Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane

Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
Metale ciężkie są bardzo ważnym elementem skorupy ziemskiej. Uważane są za nieodnawialne bogactwa naturalne. Problem
środowiskowy, jaki one stwarzają, jest złożony. Z jednej strony mamy do czynienia ze znacznym ubytkiem rud, w skład których
one wchodzą, z drugiej zaś, występują one w coraz wyższych stężeniach w żywych organizmach (rośliny, zwierzęta, ludzie) i
środowisku, w którym bytują te organizmy. Przyczyną rozproszenia i wzrostu toksycznego wpływu wielu metali na organizmy
żywe są głownie procesy antropogeniczne.
METALE NIEZBĘDNE I TOKSYCZNE
Spośród ponad stu pierwiastków układu okresowego występujących w biosferze, znaczną ich częśd stanowią metale. Większośd
metali nie występuje w stanie czystym a jedynie w rudach razem z innymi składnikami. Metale dzieli się na: niezbędne i
toksyczne, żeliwne i nieżeliwne, lekkie i ciężkie oraz wyróżnia się grupę metali szlachetnych.
3
Metale ciężkie to te metale, których gęstośd jest większa od 4,5 [g/cm ]. Należą one często do grupy pierwiastków śladowych.
Dzieli się na cztery grupy:
- pierwiastki o bardzo wysokim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska, do których zalicza się m.in.: Cd, Hg, Cr, Ag,
Zn, Au, Sb, Sn, Tl,
- pierwiastki o wysokim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: Mo, Mn, Fe, Se i in.,
- pierwiastki o średnim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: V, Ni, Co, W i in.,
- pierwiastki o niskim stopniu potencjalnego zagrożenia dla środowiska: Zr, Ta, La, Nb i in.
Wybrane metale ciężkie i gałęzie przemysłu będące źródłem ich emisji do środowiska:
- Cd - galwanizernie, produkcja barwników, baterii, akumulatorów, farb i tworzyw sztucznych, stabilizatorów polimerów,
przem. chemiczny, ochrony roślin, zakłady graficzne i drukarskie
- Pb - produkcja barwników, akumulatorów, baterii, nawozów, motoryzacja, przem. energetyczny, ochrony roślin,
elektrochemiczny
- Cr - przemysł galwanizerski, garbarski, impregnacji drewna, włókienniczy, produkcji barwników i tworzyw sztucznych,
zakłady drukarskie i graficzne
- Cu - przemysł metalurgiczny, farbiarski, tekstylny, produkcja środków ochrony roślin i nawozów
- Hg - produkcja baterii, kwasu fosforowego, sody kaustycznej, celulozowni, produkcja środków ochrony roślin i wytwarzania
rtęci metalicznej
- Ni - przemysł galwanizerski, papierniczy, rafinerie, stalownie, fabryki nawozów sztucznych
- Zn - produkcja baterii, farb, przem. tekstylny, tworzyw sztucznych, stabilizatorów polimerów, zakłady drukarskie i graficzne
Toksycznośd metali ciężkich wynika nie tylko ze stopnia skażenia środowiska, ale także z ich biochemicznej roli, jaką spełniają w
procesach metabolicznych oraz ze stopnia wchłaniania i wydalania ich przez organizmy żywe. Rośliny są głównym odbiorcą
składników mineralnych z gleby, wód, w tym niebezpiecznych metali a jednocześnie głównym ich źródłem w pożywieniu ludzi i
zwierząt. Zagrożenie ze strony metali ciężkich polega głownie na wchodzeniu ich do łaocucha pokarmowego. Przechodzenie
metali ciężkich do wyższych ogniw łaocucha pokarmowego jest uzależnione od naturalnych barier biologicznych.
Szczególnie niebezpieczne dla środowiska i organizmów żywych są: Cd, Pb, Hg, Cr, As, Zn, Cu.
Kadm – jest „trucizną” kumulującą się w organizmie. Organami docelowymi gdzie deponowany jest ten pierwiastek są wątroba i
nerki. Kadm narusza przemiany metaboliczne wapnia, magnezu, żelaza, cynku i miedzi. Wypłukiwanie wapnia przez kadm ze
szkieletu i innych narządów powoduje deformację i łamanie kości, uszkodzenia narządów wewnętrznych. Zatrucie kadmem
powoduje bole i zanik mięśni, niedokrwistośd, nadciśnienie tętnicze, uszkodzenia wątroby, nerek i płuc. Jego nadmiar może byd
przyczyną powstawania nowotworów, zwłaszcza nerek i gruczołu krokowego.
Chrom – w niskich stężeniach i na III stopniu utlenienia jest pierwiastkiem niezbędnym dla funkcjonowania organizmu żywego.
W wyższych stężeniach może wywoład poważne zmiany immunologiczne w organizmach ssaków. Chrom(VI) cechuje się wysoką
toksycznością, wykazuje też działania kancerogenne, najczęściej powoduje raka płuc.
Rtęd – i jej związki mogą wywoływad gwałtowne objawy zatrucia. Wchłaniane ich w niewielkich dawkach powoduje
systematyczne kumulowanie się w organizmie. Najłatwiej wchłaniane są alkilowe związki, które są najbardziej szkodliwe,
ponieważ szybko przedostają się do komórek nerwowych. Toksyczne działanie tego pierwiastka polega na jego wiązaniu z
białkami, zmianie w działaniu hormonów, enzymów, hemoglobiny i białych ciałek krwi. Ma też działanie kancerogenne.
