Metabolity grzybów pleśniowych sa ważnym źródłem enzymów i

STRESZCZENIE
Metabolity grzybów pleśniowych sa ważnym źródłem enzymów i prostych związków
organicznych. Jednym z najważniejszych pod względem przemysłowym grzybem z klasy
workowców jest kropidlak czarny. Swoją nazwę zawdzięcza czarnemu zabarwieniu pleśni, przez co
jest łatwo rozpoznawalny w swoim naturalny środowisku, którym są miejsca o wysokiej wilgotności
powietrza (łazienki, piwnice etc). Kropidlak czarny jest wykorzystywany w biotechnologii z uwagi na
wysoki stopień produkcji kwasu cytrynowego i pozakomórkowej sekrecji enzymów.
Analiza metabolitów pleśni jest prowadzona na szeroką skalę niosąc ze sobą wysokie
koszty ekonomiczne. Dlatego też poszukiwane są technologie automatyzacji prowadzonych badań.
Celem tej pracy inżynierskiej jest opracowanie efektywnej i wydajnej metody analizy metabolitów,
przemysłowo ważnego gatunku grzyba jakim jest Aspergillus niger.
Mikromacierz fenotypowa Biolog to szybki i skuteczny system monitorowania wpływu
warunków hodowli m.in. takich jak źródła węgla, na rozwój organizmów. Do tej pory nie
opracowano metod kompatybilnych z wyżej wymienioną mikromaierzą, z wystarczającą
wydajnością.
Głównym celem tej pracy jest opracowanie nowej metody badania metabolitów
kropidlaka czarnego z użyciem mikromacierzy i porównanie tej metody z metodą tradycyjną
polegającą na hodowli na szalkach Petriego.
Cześć laboratoryjna została przeprowadzona poprzez wyhodowanie typu dzikiego i 4
mutantów gatunku Aspergillus niger. Materiał biologiczny pobrany z hodowli na różnych
pożywkach został następnie zanalizowany za pomocą chromatografi gazowej sprzężonej z
spektrometrem mas (GC-MS) oraz wysokociśnieniowej chromatografi cieczowej (HPLC) z
detektorem z matrycą fotodiodową (DAD). Szczególna uwaga została poświęcona wynikom analizy
uzyskanym metodą drugą.
Przeprowadzone badania potwierdzają wpływ pożywki na wzrost komórek A. niger.
Metabolity produkowane przez kropidlaka czarnego różnią się w zależnosci od dostępnych zródeł
pożywienia. Chromatogramy uzyskane z próbek; z mikromacierzy fenotypowej oraz z szalek
Petriego, znacząco się różnią. Porównanie czasu retencji oraz spektrum UV związków rozdzielonych
za pomocą HPLC potwierdziło róznorodność wyników. Chromatogramy uzyskane na podstawie
nowej metody zawierą znacznie mniejszą liczbę pików.
Wyniki porównań tych dwóch metod wyraźnie wskazują, że metoda z użyciemm
mikromacierzy fenotypowej Biolog nie może efektywnie zastąpić tradycyjnej hodowli na szalce
Petriego.
ABSTRACT
Microorganisms are important to us for many reasons; the principal one is that they
produce metabolites of particular value to us. Fungi, in particular, are used in many industrial
processes, such as production of enzymes, vitamins, polysaccharides, pigments and lipids, since
the versatility of fungal biosynthesis is enormous. Secondary metabolites are extremely important
to our health and are useful in carrying out processes valuable in biotechnology.
Aspergillus niger can produce an impressive variety of metabolites. Some of them
play an important role as a defense of the fungus against other microorganisms or insects
inhabiting niche. Since the secretome of this fungi group is highly influenced by external factors
like nutrition, pH and temperature, it is possible to manipulate it, making scree ning methods for
metabolites discovery in high demand.
Intelligent screening for known or novel metabolites would result in preselecting high
potential producers with future possibility of metabolic engineering to create microbial cell
factories.
This thesis aimed at developing a high throughput screening method, utilizing a
commercial nutritional profiling assay (Biolog plates). Samples of both wild type and mutants
were assayed and different media were applied. The experimental setup focused on investigation
of methods for sample preparation and testing developed methods for previously used Biolog
plates on GCMS/HPLC. In addition evaluation of the methods and application in a large scale
reproduction on agar plates. A. niger production profile of both primary and secondary
metabolites coupled to the available substrate was analyzed with GC/MS and HPLC/DAD.
The results clearly indicate that medium is an important environmental parameter
for A. niger. Unfortunately, the hypothesis that Biolog plate could fully replace traditional
approach could not be proven, leaving a case of metabolite screening in Biolog plate still open.