalnie, wybierz funkcję Open Post-Elution w menu Action (aparat MagNA Pure LC) lub zakładkę Post-Elution Edit (aparat
MagNA Pure LC 2.0). Możesz też przejść do punktu B w rozdziale 2 (ręczne przygotowanie próbki) niniejszej ulotki dołączonej do
opakowania.
7. W razie niepowodzenia ekstrakcji pojedynczej próbki w aparacie MagNA Pure (odnotowane na ekranie Result/zakładce Batch
Results), odpowiednia próbka musi być ponownie poddana ekstrakcji.
Jeśli nie można przeprowadzić funkcji Post-Elution, przejdź do punktu B w rozdziale 2 (ręczne przygotowanie próbki) niniejszej ulotki
dołączonej do opakowania, wykorzystując próbki, których ekstrakcja powiodła się za pierwszym lub drugim razem.
B. FUNKCJA POST-ELUTION (opcjonalna)
Procedura Post-Elution (opcjonalna)
1. Upewnij się, że blok chłodzący MagNA Pure LC i obrotowy pojemnik na próbki LC znajdują się we właściwym miejscu i zostały
wstępnie schłodzone (np. były przechowywane w temperaturze od +2°C do +8°C przez co najmniej 2 godziny).
2. Z płyty CD zawierającej protokoły Post-Elution do wykrywania trombofilii (nr kat. 04 378 784 001) wczytaj protokół Post-Elution,
zatytułowany Thrombophilia 15 or 30 samples (opcjonalnie).
3. Przygotowanie odczynnika Master Mix (dla procedury Post-Elution)
• Przygotuj wymaganą ilość bezpośrednio przed użyciem.
• Rozmroź elementy zestawu Factor V Leiden, delikatnie zamieszaj i przechowuj w lodzie.
®
®
• Włóż jedną kapilarę LightCycler dla każdej próbki DNA oraz kontroli do obrotowego pojemnika LightCycler , tj. odpowiednio
17 kapilar na 15 próbek i 32 kapilary na 30 próbek.
• Przygotowanie odczynnika Master Mix:
Etap
1
2
3
Działanie
Do zakręcanej probówki Sarstedt o objętości 1,5 ml, znajdującej się w lodzie, dodawaj następujące składniki w wymienionej
kolejności:
(Przykłady podane dla 15 lub 30 próbek):
Odczynniki — roztwory robocze
Objętość*/15 próbek
Objętość*/30 próbek
Odczynnik FVL DIL, fiolka 4
209 µl
396 µl
Odczynnik FVL MD Mix, fiolka 1
38 µl
72 µl
Odczynnik FVL R Mix, fiolka 2
38 µl
72 µl
Łączna objętość
285 µl
540 µl
* wskazane objętości obejmują kontrole i marginesy pipetowania
• Delikatnie wymieszaj.
• Upewnij się, że na dnie probówki nie ma pęcherzyków powietrza.
Probówkę zawierającą odczynnik Master Mix umieść w bloku chłodzącym Magna Pure LC w pozycji 1. Zdejmij zakrętkę
probówki.
®
4. W bloku chłodzącym umieść pojemnik obrotowy LightCycler łącznie z kapilarami wskazanymi w protokole Post-Elution i umieść
wymaganą liczbę końcówek, jak pokazano na ekranie.
5. Otwórz odczynnik FVL CT (fiolka 3, fioletowa zakrętka) i za pomocą pipety dodaj 25 µl do nowej zakręcanej probówki Sarstedt
o objętości 1,5 ml, a następnie umieść blok chłodzący w pozycji 16, jak pokazano w protokole Post-Elution.
Uwaga:
• Należy odwirować przed otwarciem fiolkę zawierającą odczynnik FVL CT, aby jej zawartość osadziła się na dnie.
• Upewnij się, że na dnie probówki nie ma pęcherzyków powietrza.