Ołów – jego szkodliwośd dotyczy m.in. obniżenia poziomu inteligencji, upośledzenia słuchu, zaburzenia rozwoju fizycznego i
umysłowego, a czasem prowadzi do śmierci. Zmiany spowodowane nadmiarem ołowiu we krwi są nieodwracalne w okresie
rozwojowym każdego organizmu. Ołów odkłada się głownie w nerkach i tkance kostnej.
Arsen – jest czynnikiem kancerogennym. Niebezpieczne dla człowieka związki arsenu(III) przedostają się do organizmu człowieka
przez układ oddechowy i pokarmowy. Może powodowad też: upośledzenia słuchowe u dzieci, poronienie samoistne, wady
wrodzone u dzieci.
Cynk - będąc składnikiem rożnych enzymów, spełnia wiele podstawowych funkcji w organizmach. Jego szkodliwośd jest
najczęściej związana z wywołaniem wtórnego deficytu. Niedobór cynku prowadzi u ludzi do karłowatości, zmniejsza tempo
krzepnięcia krwi, gojenia się ran i zapaleo skory. Nadmiar cynku uważa się za jedną z przyczyn zmian nowotworowych.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
Miedź – i jej szkodliwy wpływ na organizm człowieka wiąże się z nadmiarem tego pierwiastka w diecie, co może prowadzid do
zatrud chemicznych. Wywołuje rożne zmiany metaboliczne, uszkadza wątrobę, nerki, tkanki mózgowe, naczynia wieocowe i
serce.
Ścieki zawierające metale ciężkie najczęściej oczyszcza się metodami:
chemicznymi (neutralizacja, redukcja i/lub utlenianie, strącanie), fizyko-chemicznymi (sorpcja, ekstrakcja, wymiana jonowa),
elektrochemicznymi. Wybór metody zależny jest do: rodzaju ścieków, składu, postaci i stężenia usuwanych składników i
wymaganego stopnia oczyszczenia .
Ekstrakcję stosuje się najczęściej w przypadkach, gdy zależy nam na wydzieleniu określonego składnika z mieszaniny i otrzymania
go w czystej postaci. Metody ekstrakcyjne są proponowane głownie do oczyszczania ścieków galwanicznych.
Neutralizację prowadzi się w celu osiągnięcia określonego przepisami odczynu pH, przy zastosowaniu określonych reagentów
(kwasy, zasady). W zależności od składu ścieków i stosowanego reagenta, procesowi neutralizacji może towarzyszyd chemiczne
współstrącanie i strącanie wodorotlenków metali ciężkich.
Chemiczne strącanie prowadzi najczęściej do wytrącenia wodorotlenków metali ciężkich. Strącanie poszczególnych metali zależy
ściśle od wartościach pH. W przypadku roztworów jednoskładnikowych ilośd jonów metali ciężkich pozostałych w ściekach zależy
od iloczynu rozpuszczalności wodorotlenków. Na skuteczne wytrącenie kationów metali z roztworu ma wpływ wiele czynników:
rodzaj neutralizującego reagenta, skład i stężenie substancji rozpuszczonych, szybkośd mieszania. W przypadku występowania w
roztworze kilku jonów metali ciężkich stosowana dawka środka neutralizującego jest wypadkową zapotrzebowania na strącenie
poszczególnych jonów.
Utlenianie/redukcja to procesy wykorzystywane w oczyszczaniu m.in. ścieków galwanicznych, np. redukcja silnie toksycznego
chromu Cr(VI) do Cr(III), a następnie wytrącanie Cr(OH)3 .
Wymiana jonowa jest to proces, w którym wykorzystuje się wymieniacze jonowe zwane jonitami. Są to substancje
wielkocząsteczkowe, wykazujące zdolności do wymiany własnych jonów na jony w otaczającym je roztworze. W zależności od
tego, czy wymieniane są kationy czy aniony, wyróżnia się kationity i anionity. Proces ten wykorzystuje się także do oczyszczania
ścieków pogalwanicznych.
Mikroorganizmy wykorzystywane w procesach usuwania metali ciężkich przy wykorzystywaniu metod mikrobiologicznych
stosowane są szczepy mikroorganizmów charakteryzujące się dobrą zdolnością namnażania nawet w niekorzystnych warunkach
środowiskowych. Zastosowanie mają również mieszane populacje drobnoustrojów. Do mikroorganizmów, dzięki którym możliwe
jest usuwanie metali ze ścieków, osadów ściekowych, odpadów stałych czy terenów nimi skażonych, zalicza się: bakterie,
drożdże, promieniowce, pleśnie, grzyby (bez kapeluszowych), glony (bez plechowych).
Bakterie są najliczniej reprezentowaną grupą mikroorganizmów w procesach biosorpcji metali. Ze względu na istotną rolę, jaką
pełnią osłony komórek bakteryjnych w procesie usuwania metali ciężkich ze ścieków, osadów ściekowych czy w innych
procesach technologicznych, przedstawiona zostanie charakterystyka rodzaju tych osłon.
Osłony komórki bakteryjnej są utworzone z:
- błony cytoplazmatycznej,
- ściany komórkowej
- polimerów, występujących u bakterii zewnątrzkomórkowych.
Błona cytoplazmatyczna składa się z dwóch nieprzepuszczalnych dla elektronów warstw białek przedzielonych warstwą
fosfolipidów. Udział fosfolipidów w masie błony komórkowej stanowi 40%. Każda cząsteczka fosfolipidów zawiera częśd polarną
zbudowaną z grupy fosforanowej i glicerolu (ma ona hydrofilowy charakter a więc jest rozpuszczalna w wodzie) oraz częśd
niepolarną zbudowaną z kwasów tłuszczowych (wykazuje hydrofobowy charakter i jest nierozpuszczalna w wodzie).