• Zmień rękawice po pracy z matrycą kontrolną.
6. Zamknij aparat i kliknij Start, a następnie OK, aby rozpocząć automatyczne pipetowanie. Po zakończeniu procedury Post-Elution
pojawi się ekran Post-Elution Result.
7. Wydrukuj kod kreskowy bloku chłodzącego w trzech egzemplarzach (opcjonalnie).
8. Zapisz (opcja Save) i wydrukuj (opcja Print) tabelę wyników procedury Post-Elution, a następnie oznacz wydruk kodem kreskowym
bloku chłodzącego (opcjonalnie).
9. Oznacz pustą dyskietkę nazwą przebiegu oczyszczania lub kodem kreskowym bloku chłodzącego. Na dyskietce wygeneruj plik
®
SAM LightCycler (plik wzorca próbki).
10. Zamknij szczelnie każdą kapilarę zatyczką, używając narzędzia do zamykania (nr kat. 03 357 317 001).
®
11. Oznacz obrotowy pojemnik LightCycler kodem kreskowym bloku chłodzącego (opcjonalnie).
®
12. Umieść obrotowy pojemnik LightCycler w bębnie wirówki LC na obrotowy pojemnik.
®
13. Przenieś bęben wirówki, łącznie z obrotowym pojemnikiem LightCycler , do wirówki LC na obrotowy pojemnik.
®
Uwaga: Jeśli żadna wirówka LC na obrotowy pojemnik nie jest dostępna, należy użyć wirówki laboratoryjnej (takiej jak Biofuge 13
®
firmy Heraeus Instruments lub Kendro Laboratory Products) z adapterami do wirowania LightCycler i maksymalną siłą wirowania
735 × g przez 30 sekund.
14. Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć przebieg wirówki LC na obrotowy pojemnik.
5
®
®
15. Po odwirowaniu przenieś obrotowy pojemnik LightCycler do aparatu LightCycler 2.0.
Uwaga: Eluowany DNA przechowywać w temperaturze od +2°C do +8°C przez maksymalnie siedem dni i w temperaturze od
–15°C do –25°C przez dłuższy czas (ok. 3 tygodnie). Jeśli w aparacie MagNA Pure LC nie wykorzystuje się protokołu
Post-Elution, przejdź do punktu B w rozdziale 2 protokołu w celu przygotowania odczynnika Master Mix do cyklu PCR.
16. Jeśli nie planujesz wykonania dalszych przebiegów w aparacie MagNA Pure, wyłącz komputer MagNA Pure LC i aparat MagNA
Pure LC.
C. AMPLIFIKACJA I DETEKCJA
®
Aparat LightCycler 2.0
Uwaga: Przed uruchomieniem makropolecenia należy zalogować się do bazy danych (DB) Exor z dziennikiem zdarzeń. Po
zalogowaniu do bazy danych Exor z dziennikiem zdarzeń na pasku stanu oprogramowania zostanie wyświetlone słowo „Traceable”.
W celu uzyskania dalszych informacji na temat logowania się do oprogramowania należy zapoznać się z podręcznikiem użytkownika
®
aparatu LightCycler 2.0 z oprogramowaniem w wersji 4.05 lub 4.1 do stosowania w diagnostyce in vitro.
1. Jeśli obrotowy pojemnik LightCycler® został wcześniej oznaczony (punkt B.11), usuń z niego etykietę z kodem kreskowym
(opcjonalnie).
®
2. Umieść obrotowy pojemnik w aparacie LightCycler 2.0.
3. Upewnij się, że makropolecenie zestawu Factor V Leiden (nr kat. 04 586 913 001) jest zainstalowane. Makropolecenie musi być
zainstalowane tylko raz przy przeprowadzaniu testu po raz pierwszy.
4. Uruchom makropolecenie, naciskając przycisk Roche i wprowadzając numer katalogowy zestawu ręcznie lub poprzez skanowanie
kodu kreskowego. W celu uzyskania informacji na temat prawidłowych kodów kreskowych właściwych dla zestawu należy zapoznać
się z ostatnią stroną niniejszej ulotki dołączonej do opakowania.
Uwaga: Funkcja „Perform self test” może nie być aktywna.
5. Kreator pokieruje Cię przez całą procedurę.
6. Na ekranie Capillary View wprowadź nazwy próbek ręcznie lub wczytaj je z pliku SAM, jeśli został on wcześniej utworzony,
naciskając przycisk „Import SAM”. W odpowiednim polu na ekranie Capillary View wprowadź numer serii zestawu.
7. W kreatorze kliknij przycisk Start Run.
®
8. Po ukończeniu przebiegu aparat LightCycler 2.0 automatycznie określa i wyświetla genotyp, wykonując analizę krzywej topnienia.
Uwaga: Sygnał fluorescencji jest mierzony w kanale 640 nm.
¹ Procedura ręcznego przygotowywania próbek dla jednej próbki przy użyciu zestawu High Pure PCR Template Preparation
(nr kat. 11 796 828 001)
A. OCZYSZCZANIE
Przed rozpoczęciem
®
Rozpocznij wstępne schładzanie adapterów do wirowania LightCycler w lodówce w temperaturze od +2°C do +8°C (przez co najmniej
2 godziny).
Przygotowanie roztworów roboczych
Odczynnik
Rozpuszczanie/przygotowanie roztworu roboczego
Proteinaza K
(fiolka 3, różowa zakrętka)
Rozpuść proteinazę K w 4,5 ml podwójnie destylowanej
wody, podziel roztwór na jednakowe objętości.
Bufor usuwający
inhibitor
(fiolka 4a, czarna zakrętka)
Do Inhibitor Removal Buffer dodaj 20 ml etanolu.
Uwaga: Po dodaniu etanolu oznacz i zapisz na
butelce datę.
Bufor płuczący
(fiolka 4, niebieska
zakrętka)
Do Wash Buffer dodaj 80 ml etanolu.
Uwaga: Po dodaniu etanolu oznacz i zapisz na
butelce datę.
Przechowywanie i stabilność roztworu
roboczego
Należy przechowywać w temperaturze od
–15°C do –25°C. Zachowuje stabilność przez
12 miesięcy.
Należy przechowywać w temperaturze od
+15°C do +25°C. Zachowuje stabilność do
daty ważności wydrukowanej na etykiecie
zestawu.
Należy przechowywać w temperaturze od
+15°C do +25°C. Zachowuje stabilność do
daty ważności wydrukowanej na etykiecie
zestawu.
Procedura oczyszczania
Uwaga: Upewnić się, aby postępować zgodnie z procedurą opisaną poniżej, a nie z procedurą opisaną w ulotce dołączonej do
opakowania zestawu High Pure PCR Template Preparation.
1. Wydziel równe objętości 200 µl Elution Buffer na każdą próbkę do sterylnych probówek reakcyjnych o objętości 1,5 ml, zamknij
probówki i wstępnie podgrzej do temperatury +70°C.
2. Do próbek obwodowej pełnej krwi ludzkiej o objętości 200 μl, z dodatkiem antykoagulantu EDTA lub cytrynianu dodaj:
• 200 µl Binding Buffer (zielona zakrętka)
• 40 µl proteinazy K (rozpuszczonej)
• Wymieszaj bezzwłocznie na mieszadle wibracyjnym i inkubuj w temperaturze +70°C przez 10 minut.