Białka występujące w błonie cytoplazmatycznej dzieli się na:
- białka peryferyczne, przylegające do warstwy lipidowej po stronie wewnętrznej i zewnętrznej, słabo z nią związane,
- białka integralne wnikające w głąb warstwy lipidowej, silnie z nią związane; białka te to permeazy oraz białka uczestniczące
w transporcie wykorzystującym system grup translokacyjnych.
Do podstawowych funkcji błony cytoplazmatycznej należy:
- transport substancji pokarmowych i innych do komórki i wydalanie zbędnych produktów metabolizmu,
- udział w procesach oksydacyjno-redukcyjnych,
- wydzielanie enzymów hydrolitycznych rozkładających makrocząsteczki na mniejsze,
- uczestniczenie w syntezie ściany komórkowej.
Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich zbudowana jest mureiny i kwasów tejchojowych. Pod względem chemicznym
mureina jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek utworzonych z N-acetyloglukozoaminy oraz kwasu Nacetylomuraminowego, połączonych wiązaniem beta-1,4-glikozydowym. Do każdej cząsteczki przyłączone są krótkie boczne
łaocuchy peptydowe, ktore mogą byd połączone ze sobą poprzecznymi mostkami peptydowymi. Mureina w ścianach bakterii
gramdodatnich tworzy struktury wielowarstwowe i może stanowid 90% materiału ściany komórkowej. Kwasy tejchojowe są z
kolei polimerami składającymi się z powtarzających się jednostek glicerolu lub rybitolu, połączonych wiązaniem
fosfodiestrowym. Są one powiązane z mureiną lub błoną cytoplazmatyczną za pomocą wiązao kowalencyjnych.
Ściana komórki bakterii gramujemnych zbudowana jest z kilku warstw: mureiny, lipoproteiny, błony zewnętrznej. Mureina
składa się tylko z jednej do maksymalnie trzech warstw, stanowiąc 5-20 % materiału ściany komórkowej i jest mniej usieciowana
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
poprzecznie. Lipoproteina wiąże błonę zewnętrzną z mureiną. Częśd białkowa lipoproteiny połączona jest wiązaniem
peptydowym z bocznym łaocuchem peptydowym mureiny, a częśd lipidowa związana jest z lipidami błony zewnętrznej. Błona
zewnętrzna bakterii składa się z białek, fosfolipidów i lipopolisacharydów. Nie zawiera kwasów tejchojowych (typowych dla
bakterii gramdodatnich). Błona zewnętrzna jest w małym stopniu przepuszczalna dla substancji o charakterze hydrofilowym.
Częśd rzeczywistej przepuszczalności tej błony zależy od jej białek. Białka błony zewnętrznej, które uczestniczą w transporcie do
komórki, zwane są porynami. Przez nie mogą dyfundowad rożnego rodzaju substancje. Dzieli się je na:
- poryny specyficzne, które umożliwiają przechodzenie ściśle określonych substancji
- poryny niespecyficzne umożliwiające przepuszczanie cząsteczek o określonej wielkości i hydrofilowym charakterze.
Fosfolipidy stanowią wewnętrzną warstwę błony zewnętrznej. Lipopolisacharyd - charakterystyczny składnik dla bakterii
gramujemnych, umiejscowiony jest w zewnętrznej warstwie błony. Zbudowany jest z trzech składników: lipidu A, wielocukru
rdzeniowego i O-swoistego łaocucha cukrowego. Bakterie gramdodatnie i gramujemne mogą syntetyzowad i wydzielad
substancje o charakterze polimerów. Polimery tworzące zbitą warstwę ściśle otaczającą komórkę i ściśle z nią związaną nazywa
się otoczką. Gdy polimery tworzą warstwę luźno związaną z komórką, przybierając formę włókienek sterczących na zewnątrz
komórek, nazywa się je glikokaliksem. Jeżeli polimery są całkowicie odłączone od komórki bakteryjnej, ale ją otaczają, nazywa się
je warstwą śluzową. Polimery te mogą byd: polisacharydami, polipeptydami lub polisacharydopolipeptydami. Polisacharydy
zbudowane są z: cukrów, aminocukrów i kwasów uronowych. Funkcje i właściwości zewnątrzkomórkowych polimerów są
rożnorodne i zależą w dużym stopniu od sposobu ich ukształtowania wokół komórki. Egzoplimery poza ochroną komórki przed
wysychaniem i szkodliwymi czynnikami, wpływają także na przechodzenie związków chemicznych do jak i z komórki.
Usuwanie metali ciężkich przez mikroorganizmy wynika z mechanizmów:
- powierzchniowego wiązania metali przez reaktywne polimery i makrocząsteczki występujące w osłonach komórkowych,
- wewnątrzkomórkowego wiązania metali.
Opornośd drobnoustrojów na metale ciężkie wynika z obecności systemów komórkowych umożliwiających wydalanie metali na
zewnątrz, bioakumulację lub przemiany enzymatyczne prowadzące do powstawania mniej toksycznych form metali. Usuwanie
metali z udziałem mikroorganizmów jest określana mianem biosorpcji. Jest to proces, który polega na:
- wiązaniu jonów metali przez grupy reaktywne biopolimerów występujących w osłonach komórkowych mikroorganizmów,
- zatrzymaniu na powierzchni nierozpuszczalnych wodorotlenków, soli lub kompleksów metali,
- reakcji chemicznych z wydzielanymi na zewnątrz metabolitami,
- tworzeniu nierozpuszczalnych związków metali, a następnie ich gromadzeniu i krystalizacji w obrębie osłon komórkowych.