3. Dodaj 100 µl izopropanolu i dokładnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym.
4. Dodaj pipetą mieszaninę próbki do górnej części kolumny filtracyjnej High Pure z probówką zbiorczą.
5. Odwiruj przez 1 minutę z siłą wirowania 6000 × g w standardowej wirówce stołowej.
6. Usuń nadsącz i probówkę zbiorczą.
7. Przenieś kolumnę filtracyjną do nowej probówki zbiorczej.
8. Do górnej części kolumny filtracyjnej dodaj 500 µl Inhibitor Removal Buffer (czarna zakrętka).
9. Odwiruj przez 1 minutę z siła wirowania 6000 × g.
10. Usuń nadsącz i probówkę zbiorczą.
6
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
Przenieś kolumnę filtracyjną do nowej probówki zbiorczej.
Do górnej części kolumny filtracyjnej dodaj 500 µl Wash Buffer (niebieska zakrętka).
Odwiruj przez 1 minutę z siła wirowania 6000 × g.
Usuń nadsącz i probówkę zbiorczą.
Przenieś kolumnę filtracyjną do nowej probówki zbiorczej.
Do górnej części kolumny filtracyjnej dodaj 500 µl Wash Buffer (niebieska zakrętka).
Odwiruj przez 1 minutę z siła wirowania 6000 × g.
Usuń nadsącz.
Wstaw kolumnę filtracyjną do tej samej probówki zbiorczej.
Odwiruj przez 10 sekund przy maksymalnej sile wirowania (13 000 × g lub większej), aby usunąć pozostały Wash Buffer.
Wyrzuć probówkę zbiorczą.
Włóż kolumnę filtracyjną do czystej probówki reakcyjnej o objętości 1,5 ml.
Do rurki filtracyjnej dodaj 200 µl wstępnie podgrzanego (do temperatury +70°C) Elution Buffer.
Odwiruj przez 1 minutę z siła wirowania 6000 × g.
Probówka do mikrowirówki zawiera eluowany DNA.
B. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKA MASTER MIX
1. Rozmroź elementy zestawu Factor V Leiden, delikatnie zamieszaj i przechowuj w lodzie.
®
2. Włóż jedną kapilarę LightCycler dla każdej próbki DNA oraz kontroli do każdej kontroli we wstępnie schłodzone adaptery do
®
wirowania LightCycler .
3. Przygotuj odczynnik Master Mix, mnożąc wartość objętości z kolumny Volume/reaction przez liczbę reakcji, jakie mają zostać
wykonane (tj. DNA pochodzący z próbek, kontrole ujemne i dodatnie), z uwzględnieniem jednej dodatkowej reakcji.
Postępuj zgodnie z poniższym opisem dla standardowej reakcji (20 µl).
Etap
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Działanie
Do probówki reakcyjnej o objętości 1,5 ml, znajdującej się w lodzie, dodawaj następujące składniki w wymienionej kolejności:
Odczynniki — roztwory robocze
Objętość/reakcja
Odczynnik FVL DIL, fiolka 4
11 µl
Odczynnik FVL MD Mix, fiolka 1
2 µl
Odczynnik FVL R Mix, fiolka 2
2 µl
Łączna objętość
15 µl
• Delikatnie wymieszaj.
®
• Dodaj pipetą po 15 µl odczynnika Master Mix do każdej wstępnie schłodzonej kapilary LightCycler .
• Sprawdź oznaczenie listy próbek (rozdział 1, A7, wydruk) z odpowiednią kasetą na próbki porównując numery kodów
kreskowych (opcjonalnie).
• Dodaj 5 µl wyizolowanego DNA pochodzącego z próbki lub 5 µl odczynnika FVL CT (fiolka 3, fioletowa zakrętka) jako
kontroli dodatniej lub 5 µl odczynnika FVL DIL (fiolka 4, bezbarwna zakrętka) jako kontroli ujemnej.
Zamknij szczelnie każdą kapilarę zatyczką, używając narzędzia do zamykania (nr kat. 03 357 317 001).
Jeśli używana jest wirówka LC na obrotowy pojemnik, przejdź do punktu 5.
Jeśli wykorzystywana jest równoważna wirówka laboratoryjna (taka jak Biofuge 13 firmy Heraeus Instruments lub Kendro
®
Laboratory Products), umieść każdą kapilarę w odpowiednim wstępnie schłodzonym adapterze do wirowania LightCycler
i wykonaj następujące czynności:
• Umieść adaptery w wirówce laboratoryjnej.
• Odwiruj z maksymalną siłą wirowania 735 × g przez 30 sekund.
• Przejdź do punktu 5.
Umieść kapilarę zawierającą kontrolę ujemną w pozycji 1, a kapilarę zawierającą kontrolę dodatnią w pozycji 2 obrotowego
®
pojemnika LightCycler .
®
Umieść kapilary zawierające DNA pochodzące z próbki w obrotowym pojemniku LightCycler , rozpoczynając od pozycji 3.
®
Przenieś kubełek wirówki, łącznie z obrotowym pojemnikiem LightCycler , do wirówki LC 2.0 na obrotowy pojemnik.
Naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć przebieg wirówki LC na obrotowy pojemnik.
®
®
Po odwirowaniu przenieś obrotowy pojemnik LightCycler do aparatu LightCycler 2.0.
7
C. AMPLIFIKACJA I DETEKCJA
®
Aparat LightCycler 2.0
Uwaga: Przed uruchomieniem makropolecenia należy zalogować się do bazy danych (DB) Exor z dziennikiem zdarzeń. Po zalogowaniu
do bazy danych Exor z dziennikiem zdarzeń na pasku stanu oprogramowania zostanie wyświetlone słowo „Traceable”. W celu uzyskania
dalszych informacji na temat logowania się do oprogramowania należy zapoznać się z podręcznikiem użytkownika aparatu
®
LightCycler 2.0 z oprogramowaniem w wersji 4.05 lub 4.1 do stosowania w diagnostyce in vitro.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
®
Umieść obrotowy pojemnik w aparacie LightCycler 2.0.
Upewnij się, że makropolecenie zestawu Factor V Leiden (nr kat. 04 586 913 001) jest zainstalowane. Makropolecenie musi być
zainstalowane tylko raz przy przeprowadzaniu testu po raz pierwszy.
Uruchom makropolecenie, naciskając przycisk Roche i wprowadzając numer katalogowy zestawu ręcznie lub poprzez skanowanie
kodu kreskowego. W celu uzyskania informacji na temat prawidłowych kodów kreskowych właściwych dla zestawu należy zapoznać
się z ostatnią stroną niniejszej ulotki dołączonej do opakowania.
Uwaga: Funkcja „Perform self test” może nie być aktywna.
Kreator pokieruje Cię przez całą procedurę.
Wprowadź liczbę próbek w części z liczbą próbek, a na ekranie Capillary View nazwy próbek, zgodnie z bieżącym schematem
wkładania próbek. W odpowiednim polu na ekranie Capillary View wprowadź numer serii zestawu.
W kreatorze kliknij przycisk Start Run.
®
Po ukończeniu przebiegu aparat LightCycler 2.0 automatycznie określa i wyświetla genotyp, wykonując analizę krzywej topnienia.
Uwaga: Sygnał fluorescencji jest mierzony w kanale 640 nm.
KALIBRACJA APARATU
Nie ma potrzeby przeprowadzania kalibracji.
KONTROLA JAKOŚCI
W każdym przebiegu cyklu PCR muszą być uwzględnione kontrole ujemna i dodatnia.
Kontrola ujemna:
Wynik testu kontroli ujemnej dla czynnika V Leiden powinien być zawsze oznaczony jako „negative”. W przeciwnym razie cały przebieg jest
oznaczany jako nieważny. Należy powtórzyć całą procedurę (przygotowanie próbek, amplifikację i detekcję). Jeżeli kontrola ujemna ciągle
daje wynik inny niż ujemny, należy skontaktować się z miejscowym przedstawicielem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Kontrola dodatnia:
Wynikiem testu dla kontroli czynnika V Leiden CT powinien być zawsze genotyp „het”.