Mechanizmy usuwania metali ciężkich przez mikroorganizmy:
a) Powierzchniowe wiązanie metali zależy głownie od składu chemicznego osłon, a w szczególności od:
- rodzaju i liczebności dostępnych ligandów,
- ich rozmieszczenia przestrzennego,
- powinowactwa chemicznego do metalu.
Osłony komórkowe mają charakter anionowy, a wiązanie metali może byd skutkiem adsorpcji jonowymiennej, przyciągania
elektrostatycznego bądź reakcji chemicznych. Główną rolę w procesach zewnątrzkomórkowego wiązania metali przez
drobnoustroje odgrywają procesy:
- wymiany jonowej,
- tworzenia trwałych kompleksów.
W procesach wymiany jonowej biorą udział grupy funkcyjne polimerów i makrocząsteczek komórkowych, a w szczególności
grupa karboksylowa i fosforanowa. Grupy karboksylowe występują licznie w białkach ściany komórkowej, odpowiednio
podstawionych mono- i polisacharydach. Fosforany występują w polisacharydach komórkowych, lipoproteinach i
lipopolisacharydach.
b) Tworzenie trwałych kompleksów to mechanizm zewnątrzkomórkowego wiązania metali. Ujemnie naładowane grupy:
karboksylowa i hydroksylowa oraz posiadająca wolną parę elektronową grupa aminowa, łatwo tworzą kompleksy z
3+
3+
2+
2+
2+
2+
2+
elektrododatnimi jonami metali, jak: Al , Cr , Fe , Co , Ti , Zn , Sn . Istotną rolę białek w procesach sorpcji metali
potwierdzają liczne badania. Obniżając zawartośd białka w stosunku do węglowodanów w ścianie komórkowej u Saccharomyces
cerevisiae, nastąpiło obniżenie sorbowanej miedzi o 30%. Białka odgrywają natomiast mniejsze znaczenie w przypadku wiązania
takich metali jak kadm i nikiel. Istotną rolę w procesie wiązania kadmu ma chityna, składnik ściany komórkowej u grzybów. Z
kolei mannan - jeden z głównych składników ściany komórkowej drożdży charakteryzował się największą zdolnością sorpcji
miedzi i kobaltu.
Badania czterech szczepów bakterii: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli i Pseudosomonas aureginosa pod kątem
sorpcji takich metali jak: kadm, miedź, srebro, lantan dowiodły, że gramujemne bakterie (Escherichia coli, Pseudosomonas
aureginosa) usuwały kadm z większą efektywnością niż bakterie gramdodatnie (Bacillus subtilis, Bacillus cereus). Z kolei miedź
była najefektywniej usuwana przez Bacillus subtilis.
c) Wewnątrzkomórkowe wiązanie metali ciężkich. Różnice w zdolności wiązania metali przez bakterie gramdodatnie i
gramujemne wynikają głownie ze zróżnicowanego składu chemicznego ścian komórkowych. Przyjmuje się, że gramdodatnie
bakterie efektywniej wiążą metale w porównaniu z gramujemnymi. Zdaniem niektórych badaczy gramujemne bakterie wiążą
około dziesięciokrotnie mniej metali ciężkich niż gramdodatnie. Zdolnośd bakterii gramdodatnich do efektywniejszego wiązania
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
metali wiąże się z obecnością mureiny (peptydoglikanu), która u tych bakterii składa się z kilkudziesięciu warstw (u
gramujemnych tworzy ona od jednej do trzech warstw). Wiązanie jonów przez mureinę ma charakter jonowy. Kwasy tejchojowe,
drugi obok mureiny budulec ścian komórkowych bakterii gramdodatnich, ze względu na wysoką zawartośd fosforanów,
posiadają silnie kwasowy charakter. W dużej mierze odpowiada to za ujemny ładunek powierzchni komórek gramdodatnich.
Ważną rolę w powierzchniowym wiązaniu metali pełnią też otoczki i warstwy śluzowe. Większośd z nich składa się z polimerów
obojętnych cukrów, kwasów (uronowego, pirogronowego, octowego) oraz polipeptydów. Nadają one egzopolimerom anionowy
charakter wynikający z przewagi grup elektroujemnych i pozwala na wiązanie znacznych ilości kationów metali. Egzopolimery
efektywnie usuwają kadm z roztworów wodnych.
d) Wewnątrzkomórkowe wiązanie metali ciężkich. Metale ciężkie są usuwane z wód, ścieków, osadów ściekowych czy terenów
nimi zanieczyszczonych przez mikroorganizmy w wyniku procesów związanych z ich metabolizmem komórkowym. Wśród takich
procesów metabolicznych wyróżnid można:
- pozakomórkowe wydzielanie przez mikroorganizmy substancji nieorganicznych lub organicznych, reagujących z
występującymi w roztworze metalami, powodujących zmianę odczynu, w wyniku czego tworzą się związki o małej
rozpuszczalności,
- biotransformację polegającą na biologicznym utlenianiu lub redukcji metalu w wyniku czego usuwanie metalu jest skutkiem
jego przechodzenia z form rozpuszczalnych w mniej rozpuszczalne,
- biotransformację rozpuszczalnych form metali do lotnych związków organopochodnych czy czystego pierwiastka (np. rtęci),
które następnie mogą byd uwalniane do atmosfery,
- wewnątrzkomórkowe pobieranie i wytrącanie metali.