W przeciwnym razie przebieg jest nieważny i cykl PCR musi być powtórzony.
Jeżeli kontrola dodatnia ciągle nie daje genotypu heterozygotycznego, należy skontaktować się z miejscowym przedstawicielem firmy Roche
w celu uzyskania pomocy technicznej.
Wynik próbki:
Wynik testu DNA pochodzącego z próbki powinien zawsze wykazywać profil krzywej topnienia dla homozygot występujących naturalnie,
homozygot mutantów lub genotypu heterozygotycznego. W przeciwnym razie wynik tej próbki jest nieważny i całą procedurę (przygotowanie
próbki, amplifikację i detekcję) należy powtórzyć.
OGRANICZENIA I INTERFERENCJE
Odczynnik FVL MD Mix (fiolka 1, żółta zakrętka) jest swoisty dla sekwencji ludzkiego genu czynnika V. Wysokie stężenie heparyny może
zakłócić przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy. Inne możliwe zakłócenia nie są znane.
OCZEKIWANE WARTOŚCI/INTERPRETACJA WYNIKÓW
1. Upewnij się, czy wyniki kontroli przebiegu są ważne. Jeżeli przebieg jest nieważny, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie
próbek, amplifikację i detekcję).
2. W przypadku ważnego przebiegu wyniki próbek są wyświetlane w następujący sposób przez moduł analizy genotypowania
®
oprogramowania LightCycler :
Wyświetlony wynik
wt
het
mut
unknown
negative
Interpretacja
Genotyp homozygotyczny występujący naturalnie: próbka jest ujemna pod kątem mutacji Leiden czynnika V
(tj. żaden zmutowany allel nie jest obecny).
Genotyp heterozygotyczny: próbka zawiera oba allele — jeden występujący naturalnie i jeden zmutowany
(czynnik V Leiden).
Genotyp homozygotyczny zmutowany: próbka jest dodatnia pod kątem mutacji Leiden czynnika V
(tj. oba zmutowane allele są obecne).
•
•
Genotyp nie może być przydzielony do uprzednio określonych standardów topnienia.
Należy powtórzyć całą procedurę analizy, łącznie z przygotowaniem próbek, amplifikacją i detekcją.
Jeżeli wynik jest ponownie podany jako „unknown”, należy skontaktować się z miejscowym
przedstawicielem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
Próbka odpowiada kryteriom oprogramowania dla kontroli ujemnej.
8
DANE DOTYCZĄCE SKUTECZNOŚCI TESTU
Swoistość analityczna
Przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów jako starterów
i sond hybrydyzujących H wykazano, że opro®
gramowanie LightCycler w wersji 4.05 lub 4.1 (genotypowanie)
precyzyjnie rozpoznaje mutację Leiden czynnika V. Jednak nie
pozwala ono na rozróżnienie pomiędzy rzadkimi mutacjami
cichymi A1692C, G1689A i A1696G. Genotypowanie przy
®
użyciu oprogramowania LightCycler w wersji 4.05 lub 4.1
sklasyfikuje te mutacje jako fałszywie dodatni wynik dla
czynnika V Leiden.
0,9
–(d/dT) Fluorescencja (640)
0,8
Dzięki zastosowaniu analizy sekwencji wykazano, że wybrane
syntetyczne oligonukleotydy stosowane jako startery swoiście
amplifikują fragment genu czynnika V o długości 222 par zasad
zawierający sekwencję czynnika V Leiden.
0,7
Heterozygota
Występujący naturalnie
(homozygota)
Mutant (homozygota)
FVL DIL
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
60
50
45
55
65
70
Czułość analityczna
Oczyszczony ludzki DNA heterozygotyczny pod kątem mutacji
Temperatura (°C)
Leiden czynnika V został rozcieńczony w czterech kolejnych
etapach rozcieńczania. Każde rozcieńczenie analizowano w sześciu powtórzeniach i wykonano statystyczną interpretację wyników.