Wpływ pH środowiska
Podczas wzrostu wielu gatunków mikroorganizmów ulega zmianie odczyn pH środowiska. Przykładem może byd wzrost bakterii z
rodzaju Citrobacter czy Pseudosomonas na pożywkach organicznych, który powoduje podwyższenie pH. Zmiana odczynu
powoduje przesunięcie równowagi chemicznej pomiędzy formami metali występującymi w roztworze, a pośrednio ma wpływ na
powinowactwo adsorpcyjne metalu do otoczek i ścian komórkowych. W środowisku alkalicznym tworzą się słabo rozpuszczalne
związki metali, podczas gdy w środowisku kwaśnym dominują rozpuszczalne formy, w których metal występuje w formie
jonowej. Zdolnośd zmiany odczynu przez mikroorganizmy zależy w dużej mierze od podłoża, na którym są namnażane.
Mechanizm zwiększonego usuwania kadmu z roztworu z udziałem Alcaligenes denitrificans, jest związany ze zdolnością tego
gatunku do silnej alkalizacji środowiska w wyniku denitryfikacji.
Wpływ wydzielanych metabolitów
Inny mechanizm, stymulujący usuwanie z roztworu, metali jest związany z wydzielaniem organicznych oraz nieorganicznych
metabolitów. Niektóre wydzielane pozakomórkowo kwasy organiczne czy niskocząsteczkowe białka łatwo przyłączają kadm.
Powstające kompleksy są deponowane następnie w obrębie błon lub ściany komórkowej, dzięki czemu zachodzi jego usuwanie z
roztworu. Niektóre gatunki mikroorganizmów redukują siarczany do siarkowodoru dzięki obecności reduktaz występujących w
białkach błonowych. Umożliwia to wytrącenie metali w postaci nierozpuszczalnych siarczków np. srebra, kadmu, niklu czy
miedzi. Wysoka efektywnośd usuwania kadmu osiągana jest przy użyciu Citrobacter sp. Bakterie te rosnąc na podłożach
zawierających fosfoglicerol lub inne organiczne fosforany, wytwarzają specyficzny enzym - kwaśną fosfatazę. Enzym ten
2zlokalizowany jest na powierzchni komórek i odpowiada za hydrolizę substratu, wskutek czego uwalniane są jony HPO4 .
2Usuwanie metalu polegało na ich reakcji z jonami HPO4 i wytrącaniu nierozpuszczalnych MeHPO4 na powierzchni komórek.
Wpływ procesów biologicznego utleniania – redukcji.
Przemiany enzymatyczne w transformacjach metali to procesy utleniania-redukcji oraz metylacji i demetylacji, prowadzące do
zmiany formy występowania, a często do detoksykacji środowiska. Arsen może zostad utleniony do As(V) przy udziale oksydaz, a
ten jest z kolei mniej toksyczny oraz łatwiej strącany przez fosforany, wapno czy chlorek żelaza(III). Jednym ze sposobów
usuwania chromu(VI) z roztworu jest zdolnośd wykorzystania go przez mikroorganizmy jako akceptora elektronów, dzięki czemu
następuje jego redukcja do Cr(III). Do bakterii redukujących chromiany zaliczyd można Enterobacter cloacae. Do usuwania rtęci
wykorzystuje się szczep Aeromonas hydrophila. Proces ten przebiega dwuetapowo:
- redukcja jonowej formy rtęci do rtęci metalicznej przez system reduktaz,
- gromadzenie rtęci na zewnątrz komórek.
Akumulacja
Z metabolizmem komórkowym związany jest proces bioakumulacji metali. Zależna od metabolizmu komórkowego kumulacja
metali jedno- i wielowartościowych odbywa się przez systemy transportowe. Obecnośd metali ciężkich w środowisku indukuje u
mikroorganizmów syntezę specyficznych białek – metalotionein. Są to politiolowe polipeptydy zawierające znaczne ilości (do
30%) cysteiny. U glonów i wyższych roślin wykryto fitochelatyny – polipeptydy wiążące metale. Bogata w reszty tiolowe
metalotioneina zdolna jest do wiązania takich metali jak: Zn, Cu, Ag, Sn, Hg, Cd. Po związaniu z metalotioneiną nie mogą się one
związad z innymi ważnymi funkcjonalnie białkami, co obniża ich toksycznośd. Synteza metylotioneiny w komórkach indukowana
jest obecnością metali i cysteiny. Zdolnośd usuwania miedzi i kadmu przez mikroorganizmy rosnące na podłożu z cysteiną była
odpowiednio o 38 i 88% większa w porównaniu z próbą kontrolną. Fitochelatyny- to białka, które są indukowane przez rośliny i
glony podczas ich kontaktu z wysokim stężeniem metali w środowisku. Metale mogą byd też wiązane w komórkach w postaci
granul polifosforanowych np. z kadmem. Drożdże wiążą metale wewnątrz komórek w postaci niskocząsteczkowych
polifosforanów w wakuolach lub w postaci granulek.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
Adsorpcja
Na powierzchni zetknięcia się dwóch faz zawsze występuje pewne pole niewysyconych sił przyciągających (sił niewysyconych
wiązao chemicznych, sił Van der Waalsa itp.), które we wnętrzu fazy kompensują się. W wyniku oddziaływania tych sił substancje
pozostające w fazie gazowej nad cieczą lub ciałem stałym oraz substancje rozpuszczone w roztworze mogą byd selektywnie
gromadzone w pobliżu granicy faz lub też odpychane z tej przestrzeni. W konsekwencji mogą występowad różnice stężeo
pomiędzy średnim składem ośrodka gazowego lub ciekłego, a składem warstw przyległych do granicy faz. Zjawisko to nazwano
adsorpcją.
Jeśli na powierzchni granicznej występuje wzrost stężenia danej substancji - mówimy o adsorpcji dodatniej, jeśli natomiast
stężenie substancji na granicy faz jest mniejsze od stężenia we wnętrzu fazy ciekłej lub gazowej - o adsorpcji ujemnej.