Obliczono, że minimalny poziom wykrywania dla zestawu Factor V Leiden wynosi 202 kopie.
Czułość i swoistość diagnostyczna
W prospektywnym badaniu próbek ludzkiego DNA — pobranych świeżo i przechowywanych — przy użyciu zestawu Factor V Leiden oraz analizy
sekwencji pojedynczej lub podwójnej nici w systemie sekwencjonowania MegaBACE 500 z oprogramowaniem Cimarron Base Caller SW 3.12
analizowane były 530 próbki od pacjentów rasy białej z podejrzeniem trombofilii. Obie grupy reprezentują cały zbiór jednego laboratorium szpitala
uniwersyteckiego zebrany rutynowo w określonym czasie od hospitalizowanych pacjentów z trombofilią. Poziom zgodności między zestawem
Factor V Leiden a analizą sekwencji wyniósł 99,4% (527/530). Szczegółowe dane przedstawiono w poniższej tabeli.
Analiza
sekwencji
Tabela 1: Zestaw Factor V Leiden w porównaniu z analizą sekwencji
Zestaw Factor V Leiden
występujący naturalnie (wt)
heterozygota (het)
mutant (mut)
unknown
wt
440
-
–
2
het
1
82
–
-
mut
–
–
5
–
Uwaga: 41% próbek ludzkiego DNA uzyskano od pacjentów z podejrzeniem żylnych przypadków zakrzepowo-zatorowych, zgodnie ze
sformułowaniami konsensusu Amerykańskiego Kolegium Genetyki Medycznej (ACMG) lub Kolegium Patologów Amerykańskich (CAP) (2,4),
37,0% od pacjentów z tętniczymi zaburzeniami zakrzepowymi (np. z udarem), 18,0% od pacjentów skierowanych z podejrzeniem trombofilii
z innych przyczyn i 4,0% z przyczyn nieudokumentowanych. Przy użyciu zestawu Factor V Leiden nie można było uzyskać genotypów
w przypadku dwóch próbek.
INFORMACJA DLA NABYWCY
Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego w celach diagnostyki
in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej
licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu.
PIŚMIENNICTWO
1. Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism
screening. JAMA, 277, 1305-1307.
2. Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics
in Medicine, 3, Vol.2,139-148.
3. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN 1-56238-368-X).
NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa 19087-1898, USA (1999).
4. Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic
Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia.
9
©2012 Roche Molecular Systems, Inc.
®
Technologia zastosowana w aparacie LightCycler jest udostępniania na zasadzie licencji przez firmę Idaho Technology Inc., Salt Lake City,
UT, USA.
ROCHE, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE, LC i HIGH PURE są znakami towarowymi firmy Roche.
Biofuge jest znakiem towarowym firmy Heraeus Instruments GmbH.
Brij jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy ICI Americas, Inc., PA, USA.
MegaBACE jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp.
Cimarron jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA.
Barwniki cyjaninowe zawarte w produkcie są objęte prawami patentowymi firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp. oraz uniwersytetu
Carnegie Mellon University i udostępniane są firmie Roche na zasadzie licencji w celu ich włączenia do składników zestawów badawczych
i zestawów do diagnostyki in vitro. Wszelkie wykorzystanie takich zestawów do celów innych niż badawcze lub związane z diagnostyką
in vitro wymaga uzyskania podlicencji od firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA oraz uniwersytetu Carnegie
Mellon University, Pittsburgh, Pensylwania, USA.
Wyprodukowano w Niemczech
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
EC REP
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Str. 116
68305 Mannheim
Niemcy
W USA:
Dystrybucja w USA: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA
Linia pomocy technicznej dla klientów w USA: 1-800-526-1247
09/2012
(04536045001-07ENGL)
Doc Rev. 7.0
06362257049-02
10