Adsorpcja jest zjawiskiem złożonym. Na jej przebieg wpływa przede wszystkim niejednorodnośd powierzchni adsorbentów
(defekty punktowe, defekty jedno-, dwu- i trójwymiarowe). W zależności od geometrycznego ułożenia atomów na powierzchni
ciała stałego oraz od rodzaju tych atomów, w różnych punktach powierzchni adsorbentu działają siły o różnej naturze i wartości.
Na skutek tego na powierzchni istnieją miejsca różniące się wartościami energii wiązania danego adsorbentu z adsorbatem, a
więc miejsca o różnej aktywności w procesie adsorpcji i o różnym cieple adsorpcji. Te miejsca aktywne nazwano centrami
aktywnymi.
Ponadto cząsteczki zaadsorbowane wykazują resztkowe siły przyciągające, które mogą powodowad adsorbowanie kolejnych
cząsteczek i tworzenie się wielocząsteczkowych warstw zaadsorbowanej substancji.
W zależności od natury sił działających pomiędzy powierzchnią ciała adsorbującego (adsorbentu) a cząsteczkami ciała
adsorbowanego (adsorbatu) rozróżniamy adsorpcję fizyczną i chemiczną (chemisorpcję). W przypadku adsorpcji fizycznej siły
działające mają charakter słabych oddziaływao międzycząsteczkowych (siły Van der Waalsa), natomiast w przypadku
chemisorpcji - znacznie silniejszych oddziaływao chemicznych.
Dla jednocząsteczkowej warstwy substancji zaadsorbowanej zależności ilości substancji zaadsorbowanej od parametrów
opisujących układ (temperatura, ciśnienie lub stężenie substancji, rodzaj adsorbentu, adsorbatu itp.) są stosunkowo proste i
łatwe do interpretacji. Dla adsorpcji wielowarstwowej zależności te mają jakościowo podobny charakter, jednak interpretacja
wyników jest znacznie bardziej złożona.
W celu scharakteryzowania procesów adsorpcyjnych podaje się najczęściej izobary i izotermy adsorpcji.
Jednym z najprostszych jest, podane przez Freundlicha, empiryczne równanie izotermy adsorpcji:
x  k  p n lub x  k  c n
(1)
gdzie: x – liczba moli substancji zaadsorbowanej przez 1 gram adsorbentu, p i c – odpowiednio ciśnienie cząstkowe i stężenie roztworu w stanie
równowagi adsorpcyjnej, k i n - parametry zależne od temperatury, charakterystyczne dla adsorbentu i adsorbatu. Dla adsorpcji
gazów wartości współczynnika n są zwykle zawarte w granicach 0,2 - 0,9; a w przypadku adsorpcji z roztworu 0,2 - 0,5 i
rosną ze wzrostem temperatury dążąc do jedności. Wartości współczynnika k zmieniają się znacznie w zależności od rodzaju
adsorbentu i substancji adsorbowanej, zależą od temperatury oraz w dużym stopniu od wielkości i stanu powierzchni
adsorbentu.
Izoterma Freundlicha jest zależnością o charakterze czysto empirycznym i ma ograniczony zakres stosowalności. Nie można jej
stosowad dla bardzo niskich (brak proporcjonalności), ani zbyt wysokich ciśnieo, gdyż matematycznie opisana krzywa rośnie
nieograniczenie, podczas gdy w rzeczywistości występuje zjawisko nasycenia.
Stosunkowo prosty model procesu adsorpcji został zaproponowany przez Langmuira. Opierając się na następujących
założeniach:
1. powierzchnia adsorbentu zawiera ustaloną liczbę miejsc dla adsorbowanych cząsteczek (centra aktywne)
2. każde takie miejsce, może byd obsadzone przez jedną cząsteczkę (może się wytworzyd tylko warstwa jednocząsteczkowa),
3. ciepło adsorpcji jest stałe, niezależne od stopnia pokrycia powierzchni
4. ustala się dynamiczna równowaga: adsorpcja – desorpcja.
otrzymał zależnośd znaną jako równanie izotermy Langmuira:

p
x
x
c

lub θ 

.
xo k  p
xo k  c
(2)
Gdzie:  - stopieo pokrycia powierzchni (ułamek miejsc zajętych przez cząsteczki zaadsorbowane), xo – liczba moli substancji
zaadsorbowanej przez jednostkową masę adsorbentu w stanie pełnego obsadzenia jego powierzchni warstwą
jednocząsteczkową (wszystkie centra aktywne zajęte), x – liczba moli substancji zaadsorbowanej przez jednostkową masę
adsorbentu z fazy gazowej o równowagowym ciśnieniu cząstkowym p lub stężeniu molowym c, k – stała zależna od temperatury.
Wykonanie dwiczenia
Wpływ czasu reakcji na biosorpcję jonów metali (Pb(II), Ni(II), Cu(II), Cr(VI)) przez biomasę drożdży.
3
3
1. W kolbie stożkowej o pojemności 250-300 cm przygotowujemy 100 cm (V) roztworu wskazanego przez prowadzącego
3
jonu metalu w stężeniu ok. 100 mg/dm .
2. Ustalamy odpowiednie pH roztworu, w zakresie 5-6, używając 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
3.
4.
5.
6.
W przygotowanym roztworze określamy dokładne stężenie jonów metalu (C0) metodą spektrofotometryczną, z
wykorzystaniem testów kuwetowych – patrz pkt. 7.
Kolbę z roztworem metalu umieszczamy na wytrząsarce rotacyjnej (150 rpm) i wprowadzamy do niej 0,2 g suchej biomasy
drożdży (m).
Po 10, 20, 30, 40, 50 i 60 minutach (t) pobieramy 5 ml roztworu, w którym określamy stężenie metalu (Ce) metodą
spektrofotometryczną – patrz pkt. 7.
Ilośd zaabsorbowanego metalu przez biomasę drożdży (Q, metal mg/g suchej biomasy) obliczamy ze wzoru;
3
gdzie: C0 było początkowym stężeniem metalu (mg/dm ), Ce koocowym stężeniem metalu (mg/l), V objętością roztworu
3
metalu (dm ) i m suchą masa komórek (g).
7.
Pomiar stężenia metalu metodą spektrofotometryczną - przed wykonaniem pomiaru na spektrofotometrze należy:
7.1. Przefiltrowad roztwór - jeżeli występuje w nim zawiesina i roztwór jest nieklarowny – z wykorzystaniem zestawu do
filtracji próżniowej i użyciem sączków celulozowych 0,45µm.
7.2. Odpowiednio rozcieoczyd badany roztwór ( np. 100-krotnie) – tak aby stężenie jonów badanego metalu mieściło się w
zakresie pomiarowym odpowiedniego testu kuwetowego – rozcieoczenia należy wykonywad bardzo dokładnie z
wykorzystaniem kolb miarowych !!!
7.3. Postępowad zgodnie z instrukcją użycia danego testu kuwetowego, przestrzegad kolejności i objętości dodawanych
odczynników, oraz czasu ich reakcji:
7.3.1. Test ołowiu(II) – w zasadowym środowisku jony Pb(II) reagują z 4-(2’-pirydylazo) rezorcyną (PAR) tworząc
czerwono zabarwiony kompleks, który oznaczamy fotometrycznie (520 nm).
3
Zakres pomiarowy 0,1 – 5,0 mg/dm .
pH próby musi mieścid się w granicach 3-6. Jeżeli zachodzi potrzeba, dodad 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH.
Procedura - do probówki szklanej wprowadzid:
 Odczynnik Pb-1 – 0,25 ml
 Odczynnik Pb-2 – 0,25 ml – probówkę wymieszad (vortex)
 Przygotowana próba – 8 ml – probówkę wymieszad (vortex)
Wprowadzid przygotowany roztwór do kuwety i dokonad pomiaru w fotometrze.
3
Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,13 mg/dm Pb(II)
7.3.2. Test niklu(II) – jony Ni(II) poddaje się utlenieniu przy pomocy jodu, a następnie w reakcji z
dimetyloglioksymem, w środowisku amoniakalnym, tworzą czerwono-brązowy kompleks, który jest oznaczany
fotometrycznie.
3
Zakres pomiarowy 0,1 – 5,0 mg/dm .
pH próby musi mieścid się w granicach 3-8. Jeżeli zachodzi potrzeba, dodad 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH.
Procedura – do probówki szklanej wprowadzid:
 Przygotowaną próbę – 5 ml
 Odczynnik Ni-1 – 1 kropla – dodad i wymieszad, delikatne żółte zabarwienie musi się utrzymad. Jeżeli
zachodzi potrzeba dodad odczynnika Ni-1 kroplami do momentu, gdy barwa pozostanie stabilna.
Pozostawid na 1 minutę – czas reakcji A
 Odczynnik Ni-2 – 2 krople – dodad i wymieszad. Wartośd pH próbki musi mieścid się w granicach 10-12 ( w
razie potrzeby skorygowad pH).
 Odczynnik Ni-3 – 2 krople – dodad i wymieszad.
Pozostawid na 2 minuty – czas reakcji B.
Przelad próbkę do kuwety i dokonad pomiaru w fotometrze.
3
Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,11 mg/dm Ni(II).
7.3.3. Test miedzi(II) – środowisku amoniakalnym, jony miedzi(II) reagują z kupryzonem tworząc niebieski kompleks,
który jest oznaczany fotometrycznie.
3
Zakres pomiarowy 0,1 – 6,00 mg/dm .
pH próby musi mieścid się w granicach 4-10. Jeżeli zachodzi potrzeba, dodad 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH.
Procedura – do probówki szklanej wprowadzid:
 Przygotowaną próbę – 5 ml
 Odczynnik Cu-1 – 1 poziom zielonej łyżeczki pomiarowej – dodad i wstrząsad energicznie do momentu
rozpuszczenia odczynnika, pH próbki musi mieścid się w granicach 7-9,5.
 Odczynnik Cu-2 – 5 kropli – dodad i wymieszad
Pozostawid na 5 minut (czas reakcji).
Przelad próbkę do kuwety pomiarowej i dokonad pomiaru w fotometrze.
3
Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,15 mg/dm Cu(II).
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
7.3.4.
8.
Test chromu(VI) – metoda polega na zredukowaniu chromu(VI) przy użyciu difenylokarbazydu w roztworze
zawierającym niewielkie stężenie fluorowodoru. Przejściowym produktem tej reakcji jest niezhydratowany
chrom(III). Tworzy on czerwono-fioletowy kompleks z difenylokarbazonem, produktem utleniania
difenylokarbazydu. Kompleks jest oznaczany fotometrycznie.
3
Zakres pomiarowy 0,11 – 6,69 mg/dm .
pH próby musi mieścid się w granicach 1-9. Jeżeli zachodzi potrzeba, dodad 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH.
Procedura – do probówki szklanej wprowadzid:
 Odczynnik Cr-1 – 1 poziom szarej mikrołyżeczki umieścid w pustej probówce
 Odczynnik Cr-2 – 6 kropli – dodad i wstrząsad energicznie do momentu całkowitego rozpuszczenia
odczynnika
 Przygotowana próba – 5 ml – dodad i wymieszad
Pozostawid na 1 minutę (czas reakcji), następnie wprowadzid próbkę do kuwety i dokonad pomiaru.
3
Zakres odchylenia wartości pomiaru: maksymalnie ±0,04 mg/dm Cr(VI).
Opracowanie wyników
8.1. Wyniki zestawid w tabeli.
8.2. Sporządzid wykres Q [metal mg/g suchej biomasy]=f(t).
Wyznaczanie izoterm adsorpcji jonów metali (Pb(II), Ni(II), Cu(II), Cr(VI)) przez biomasę drożdży
3
9. W 6 kolbach stożkowych 250-300 cm sporządzamy roztwory wskazanego przez prowadzącego jonu metalu – w/g Tabeli 1.
10. Oznaczamy dokładne stężenie jonów metalu w poszczególnych roztworach c1 przez pomiar metodą spektrofotometryczną z
wykorzystaniem testów kuwetowych – patrz pkt. 7.
11. Do każdej kolby wprowadzamy po 0,2 g suchej biomasy drożdży i całośd wytrząsamy (150 rpm) przez 15 minut.
3
12. Kolby zdejmujemy z wytrząsarki i z każdej pobieramy po 5 cm roztworu do opisanej wcześniej probówki.
13. Oznaczamy stężenie jonów metalu w poszczególnych roztworach c2 – pomiar metodą spektrofotometryczną – patrz pkt. 7.
Jeśli czas adsorpcji był wystarczająco długi do ustalenia się w danej temperaturze równowagi adsorpcyjnej pomiędzy
roztworem metalu a biomasą drożdży, to wyznaczone wartości c2 są równowagowymi stężeniami jonów metalu.
14. Otrzymane wyniki pomiarów i obliczeo należy zamieścid w Tabeli 2.
15. Opracowanie wyników
15.1. Na podstawie uzyskanych wyników wykreślid izotermę adsorpcji jonów metalu przez biomasę drożdży, tzn. zależnośd
ilości jonów metalu zaadsorbowanych przez jednostkę biomasy drożdży x od stężenia roztworu po osiągnięciu stanu
równowagi c2. Na wykresie należy nanieśd punkty doświadczalne oraz wielkośd niepewności pomiarowych.
15.2. Sprawdzid stosowalnośd równao Freundlicha i Langmuira do opisu badanego procesu adsorpcji.
W tym celu zlogarytmowad równanie Freundlicha:
log x  log k  n  log c 2 .
(1)
i przedstawid wyniki doświadczalnie w układzie współrzędnych logx = f(logc2).
Metodą najmniejszych kwadratów obliczyd wartości współczynników k i n w równaniu (1) oraz ich średnie błędy
kwadratowe.
15.3. Analogicznie, w celu sprawdzenia stosowalności równania Langmuira, przekształcid równanie izotermy Langmuira do
postaci :
c 2 c2
k


x xo xo
lub
1 1
k


x xo c2 xo
,
(2)
a następnie na podstawie danych doświadczalnych sporządzid wykres w układzie współrzędnych (c 2/x)=f(c2) lub
(1/x)=f(1/c2).
Metodą najmniejszych kwadratów obliczyd wartości współczynników k oraz xo w równaniu (2) oraz ich średnie błędy
kwadratowe.
15.4. Sporządzid wykres izotermy adsorpcji w układzie x=f(c2) w następujący sposób:
punkty odpowiadające uzyskanym wynikom doświadczalnym, należy nanieśd razem z obliczonymi wielkościami
niepewności pomiarowych
wykreślid linią ciągłą izotermę Freundlicha w oparciu o wyznaczone współczynniki
wykreślid linią przerywaną izotermę Langmuira w oparciu o wyznaczone współczynniki
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii – studia II stopnia
Dwiczenie 2
Adsorpcja metali przez mikroorganizmy
Tabela 1. Sporządzanie roztworów do adsorpcji
Nr kolbki
I
3
Ilośd roztworu Pb(II)/Ni(II)/Cu(II)/Cr(VI) [cm ] o stężeniu 5 mg/dm
3
Ilośd wody destylowanej *cm ]
3
Przybliżone stężenie otrzymanego roztworu [mg/dm ]
3
Objętośd otrzymanego roztworu *cm ]
3
0,5
99,5
25
100
II
1
99
50
100
III
2
98
100
100
IV
3
97
150
100
V
4
96
200
100
VI
5
95
250
100
Tabela 2 Zestawienie wyników
Ilośd roztworu
pobranego
do oznaczenia
Nr
Nr
stężenia metalu
pomiaru kolbki
metodą
spektrofotometryczną
[cm3]
1.
I
5
2.
3.
4.
II
5
5.
6.
7.
III
5
8.
9.
10.
IV
5
11.
12.
13.
V
5
14.
15.
16.
VI
5
17.
18.
Stężenie
roztworu
przed
adsorpcją
c1
[mg/dm3]
Ilośd roztworu
pobranego
do oznaczenia
stężenia metalu
metodą
spektrofotometryczną
[cm3]
5
Stężenie
roztworu
po
adsorpcji
c2
[mg/dm3]
Ilośd
jonów metalu
zaadsorbowana
z objętości V
roztworu
n=V(c1-c2) [mg]
Ilośd
Jonów metalu
zaadsorbowana
przez 1g
suchej biomasy drożdży
(m)
x=n/m [mg/g]
log c2
log x
c2/x
5
5
5
5
5
Literatura:
1. Łebkowska M., Klimiuk E., Biotechnologia w ochronie środowiska, WN PWN, Warszawa 2003.
2. Sadowski Z., Biogeochemia – wybrane zagadnienia, Oficyna wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba